Summary
דו ח זה מתאר שיטה מהירה ואמינה עבור אימות מטרות mRNA miRNAs הסלולר. משתמשת בשיטה biotinylated סינתטי מבוססת מגבר קדם חומצת גרעין נעול miRNA מחקה ללכידת המטרה mRNA. לאחר מכן, מצופים streptavidin beads מגנטי מועסקים הנפתח המטרה mRNA על כימות על ידי תגובת שרשרת של פולימראז qPCR.
Abstract
מיקרו Rna (miRNAs) הם סוג של RNAs noncoding קטן המווסתים ביטוי גנים הסלולר post-transcriptionally. איגוד MiRNAs לאזור 3' לא מתורגם (UTR) של יעד ה-mRNA לעכב תרגום חלבונים או במקרים מסוימים לגרום השפלה mRNA. הכריכה של miRNA 3' UTR המטרה ש-mrna מתווך על ידי רצף 2 – 8 זרעים נוקלאוטיד בקצה 5' של miRNA. בעוד תפקיד miRNAs כמו מולקולות התאית התקינה וותיקה, זיהוי של mRNAs המטרה עם רלוונטיות פונקציונלי נשאר אתגר. יש כבר מועסקים Bioinformatic כלים לחזות רצפים בטווח 3' UTR של mRNAs בתור מטרות פוטנציאליות עבור איגוד miRNA. כלים אלה יש גם מנוצל כדי לקבוע שימור כזה רצפים בין מינים קרובים אבולוציונית בניסיון לחזות את תפקיד פונקציונלי. אולם, שיטות אלה לעיתים קרובות להפיק תוצאות חיוביות שגויות, מוגבלות לחיזוי הקנוני האינטראקציה בין miRNA ל- mRNA. לכן, הטיפול. הניסיוני המודדים איגוד ישירה של miRNA למטרה mRNA שלו נחוצים ליצור אינטראקציה פונקציונלית. בדו ח זה, אנו מתארים שיטה רגיש עבור אימות באינטראקציה ישירה בין הסלולר miRNA של מיר-125b את 3' UTR של PARP-1 mRNA. אנו נרחיב על פרוטוקול שבו מחקה biotinylated סינתטי-miRNA היו transfected בתרבית של תאים, למתחם miRNA-mRNA הסלולר lysate היה משוך כלפי מטה עם מצופים streptavidin beads מגנטי. בסופו של דבר, המטרה ש-mrna של חומצות גרעין למטה הוציא מורכבים הייתה לכמת באמצעות אסטרטגיה מבוסס qPCR.
Introduction
מיקרו Rna (miRNAs) הם קטנים ללא קידוד RNAs המווסתים ביטוי חלבון1באופן שלילי. סימנים מקדימים של miRNA לשכון אשכולות דרך אזורים רבים של הגנום, בתדירות הגבוהה ביותר בתוך אזורים intergenic, אינטרונים של חלבונים גנים2,3. להן של miRNAs לערב שעתוק של פרי-miRNAs מ קידוד miRNA גנים4. פרי-miRNAs עוברים עיבוד סדרתי, תחילה בגרעין ואז בציטופלסמה כדי ליצור יחידה miRNAs בוגרת נטושים4,5. לאחר מכן, בוגרת miRNAs משולבים המתחם שתיקה RNA-induced (RISC): קומפלקס חלבונים-RNA multimeric הכולל חבר של משפחת Argonaute של חלבונים היעד זיהוי4,5, 6,7. בוגרת miRNAs ב- RISC מורכבות בעיקר לאגד 3' UTR של היעד mRNAs8,9,10 אבל יכול גם לאגד מדי פעם את הקוד ובאזור 5' UTR של mRNA10,11 . הכריכה של miRNA ל mRNA רצף תוצאות translational שתיקה12,13,14 וכמה תיקים mRNA הקשורה15. מאז miRNA יחיד יכול למקד mRNAs רבים, מולקולות אלה רגולטוריות מעורב כמעט בכל תהליך הסלולר, היו מעורבים שונים המחלה התנאים16,17,18.
ההבנה מפורט כיצד miRNAs להסדיר מסלולים סלולריים דורש זיהוי של mRNAs המטרה. פלטפורמות מרובות ביואינפורמטיקה זמינים לחזות miRNA:mRNA בשם אינטראקציות19,20. תחזיות אלה מסתמכים על ווטסון-קריק הבסיס זיווג מושלם בין 2-8 נוקלאוטיד זרע רצף miRNA רצף משלים בתוך ה mRNA היעד4,21. בנוסף, כלים אלה ליצור מבנה שניוני של דופלקס miRNA:mRNA, חישוב הפרמטרים התרמודינמית של אינטראקציה מולקולרית זו ולהראות שימור האתרים מחייב על פני מינים לשיפור פונקציונלי הרלוונטיות של המטרה חיזוי. למרבה הצער, כלים אלה יש גם המגבלה של חיזוי מטרות חיובי כוזב בקצב מאוד גבוה (~ 27 – 70%)15,22. והכי חשוב, פלטפורמות אלה סיליקו להיכשל לזהות את האינטראקציות קאנונית של miRNAs עם המטרות שלהם23. לכן, כזה הניתוחים חזוי משולבים לעתים קרובות עם שיטות נסיוניות כדי לאמת את המטרות באופן פונקציונלי.
