Summary
Qui, presentiamo un protocollo che utilizza la tintura JC-1 per valutare il potenziale di membrana mitocondriale delle cellule dopo l'esposizione all'ipossia/riossigenazione con o senza un agente protettivo.
Abstract
Tempestivo ed efficace riperfusione dell'arteria coronaria occlusa è la migliore strategia per ridurre la dimensione di infarto del miocardio in pazienti con un segmento ST elevato di infarto miocardico. Tuttavia, riperfusione di per sé può provocare ulteriore del cardiomyocyte, un fenomeno noto come lesione di riperfusione. L'apertura del poro di transizione di permeabilità mitocondriale (mPTP), con la diminuzione del potenziale di membrana mitocondriale (MMP), o la depolarizzazione mitocondriale, è universalmente riconosciuto come il passaggio finale di riperfusione ed è responsabile mitocondriale e morte dei cardiomiociti. JC-1 è una tintura cationica lipofilica che si accumula in mitocondri a seconda del valore di MMP. Più alto è il MMP, più JC-1 si accumula nei mitocondri. La quantità crescente di JC-1 in mitocondri può essere riflessa da uno spostamento di emissione di fluorescenza da verde (~ 530 nm) al rosso (~ 590 nm). Quindi, la riduzione del rapporto dell'intensità di fluorescenza rosso/verde può indicare la depolarizzazione dei mitocondri. Qui, prendiamo vantaggio di JC-1 per misurare MMP, o l'apertura di mPTP in miociti cardiaci umani dopo ipossia/riossigenazione, rilevato tramite flusso cytometry.
Introduction
Malattia coronarica è la principale causa di morte in tutto il mondo. Il trattamento della scelta per ridurre la lesione ischemica e limitando la dimensione di infarto in pazienti con ST-segmento elevato l'infarto miocardico è tempestiva ed efficace riperfusione miocardica via primaria intervento coronarico percutaneo (PCI)1, 2. Tuttavia, riperfusione determina danni aggiuntivi, che possono rappresentare fino al 30% della dimensione finale infarto3. È universalmente riconosciuto che il poro di transizione di permeabilità mitocondriale (mPTP) non è solo centrale nella morte delle cellule e danno mitocondriale durante ischemia/riperfusione (I / R), ma è anche un obiettivo convergente di cardioprotective segnalazione4 , 5. come l'apertura di mPTP porterebbe a depolarizzazione della membrana mitocondriale interna potenziali (MMP)4, abbiamo rilevato mPTP apertura utilizzando 5, 5 ', 6, 6 '-Tetrachloro-1, 1 ′, 3, 3 '-tetraetile-imidacarbocyanineiodide (JC-1) dosaggio.
L'analisi di JC-1 è un metodo di citofluorimetria che è sia qualitativa che quantitativa, e che è stato ulteriormente convalidato analizzando le MMP al livello di un singolo mitocondri6. JC-1 esiste come forma aggregata, producendo un colore rosso a emissione colorata arancione (590 nm ± 17,5) nella matrice dei mitocondri con MMP normale; con la perdita di MMP, JC-1 viene convertito in forma monomerica che produce fluorescenza verde con un'emissione di 530 ± 15 nm. Di conseguenza, una diminuzione nel rapporto di intensità della fluorescenza rosso/verde potrebbe indicare la riduzione delle MMP in condizioni quali l'ischemia/riperfusione (I / R).
Oltre a JC-1, MMP è stato anche studiato con membrana permeabile cationi lipofilici quali rodamina 123 e 3, 3 '-dihexyloxadicarbocyanine ioduro [DiOC6(3)]. Tuttavia, rispetto a queste due sonde, JC-1 è più affidabile per l'analisi di MMP. Rodamina 123 ha relativamente scarsa sensibilità (soprattutto in tempra modalità7,8) e scarsa specificità. Lo spostamento in rodamina 123 a volte è così piccolo che è difficile per i ricercatori o attrezzature osservare/rilevare. Inoltre, in una singola cella, ci sono siti di legame del mitocondrio differenti per rodamina 123 e così che esso può avere fluorescenza diverse emissioni9. DiOC6(3) non è raccomandato per la rilevazione di MMP o come reagisce in maniera sensibile per la depolarizzazione della membrana plasmatica10.
Pertanto, qui usiamo l'analisi di JC-1 per valutare il MMP di HCMs dopo essere stati esposti ad ipossia/riossigenazione con o senza un agente protettivo.
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Protocol
1. preparazione dei reagenti e soluzioni
- Preparare il supporto completo di miociti cardiaci umani (HCMs) aggiungendo 25 mL di miscela di supplemento del miocita crescita medio a 500 mL di Medium di crescita del miocita secondo le istruzioni del produttore. Conservare a 4 ° C e riscaldare a 37 ° C prima dell'uso.
