Summary
Zatürreeye insan en sık görülen enfeksiyonlar arasında yer alıyor. Hastalığın patogenezinde anlama ve Roman tedavi etkinliğinin sınamak için kritik bir uygun vivo içinde modelidir. Bu fare oropharyngeal aspirasyon pnömoni model ile bir patogenez ve bu ölümcül enfeksiyonlara karşı yeni tedavi inceleyebilirsiniz.
Abstract
Fare enfeksiyon modelleri hastalık patogenezinde anlama ve etken patojenler ile mücadele için tasarlanmış yeni tedavi etkinliğinin sınamak için kritik öneme sahiptir. Zatürreeye klinikte Hastalar tarafından sunulan en sık görülen enfeksiyonlar arasında yer alıyor ve böylece bir uygun vivo içinde modeli garanti eder. Hedef kapalı komplikasyonlar ve sinüzit, gastrit, enterit, fiziksel travma veya aerosol taklit etmek için sis microparticle gibi belirtiler neden akciğer dışında aşırı organizmalar mevduat burunici aşılama tipik pnömoni modelleri kullanmak viral, tüberküloz veya mantar zatürreden daha normal yayıldı. Bu modeller patogenezinde bakteriyel pnömoni tipik topluluk veya sağlık-edinilen doğru bir şekilde yansıtmıyor. Buna ek olarak, bu fare modeli oropharyngeal aspirasyon pnömoni sağlık edinilen pnömoni damlacık rotasında taklit eder. Bakterilerin 50 µL aşı süspansiyon imzalat farelerin mastoidi içine pnömoni sonuçları yansımalı aspirasyon neden olur. Bu model ile bir zatürre neden olan patojen ve bu hastalıklar ile mücadele için yeni tedaviler patogenezinde inceleyebilirsiniz.
Introduction
Alt solunum yolu enfeksiyonu dünyanın en ölümcül bulaşıcı hastalık ve ölüm gelişmekte olan ülkelerde1' deki en yaygın nedeni var. Genel olarak, bu enfeksiyonların fazla 3.2 milyon ölüm1için hesap. Buna ek olarak, nozokomiyal pnömoni sağlık edinsel enfeksiyonlar en yaygın ve en ölümcül formları arasında ve en antibiyotik dirençli patojenler2,3tarafından kaynaklanır. Tipik topluluk alınan her ikisi için bakteriyel pnömoni ve nozokomiyal pnömoni edinimi oropharyngeal içeriği aspirasyon alveoller içine yoldur. Bu hastalıklar genellikle eğitim için kullanılan fare modelleri burunici aşı4çok hedef kapalı komplikasyonlar ve hastalığı ile uyumsuz sinüzit ve fiziksel travma, gibi belirtiler neden akciğer dışında bakterilerin yatırmak, kullanın modelleri vardı insan ilerlemesinde taklit etmek için tasarlanmış. Diğer modelleri inhalasyon odalar ve daha doğru viral, tüberküloz ve fungal pnömoni taklit ama doğru bir şekilde tipik bakteriyel pnömoni edinmesinin normal rotanın özetlemek değil micromisting cihazlar kullanabilirsiniz.
Fare oropharyngeal aspirasyon pnömoni modeli doğal yol ve patogenezinde bakteriyel pnömoni benzetimi yapmak için yararlı. Aşı tarafından 50 µL imzalat fareler bir pipet kullanarak mastoidi içine bakteriyel süspansiyon yansımalı aspirasyon ensues, hangi içinde zatürreeye sonuçlanır. Bu modeli kullanarak, bir zatürre neden olan patojen ve daha yüksek sadakat manken insanda gözlenen aspirasyon pnömoni enfeksiyonlara daha benzer bu hastalıklarla mücadele için yeni tedaviler patogenezinde inceleyebilirsiniz. Ayrıca, ağız boşluğu5,6ile enfekte benzer modelleri farklı olarak tam inoculum nerede bu off-site inflamasyon ve gastrit gibi enfeksiyonlara neden olabilir bağırsak yerine akciğerlere ulaşır bu model sağlar ve enterit. Son olarak, Laringoskop gerektirir ve trakea7ile inoculates başka bir yayımlanmış modeli, aksine bu model hava yolu bir sonda ile besleme iğneyle engel değil ve enjeksiyon inoculum teslim edilmek üzere gerektirmez. Yerine, aşı üzerinde fare doğal aspirasyon refleks dayanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanları içeren tüm yordamları araştırmacı kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanması gerekir.
1. bakteriyel Inoculum hazırlanması
- Bakteri kolonileri yalıtmak.