גישות רבות פותחו לאימות השפעול האינטראקציה miRNA:mRNA. ניסויים גנטיים באמצעות miRNA מחקה, ספוגים, מעכבי שמשנות את רמות miRNAs בתא לספק רמזים על השפעתו הרגולציה על היעד גנים ביטוי24,25,26. בנוסף, כתב המבוסס על מבחני דרך שיתוף תרביות תאים של שיבוט המכיל 3' UTR האזור של mRNA, miRNA מחקה היעד או מעכבי לתוך תאים לספק הוכחה של פונקציית רגולציה של miRNAs26. בעוד ששיטות אלה חיוני ללמוד post-transcriptional בקרת גנים מאת miRNAs, תרביות תאים pleotropic ויעילות תופעות של שינויים ברמות miRNA הסלולר הן מגבלות הגדולות של אלה גישות גנטיות23, 26. לכן, שיטות ביוכימיות משלימים בדיקה האינטראקציה הישירה בין miRNA לבין המטרה שלו הם מועסקים כדי להבין טוב יותר את תפקוד miRNAs הסלולר.
אחת השיטות בשימוש נרחב כדי ללמוד את האינטראקציה הישירה בין miRNA לבין המטרה שלו היא immunoprecipitation של מורכבות RISC ואחריו את הגילוי של mRNA היעד בתוך מתחם27,28,29,30 . לאחרונה, שיטה משופרת של מלכודת RISC היה מנוצל גם לזהות מטרות miRNA; זה זוגות ייצוב של יעדים בתוך intermediates RISC-miRNA-mRNA בטהרה של mRNA מטרות. עם זאת, אלה methodsface האתגרים הכרוכים שאינם ספציפיים אינטראקציות בין חלבונים RNA ו- RNA-איגוד אשר מובדלים בדרך כלל על ידי תאים סלולריים31,32. בנוסף, מבחני אלה תלויות הנוכחות של חלבון AGO2 עבור immunoprecipitation של קומפלקס RISC33. בהתחשב בכך AGO2 אינה argonaute רק לתווך אינטראקציות miRNA:mRNA יעיל, אי-הכללה של אחרים argonautes עלול להוביל מוטה תוצאות34. לכן, אסטרטגיות אלטרנטיביות נדרשים ללמוד איגוד ישירה של miRNA ל mRNA.
בדו ח זה, אנו נרחיב על גישה חד-שלבית דורשים בדיקה האינטראקציה הישירה בין miRNA המטרה שלו mRNA. ראשית, 3' מחקה miRNA חומצת גרעין (מגבר קדם) של biotinylated נעול הם transfected בתרבית של תאים. לאחר מכן, miRNA:mRNA מתחם הסלולר lysate נתפס באמצעות beads מגנטי streptavidin מצופה. המטרה mRNA המאוגד שלו miRNA משלימים זה לכמת באמצעות qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תרביות תאים של miRNA 3'-biotinylated
הערה: בצע את השלבים הבאים בתוך תא סטרילי למינארי.
- זרע 4 x 105–5 x 105 HEK-293T תאים לכל טוב ב- 2 מ של השלם של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) [DMEM בתוספת 10% סרום עוברית שור (FBS) ו- 1 x עט-דלקת אנטיביוטיקה]. התרבות התאים בתוך אינקובטור להגדיר ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 בן לילה.
- למחרת, בדוק את הבריאות ואת דבקותה של התאים מצופה תחת מיקרוסקופ אור.
הערה: ודא כי התאים יש דבקה, השיגו מורפולוגיה המתאים לפני שתמשיך לשלב הבא. התאים HEK-293T הם בדרך כלל מוכן תרביות תאים 18 – 24 h פוסט ציפוי. - צינור microfuge mL 1.7 סטרילי, לדלל 75 picomoles של biotinylated miRNA ב µL 200 אמצעי חיוני מינימלי. להעביר את המיקס הזה עוד 1.7 מ ל microfuge שפופרת המכילה ליפוזום המבוססת על תקנים ריאגנט (8 µL טוב) מעורבבת עם µL 200 אמצעי חיוני מינימלי. לערבב היטב, אבל בעדינות, על-ידי pipetting, תקופת דגירה של 20 – 25 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לאפשר היווצרות מתחמי תרביות תאים.
- להסיר את המדיה הישנה מהצלחת 6 תרבות היטב על-ידי pipetting עדין, לחדש בכל טוב עם 1.6 מ ל שזה עתה הוכנו DMEM מלאה (ללא 1 x עט-דלקת אנטיביוטיקה).
- הוסף את מתחמי תרביות תאים (1.3) drop-wise תאים בצלחת 6-ובכן באמצעות פיפטה המכויל היטב. מערבולת את הצלחת בעדינות תוך הוספת את מתחמי כדי להבטיח התפלגות אחידה שלהם על פני הלוח.
הערה: שלב זה הוא קריטי מאוד להשגת יעילות גבוהה תקנים ואני חייב להתבצע עם טיפול וסבלנות. - התרבות התאים-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 לפחות 36 שעות.
2. הכנת Streptavidin מצופה Beads מגנטי – אני
- Resuspend beads מגנטי את streptavidin באופן יסודי על-ידי vortexing. להעביר 30 µL של חרוז השעיה (לכל דגימה) צינור ללא נוקלאז microfuge 2 מ"ל.
- מקם את הצינור המכיל את המתלים חרוז על הדוכן מפריד חרוז מגנטי ("מגנט" להלן) למשך 2 דקות. אחרי שתוודא כי החרוזים נמשכים לצד של הצינור בקשר עם המגנט, הסר בזהירות את תגובת שיקוע באמצעות של micropipette.
