Summary
В настоящем докладе описывается быстрый и надежный метод для проверки мРНК-мишеней клеточных адаптивной. Метод использует Мирна Locked LNA нуклеиновой кислоты на основе синтетических биотинилированным имитирует захватить цель мРНК. Впоследствии, с покрытием стрептавидина магнитные бусы используются для выпадающих целевой мРНК для количественной ПЦР полимеразной цепной реакции.
Abstract
МикроРНК (интерферирующим) являются класс малых некодирующей РНК, которые post-transcriptionally регулировать экспрессию клеточных генов. Интерферирующим привязку к 3' непереведенные региона (утр) целевых мРНК ингибировать белков перевод или в некоторых случаях привести к деградации мРНК. Связывание Мирна с 3' УТР цели, которую мРНК при посредничестве 2 – 8 нуклеотидной последовательности семян к 5' концу Мирна. Хотя роль адаптивной как сотовой регуляторных молекул является хорошо организованной, идентификация целевого мРНК с функциональной значимости остается проблемой. Инструменты bioinformatic использовались для прогнозирования последовательностей в течение 3' УТР мРНК как потенциальных объектов для привязки Мирна. Эти средства использовались также определить эволюционной сохранения таких последовательностей среди родственных видов в попытке предсказать функциональную роль. Однако эти вычислительные методы часто создавать ложных положительных результатов и ограничиваются прогнозирования канонические взаимодействие между Мирна и мРНК. Таким образом экспериментальные методы, измеряющих прямую привязку Мирна mRNA цели необходимы для создания функционального взаимодействия. В настоящем докладе мы описываем чувствительный метод для проверки прямого взаимодействия между сотовой микроРНК miR-125b и 3' УТР ППА-1 мРНК. Мы разработать протокол, в котором синтетических биотинилированным miRNA имитирует были transfected в клетки млекопитающих и Мирна мРНК комплекс в lysate сотовых был потянул вниз с покрытием стрептавидина магнитные бусы. Наконец цель, которую мРНК в потянул вниз нуклеиновой кислоты комплекс был количественно с помощью стратегию на основе ПЦР.
Introduction
МикроРНК (интерферирующим) малы некодирующих РНК, которые негативно регулируют выражение протеина1. Предшественники микроРНК проживают в кластерах через многие регионы генома, наиболее часто в intergenic регионах и интронов белка кодирование генов2,3. Биогенеза интерферирующим включают транскрипции pri адаптивной от miRNA кодирование генов4. Pri адаптивной проходят последовательной обработки, сначала в ядре и затем в цитоплазме для создания единого мель Зрелые интерферирующим4,5. Впоследствии, Зрелые интерферирующим включены в РНК-комплекс (RISC): multimeric белка РНК комплекс, который включает в себя членом семьи Argonaute белков для целевых признание4,5, 6,7. Зрелые интерферирующим в RISC комплекс преимущественно привязку к 3' УТР целевой mRNAs8,9,10 , но можно также привязать иногда кодирование и 5' УТР регионе мРНК10,11 . Связывание Мирна к мРНК последовательностей результаты в трансляционной глушителей12,13,14 и в некоторых случаях мРНК дестабилизации15. Поскольку один Мирна можно ориентировать многие мРНК, эти регуляторные молекулы участвуют в почти каждый клеточных процессов и были вовлечены в различные болезни условия16,17,18.
Глубокое понимание как интерферирующим регулировать сотовой пути требует идентификации целевого мРНК. Биоинформатика платформ доступны прогнозировать предполагаемый miRNA:mRNA взаимодействия19,20. Эти предсказания полагаются на идеальный Уотсона-крика низкопробный спаривать между 2-8 семян нуклеотидной последовательности Мирна и взаимодополняющих последовательности в рамках целевой мРНК4,21. Кроме того эти инструменты создать вторичную структуру miRNA:mRNA дуплекс, расчет термодинамических параметров этого молекулярного взаимодействия и показать сохранения привязки сайтов различных видов для повышения функциональной значимости цели предсказание. К сожалению эти средства также имеют ограничение прогнозирования ложных положительных целей очень высокий уровень (~ 27 – 70%)15,22. Самое главное эти платформы в silico не признать неканонических взаимодействия интерферирующим с их цели23. Таким образом такой интеллектуальный анализ часто комбинируются с экспериментальные методы для проверки функционально соответствующих целей.