- Çizgi uygun steril agar Orta (Örneğin, Tryptic soya agar), bakteriyel strain (Örneğin, A. baumannii "HUMC1") izole kolonileri oluşturmak için dikkatli olmak.
- Uygun koşullar (Örneğin, bir gecede 37 ° C'de), kuluçkaya.
- Gecede kültür büyümek.
- Bir temsilci, steril bir inoculating döngü agar plakalı izole koloni seçin ve uygun steril broth Orta (Örneğin, Tryptic soya suyu) 10 mL aşılamak için kullanabilirsiniz.
- Durağan faz, uygun koşullar (Örneğin, Bacalı kapağı, 50 mL konik şişe geceleme 200 devirde sallayarak ile 37 ° C) ulaşmak örnek sağlar.
- Alt kültür büyümek.
- Gecede Kültür 100 μL 10 mL taze steril broth bir pipet kullanarak aktarın.
- Uygun koşullar (Örneğin, 3 h Bacalı kapağı, 50 mL konik şişe için 200 devirde sallayarak ile 37 ° C), üstel/log fazı ulaşmak için izin verir.
- Alt kültür yıkayın.
- Alt kültür incubating onun ortamdan kaldırabilirsiniz.
- Bakteri cips 5 min için 4.000 × g, santrifüj kapasitesi.
- Aspire edin ve süpernatant atın.
- 10 mL steril fosfat tamponlu tuz (PBS) Pelet ve şiddetle tamamen resuspended kadar girdap ekleyin.
- Adımları yineleyin 1.4.2 - 1.4.4 iki kez, toplam 3 yıkar.
- Bakteriyel süspansiyon konsantrasyon ayarlayın.
- 600 optik yoğunluk ölçer bir spektrofotometre kullanarak nm (OD600), bakteriyel süspansiyon optik yoğunluğunu ölçmek.
- İnoculum optik yoğunluğu bir OD600 0,5, düşünceye kadar steril PBS denklem Cben× Vben kullanarak bakteriyel süspansiyon Ekle "C" nerede konsantrasyon, Cf× Vf, = "V" ise birim, "ben" ilk, olduğunu ve "f", son. * Cf her zaman 0,5 olmalıdır; Vf çözmek için değişkendir.
- Bakteriyel süspansiyon bir OD600 0,5 düşerse, bakteri cips ve 0,5 OD600 ulaşmak için süpernatant uygun miktarda kaldırmak 5 min için 4.000 × g, santrifüj kapasitesi.
- Seri dilutions steril PBS (Örneğin, 1 × 10-6elde etmek için üç 1: 100 dilutions) gerçekleştirmek ve koloni oluşturan bakteri konsantrasyonu ortaya koymaktadır korelasyon katsayısı belirlemek için steril agar tabağa mL (CFUs/mL) başına birim bir OD600 0,5.
Not: Bu korelasyon katsayısının değeri için her tür her zor değişir ve inoculum hazırlık bir enfeksiyon için önce belirlenmelidir. - Korelasyon katsayısı belirledikten sonra bunu bir inoculum (Örneğin, 2 × 108- 1 × 109 CFUs/mL); istenilen konsantrasyon oluşturmak için kullanın istenen inoculum OD600 0,5 büyükse bakteri cips ve istenen toplama ulaşmak için süpernatant uygun miktarda kaldırmak 5 min için 4.000 × g de bakteriyel süspansiyon santrifüj kapasitesi.
- Bu değerler aynı türden bakteri yalıtır ve farklı genetik kökenden fareler arasında değişir gibi her tür fare her bakteri izole virülans belirlemek için in vivo pilot çalışmalar gerçekleştirmek. Belirli suşları alt inocula öldürücü Ayagin Gram-negatif türleri için farelerde LD100 genellikle 1-5 × 108 CFUs/fare, olmasına rağmen.
- Daha önce yayımlanmış8 (isteğe bağlı) isteğe bağlı, kesin inocula olarak ileride kullanmak için aynı aliquots dondur.
- Bakteriyel inoculum 1 L iki 500 mL konik şişeleri ve 5 min için 4.000 × g, santrifüj yukarıda açıklanan transfer olarak hazırlayın.
- 450 mL süpernatant konik her şişe üzerinden atmak ve granül kalan süpernatant bakteri resuspend.
- Konsantre bakteriyel inoculum manyetik heyecan çubuğunu içeren bir 250 mL kabı transfer ve sürekli bir heyecan tabak 300 devirde üstüne karıştırın.