- Preparare la soluzione di Tongxinluo (TXL) sciogliendo il polvere ultrafine TXL in privo di siero e glucosio di Dulbecco modificato medio dell'Aquila (DMEM) e regolare la concentrazione di TXL a 400 µ g/mL aggiungendo DMEM (per maggiori dettagli, cfr.11). Conservare a 4 ° C e riscaldare a 37 ° C prima dell'uso.
- Preparare 5 mL di soluzione di lavoro di JC-1 aggiungendo 25 µ l di soluzione madre (200x) JC-1, 4 mL di acqua ultrapura e 1 mL di brodo macchiatura buffer (5x) in una provetta da centrifuga da 15 mL al buio. Pipettare la miscela su e giù più volte e riscaldare a 37 ° C prima dell'uso.
- Preparare 30 mL di buffer di macchiatura di lavoro aggiungendo 24 mL di acqua ultrapura a 6 mL di brodo macchiatura buffer (5x) in una provetta da centrifuga 50 mL. Utilizzare questa soluzione ghiacciata.
2. istituzione di ipossia/riossigenazione modello
- Piastra 1.0 x 105 cellule per pozzetto con HCM completano medio in un piatto ben 6. Crescere fino a raggiungere una confluenza di circa il 70% in un'incubatrice di cellulare contenente 5% CO2% e 95% aria a 37 ° C.
- HCMs lavare con soluzione salina tampone fosfato (PBS). Esporli a diversi trattamenti (400 µ g/mL TXL o non) in 2 mL di siero/glucosio-liberi DMEM per 30 min prima di ipossia in un'incubatrice di cellulare contenente 5% CO2% e 95% aria a 37 ° C.
- Incubare HCMs in un vaso ermetico e hypoxic (2,5 L) dotati di catalizzatore per consuma ossigeno libero ed indurre ipossia per 18 h (Figura 1A) e un indicatore di anaerobiosi per misurare la tensione di ossigeno nella media11,12, 13, in un'incubatrice di cellulare contenente 5% CO2% e 95% aria a 37 ° C.
Nota: Ci vogliono circa 1,5 h per il catalizzatore alla consuma ossigeno libero nel vaso. Pertanto, la HCMs sono conservati in vaso per 19,5 h prima che venga aperto il vaso. Il colore dell'indicatore di anaerobiosi cambia da luce blu in condizioni di normossia ambiente a bianco pallido in condizioni di ipossia (Figura 1B). - Riossigenare HCMs spostando la piastra ben 6 in un incubatore a 37 ° C, contenente 5% CO2% e 95% aria per 2 h.
3. preparazione di HCMs per citometria a flusso
- Riscaldare la soluzione di 0,25% tripsina-Etilendiamminotetraacetico acido (EDTA) e PBS a 37 ° C.
- Aspirare il mezzo da ogni pozzetto, lavare le cellule con 1 mL di PBS e aggiungere 0,5 mL di tripsina 0,25% lungo la parete del pozzo.
- Incubare a 37 ° C fino a quando tutti i HCMs sono quasi staccati (1 minuto circa).
- Aggiungere 1 mL di terreno completo DMEM (medium DMEM con 10% siero bovino fetale) ai pozzetti per neutralizzare la tripsina. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL e pellet HCMs mediante centrifugazione a 500 x g per 3 min a temperatura ambiente.
- Aspirare accuratamente il sopranatante senza disturbare il pellet.
- Aggiungere 0,5 mL di terreno completo HCM e 0,5 mL di soluzione di lavoro di JC-1 in ogni provetta. Risospendere il HCMs pipettando su e giù.
- Coprire le provette intere con carta stagnola per evitare che lo sbiancamento dell'indicatore fluorescente e incubare HCMs in condizioni normali (a 37 ° C contenente 5% CO2% e 95% aria) per 20 min.
- Pellet HCMs mediante centrifugazione a 500 x g per 3 min a 4 ° C.
- Sciacquare HCMs due volte con 2 mL di buffer di macchiatura JC-1 ghiacciata.
- Risospendere HCMs in un volume finale di 300 µ l di tampone ghiacciata colorazione nella provetta del campione (12 x 75 mm) e utilizzare le cellule per l'analisi entro 30 min.
Nota: Utilizzare Carbonil cianuro m-clorofenil idrazone (CCCP), un inibitore potente della catena respiratoria trasporto dell'elettrone, per il trattamento di HCMs per 1 h a una concentrazione di 20 µM, per il controllo positivo.