Были разработаны несколько подходов для экспериментально проверить miRNA:mRNA взаимодействия. Генетических экспериментов с использованием Мирна мимики, губки и ингибиторов, которые изменяют уровни интерферирующим в ячейке предоставляют ключи для его регулирования воздействия на25,24,выражение гена целевой26. Кроме того репортер на основе анализов через совместное трансфекции клона, содержащий 3' УТР регионе целевой мРНК и Мирна имитирует или ингибиторов в клетки свидетельствуют о регулирующей функции интерферирующим26. Хотя эти методы имеют решающее значение для изучения post-transcriptional регуляции экспрессии генов, адаптивной, transfection эффективность и pleotropic эффекты изменений в клеточных Мирна уровнях являются основные ограничения этих генетических подходов23, 26. Таким образом взаимодополняющие биохимические методы, проверяющие прямое взаимодействие между Мирна и его цели работают лучше понять клетчатую функцию адаптивной.
Один широко используемый метод изучения прямое взаимодействие между Мирна и его целью является иммунопреципитации RISC комплекс следуют обнаружения mRNA цели в пределах комплекса27,28,29,30 . Недавно усовершенствованный метод ловушки RISC была также использована для выявления Мирна целей; Это пары стабилизации целей в рамках промежуточных RISC-miRNA мРНК с очисткой мРНК-мишеней. Однако эти methodsface присущие проблемы неспецифичные взаимодействия РНК и RNA-связывая протеинов, которые обычно разделяются на клеточном отсеков31,32. Кроме того эти анализы зависит от наличия давности2 белка для иммунопреципитации RISC комплекс33. Учитывая, что давности2 является не только argonaute для эффективного miRNA:mRNA взаимодействие, исключение других argonautes может привести к предвзятым результаты34. Таким образом альтернативные стратегии необходимы для изучения прямую привязку Мирна к мРНК.
В настоящем докладе, мы разрабатываем одноэтапный подход для проверки прямого взаимодействия между Мирна и его целевых мРНК. Во-первых 3' биотинилированным заблокирован нуклеиновой кислоты (LNA) Мирна имитирует являются transfected в mammalian клетках. Затем miRNA:mRNA комплекс в lysate сотовых фиксируются с помощью магнитной бусины стрептавидина покрытием. Целевой мРНК, обязан ее дополнительных Мирна количественно с помощью ПЦР.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. transfection 3'-биотинилированным Мирна
Примечание: Выполните следующие действия внутри стерильной Ламинарный шкаф.
- Семя 4 x 105– 5 x 105 ГЭС 293T клеток на скважину в 2 мл полное Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) [DMEM дополнена 10% плода Bovine сыворотки (ФБС) и 1 х перо стрептококк антибиотик]. Культура клетки в инкубаторе набор при 37 ° C, 5% CO2 на ночь.
- Следующий день, проверьте соблюдение покрытием клеток под микроскопом света и здоровья.
Примечание: Убедитесь, что клетки придерживался и достигнуты соответствующие морфологии перед переходом к следующему шагу. ГЭС 293T клетки обычно готовы к трансфекции 18 – 24 h сообщение обшивки. - В стерильные 1,7 мл отцентрифугировать трубку разбавляют 75 пикомоль биотинилированным микроРНК в 200 мкл минимальных основных СМИ. Передавать этот микс еще 1,7 мл отцентрифугировать трубки содержащие липосом основе трансфекции реагента (8 мкл/хорошо) разбавляют в 200 мкл минимальных основных СМИ. Mix тщательно, но осторожно, закупорить и проинкубируйте 20-25 мин при комнатной температуре, чтобы позволить образование комплексов transfection.
- Удалите старые средства массовой информации от пластины 6 хорошо культуры, нежный закупорить и пополнить каждой скважины с 1,6 мл свежеприготовленный полный DMEM (без 1 х перо стрептококк антибиотиков).
- Добавьте трансфекции комплексы (1.3) каплям в ячейки 6-ну пластину, используя хорошо калиброванный пипетки. Вихревой мягко пластины при добавлении комплексов для обеспечения их равномерное распределение по всей пластине.