- Dikkatle konsantre bakteriyel inoculum (Örneğin, 1 × 1010 CFUs/mL) tam olarak 600 μL aktarım bir 1.6-mL kriyojenik flakon steril H2O tam olarak 300 μL ve 300 içeren bir pipet kullanarak μL steril gliserin; Mix ve-80 ° C'de depolayın
Not: Gliserol muhafazası için gerekli deneysel sonuçlar yıkmak ve bu nedenle onu yıkamak gerekli olan aşırı ölüm neden olur. - Kullanım için hazır olduğunuzda, oda sıcaklığında 10 dakika için örnek çözülme.
- 1 mL 50 mL konik şişe aktarmak, 4.000 × g bakteri cips 5 min için de 9 mL steril PBS ve santrifüj ekleyin. Süpernatant Aspire edin ve PBS bulaşıcı inoculum için istenen toplama ulaşmak için uygun bir hacmine CFUs (CFUs/ml hisse senedi toplama donmuş 1 mL ×) önceden belirlenmiş miktar resuspend.
2. anesthetizing fareler
- Ketamin/Xylazine
Not: Anestezi ketamin/xylazine ile fare uyanır önce aşı yordamı tamamlamak için bu tekniği yeni araştırmacı için yeterli zaman sunan uzun bir süre vardır.- Pharmaceutifcal sınıf PBS, 1 mL olarak 100 mg/mL ketamin hisse senedi çözüm 8,5 mL birleştirerek 10 mL enjekte edilebilir çözeltisi hazırlamak (son konsantrasyonu 10 mg/mL) ve 20 mg/mL Xylazine hisse senedi çözüm 0.5 mL (son konsantrasyonu 10 mg/mL).
- Enjeksiyonla mayi (IP) (Örneğin, bir 25-g fare için 250 μL) 10 μL/g yönetmek.
- Çünkü onların gözleri anestezi sırasında uzun bir süre zarar eğilimli ketamin/Xylazine ile anestezi fareler gözünde oftalmik merhem uygulamak.
- Fareyi bir kafese koyun ve anesteziden uyanana kadar izlemek.
Not: sternal recumbency korumak için yeterli kendine geldi kadar hayvan katılımsız bırakılmamalıdır.
- Isoflurane
Not: Fare hızlı bir şekilde isoflurane kaynaklı anesteziden anestezi bu yöntemi yalnızca aşılama yordam yetkin olduktan sonra kullanılmalıdır yüzden indüksiyon odasından sonra kaldırılmakta uyan.- Saf fareler ile oksijen akan bir uygun ölçekli indüksiyon odası yerleştirin.
- Odası tamamen kapalı sonra fareyi kullanarak hassas Buharlaştırıcı %4 (v/v) en az 5 min için isoflurane eklemek anestezi; anestezi indüksiyon odasından bir fare kaldırma ve anesteziden uyanmaya ne kadar süreceği ölçerek onaylamak (~ 60 s).
Not: anestezi kez değişebilir üzerinde kurumsal yönergeleri dayalı ve bazı hayvanlar tam anestezi olmak için daha--dan 5 dk gerekebilir unutmayın. - 10 dakikaya kadar için anestezi isoflurane konsantrasyonu % 2-3 ayarlayarak korumak; anestezi toplam süresi ise > 15 dk, oftalmik merhem imzalat fareler gözler için geçerlidir.
- Bir kafes içinde fareyi getirin ve anestezi, adım 2.1 olduğu gibi gelen uyanana kadar izlemek.
3. aşı/hastalık fareler
- İmzalat bir fare askıya alma, onun üst kesici dişler (Örneğin, diş ipi) güçlü, zayıf dizesini tarafından asılı bir yükseklikte sabit bir nesne için yaklaşık iki katı fare Gövde uzunluğu (Örneğin, 20 cm) çalışma yüzeyi (Örneğin yukarıda güvenli Laboratuvar tezgah).
- Fare dil steril, künt uçlu forseps kullanarak onun ağzından yavaşça çekin. Dil bir steril, eldivenli bir parmak fare dili yanlışlıkla kırma önlemek için transfer. Dil mastoidi erişmesine izin vermek ve inoculum tarafa, yutma engelleyen ağız dışında tutun.
- Fare dilini tutarak, 50-μL inoculum (bakteriyel süspansiyon) bir micropipette kullanarak mastoidi yerleştirin; mastoidi oral kavite ve farenks arka ağız kısmına doğru yer alır.
Not: Sadece ilk durak micropipette tarihinde pipetting tarafından sıvı sunmak çok önemlidir. Fareyi birkaç saniye ne zaman inoculum içinde mastoidi yerleştirilir nefes; sonunda, yansımalı aspirasyon pnömoni enfeksiyonu neden olan akciğerlere giren sıvı ayırt edici çatırtı gürültü ile gösterilen bakteriyel süspansiyon nefes için fareyi neden olur. - İnoculum kadar koymamış durumunda normal solunum engellemek, siklikla ağız ve inoculum sonraki soluma yoluyla yansımalı aspirasyon zorlamak için forseps ile çimdik için yeterli geri.