4. flusso Cytometer Setup
- Avviare il citometro a flusso e assicurarsi che il software sia collegato ad esso.
- Eseguire fluidica avvio, avviare il flusso e impostare il breakoff.
- Aprire due finestre di trama del puntino del software di citometria a flusso.
- Selezionare Avanti sparsi luce (FSC) sull'asse X e luce laterale sparsi (SSC) sull'asse Y nella prima trama dot per rappresentare le caratteristiche delle cellule nelle loro dimensioni e loro granularità, rispettivamente.
- Selezionare il canale di rilevamento (575 nm ± 26) PE per l'asse Y e FITC (530 ± 30 nm) per l'asse X utilizzando una scala logaritmica nella seconda trama dot, che viene utilizzata per misurare l'intensità di fluorescenza della tintura JC-1 nelle cellule.
5. flusso Cytometry misurazione e analisi dei dati
- Fare clic su Scarica per far fuori il tubo di supporto braccio e posizionare il vuoto (HCMs che non sono stati tinti con JC-1) del campione di tubo su di esso. Fare clic su carico per tornare il braccio di supporto del tubo alla posizione di lavoro.
- Fare clic su Record per raccogliere le particelle da sospensione nella provetta del campione in bianco e poi cancello la popolazione delle cellule (P1) per ulteriori analisi nel primo appezzamento di dot (Figura 3).
- Raccogliere HCMs in altre provette e ottimizzare la misurazione regolando le tensioni dei canali di fluorescenza, per assicurarsi che il punto di cella si trova nella zona centrale della trama del seconda punto.
- Visualizzare le statistiche di ogni provetta e MMP di ogni campione viene calcolato dividendo il rapporto di intensità di fluorescenza rossa da quella di intensità di fluorescenza verde.
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Representative Results
Prima di eseguire il test di JC-1 per valutare i cambiamenti di MMP, si consiglia vivamente che gli esperimenti condotti per confermare le condizioni correttamente impostato dai ricercatori. Come dimostrano i risultati di citometria a flusso (Figura 2), rispetto al gruppo normale, ipossia/riossigenazione (H/R) significativamente indotta l'apoptosi di HCMs (Annessina V + /PI±), che indica che avevamo stabilito un modello basato su cellule di I / R (± 45.00 2.13% vs. 11.50 ± 0,18% nel gruppo normale, p < 0,05). Tongxinluo, una medicina tradizionale cinese con effetti cardioprotective, ha impedito l'apoptosi di HCMs in condizione di H/R (24.50 ± 1,13% vs 45,00 ± 2.13% nel gruppo H/R, p < 0,05).
CCCP è un protonophore che possa inibire la fosforilazione ossidativa nei mitocondri di disgiungere la pendenza del protone (perdita di MMP) stabilita nel corso della normale attività di trasportatori di elettroni nella catena di trasporto degli elettroni. Di conseguenza, HCMs trattati con CCCP è stato impostato come controllo positivo. Come illustrato nella Figura 4, il rapporto di rosso/verde nel gruppo trattato con CCCP era quasi pari a zero. Coerente con i risultati del dosaggio di apoptosi, il gruppo H/R-trattati visualizzato un rapporto di rosso/verde significativamente più basso rispetto al gruppo normale (0,69 ± 0,07 vs 5,64 ± 0.21 nel gruppo normale, p < 0,05) e Tongxinluo invertito tale indice modificare (2,92 ± 0,22 vs 0,69 ± 0,07 nel gruppo H/R, p< 0,05).
Figura 1. Istituzione di modello di ipossia/riossigenazione (H/R). A. materiali necessari per stabilire il modello di H/R; B. conferma dell'ambiente ipossico nel vaso. Il colore dell'indicatore di anaerobiosi cambia da luce blu in condizioni di normossia ambiente a bianco pallido in condizioni di ipossia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Convalida dell'istituzione del modello di ipossia/riossigenazione (H/R) tramite flusso cytometry. Rispetto al gruppo normale, il tasso apoptotico dei miociti cardiaci umani era significativamente più alto nel gruppo H/R, mentre Tongxinluo invertito questo cambiamento (*p < 0.05 vs normale; # p < 0.05 vs H/R; n = 3)11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Gating popolazione cellulare (P1, rosso) in SSC contro FSC dot plot per ulteriore analisi. L'integrità della popolazione cellulare è valutata usando side scatter (SSC) e forward scatter (FSC). Detriti cellulari (fuori dalla porta P1, nero), che hanno ridotto light scattering, sono esclusi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Valutazione del potenziale in miociti cardiaci umani della membrana mitocondriale. Rispetto al gruppo normale, il gruppo H/R visualizzato un rapporto significativamente più basso di rosso/verde, mentre Tongxinluo invertito questa tendenza (rosso: cellule senza fluorescenza; Celle blu, con fluorescenza rossa; Viola, cellule con fluorescenza verde. Controllo negativo, vuoto e senza colorazione; Controllo positivo, cellule trattate con CCCP; p < 0.05 vs normale; n #p < 0.05 vs H/R; n = 3)11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui, presentiamo un protocollo che utilizza la tintura JC-1 per valutare il MMP delle cellule dopo essere stati esposti per H/R. rilevato dall'analisi di JC-1, MMP delle cellule è indipendente da fattori quali dimensione mitocondriale, forma e densità che possono influenzare la fluorescenza di singolo-componente segnali di14. Di conseguenza, i risultati dell'analisi di JC-1 sono relativamente affidabili. Inoltre, è conveniente e risparmio di tempo per eseguire l'analisi di JC-1. Questo test ha un requisito basso per materiali e reagenti, ed in generale, ci vuole meno di 1,5 h da fare la colorazione, da distacco cellulare alla misura di MMP.
