Summary
Aquí, presentamos un protocolo que utiliza tinte JC-1 para evaluar el potencial de membrana mitocondrial de las células después de ser expuestos a hipoxia/reoxygenation con o sin un agente protector.
Abstract
Oportuna y eficiente la reperfusión de la arteria coronaria ocluida es la mejor estrategia para disminuir el tamaño del infarto miocardio en pacientes con un segmento ST elevado de infarto de miocardio. Sin embargo, la reperfusión por sí puede provocar más muerte de cardiomiocitos, un fenómeno conocido como lesión de la reperfusión. La apertura del poro de transición de la permeabilidad mitocondrial (mPTP), con la disminución del potencial de membrana mitocondrial (MMP), o la despolarización mitocondrial, es reconocida universalmente como el paso final de daño por reperfusión y es responsable de mitocondrial y de la muerte de los cardiomiocitos. JC-1 es un colorante catiónico lipofílico que se acumula en las mitocondrias dependiendo del valor de MMP. Cuanto más alto es el MMP, más JC-1 se acumula en la mitocondria. Las crecientes cantidades de JC-1 en la mitocondria pueden ser reflejadas por un cambio de emisión de fluorescencia verde (~ 530 nm) a rojo (~ 590 nm). Por lo tanto, la reducción de la relación de intensidad de fluorescencia roja/verde puede indicar la despolarización de las mitocondrias. Aquí, tomamos ventaja de JC-1 para medir la MMP o la apertura del mPTP en miocitos cardiacos humanos después de la hipoxia/reoxygenation, detectado mediante citometría de flujo.
Introduction
Enfermedad coronaria es la principal causa de muerte en todo el mundo. El tratamiento de elección para reducir lesión isquémica y limitar el tamaño del infarto en pacientes con segmento ST elevan de infarto de miocardio es oportuna y eficaz la reperfusión miocárdica mediante intervención coronaria percutánea (ICP) primaria1, 2. Sin embargo, la reperfusión causa daño adicional, que puede suponer hasta un 30% del tamaño final del infarto3. Se reconoce universalmente que el poro de transición de permeabilidad mitocondrial (mPTP) no es sólo central en mitocondrial daño y muerte celular durante la isquemia/reperfusión (me / R), pero es también un objetivo convergente de cardioprotectores señalización4 , 5. como la apertura del mPTP traería sobre la despolarización de la membrana mitocondrial interna potencial (MMP)4, detectamos la apertura del mPTP usando el 5, 5, 6, 6 '-Tetrachloro-1, 1, 3, 3′-Tetraetil-imidacarbocyanineiodide (JC-1) ensayo.
El ensayo de JC-1 es un método cytofluorimetric que es cualitativa y cuantitativa, y ha sido validado mediante el análisis de la MMP en el nivel de una sola mitocondria6. JC-1 existe como un agregado, rindiendo un rojo a emisión color naranja (590 ± 17,5 nm) en la matriz de la mitocondria con MMP normal; con la pérdida de MMP, JC-1 se convierte en la forma monomérica que produce fluorescencia verde con una emisión de 530 nm ± 15. Por lo tanto, una disminución en el cociente de la intensidad de fluorescencia roja/verde podría indicar la reducción de MMP en condiciones como la isquemia/reperfusión (me / R).
Además de JC-1, MMP también se ha estudiado con membrana permeable cationes lipofílicos como rodamina 123 y 3, 3′ dihexyloxadicarbocyanine yoduro [DiOC6(3)]. Sin embargo, en comparación con estas dos sondas, JC-1 es más confiable para el análisis de MMP. Rodamina 123 tiene sensibilidad relativamente pobre (especialmente en modo7,8de amortiguamiento) y la pobre especificidad. El cambio en rodamina 123 a veces es tan pequeño que es difícil para los investigadores o equipos para observar/detectar. Además, en una sola célula, existen sitios de Unión diferentes mitocondrias de rodamina 123 y así ello tenga fluorescencia diferentes emisiones9. DiOC6(3) no se recomienda para la detección de MMP o como reacciona sensiblemente a la despolarización de la membrana plasmática10.
Por lo tanto, aquí utilizamos el JC-1 ensayo para evaluar la MMP de HCMs después de ser expuestos a hipoxia/reoxygenation con o sin un agente protector.