- Aşı sonra dil yayın, fare süspansiyon dizeden kaldırmak, bir kafese koyun ve anestezi, adım 2.1 olduğu gibi gelen uyanana kadar izlemek.
4. hastalık ilerleme izleme
Not: hayvan acı nedeniyle, çeşitli göstergeler fareler can çekişen olunca belirtmek için kullanılmalıdır; ötenazi önceden onaylanmış bir IACUC protokol uyarınca bu tespiti takip yapılmalıdır; moribundity çeşitli işaretleri vücut ısısı, kilo kaybı, görünüm, yürüyüş ve kan (Örneğin, Istat üzerinden)9,10,11,12denelde edilebilir diğer biyolojik dahil, 13,14,15,16.
- Daha önce onaylanmış IACUC Protokolü (Örneğin, servikal çıkığı tarafından takip CO2 ) göre fareler ötenazi.
- Akciğerlere trakea, pulmoner arter ve pulmoner ven yakın akciğerlere keserek euthanized fareden kaldırın.
- Mikroskobu
- Akciğerler (veya bölümünün) bir örnek kalıp içine yerleştirin.
- Örnek kalıp tamamen doku batış en uygun kesme sıcaklık (O.C.T.) karışımla doldurun.
- Örnek-80 ° C'de dondurmak
- Örnek bir patoloji laboratuvar bölümü ve slaytları Mikroskopi için bağlama için gönderin.
- Bakteri yükü
- Akciğer dokusu bir analitik dengede tartın.
- Akciğer dokusu 50 mL konik flakon steril PBS (doku büyüklüğüne) 2-5 mL içeren aktarın.
- Akciğer doku doku homogenizer ile homojenize.
- Homogenate seri dilutions yaklaşık 1000 CFUs/beklenen bakteri yükü akciğerlerde dayalı mL, elde etmek için steril PBS gerçekleştirin.
- 1 × 109 CFUs/mg bekleniyor, örneğin, üç 1: 100 dilutions gerçekleştirin: PBS ve girdap; 9.9 ml homogenate Transfer 100 μL ilk 1: 100 seyreltme bu. İlk 1: 100 seyreltme 100 μL PBS ve girdap 9.9 mL transfer; ikinci 1: 100 seyreltme bu. İkinci 1: 100 seyreltme 100 μL PBS ve girdap 9.9 mL transfer; Bu üçüncü ve son 1: 100 seyreltme var.
- Akciğerlerde bakteri yükü bilinmiyorsa, beklenen aralığı yakalamak için dilutions gerçekleştirebilirsiniz.
- Steril agar üzerinde plaka dilution(s).
- Steril Tryptic soya suyu (TSB) agar (TSA) plakalı hazırlamak: birleştirin TSB 30 g, agar 15 g ve 1 litre su, mix ile manyetik karıştırıcı ve ısı ~ 100 ° C'de 5 dakika serin ve basınçlı kap üzerinde sıvı döngüsü için 15 dk. için soğutmak için izin ver sonra izin ver süreyle kaynar kadar ~ 55 ° C, transfer 10 mL taze autoclaved steril Petri yemekler, TSA ve oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Kuru benchtop 2-5 d için üzerinde veya altında bir Biyogüvenlik 10 dakikadır kabine ortaya izin.
- Seyreltme 100 μL steril TSA içeren bir Petri kabına aktarın ve dağıtıcı veya cam boncuk kullanarak TSA yayılmış.
- Gecede 37 ° C'de Petri kabına bir oksijen kuluçka (yani, 37 ° C kuluçka makinesi su ele geçen bir 1-L kabı içeren) saklamak
- CFUs/mL akciğer homogenate üzerine agar kaplama göre belirler (Örneğin, yukarıda açıklanan üçüncü ve son seyreltme 100 μL ile TSA plaka üzerinde 100 CFUs 100 CFUs/100 μL × 100dil 1 × 100dil #2 × 100dil #3 olurdu = 1 × 109 CFUs/mL).
- CFUs/mg akciğer doku CFUs/mL akciğer homogenate mg akciğer doku/mL homogenate (Eğer yukarıda açıklanan örnek 100 mg 5 mL PBS, sonra 1 × 109 CFUs/mL ÷ 100 mg / 5 mL = 5 × 107 homojenize akciğer dokusunun kullanılanÖrneğin, tarafından bölerek dayalı hesaplamak CFUs/mg).