- להוסיף 100 µL חרוז שטיפת מאגר (10 מ מ טריס-Cl pH 7.5, 0.5 מ מ EDTA, 1 M NaCl) החרוזים. הסר את הצינור המגנט. מערבולת 15 s בטמפרטורת החדר לשטוף את החרוזים.
- למקם את שפופרת המכילה חרוזים על המגנט למשך 2 דקות, בזהירות להסיר, למחוק את תגובת שיקוע.
- חזור על שלבים 2.3 ו- 2.4 עבור סכום כולל של שלושה שוטף. לאחר השלב הסופי לשטוף, הסר את הצינור המגנט.
- להוסיף 100 µL של RNase פינוי פתרון (0.1 M NaOH, 0.05 M NaCl) את החרוזים, מערבבים היטב בעזרת vortexing 15 s, ואת דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דק למקם את שפופרת המכילה חרוזים על המגנט למשך 2 דקות, ו בזהירות להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע.
- חזור על שלב 2.6 עבור סכום כולל של שלוש פעמים.
- להוסיף החרוזים, מערבולת 15 s, חרוז resuspension פתרון (0.5 M NaCl), דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דק למקם את החרוזים resuspended על המגנט למשך 2 דקות, הסר בזהירות את תגובת שיקוע.
- להוסיף 200 µL חרוז חסימת פתרון (1 µg/µL BSA, µg 2/שמרים tRNA µL) החרוזים. מיקס על ידי עדינה vortexing 15 s בטמפרטורת החדר. דגירה ב 4 ° C עבור 16 h (לילה יתר) ב rotator שפופרת מרובה.
3. הכנת תא Lysates
- הקציר התאים transfected HEK-293T על ידי גירוד עדין באמצעות המגרד של תא סטרילי בתוך המנוע למינריות ולאחר מכן להעביר כל מדגם לתוך צינור microfuge mL 2 סטרילי.
- גלולה התאים שרוטים על ידי צנטריפוגה ב 1,500 x g עבור 5 דק Resuspend בגדר 1 x סטרילי PBS (פוספט מאגר מלוחים), pH 7.2. צנטריפוגה שוב ב x 1,500 גרם במשך 5 דקות כדי להשיג גלולה ללא מדיה שיורית. מיד מזנקת הצינור המכיל צניפה לתוך הקרח.
- הכנת מאגר פירוק התא שלם טרי (150 מ מ NaCl, 25 מ מ טריס-קלרנית, pH-7.5, 5 מ מ. DTT, 0.5% IGEPAL, Superase U/mL 60, 1 x מעכב פרוטאז).
הערה: מלאי של מאגר פירוק התא חסר IGEPAL Superase, פרוטאז קוקטייל מעכב ייתכן שהוכנה מראש ויש לאחסן בטמפרטורת החדר. הכן קבוצה חדשה של מאגר פירוק התא מלא על ידי הוספת את תוספי לעיל בריכוזים הסופי מומלץ למאגר פירוק התא מלאי ואחסון זה על קרח. - להוסיף µL 260 מאגר פירוק התא מלא קרח כל מדגם בצינור microfuge (קרי, כל שפופרת microfuge מכיל תאים שנקטפו באר אחת של צלחת 6-טוב), resuspend בגדר תא להשעיה הומוגנית על-ידי pipetting.
- Lyse התאים באמצעות שיטת ההקפאה-הפשרה: דגירה הצינורות ב-80 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות. לאחר מכן, מאפשרים לתאים להפשיר על קרח.
- Centrifuge התא שנוצר lysate ב x 16,000 g למשך 5 דקות ומפרידה benchtop בקירור להגדיר ב 4 º C.
- העברה התא lysate צינור microfuge mL 1.7 סטרילי על קרח. להתעלם בגדר.
הערה: הנפח הסופי של פינו lysate יהיה ~ 240-250 µL. - להוסיף 5 M NaCl שנוקה lysate ריכוז סופי של 1 מ' ולתחזק את הדוגמאות על קרח.
4. הכנת Beads מגנטי Streptavidin — II
- הכנת מאגר טרי שטיפת נפתחים מלאה (10 מ מ אשלגן כלורי, 1.5 mM MgCl2, 10 מ מ טריס-Cl pH 7.5, 5 מ מ DTT, 1 מ' NaCl, 0.5% IGEPAL, 60U/mL Superase ו- 1 x מעכב פרוטאז קוקטייל)
הערה: מלאי של מאגר נפתחים שטיפת חסר IGEPAL Superase, פרוטאז קוקטייל מעכב ייתכן שהוכנה מראש ויש לאחסן בטמפרטורת החדר. הכן קבוצה חדשה של מאגר פירוק התא מלא על ידי הוספת את תוספי לעיל בריכוזים הסופי מומלץ למאגר פירוק התא מלאי ואחסון זה על קרח. - מקם את שפופרת המכילה החרוזים מוכן (מתוך שלב 2.9) על המגנט עבור 2 דק בזהירות להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע.
- להוסיף 150 µL קר כקרח לשטיפת נפתחים מלא המאגר החרוזים. מערבולת 15 s דגירה בטמפרטורת החדר עבור המקום ס' 30 – 60 הצינורות על המגנט עבור 2 דק בזהירות להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע.