Примечание: Этот шаг очень важен для достижения высокой эффективности transfection и должны выполняться с осторожностью и терпение. - Культура клетки при 37 ° C и 5% CO2 для по крайней мере 36 часов.
2. Подготовка стрептавидина покрытием магнитные бусы — я
- Ресуспензируйте тщательно стрептавидина магнитные бусы, vortexing. Передача 30 мкл суспензии из бисера (на сэмпл) в 2-мл пробирку свободной от нуклеиназы отцентрифугировать.
- Место трубка, содержащая подвески из бисера на стенде Сепаратор магнитный шарик («магнит» далее) 2 мин. Убедившись, что бисер тянутся к стороне трубки при контакте с магнитом, осторожно удалите с помощью микропипеткой супернатант.
- Добавьте 100 мкл буфера мытья шарик (10 мм трис-Cl рН 7,5, ЭДТА 0,5 мм, 1 M NaCl) бисер. Снять трубку от магнита. Вихрь для 15 s при комнатной температуре мыть бисер.
- Место трубка, содержащая бусы на магните для 2 мин и осторожно снимите и выбросьте супернатант.
- Повторите шаги, 2.3 и 2.4 для в общей сложности три автомойки. После окончательного мыть шага извлеките трубку от магнита.
- 100 мкл РНКазы, освобождая решение (0,1 М NaOH, 0,05 М NaCl) бисер, смешайте хорошо vortexing для 15 s и инкубации при комнатной температуре за 5 минут место трубка, содержащая бусы на магните для 2 мин, тщательно удалить и удалить супернатант.
- Повторите шаг 2.6 в общей сложности три раза.
- Шарик ресуспендирования решение (0.5 М NaCl) добавить бисер, вихревой 15 s и инкубации при комнатной температуре для 5 минут место ресуспензированы бусы на магните для 2 мин и тщательно удалить супернатант.
- Добавьте 200 мкл шарик, преграждая разрешение (1 мкг/мкл BSA, 2 мкг/мкл дрожжи tRNA) бисер. Микс, нежный vortexing для 15 s при комнатной температуре. Инкубируйте на 4 ° C для 16 h (ночь) на вращателе мульти трубки.
3. Подготовка Lysates клетки
- Урожай transfected клеток ГЭС 293T нежный соскабливания скребком стерильные клеток внутри ламинарных капюшоном, а затем перевести каждый образец в стерильные 2-мл пробирку отцентрифугировать.
- Пелле царапины клетки центрифугированием на 1500 x g за 5 мин Ресуспензируйте гранулы в 1 x стерильные PBS (фосфат буфер солевой), рН 7,2. Центрифуга снова на 1500 x g 5 минут для получения гранул свободной от остатков средств массовой информации. Сразу же окунуться трубка, содержащая Пелле в лед.
- Подготовить буфер lysis клетки свежий полный (150 мм NaCl, 25 мм трис-Cl, рН 7,5, 5 DTT, 0,5% IGEPAL, 60 Superase ед/мл, 1 x ингибитор протеазы).
Примечание: Запас буфера lysis клетки, не хватает IGEPAL, Superase и протеазы ингибитор коктейль может заранее подготовлены и хранятся при комнатной температуре. Подготовьте свежая порция буфера lysis полного ячейки, добавив выше добавки в рекомендуемых окончательный концентрациях в буфер lysis клетки запасов и хранить его на льду. - 260 мкл буфера lysis ледяной полный ячейки для каждого образца в отцентрифугировать трубки (то есть, каждая трубка отцентрифугировать содержит клетки заготавливаемым из одной скважины 6-ну плиты) и Ресуспензируйте Пелле клеток в однородная суспензия, закупорить.
- Лизировать клетки, с помощью метода замораживания оттаивания: инкубировать трубы на-80 ° C для 10 – 15 мин. Затем позволяют клеткам оттаять на льду.
- Центрифуга результирующая ячейка lysate на 16000 x g 5 мин в охлажденных настольная центрифуга на 4 ° C.
- Передать стерильные 1,7 мл отцентрифугировать очищается lysate клетки на льду. Выбросите гранулы.
Примечание: Окончательный объем очистили lysate должно быть ~ 240-250 мкл. - Добавить 5 М NaCl на очищенное lysate в конечной концентрации 1 м и поддерживать образцы на льду.