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Protocol
1. preparación de reactivos y soluciones
- Preparar el medio completo de miocitos cardiacos humanos (HCMs) añadiendo 25 mL de mezcla de suplemento del medio de crecimiento del miocito a 500 mL de medio de crecimiento del miocito según las instrucciones del fabricante. Almacenar a 4 ° C y caliente a 37 ° C antes de usar.
- Preparar solución de Tongxinluo (TXL) disolviendo polvo ultrafino TXL en suero glucosa-libre de Dulbecco modificado medio de águila (DMEM) y ajustar la concentración de TXL a 400 μg/mL mediante la adición de DMEM (para más detalles, véase11). Almacenar a 4 ° C y caliente a 37 ° C antes de usar.
- Preparar 5 mL de solución de trabajo de JC-1 añadiendo 25 μl de la solución madre (200 x) JC-1, 4 mL de agua ultrapura y 1 mL de caldo coloración buffer (x 5) en un tubo de centrífuga de 15 mL en la oscuridad. Pipetear la mezcla arriba y abajo varias veces y caliente a 37 ° C antes de usar.
- Prepare 30 mL de tampón de tinción de trabajo agregando 24 mL de agua ultrapura a 6 mL de stock buffer (x 5) en un tubo de centrífuga de 50 mL de tinción. Utilice esta solución helada.
2. establecimiento del modelo de hipoxia/Reoxygenation
- Células por pozo con medio completo de HCM en una placa de la pozo 6 en placa de 1.0 x 105 . Crecer para llegar a una confluencia de 70% en un incubador de células que contiene 5% CO2 y 95% aire a 37 ° C.
- HCMs lavar con solución salina buffer fosfato (PBS). Exponerlos a diferentes tratamientos (400 μg/mL TXL o no) en 2 mL de suero glucosa-libre DMEM 30 min antes de la hipoxia en un incubador de células que contiene 5% CO2 y 95% aire a 37 ° C.
- Incubar adoptadas en un tarro hermético e hipóxico (2.5 L) equipado con un catalizador para buscar oxígeno libre e inducir hipoxia por 18 h (figura 1A) y un indicador anaerobio para medir la tensión de oxígeno en el medio11,12, 13, en un incubador de células que contiene 5% CO2 y 95% aire a 37 ° C.
Nota: Tarda aproximadamente 1,5 horas para el catalizador de barrido de oxígeno libre en la jarra. Por lo tanto, el HCMs se mantienen en la jarra de 19,5 h antes de abrir el frasco. El color del indicador de anaerobios cambia de azul claro en medio ambiente normoxic a blanca palidez en condición hipóxica (figura 1B). - Reoxygenate adoptadas mediante el movimiento de la placa de la pozo 6 en una incubadora a 37 ° C con 5% CO2 y 95% aire durante 2 h.
3. preparación de HCMs para citometría de flujo
- Calentar la solución de ácido (EDTA) 0.25% tripsina-etilendiaminotetracético y PBS a 37 ° C.
- Aspirar el medio de cada pozo, lavar las células con 1 mL de PBS y añadir 0,5 mL de tripsina 0.25% a lo largo de la pared del pozo.
- Incubar a 37 ° C hasta que todas adoptadas son casi independiente (1 min.).
- Añadir 1 mL de medio completo DMEM (medio DMEM con 10% suero bovino fetal) en los pocillos para neutralizar la tripsina. Transferir la suspensión de células a un tubo de centrífuga de 15 mL y pelotilla adoptadas por centrifugación a 500 x g durante 3 min a temperatura ambiente.
- Cuidadosamente aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet.
- Agregar 0,5 mL de medio completo de HCM y 0,5 mL de solución de trabajo de JC-1 para cada tubo. Resuspender las adoptadas mediante pipeteo arriba y abajo.
- Cubrir los tubos todo con papel de aluminio para evitar la decoloración del indicador fluorescente e incubar adoptadas en condiciones normales (a 37 ° C con 5% CO2 y 95% aire) durante 20 minutos.
- Pelotilla adoptadas por centrifugación a 500 x g durante 3 min a 4 ° C.
- Enjuague adoptadas dos veces con 2 mL de tampón de tinción de JC-1 helado.
- Suspender adoptadas en un volumen final de 300 μL de tampón de tinción helada en el tubo de ensayo (12 x 75 mm) y utilizar las células para su análisis dentro de 30 minutos.
Nota: Use carbonilo cianuro m-clorofenil hidrazona (CCCP), un potente inhibidor de la cadena de transporte de electrones respiratoria, para tratar adoptadas por 1 h a una concentración de 20 μm, para el control positivo.