- חזור על שלב 4.3 עבור סכום כולל של 3 פעמים.
- Resuspend את החרוזים ב- 300 µL לשטיפת נפתחים מלא המאגר.
5. נפתחים של מתחמי mRNA-miRNA היעד
- העברת µL 300 של התא lysate (מתוך שלב 3.8) אל הצינור microfuge המכיל 300 µL של חרוזים (מתוך שלב 4.5).
- דגירה את התערובת על מיקסר nutating לשעה בטמפרטורת החדר.
- מניחים את הצינורית על המגנט עבור 5 דק בזהירות להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע.
- להוסיף µL 300 קר כקרח לשטיפת נפתחים מלא המאגר החרוזים. מערבולת 15 s בטמפרטורת החדר ובמקום הצינורית על המגנט עבור 5 דק בזהירות להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע.
- חזור על שלב 5.4 עוד פעמיים.
- Resuspend את החרוזים ב 100 µL של מים נטולי נוקלאז, דגירה על קרח.
6. סה כ החילוץ-RNA cDNA סינתזה, qPCR
- לחלץ RNA הכולל החרוזים resuspended (מתוך שלב 5.6) באמצעות שיטה המתאימה (ראה טבלה של חומרים). Resuspend את הרנ א הכולל שחולצו ב 25 µL של נוקלאז ללא מים. לקבוע את ריכוז ה-RNA ואת איכות שימוש ספקטרופוטומטרים (ספיגת-260/280). להכין מלאי עבודה של RNA-50 ng/µL.
- לבצע סינתזה cDNA, ב- triplicates, באמצעות 50 ng של RNA הכולל (מתוך שלב 6.1) באמצעות סינתזה של cDNA המתאים קיט (ראה טבלה של חומרים) באמצעות oligo dT תחל בנפח סופי של 20 µL (טבלה 1). לאחר מכן, טען המבחנות לתוך הכלי qPCR לבצע רכיבה תרמי בהתאם לתנאים המפורטים בטבלה מס ' 2.
-
לבצע qPCR CDNA (מתוך שלב 6.2) באמצעות SYBR Green כימיה (ראה טבלה של חומרים):
- ביצוע כל התגובות qPCR triplicates בצלחת התחתונה ברורה ובכן 96 בתנאים סטריליים.
- Aliquot µL 9 של תערובת התגובה מהמאסטר qPCR מערבבים (ראו טבלה 3) לבאר כל צלחת. לאחר מכן, להוסיף 1 µL של cDNA כדי בכל טוב כדי להשיג נפח סופי של µL 10. לאטום את הצלחת ה-PCR באמצעות PCR עמידים בחום-צלחת סילר לאיטום ולטעון לתוך הכלי qPCR
- לבצע רכיבה תרמי בהתאם לתנאים המפורטים בטבלה4.
- לנרמל את רמות הביטוי (Ct ערכים) של כל מדגם את רמות הביטוי של הפקד מקושקשות. השתמש בערכים אלה כדי לחשב הקיפול שינויים בביטוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MiRNAs לווסת תהליכים תאיים על-ידי איגוד אל היעד mRNAs. לכן, זיהוי מטרות mRNA הן מפתח כדי להבין את הפונקציה miRNA. כאן אנו נרחיב על שיטה לזיהוי mRNA היעד של miRNA הסלולר. פרוטוקול זה הוא ממאמרו של Wani. et al. 35 עם השינוי של ניצול biotinylated מחקה miRNA מבוססת מגבר קדם כדי הנפתח יעד ה-mRNA. השימוש oligonucleotide מבוססת מגבר קדם מחקה מגבירה את ייחודה של היעד מחייב עקב יציבות גבוהה יותר של הטבעת ריבוז שהשתנו ללא ההשפעות הרעילות36,37,38. אנחנו מועסקים בשיטה זו כדי להוריד את ה-mRNA PARP-1 כיעד של מיר miRNA סלולרי-125b. הרמה הגבוהה ביותר של מיר-125b ביטוי מזוהה ברקמת המוח המסדירה את תפקוד39,40. בניסיון לזהות את המטרות של מיר-125b תאים עצביים, לאחרונה דיווחנו שמיר-125b הזה מסדיר באופן שלילי PARP-1 ביטוי באמצעות קשירה 3' UTR של PARP-1 mRNA41.
טלסין (pulldown) של miRNA:mRNA מרוכב
השתמשנו HEK-293T תאים ללמוד את האינטראקציה בין מיר-125b ל- mRNA PARP-1, מאז תאים אלה נמצאים בשימוש נרחב סלולרים, ביוכימי, ולימודי ביולוגיה מולקולרית. תיאור סכמטי של פרוטוקול המשמש את המטרה mRNA מתואר באיור1. ראשית, HEK-293T תאים (4 x 105–5 x 105 תאים לכל טוב) היו נזרע לילה בצלחת תרביות רקמה 6-ובכן, מודגרות ב 37 ° C עם 5% CO2 עבור 18 – 24 שעות. לאחר מכן, picomoles 75 של 3'-biotinylated מיר-125b מחקה ופקדים 3'-biotinylated מעורבל היו transfected לתוך התאים בשיטה ליפוזום המבוסס על תרביות תאים. התאים transfected היו מתפשט-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עבור h 36 נוספים, שנקטפו. לאחר מכן הסלולר lysates של תאים transfected הוכנו על ידי שיטת פירוק ההקפאה-הפשרה. Lysates הסלולר הטרי היו מודגרות עם החרוזים מגנטי חסומים streptavidin מצופה על ספסל nutating העליון מערבל לשעה בטמפרטורת החדר. בעקבות זאת, החרוזים עובדו ועל שימוש שטוף טרי להכין מאגר נפתחים שטיפת קר כקרח במפריד מגנטי. לבסוף, החרוזים היו resuspended ב µL 100 של נוקלאז מים חינם לצורך ניתוח נוסף.