A pochi passi di critici non possono essere sopravvalutati quando si esegue l'analisi di JC-1 se i ricercatori vogliono ottenere risultati affidabili e soddisfacenti. Prima di tutto, le cellule caricate con JC-1 dovrebbero essere memorizzate in ghiacciata colorazione buffer fino a quando essi sono stati raccolti dal citometro a flusso. La temperatura ha un effetto notevole sulla stabilità delle MMP e il valore di un campione varia molto dopo un breve tempo a temperatura ambiente. Inoltre, esperimenti preliminari sono raccomandati per determinare il tempo e la concentrazione di CCCP, pretrattando assicurando che il rapporto di rosso/verde del controllo positivo è ~ 0. È interessante nota che Carbonil cianuro 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), che può anche eliminare MMP e inibire la fosforilazione ossidativa, è un'alternativa ai CCCP e può anche essere utilizzato per impostare il controllo positivo10.
Il saggio di JC-1 ha una limitazione importante, in quanto altri fluorocromi non è cumulabile con JC-1, per la sua fluorescenza emissione estende il verde, il giallo e la parte delle lunghezze d'onda rosse dello spettro. Inoltre, analisi JC-1 deve essere combinato con uno o più metodi, ad esempio utilizzando calceina-acetoxymethylester15,16 o manipolazione genetica anche17,18, per determinare se l'apertura di mPTP è responsabile la diminuzione di MMP. Infatti, l'apertura di altri pori mitocondriali come il19,di canali ATP sensibili di K+ 20 può anche portare alla depolarizzazione dei mitocondri.
L'analisi di JC-1 è più adatto a più grossolana "sì/no" valutazioni con l'obiettivo di valutare se i mitocondri sono in gran parte polarizzata (ad es., apoptosis-relativi esperimenti)8. Inoltre è stato applicato per misurare MMP in una varietà di tipi cellulari diversi da cardiomiociti, tra cui neuroni21, epatociti22, cellule renali23 e mitocondri isolati anche24. In breve, descriviamo un metodo rapido, semplice e sensibile per la rilevazione di MMP in HCMs dopo H/R.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni da The National Key Research e programma di sviluppo della Cina (n. 2017YFC1700503), il programma nazionale di ricerca base (973 programma) della Cina (No.2012CB518602), National Natural Science Foundation of China (No. 81370223 e no. 81573957) e la Fondazione di ricerca innovativa degli specializzandi del Peking Union Medical College (2016-1002-01-02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Beyodtime, China | C2006 | In the kit there are JC-1 stock solution (200×), stock staining buffer (5×) and CCCP(10mM) |
| Tongxinluo ultrafine powder | Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China | 071201 | |
| Annexin V-FITC/PI Kit | Becton-Dickinson, USA | 556547 | |
| DMEM | Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA | 11966-025 | |
| Human cardiac myocyte | Promocell, Germany | C-12810 | |
| Myocyte Growth Medium (SupplementMix) |
Promocell, Germany | C-39275 | |
| Myocyte Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell, Germany | C-22070 | used with Myocyte Growth Medium SupplementMix |
| GENbox | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96127 | 2.5L |
| Catalyst (AnaeroPack) | MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC. , Japan | C-1 | |
| Anaerobic indicator | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96118 | |
| Flow cytometer | Becton-Dickinson, USA | FACSAria 2 | |
| BD FACSDiva Software | Becton-Dickinson, USA | Version8.0.1 | |
| Sample tube | Corning science, USA | 352054 | 12*75mm |
| PBS | Hyclone, USA | SH30256.01 |
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