4. configuración de citómetro de flujo de
- Inicie el citómetro de flujo y asegúrese de que el software está conectado a él.
- Realizar arranque fluídicas, comenzar la corriente y fijar el quiebre.
- Abrir dos ventanas de trama de punto en el software de citometría de flujo.
- Seleccione avance dispersa luz (FSC) en el eje X y lado dispersada (SSC) en el eje Y en la primera parcela de puntos para representar las características de las células en cuanto a su tamaño y su granularidad, respectivamente.
- Seleccione el canal de detección de PE (575 ± 26 nm) para el eje Y y FITC (530 ± 30 nm) para el eje X en escala logarítmica de la segunda trama de punto, que se utiliza para medir la intensidad de la fluorescencia del tinte de JC-1 en las células.
5. flujo Cytometry medición y análisis de datos
- Haga clic en descarga para que el tubo soporte brazo y colocar el espacio en blanco (adoptadas que no han sido teñidos con JC-1) muestra el tubo en él. Haga clic en carga para devolver el brazo de soporte del tubo a la posición de trabajo.
- Haga clic en registro para recoger las partículas en suspensión en el tubo de muestra en blanco y luego la población de la célula (P1) de la puerta para su posterior análisis en la primera parcela de punto (figura 3).
- Recoger adoptadas en otros tubos de muestras y optimizar la medición mediante el ajuste de los voltajes de los canales de fluorescencia, para asegurarse de que el punto de la célula se encuentra en la zona central de la segunda trama de punto.
- Mostrar las estadísticas de cada tubo de muestras y calcular la MMP de cada muestra dividiendo la relación de intensidad de fluorescencia roja de intensidad de fluorescencia verde.
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Representative Results
Antes de realizar el ensayo de JC-1 para evaluar los cambios de MMP, se recomienda encarecidamente que se realizaron experimentos confirmar las condiciones de éxito establecido por los investigadores. Como se muestra en los resultados de citometría de flujo (figura 2), en comparación con el grupo normal, hipoxia/reoxygenation (H/R) indujo significativamente la apoptosis de HCMs (anexina V + /PI±), indicando que habíamos establecido un modelo basado en la célula de I / R (45,00 ± 2,13% vs. 11.50 ± 0.18% en el grupo normal, p < 0.05). Tongxinluo, una medicina tradicional China con efectos cardioprotectores, prevenir la apoptosis de adoptadas en condiciones de H/R (24.50 ± 1.13% vs 45,00 ± 2,13% en el grupo H/R, p < 0.05).
CCCP es un protonophore que puede inhibir la fosforilación oxidativa en las mitocondrias por desacoplar el gradiente del protón (pérdida de MMP) durante la actividad normal de portadores de electrones en la cadena de transporte de electrones. En consecuencia, adoptadas con CCCP se estableció como control positivo. Como se muestra en la figura 4, la proporción de rojo y verde en el grupo tratado CCCP era casi cero. De acuerdo con los resultados de lo análisis de apoptosis, el grupo tratado con H/R muestra una menor proporción de rojo/verde comparada con el grupo normal (± 0.69 0.07 vs 5.64 ± 0.21 en el grupo normal, p < 0.05) y Tongxinluo invierte tal relación cambiar (2.92 ± 0.22 vs 0,69 ± 0.07 en el grupo H/R, p< 0.05).
Figura 1. Establecimiento de modelo de hipoxia/reoxygenation (H/R). A. materiales necesitan para establecer el modelo H/R; B. confirmación del ambiente hipóxico en la jarra. El color del indicador anaerobio cambia de azul claro en normoxic entorno al blanco pálido en condiciones hipóxicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Validación del establecimiento del modelo de hipoxia/reoxygenation (H/R) por el flujo cytometry. En comparación con el grupo normal, la tasa de apoptosis de miocitos cardiacos humanos fue significativamente mayor en el grupo H/R, mientras que el Tongxinluo revertir este cambio (*p < 0.05 vs Normal; # p < 0.05 vs H/R; n = 3)11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Población celular (P1, rojas) que bloquean en el CDC versus trama de puntos FSC para su posterior análisis. La integridad de la población celular se evaluó mediante dispersión lateral (SSC) y forward scatter (FSC). Restos celulares (fuera de la puerta P1, negro), que han reducido la luz dispersa, se excluyen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Evaluación de membrana mitocondrial en miocitos cardiacos humanos. Comparado con el grupo normal, el grupo H/R muestra una proporción significativamente menor de rojo/verde, mientras el Tongxinluo revirtió esta tendencia (rojo: células sin fluorescencia; Azules, células con fluorescencia roja; Púrpuras, células con fluorescencia verde. Control, en blanco y sin manchas; negativo Control positivo, las células tratadas con CCCP; p < 0.05 vs Normal; #p < 0.05 vs H/R; n = 3)11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí, presentamos un protocolo que utiliza tinte JC-1 para evaluar la MMP de células después de estar expuesto a H/R. detectado por análisis de JC-1, MMP de células es independiente de factores tales como tamaño mitocondrial, forma y densidad que puede influir en la fluorescencia del solo-componente señales de14. En consecuencia, los resultados del ensayo de JC-1 son relativamente confiables. Además, es conveniente y ahorro de tiempo para realizar el ensayo de JC-1. Este ensayo tiene un requisito bajo para materiales y reactivos, y por lo general, tarda menos de 1,5 h a hacer la tinción de la separación celular a medida de MMP.