זיהוי של mRNA היעד ב- miRNA:mRNA נפתחים מרוכב
כדי לזהות את המטרה mRNA של מיר-125b מן התערובת נפתחים, אנחנו מועסקים qPCR assay (איור 1). תיכננו תחל ואחורה (FP ו- RP) במרחק ORF כדי להגביר mRNA PARP-1 (איור 2טבלה 5b). אנו גם עוצב תחל ערכות לזיהוי p53 mRNA, מטרה ידועה של מיר-125b42, כפקד חיובי וכללה תחל כדי להגביר אקטין mRNA כפקד שליליים שאינם ספציפיים. בנוסף, לאשר עוד יחודיות של הגברה, תיכננו תחל לגילוי 3' UTR האזורים של PARP-1, p53 אקטין. ביצענו qPCR בשיטות המתוארות בפרוטוקול (סעיף 6).
איור 3 מראה qPCR המבוסס על ההגברה של יעד ה-mRNA הוא ביחס של החרוזים מטוהרים פקדים מקושקשות. הרמה של mRNA PARP-1 היה גבוה במידה ניכרת בדגימות שלף-למטה עם biotinylated מיר-125b מחקה בהשוואה הפקדים מקושקשות. כצפוי, רמות גבוהות יותר של ה-mRNA של החיובי לשלוט p53 mRNA הגברה מינימלי של אקטין בקרה שלילית ש-mrna נצפתה בדגימות אלה. רמות דומות של הגברה התקבלו באמצעות תחל את המיקוד של 3' UTR PARP-1 ו- p53 בהשוואה של אקטין שליטה שלילי (איור 3B). QPCR התוצאות של האזורים ORF (איור 3 א), את 3' UTR אזורים (איור 3B) של mRNA PARP-1, p53 mRNA הראו רמות מסוימות של השתנות. מספר גורמים שונים, לרבות זיקה מחייבת, מספר אתרי קישור miRNA, ואת ההבדלים ברצף פריימר הגברה תלויים עשויים לתרום רמות משתנה של הגברה באיור3. ובכל זאת, נתונים אלה תומכים מאוד את כדאיות וספציפיות של השיטה עבור אימות מטרות mRNA miRNAs הסלולר.
איור 1: ייצוג סכמטי של הפרוטוקול עבור וזמינותו ללכידת המטרה באמצעות מחקה biotinylated-miRNA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: פריימר עיצוב עבור הגברה של mRNA מטרות. ייצוג סכמטי תחל להשתמש כדי לזהות את המטרה mRNA של מיר-125b. סט אחד של תחל (מוגדר אני) תוכנן בתוך אזור ORF של התרשימים והשני קבוצת תחל (להגדיר II) תוכננה באזור 3' UTR של גנים היעד. FP RP מייצגים תחל ואחורה עבור כל ערכה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: זיהוי המטרה מיר-125b מאת qPCR. רמות ה-mRNA (א) שימוש בערכת פריימר I, אשר מגביר את האזור ORF של יעד ה-mRNA. רמות גבוהות יותר של ביטוי של PARP-1 ו- p53 mRNA (בקרה חיובית) נצפו בהשוואה אקטין mRNA (בקרה שלילית). (B) הגברה של 3' UTR אזור היעד mRNA באמצעות פריימר להגדיר II. אין הגברה נצפתה אין תבנית פקדים (NTC). כל התגובות בוצעו ב- triplicates, הנתונים נותחו באמצעות התוכנה ניתוח הנתונים המתאים המבוסס על שיטה 2-ΔCt . קווי שגיאה מייצגים שגיאת התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| רכיב | מניות | נפח סופי עבור התגובה μL 20 |
| תבנית (RNA) | 50 ng/µL | 1.0 ΜL |
| התגובה מאגר | 5 x | 4.0 ΜL |
| Oligo dT פריימר | בסיס מניות | 2 ΜL |
| רוורס טרנסקריפטאז | בסיס מניות | 1 ΜL |
| מים מזוקקים ללא נוקלאז | - | 12 ΜL |
| התגובה סה כ נפח | 20 ΜL |
טבלה 1: cDNA סינתזה תערובת התגובה.
| 105 ° C = 30 s |
| 42 ° C = 60 דקות |
| 95 ° C = 5 דקות |
| 10 ° C = החזק |
טבלה 2: cDNA סינתזה תרמי תנאי הרכיבה.
| רכיב | מניות | נפח סופי עבור התגובה μL 10 |
| המוצר cDNA | - | 1.0 ΜL |
| iTaq מיקס SYBR אוניברסלי | 2 x | 5.0 ΜL |
| היעד (ORF/3 ' UTR) כלול | 10 ΜM | 0.5 ΜL |
| היעד (ORF/3 ' UTR) ר | 10 ΜM | 0.5 ΜL |
| מים מזוקקים ללא נוקלאז | - | 3 ΜL |
| התגובה סה כ נפח | 10 ΜL |
טבלה 3: qPCR תערובת התגובה.