- Mikroskobu
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dikkatli bir şekilde iletişim kuralı takip ederek, tekrarlanabilir ve sağlam verileri kolayca elde edilebilir. Kesinlikle bir özelleştirilmiş inoculum hazırlama protokolüne bir birbirleriyle karşılaştırılmak üzere deneyleri için uygun önemlidir. Düzgün işlemesine fareler enfeksiyon işlemi sırasında önemlidir. İsoflurane yoksun bir anestezi odasına fareler yerleştirdiğinizden emin olun. Fare ile isoflurane önceden dolu bir odaya girdiyseniz paniğe kapılmaz ve muhtemelen deneysel sonuçlar olumsuz etkileyebilir aşırı stres karşılaşabilirsiniz. Konteyner kapağı güvenli hale getirme sonra yavaş yavaş tanıtmak isoflurane % 0'dan onun konsantrasyonu % 4 (v/v); artırılan tarafından aceleyle isoflurane yönetme de paniklemeye fareler neden olabilir. Fareler bilinçsiz hale sonra isoflurane konsantrasyonu % 2-3 (v/v) azaltmak ve ek bir kaç dakikalığına odasında kalmasını sağlayacak. Bu noktada, fare olmaya hazır mısın (Şekil 1) enfekte.
Bir fare anestezi odasından kaldırın ve dil (Şekil 2) erişmesine izin vermek için en iyi onun ön dişler tarafından askıya alma. Sonra dilini (Şekil 3) yavaşça çekmeye kullanım künt uçlu forseps forseps düzenlenen dil steril, eldivenli parmak (travma fare dili için önlemek için,Şekil 4) aktarın. Hala dışarıda ağız dil ile 50 µL inoculum mastoidi (Şekil 5) aktarın. Burada, sadece sıvı ilk durağı micropipette tarihinde pipetting tarafından teslim etmek çok önemlidir. İkinci durağı devam etmeden büyük bir kabarcık ile enfeksiyon engelleyen inoculum içine tanıtabilirsiniz.
Enfeksiyon tamamlandıktan sonra fare sınama seçenekleri sayısız vardır. Patogenez çalışmaları için bir karşılaştırabilirsiniz virüslü doku (Şekil 6) bulaşmamış. Roman therapeutics etkinliğini analiz Eğer bir akciğer kaldırmak ve onları kesitli ve lekeli. Bu bir saat ara veya hastalık (Şekil 7) göstermek için birden çok zaman noktalarda yapılabilir.
Virüslü fareleri akciğerlerde bakteri yükü değerlendirmek için başka bir seçenektir. Bu steril PBS, bilinen bir birimi içeren bir flakon aktarma akciğerlerdeki kaldırarak (her örnek arasında çapraz kontaminasyonu önlemek için durulama) bir doku homogenizer ile homojenizasyon yapılır. Akciğer homogenate besin açısından zengin agar üzerinde seri dilutions kaplama CFUs/mL her akciğer homogenate ve daha sonra CFUs/mg akciğer doku (Şekil 8) hesaplamak için izin verir. Bu, çok yapılabileceği bir saat ara veya hastalık ilerleme göstermek için birden çok zaman noktalarda.
Orada, sitokin analizleri (Şekil 9), sepsis biyolojik tarafından Istat (Şekil 10), hücre yüzey işaretleyicileri, araştırmak için akış sitometresi cep profil oluşturma, RNAseq, vb dahil olmak üzere gerçekleştirilen sayısız deneyleri
Resim 1 : LD100belirlenmesi. LD100belirlemek için çeşitli inocula konsantrasyonları ile fareler bulaştırmak gereklidir. Burada, inoculum 2 × 108 CFUs/fare çok yüksektir, 5 × 107 ve 2 × 107 çok düşüktür ve 1 × 108 sadece haklı.
Resim 2 : Asmak fareler tarafından üst kesici dişler. Fareler anestezi sonra bir fare indüksiyon odasından kaldırın (A) forseps dize 20-30 cm yukarıda çalışma yüzeyinin güvenli bir döngü dışarı çıkarmak için kullanın (B) dize fare üst kesici dişler, arkasında hareket (C) dize sağlamak üst kesici dişler sabitlenir ve (D) onun üst kesici dişler tarafından dize döngüde asmak fare izin.
Şekil 3 : Çek dil forseps ve transfer kavrama ile ağzından eldivenli parmak. Fareyi onun üst kesici dişler tarafından asılı sonra (A) forseps yavaşça fare dil, kavramak için kullanın (B) yavaşça çekin dilini ()C) dikkatle dil forseps eldivenli parmak fare için travma önlemek için transfer dil, ve (D) dili eldivenli parmak ile yerde tutun. Dilini ağzına geri kaymasını önlemek için yeterli basınç uygulayın emin olun ama değil çok fazla basınç böylece o travma ensues. Dil güve dışında ve bir sonraki adımda micropipette erişim için izin vermek için yana tutulmalıdır. Bu noktada, fare enfeksiyon için hazırdır.