4. Подготовка стрептавидина магнитные бусы — II
- Готовят свежий полный выпадающее мыть буфера (10 мм KCl, 1,5 мм MgCl2, 10 мм трис-Cl рН 7,5, 5 мм DTT, 1 M NaCl, 0,5% IGEPAL, 60U/мл Superase и 1 x ингибитор протеазы коктейль)
Примечание: Запас выпадающее мыть буфера хватает коктейль ингибитора протеазы, IGEPAL и Superase может заранее подготовлены и хранятся при комнатной температуре. Подготовьте свежая порция буфера lysis полного ячейки, добавив выше добавки в рекомендуемых окончательный концентрациях в буфер lysis клетки запасов и хранить его на льду. - Место труб, содержащий подготовленный бусины (из шага 2.9) на магните для 2 мин, тщательно снимите и выбросьте супернатант.
- Добавьте 150 мкл буфера ледяной полное выпадающего мыть в бисер. Вихрь для 15 s и инкубации при комнатной температуре за 30 – 60 s. место трубы на магните для 2 мин, тщательно снимите и выбросьте супернатант.
- Повторите шаг 4.3 в общей сложности 3 раза.
- Ресуспензируйте бисер в 300 мкл буфера полное выпадающего мыть.
5. pull-down целевых мРНК miRNA комплексов
- Перевести 300 мкл lysate клетки (из шага 3.8) к отцентрифугировать трубка, содержащая 300 мкл бусины (от шага 4.5).
- Инкубируйте смесь на смесителе nutating за 1 ч при комнатной температуре.
- Место трубки на магните для 5 минут осторожно снимите и выбросьте супернатант.
- Добавьте 300 мкл буфера ледяной полное выпадающего мыть в бисер. Вихрь для 15 s при комнатной температуре и место трубки на магните для 5 минут осторожно снимите и выбросьте супернатант.
- Повторите шаг 5.4 еще два раза.
- Ресуспензируйте бисер в 100 мкл нуклеиназы свободной воды и инкубировать на льду.
6. Общее извлечение RNA, синтез cDNA и ПЦР
- Извлечение всего РНК из ресуспензированы бусы (от шага 5.6) с использованием соответствующего метода (см. Таблицу материалы). Ресуспензируйте извлеченные всего РНК в 25 мкл воды, свободной от нуклеиназы. Определение концентрации РНК и качества, используя спектрофотометр (поглощение на 260/280). Подготовьте рабочий запас РНК в 50 нг/мкл.
- Выполнить синтез cDNA, в triplicates, используя 50 нг всего РНК (от шага 6.1) с помощью синтеза cDNA соответствующего комплекта (см. Таблицу материалы) с использованием oligo dT грунтовки в окончательном объеме 20 мкл (Таблица 1). Затем нагрузки ПЦР трубы в ПЦР инструмент для выполнения тепловой Велоспорт на условиях, описанных в таблице 2.
-
Выполнять ПЦР на CDNA (от шага 6.2) с помощью SYBR Зеленая химия (см. таблицу материалы):
- Выполните все ПЦР-реакции в triplicates в 96 хорошо четких днище в стерильных условиях.
- Аликвота 9 мкл реакционной смеси от мастера ПЦР смесь (см. таблицу 3) в каждой скважине пластины. Затем добавить 1 мкл cDNA в каждой скважине для достижения окончательный объем 10 мкл. уплотнение ПЦР пластину, используя жаростойкие ПЦР пластины герметик и загрузить в инструмент ПЦР
- Выполните, тепловой Велоспорт на условиях, описанных в таблице 4.
- Нормализации уровня выражения (Ct значения) каждого образца до уровня выражения кинулись элемента управления. Используйте эти значения для вычисления раз изменения в выражении.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Интерферирующим регулировать клеточных процессов путем привязки к целевой мРНК. Таким образом определение мРНК-мишеней являются ключом к понять функции Мирна. Здесь мы подробно метод для выявления мишенью мРНК клеточных Мирна. Этот протокол является адаптирована из Вани и др. 35 с изменением использования биотинилированным на основе LNA Мирна имитирует для выпадающих целевой мРНК. Использование на основе LNA олигонуклеотида имитирует повышает специфичность целевого объекта привязки ввиду большей стабильности модифицированных рибозы кольца без токсических эффектов36,,3738. Мы использовали этот метод, чтобы тянуть вниз мРНК ППА-1 как целевой сотовых микроРНК miR-125b. Высокий уровень экспрессии мир 125b обнаружен в тканях мозга, который регулирует функции нейронов39,40. В попытке определить цели мир 125b в нейрональных клеток недавно мы сообщали, что этот мир 125b отрицательно регулирует ППА-1 выражение путем привязки к 3' УТР ППА-1 мРНК41.