| 95 ° C = 10 דקות |
| 30 מחזורי: |
| 95 ° C = 10 s |
| S C ° 56 = 30... |
| S 72 ° C = 30 |
| להמיס עקומת ניתוח |
| S C ° 65 = 31... |
| קצב הרמפה ליניארי = 0.5 ° C/s |
| רכישה = 0.5 ° C מרווחי |
טבלה 4: תנאי הרכיבה התרמי qPCR.
| (א): Biotinylated Oligos | ||
| Biotinlyated Oligos | מניות | רצף (5' ל 3') |
| יש-מיר-125b | 25 ΜM | UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA-ביוטין |
| שליטה מקושקשות | 25 ΜM | GAUGGCAUUCGAUCAGUUCUA-ביוטין |
| (ב) תחל | ||
| היעד פריימר (ORF) | מניות | רצף (5' ל 3') |
| PARP-1 (FP) | 100 ΜM | GAGGTGGATGGGTTCTCTGA |
| PARP-1 (RP) | 100 ΜM | ACACCCCTTGCACGTACTTC |
| p53 (FP) | 100 ΜM | TGTGACTTGCACGTACTCCC |
| p53 (RP) | 100 ΜM | ACCATCGCTATCTGAGCAGC |
| אקטין (FP) | 100 ΜM | GCTCGTCGTCGACAACGGCTC |
| אקטין (RP) | 100 ΜM | CAAACATGATCTGGGTCATCTT |
| (ג) תחל | ||
| פריימר היעד (3' UTR) | מניות | רצף (5' ל 3') |
| PARP-1 (FP) | 100 ΜM | ATTGGGAGAGGTAGCCGAGT |
| PARP-1 (RP) | 100 ΜM | CTACCCATCAGCAACTTAGCG |
| p53 (FP) | 100 ΜM | GGCCCATATCTGTGAAATGC |
| p53 (RP) | 100 ΜM | CTGCAGGAAGGCAGGTTTT |
טבלה 5: Oligonucleotide ושמות רצפים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זיהוי של מטרות mRNA של הסלולר miRNAs חשוב להבנת תפקידם רגולטוריות. מספר כלים חישוביים מועסקים לחזות המטרות בהתבסס על זרע רצף משלימים את החסר ועל שימור היעד-רצפים-19,-20. כלים אלה אמנם יקר, הם יכולים ליצור רמות גבוהות של תוצאות false חיוביות והן שליליות כוזבות. לכן, תחזיות אלה נמצאים יחד עם שיטות נסיוניות כגון immunoprecipitation של RISC מורכבים ולא נפתחים של miRNA:mRNA מורכבים כדי לאשר ישירה עקידת miRNAs שלהם מטרות בהתאמה27,31. זה פרטי דוח אסטרטגיית ניסיוני אשר מנצל biotinylated miRNA מחקה את הנפתח יעד ה-mRNA. ביוטין הנפתח יכול לשמש עבור זיהוי של מטרות miRNA עם רגישות גבוהה, שיעור נמוך של חיובי כוזב35,43. לכן, בשיטה זו ניתן גם לנצל לצורך זיהוי של מטרות miRNA מצמד המבוססת על רצף ההקרנה של הבריכה RNA שנתפסו. עם זאת, ישנן מספר מגבלות על שיטה זו44. ביטוי יתר miRNA אקסוגני יכול לשנות הרשת תעתיק של תאים, גרימת שינויים הסוגר ב- mRNA שאינם miRNA בהתאם לתקנה. אלה יכול להתגבר באמצעות כמויות נמוכות מאוד של מחקה כדי לא perturb miRNA אנדוגני רגולציה. כמו כן, הפקדים תקין נדרשים כאשר miRNAs מבוטאים exogenously כדי למנוע מחייב שאינם ספציפיים. שטיפת זהירות וחסימת צעדים יכול ביעילות למזער את רעשי הרקע ולהגדיל יחודיות של miRNA יישוב. מספר מחקרים הראו כי שינויים של miRNA 3' או 5' קצוות אינם נסבלת היטב45, אף על פי כן, מספר מחקרים ביעילות לשמש ביוטין מתויג מיר-מחקה כלי יעיל לחקור mRNA מטרות.
היתרון השני של שיטה זו הוא הניצול של מחקה miRNA מבוססת מגבר קדם (נעול חומצות גרעין). מגבר קדם חומצת גרעין השינוי מאפשר היווצרות דופלקסים oligonucleotides יציב עם זיקה גבוהה46,47. יתר על כן, מחקה miRNA מגבר קדם המותאם אישית biotinylated תוצרת מורכב והחינמית RNA. חוט miRNA 3'-biotinylated עם רצף לפי הביאור miRBase, חוט הנוסעים משלים miRNA זה מתחלק ב- RNA מגבר קדם-לאחרונה שני הגדילים47. RISC משלבת רק סטרנד miRNA בעוד הנוסע שני הגדילים הם השפיל במהירות ובכך שיפור ירידה לפרטים היעד. כדי להגביר את הביטחון של הממצאים שלנו, כללנו גם של p53 היעד מאומתים של מיר-125b בקרה חיובית ו β-אקטין, אשר אין אתר איגוד מיר-125b שלה mRNA כפקד שלילי. התוצאות המתקבלות בשיטה זו עם פקדים אלה (איור 3) מראים ירידה לפרטים ההזדהות mRNA היעד. למרות מגבר קדם miRNA מחקה לייצב מאוד טובה זיווג הבסיס של ווטסון-קריק, זה יצוין, כי השימוש של מגבר קדם מחקה miRNA עם תווית ביוטין יבטל תוצאות false חיוביות וגם שליליות. יתר על כן, סביר להניח כי הם עלולים לגרום אישור של תחזיות חישובית עשוי להיות לא רלוונטי מבחינה ביולוגית. מצד שני, אם שיטה זו זה משולב עם רצף לזהות מטרות ה-mRNA, שווא שליליות עלולות להופיע, כי מגבר קדם מחקה טובה בסיס הקנוני זיווג זה עשוי לכלול הבסיס קאנונית זיווג האינטראקציות המתרחשות עם miRNAs מקורית.