Şekil 4 : Fare bulaştırmak. Dil ağız dışında tutarak, bir micropipette mastoidi için 50 µL inoculum aktarmak için kullanın. Damlalıklı uç ağız dili arka içinde yerleştirin ve sadece ilk üst üzerinde micropipette devam bakteriyel süspansiyon dağıtmak; Bu büyük bir kabarcık tam aspirasyon ile müdahale inoculum içine tanıtmak olarak ikinci durağı gitme.
Şekil 5 : Test sağlıklı (bulaşmamış) vs enfekte akciğer dokusunun. Hematoksilen ve eozin (H & E) önce ve sonra hangi ölüm genellikle 1-3 gün içinde sonuçlanan rota Ventilatör ilişkili pnömoni (VİP), beyannamedir A. baumannii, oropharyngeal aspirasyon akciğer bölümlerini boyama ve önemli alveoler burada görüldüğü gibi iltihap.
Şekil 6 : Bakteri yükü değerlendirmek; yeniden basıldı ve izni14 ile modifiye . Fareler hastalık sonra akciğerler uygulanabilir IACUC protokolü ile uyumlu başarılı ötenazi takip diseksiyon çıkarın. Akciğer doku kütlesi toplamak, bilinen birimi (2-5 mL) steril PBS içeren bir flakon, daha sonra bir doku homogenizer ile homojenize. Homogenizer etanol ve steril PBS her örnek arasında çapraz kontaminasyonu önlemek için ile yıkayın emin olun. Akciğer homogenate seri dilutions gerçekleştirmek ve besin açısından zengin agar üzerinde çeşitli dilutions plaka ve uygun şekilde için seçilen patojen kuluçkaya. CFUs/mL CFUs/plaka × seyreltme üzerinde dayalı her akciğer homogenate için hesaplamak ve sonra mg akciğer doku/mL akciğer homogenate tarafından bölebilirsiniz. Bu bir saat ara veya hastalık ilerleme göstermek için birden çok zaman noktalarda yapılabilir. Medians interquartile aralıkları temsil eden hata çubukları ile görüntülenir. p < 0,05 tedavi ve tedavi edilmezse grup.
Şekil 7 : Test enfekte akciğer dokusunun tedavi edilmezse tedavi; yeniden basıldı ve izni14 ile modifiye vs . Fareler hastalık sonra akciğerler uygulanabilir IACUC protokolü ile uyumlu başarılı ötenazi takip diseksiyon çıkarın. Uygun dokuyu korumak (örneğin, en iyi kesim ısı jel içinde dalmış ve-80 ° C'de dondurulmuş) sonra patoloji laboratuar ya da diğer yetkin bireysel kesit ve boyama için gönderin. Bu bir saat ara veya hastalık ilerleme göstermek için birden çok zaman noktalarda yapılabilir.
Şekil 8 : Sitokin analizi; yeniden basıldı ve izni14 ile modifiye . Dolaşımdaki sitokinler analiz etmek için yeterli kan (Örneğin, kuyruk nicking üzerinden 50 µL) temin etmek, 1000 × g, santrifüj 4 ° C'de 10 dakika oda sıcaklığında 30 dakika koagüle ve serum süpernatant toplamak için izin. Serum sonra Luminex sitokinler multiplex tarafından analiz edilebilir. Bu bir saat ara veya hastalık ilerleme göstermek için birden çok zaman noktalarda yapılabilir. Medians interquartile aralıkları temsil eden hata çubukları ile görüntülenir. p < 0,05 tedavi ve tedavi edilmezse grup aynı zamanda noktada.
Şekil 9 : Sepsis biyolojik; yazdırılan ve anlam değiştirici ile izni14 . Sepsis biyolojik analiz etmek için 75 µL kan (kuyruk nicking yoluylaÖrneğin,) tedarik ve hızlı bir şekilde istenen analitler için testleri bir Istat kartuş aktarın. Bu bir saat ara veya hastalık ilerleme göstermek için birden çok zaman noktalarda yapılabilir. Medians interquartile aralıkları temsil eden hata çubukları ile görüntülenir. p < 0,05 tedavi ve tedavi edilmezse grup aynı zamanda noktada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Emin olmak için fare minyatür insanlar değildir. Fare modellerden elde edilen sonuçlar bağlamda kabul ve daha sonra insanlar, iki tür6arasındaki farklılıklar ve benzerlikler dayalı uygulanabilirliği için yorumlanır. Uygun fare zorlanma olarak seçmek önemlidir bazı diğerlerinden daha; bazı enfeksiyonlara daha yatkındır aynı seçim16patojen zorlanma için geçerlidir.