A pocos pasos críticos no se puede exagerar cuando se realiza el ensayo de JC-1 si los investigadores desean obtener resultados fiables y satisfactorios. En primer lugar, las células cargadas de JC-1 deben almacenarse en tampón de tinción helada hasta que son recogidos por el citómetro de flujo. La temperatura tiene un efecto considerable en la estabilidad de MMP y el valor de una muestra varía mucho después de un breve tiempo en temperatura ambiente. Además, experimentos preliminares se recomiendan determinar el tiempo de tratamiento y concentración de CCCP, asegurándose de que la proporción de rojo y verde del control positivo es ~ 0. Es de destacar que carbonilo cianuro 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), que también puede eliminar MMP e inhiben la fosforilación oxidativa, es una alternativa a CCCP y también puede utilizarse para configurar el control positivo de10.
El análisis de JC-1 tiene una limitación importante en que no se pueden combinar otros fluorocromos con JC-1, para su fluorescencia emisión abarca la parte de las longitudes de onda rojos del espectro, verde y amarillo. Además, JC-1 ensayo debe combinarse con uno o más métodos, como el uso de calceína-acetoxymethylester15,16 o17,de manipulación genética incluso18, para determinar si es responsable de la apertura del mPTP la disminución de la MMP. Esto es debido a la apertura de otros poros mitocondriales como los canales de K sensibles a ATP+ 19,20 también puede conducir a la despolarización de las mitocondrias.
El ensayo de JC-1 es ideal para más gruesas "sí-no" evaluaciones con el fin de evaluar si las mitocondrias son en gran medida polarizaron (por ejemplo, experimentos relacionados con la apoptosis)8. También se ha aplicado para medir MMP en una variedad de tipos celulares distintos de cardiomiocitos, incluyendo neuronas21,22de hepatocitos, células renales23 y mitocondrias aisladas incluso24. En Resumen, se describe un método rápido, simple y sensible para la detección de MMP en adoptadas después de H/R.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por becas de la investigación clave nacional y programa de desarrollo de China (Nº 2017YFC1700503), el programa nacional de investigación básica (programa 973) de China (No.2012CB518602), la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (no. 81370223 y Nº 81573957) y la Fundación de investigación innovadora de los postgrados de Peking Union Medical College (2016-1002-01-02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Beyodtime, China | C2006 | In the kit there are JC-1 stock solution (200×), stock staining buffer (5×) and CCCP(10mM) |
| Tongxinluo ultrafine powder | Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China | 071201 | |
| Annexin V-FITC/PI Kit | Becton-Dickinson, USA | 556547 | |
| DMEM | Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA | 11966-025 | |
| Human cardiac myocyte | Promocell, Germany | C-12810 | |
| Myocyte Growth Medium (SupplementMix) |
Promocell, Germany | C-39275 | |
| Myocyte Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell, Germany | C-22070 | used with Myocyte Growth Medium SupplementMix |
| GENbox | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96127 | 2.5L |
| Catalyst (AnaeroPack) | MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC. , Japan | C-1 | |
| Anaerobic indicator | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96118 | |
| Flow cytometer | Becton-Dickinson, USA | FACSAria 2 | |
| BD FACSDiva Software | Becton-Dickinson, USA | Version8.0.1 | |
| Sample tube | Corning science, USA | 352054 | 12*75mm |
| PBS | Hyclone, USA | SH30256.01 |
References
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