פרוטוקול המוצג כאן הוא ממאמרו של Wani ואח ', עם שינויים מספר35. כדי לצמצם עוד יותר את רעשי הרקע, יש לנו שולבו כביסה רב שלבים, ששינה את הפרמטרים עבור יעילות תרביות תאים, הכנת מאגר, דגירה, הנפתח תנאים ו PCR קירור והקפאה וניתוח. בנוסף, השתמשנו בשתי ערכות פריימר כדי להגביר את המטרה mRNA אחרי נפתחים, הגדר נועד להגביר ORF של אזור היעד mRNA, הסט השני של תחל כדי להגביר של אזור בתוך 3' UTR של היעד mRNA. ניצול של שתי קבוצות של תחל מגבירה את יחודיות עבור העשרת mRNA היעד.
יצוין, כי מגבלה של שיטה זו היא רמת הרעש העולה מקריאת שאינם ספציפיים מטרות הבזליים. שינויים ותיקונים נוספים כגון שיפורים החסימה, כביסה ותנאי הדגירה עשוי לספק היעד הם ברמת פירוט גבוהה ורגישות. לסיכום, וזמינותו שתוארו בדו ח זה הוא שיטה מהירה ואמינה, כי יכול להיות מאומץ כדי לאמת את מטרות mRNA miRNAs באמצעות PCR המבוססת על אסטרטגיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים אין אינטרסים מתחרים לא-כספיים ופיננסיים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה חלקית על ידי הלאומית המכונים לבריאות (NIH) DA037779 מענקים (כדי ג'יי פי), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960, MD007586 (על הדיסק). העבודה גם נתמך על ידי G12MD007586 גרנט RCMI, UL1RR024975 גרנט CTSA ונדרבילט, מרכז המחקר Translational Meharry (MeTRC) CTSA הענק (RR026140 U54 NCRR/NIH, את MD007593 גרנט U54 מ NIMHD/NIH, מרכז טנסי לאיידס מחקר (P30 AI110527).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell line- HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS) | GIBCO/Thermofisher | 10438-026 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | GIBCO/Thermofisher | 11995-065 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (1x) | GIBCO/Thermofisher | 20012-027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | GIBCO/Thermofisher | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin solution (100x) | Cellgro/Mediatech | 30-002-CI | |
| DNase | Ambion | AM2238 | |
| Opti-MEM Reduced serum media | GIBCO/Thermofisher | 3198-088 | |
| Liopfectamine 2000 Transfection reagent | Invitrogen/ Thermofisher | 11668-019 | |
| Biotinylated hsa-miR-125b | Exiqon | 339178/ID-27281622 | |
| Biotinylated scrambled control | Exiqon | 479997-671/ID-714884 | |
| IGEPAL | Sigma-Aldrich | 18896 | |
| Streptavidin Magnetic beads | Pierce | 88816 | |
| Yeast tRNA | Invitrogen/Thermofisher | 15401-011 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Potassium chloride (KCl) solution | Sigma-Aldrich | 60142 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) solution | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0 | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Superase | Ambion/Thermofisher | AM2694 | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| RNAse/DNAse free water | GIBCO/Thermofisher | 10977-015 | |
| RNeasy extraction kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript-Select cDNA synthesis kit | Biorad | 170-8897 | |
| qPCR Primers | Invitrogen/Thermofisher | ||
| iTaq-Universal SYBR green supermix | Biorad | 172-5120 | |
| DynaMag-Spin Magnet | Invitrogen/Thermofisher | 12320D |
References
- Behm-Ansmant, I., Rehwinkel, J., Izaurralde, E. MicroRNAs silence gene expression by repressing protein expression and/or by promoting mRNA decay. Cold Spring Harborsymposia on quantitative biology. 71, 523-530 (2006).
- Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome research. 14, 1902-1910 (2004).
- Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Meyer, J., Borkhardt, A., Tuschl, T. New microRNAs from mouse and human. RNA. 9, 175-179 (2003).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Lee, Y., Jeon, K., Lee, J. T., Kim, S., Kim, V. N. MicroRNA maturation: Stepwise processing and subcellular localization. The EMBO journal. 21, 4663-4670 (2002).
- Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131, 1097-1108 (2007).
- Perron, M. P., Provost, P. Protein interactions and complexes in human microRNA biogenesis and function. Frontiers in bioscience: A journal and virtual library. 13, 2537-2547 (2008).
- Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75, 843-854 (1993).
- Kloosterman, W. P., Wienholds, E., Ketting, R. F., Plasterk, R. H. Substrate requirements for let-7 function in the developing zebrafish embryo. Nucleic acids research. 32, 6284-6291 (2004).