Enfeksiyonlar titiz ve son derece tekrarlanabilir biçimde gerçekleştirmek için önemlidir. İnocula-ebilmek var olmak öldürücü farelere bir değerde henüz bu değeri % 90'ı bile, zararsız. Böylece, bu protokol için listelenen koşulların tümü tam olarak aynı şekilde, özellikle inoculum hazırlarken ve ne zaman bulaşmasını çoğaltılabilir zorunludur. Ayrıca, her patojen, benzersiz bir inoculum hastalığı neden olur. Bu nedenle, her zorlanma patojen ve fare her tür için uygun inoculum belirlemek için pilot deney gerçekleştirmek gereklidir.
Ayagin Gram-negatif bakteriler ile bir inoculum ≤5 × 108 CFUs/fare öldürücü suşları ölümüne neden yeterli olur. Bu akciğerler16yerleştirilen malzemenin katıksız miktarı temel alan Patogenez şüpheli alaka öneririm çünkü ≤1 × 109 ' CFUs/fare ölümcül olan soy kullanmamayı tavsiye edilir.
Diğerlerine göre bazı oropharyngeal aspirasyon pnömoni modeli için çok az teknik sorunlar ve tekrarlanabilirlik büyüktür. Yüzey gerilimi 50 µL inoculum çevresinde mastoidi yerleştirildiğinde modeli sonuçlar tek bir küçük komplikasyonu aspirasyon-nedeni enfeksiyon iyileştirmelerden nazal solunum için sağlar. Bu durumda, sadece siklikla forseps ile pinching yansımalı aspirasyon ağız ve inoculum sonraki soluma yoluyla zatürreeye ikna etmek için zorlar. Bu, ancak, en az uygulama ile kolayca kaçınılması teknisyen tarafından teknik bir hata.
İnsan hastalık ilgisi olması açısından, hastalığın ilerlemesini hız bu model, gram-negatif bakteri enfeksiyonları, diğer modelleri gibi bir kısıtlamasıdır. İnsanlar nadiren fareler hastalık o kadar hızlı ilerleme neden olan bakteriyel bir süspansiyon, büyük bir bolus ile bulaşmış. Yine de, tüm FDA tarafından onaylanmış tedaviler böyle translasyonel araştırma gösterimleri insanlarda klinik çalışmalarda geçmeden tedavi potansiyellerini değerlendirmek için hayvan modellerinde tabi. Netlik üzerinde tedavi edici etkinliği kısa bir süre içinde-ebilmek sağlamak o ironik olarak, model hız da çekici bir özelliği olduğu.
Fare bir model mükemmel, ama bu yeteneği sadakatle rota enfeksiyon ve insan hastalıkları patogenezinde taklit ve böylece roman terapiler hızlı çeviri için izin veren potansiyel therapeutics etkinliğini değerlendirmek için bir modeldir Bu klinikte umutsuzca ihtiyaç vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Bu eser Ulusal Enstitüsü, alerji ve enfeksiyon hastalıkları Ulusal Sağlık Enstitüleri [Grant numaraları R01 AI117211, R01 AI130060, R21 AI127954 ve R42 AI106375 BS için] ve ABD Gıda ve İlaç İdaresi [sözleşme tarafından desteklenmiştir HHSF223201710199C BML için].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | BD | 214530 | Combine with TSB to make TSA |
| Beads, Borosilicate Glass | Kimble | 135003 | Sterilize by baking or autoclaving before each use |
| Beaker, 250 mL | Pyrex | 1003 | Used during precise aliquoting of concentrated bacterial inocula |
| Centrifuge | Sorvall | ST 40R | Capable of 4,000×g at 4°C |
| Chamber for Anesthesia | Kent Scientific Corporation | VetFlo-0720 | Accommodates up to 5 mice |
| Cryomold, Intermediate Size | Sakura Tissue-Tek | 4566 | Disposable vinyl specimen molds, 15×15×5 mm |
| Dental Floss | Oral-B | 37000469537 | Tie to stable post approx. 6" above table height |
| Forceps | VWR | 82027-440 | Used to gently pull tongue out of mouse's mouth |
| Homogenizer for Lung Tissue | Omni International | TM125-115 | Autoclave before first use; rinse between samples |
| Isoflurane for Anesthesia | Abbott | 10015516 | Alternative drug can be used; modify procedure accordingly |
| iSTAT Cartridge | Abbott | 03P79-25 | Various cartridges are available to suit your needs |
| Ketamine, 100 mg/mL | Western Medical Supply | 4165 | Dilute 1:10 in PBS to 1 mg/mL and combine with Xylazine at 1 mg/mL |
| Ointment for Eyes | Akorn | Tears Renewed | Avoid touching eye with tip of dispenser |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | Used to freeze lung samples at -80 °C to prepare for pathology sectioning |