- Lee, I., et al. New class of microRNA targets containing simultaneous 5'-UTR and 3'-UTR interaction sites. Genome research. 19, 1175-1183 (2009).
- Djuranovic, S., Nahvi, A., Green, R. miRNA-mediated gene silencing by translational repression followed by mRNA deadenylation and decay. Science. 336, 237-240 (2012).
- Iwakawa, H. O., Tomari, Y. The Functions of MicroRNAs: mRNA Decay and Translational Repression. Trends in cell biology. 25, 651-665 (2015).
- Wilczynska, A., Bushell, M. The complexity of miRNA-mediated repression. Cell deathand differentiation. 22, 22-33 (2015).
- Selbach, M., et al. Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs. Nature. 455, 58-63 (2008).
- Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
- Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
- Sayed, D., Abdellatif, M.
- Steinkraus, B. R., Toegel, M., Fulga, T. A. Tiny giants of gene regulation: Experimental strategies for microRNA functional studies. Wiley interdisciplinary reviews. Developmental biology. 5, 311-362 (2016).
- Watanabe, Y., Tomita, M., Kanai, A. Computational methods for microRNA target prediction. Methods in enzymology. , 65-86 (2007).
- Lewis, B. P., Shih, I. H., Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Burge, C. B.
- Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455, 64-71 (2008).
- Thomson, D. W., Bracken, C. P., Goodall, G. J. Experimental strategies for microRNA target identification. Nucleic acids research. 39, 6845-6853 (2011).
- Ebert, M. S., Neilson, J. R., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: Competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells. Nature. 4, 721-726 (2007).
- Elmen, J., et al. Antagonism of microRNA-122 in mice by systemically administered LNA-antimiR leads to up-regulation of a large set of predicted target mRNAs in the liver. Nucleic acids research. 36, 1153-1162 (2008).
- Jin, H. Y., et al. Transfection of microRNA mimics should be used with caution. Frontiersin genetics. 6, 340 (2015).
- Beitzinger, M., Peters, L., Zhu, J. Y., Kremmer, E., Meister, G. Identification of human microRNA targets from isolated argonaute protein complexes. RNA biology. 4, 76-84 (2007).
- Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps. Nature. 460, 479-486 (2009).
- Easow, G., Teleman, A. A., Cohen, S. M. Isolation of microRNA targets by miRNP immunopurification. RNA. 13, 1198-1204 (2007).
- Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141, 129-141 (2010).
- Cambronne, X. A., Shen, R., Auer, P. L., Goodman, R. H. Capturing microRNA targets using an RNA-induced silencing complex (RISC)-trap approach. Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America. , 20473-20478 (2012).
- Mili, S., Steitz, J. A. Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses. RNA. 10, 1692-1694 (2004).
- Meister, G., et al. Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs. Molecular cell. 15, 185-197 (2004).
- Su, H., Trombly, M. I., Chen, J., Wang, X. Essential and overlapping functions for mammalian Argonautes in microRNA silencing. Genes & development. 23, 304-317 (2009).
- Wani, S., Cloonan, N. Profiling direct mRNA-microRNA interactions using synthetic biotinylated microRNA-duplexes. bioRxiv. , (2014).
- Grunweller, A., Hartmann, R. K. Locked nucleic acid oligonucleotides: The next generation of antisense agents? BioDrugs: clinical immunotherapeutics,biopharmaceuticals and gene therapy. 21, 235-243 (2007).
- Guerard, M., et al. Locked nucleic acid (LNA): Based single-stranded oligonucleotides are not genotoxic. Environmental and molecular mutagenesis. 58, 112-121 (2017).
- Song, R., Ro, S., Yan, W. In situ hybridization detection of microRNAs. Methods inmolecular biology. , 287-294 (2010).
- Edbauer, D., et al. Regulation of synaptic structure and function by FMRP-associated microRNAs miR-125b and miR-132. Neuron. 65, 373-384 (2010).
- Le, M. T., et al. MicroRNA-125b promotes neuronal differentiation in human cells by repressing multiple targets. Molecular and cellular biology. 29, 5290-5305 (2009).
- Dash, S., et al. Poly (ADP-Ribose) Polymerase-1 (PARP-1) induction by cocaine is post-transcriptionally regulated by miR-125b. eNeuro. 4, (2017).
- Micheli, F., et al. Regulation of proapoptotic proteins Bak1 and p53 by miR-125b in an experimental model of Alzheimer's disease: Protective role of 17beta-estradiol. Neuroscience letters. 629, 234-240 (2016).
- Orom, U. A., Lund, A. H. Isolation of microRNA targets using biotinylated synthetic microRNAs. Methods. 43, 162-165 (2007).
- Cloonan, N. Re-thinking miRNA-mRNA interactions: Intertwining issues confound target discovery. BioEssays: News and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 37, 379-388 (2015).
- Guo, Y. E., Steitz, J. A. 3'-Biotin-tagged microRNA-27 does not associate with Argonaute proteins in cells. RNA. 20, 985-988 (2014).
- Mook, O., et al. In vivo efficacy and off-target effects of locked nucleic acid (LNA) and unlocked nucleic acid (UNA) modified siRNA and small internally segmented interfering RNA (sisiRNA) in mice bearing human tumor xenografts. Artificial DNA, PNA & XNA. 1, 36-44 (2010).
- Owczarzy, R., You, Y., Groth, C. L., Tataurov, A. V. Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes. Biochemistry. 50, 9352-9367 (2011).