| Petri Dish | VWR | 25384-302 | Polystyrene, disposable, sterilized, 100×15 mm |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CM | Dulbecco's PBS without calcium and magnesium |
| Pipette Tips, 200-μL | VWR | 10017-044 | Autoclave before use |
| Pipetter, 200-μL | Gilson | Pipetman P200 | Autoclave and calibrate before use |
| Spreader, Bacterial Cell | Bel-Art | F377360006 | Sterilize by baking or autoclaving before each use |
| Stir Bar, Magnetic, 7.9 mm Diameter × 38.1 mm Length | VWR | 58948-150 | Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting |
| Stir Plate, Magnetic | Corning | PC-620D | Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | BD | 211822 | Combine with Agar to make TSA |
| Vial, Conical, Sterile, 50 mL | Corning | 431720 | Used for preparing bacterial inocula |
| Vial, Conical, Sterile, 500 mL | Corning | 431123 | Used to concentrate inocula for preparing frozen inocula |
| Vial, Cryogenic, 2.0 mL | Corning | 430659 | Used for cryogenic storage of concentrated bacterial inocula |
| Xylazine, 20 mg/mL | Akorn | AnaSed Injection | Dilute 1:20 in PBS to 1 mg/mL and combine with Ketamine at 1 mg/mL |
References
- Media Centre, W. H. O. World Health Organization. Fact Sheet - Top 10 Causes of Death. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/ (2017).
- Spellberg, B., Talbot, G. H. Recommended Design Features of Future Clinical Trials of Antibacterial Agents for Hospital-Acquired Bacterial Pneumonia and Ventilator-Associated Bacterial Pneumonia. Clinical Infectious Diseases. 51 (S1), S150-S170 (2010).
- Kalil, A. C., et al. Management of Adults With Hospital-acquired and Ventilator-associated Pneumonia: 2016 Clinical Practice Guidelines by the Infectious Diseases Society of America and the American Thoracic Society. Clinical Infectious Diseases. 63 (5), e61-e111 (2016).
- Medina, E.
- Azoulay-Dupuis, E., et al. In vivo efficacy of a new fluoroquinolone, sparfloxacin, against penicillin-susceptible and -resistant and multiresistant strains of Streptococcus pneumoniae in a mouse model of pneumonia. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (12), 2698-2703 (1992).
- Mizgerd, J. P., Skerrett, S. J.
- Rayamajhi, M., et al. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).
- Nielsen, T. B., Bruhn, K. W., Pantapalangkoor, P., Junus, J. L., Spellberg, B. Cryopreservation of virulent Acinetobacter baumannii to reduce variability of in vivo studies. BMC Microbiology. 15, 252 (2015).
- Trammell, R. A., Toth, L. A. Markers for predicting death as an outcome for mice used in infectious disease research. Comparative Medicine. 61 (6), 492-498 (2011).
- Bast, D. J., et al. Novel murine model of pneumococcal pneumonia: use of temperature as a measure of disease severity to compare the efficacies of moxifloxacin and levofloxacin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (9), 3343-3348 (2004).
- Hankenson, F. C., et al. Weight loss and reduced body temperature determine humane endpoints in a mouse model of ocular herpesvirus infection. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (3), 277-285 (2013).
- Adamson, T. W., Diaz-Arevalo, D., Gonzalez, T. M., Liu, X., Kalkum, M. Hypothermic endpoint for an intranasal invasive pulmonary aspergillosis mouse model. Comparative Medicine. 63 (6), 477-481 (2013).
- Nielsen, T. B., et al. Diabetes Exacerbates Infection via Hyperinflammation by Signaling through TLR4 and RAGE. mBio. 8 (4), (2017).
- Nielsen, T. B., et al. Monoclonal Antibody Protects Against Acinetobacter baumannii Infection by Enhancing Bacterial Clearance and Evading Sepsis. Journal of Infectious Diseases. 216 (4), 489-501 (2017).
- Cheng, B. L., et al. Evaluation of serotypes 5 and 8 capsular polysaccharides in protection against Staphylococcus aureus in murine models of infection. Human Vaccine Immunotherapy. 13 (7), 1609-1614 (2017).
- Wong, D., et al. Clinical and Pathophysiological Overview of Acinetobacter Infections: a Century of Challenges. Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).