Раскрывающееся miRNA:mRNA комплекс
Мы использовали ГЭС 293T клетки для изучения взаимодействия между мир 125b и ППА-1 мРНК, так как эти клетки широко используется в сотовых, биохимические и молекулярно-биологических исследований. Схематическое изображение протокол, используемый для целевой мРНК изображен на рисунке 1. Во-первых ГЭС 293T клетки (4 x 105– 5 x 105 за хорошо) были посеяны на ночь в пластине 6-ну тканевые культуры и инкубируют при 37 ° C с 5% CO2 для 18 – 24 часа. После этого 75 пикомоль 3'-биотинилированным мир 125b мимики и 3'-биотинилированным кинулись контроля были transfected в клетки, используя метод трансфекции на основе липосом. Transfected клеток были инкубировали при 37 ° C и 5% CO2 для дополнительных 36 h и собирают. После этого сотовой лизатов transfected клеток были подготовлены лизис методом замораживания оттаивания. Свежеприготовленные сотовой лизатов инкубировали с заблокированных стрептавидина покрытием магнитные бусы на скамейке Топ nutating смеситель для 1 ч при комнатной температуре. После этого бусины были обработаны и промывают с помощью свежезаваренным подготовлен ледяной выпадающее мыть буфера на магнитный сепаратор. Наконец бусины были высокомобильна в 100 мкл нуклеиназы свободной воды для дальнейшего анализа.
Обнаружение цели мРНК в раскрывающемся miRNA:mRNA комплекс
Для обнаружения целевого мРНК в мир 125b из выпадающего смеси, мы заняты ПЦР анализа (рис. 1). Мы разработали прямого и обратного грунтовки (FP и RP) в пределах ORF усилить мРНК ППА-1 (рис. 2Таблица 5b). Мы также разработаны наборы Праймеры для обнаружения p53 мРНК, известный мишенью мир 125b42, как позитивный элемент управления и включить Праймеры для того чтобы усилить актина мРНК как отрицательный контроль неспецифический. Кроме того для дальнейшего подтверждения, специфики амплификации, мы разработали Праймеры для обнаружения 3' УТР регионов ППА-1, p53 и актина. Мы исполняли ПЦР, используя методы, описанные в протоколе (статья 6).
Рисунок 3 показывает ПЦР на основе усиления целевой мРНК в относительно кинулись элементов управления из очищенного бисера. Уровень мРНК ППА-1 был заметно выше в образцах потянул вниз с биотинилированным мир 125b имитирует по сравнению с платных элементов управления. Как ожидается, более высокие уровни mRNA положительный контроль p53 мРНК и минимальным усиления актина отрицательный контроль мРНК наблюдалось в этих образцах. Подобные уровни усиления были получены с помощью грунтовки, ориентации 3' УТР ППА-1 и p53 по сравнению с отрицательного контроля актина (рис. 3B). ПЦР результаты ORF регионов (Рисунок 3А) и 3' УТР регионов (рис. 3B) ППА-1 мРНК и p53 мРНК показали некоторые уровень изменчивости. Несколько факторов, включая сродство, количество сайтов связывания Мирна и различия в грунт последовательности зависимых амплификации могут способствовать различные уровни усиления на рисунке 3. Тем не менее эти данные решительно поддерживают возможности и специфичность метода для проверки мРНК-мишеней клеточных адаптивной.
Рисунок 1: Схематическое представление протокола для assay захвата целевой помощью биотинилированным miRNA имитирует. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: конструкция праймера для амплификации мРНК-мишеней,. Схематическое представление грунты, используемый для определения целевой мРНК мир 125b. Один набор грунтовки (набор я) был разработан в рамках региона ORF стенограммы и другой набор праймеров (набор II) был разработан в регионе UTR 3' генов-мишеней. FP и RP представляют собой прямого и обратного Праймеры для каждого набора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: мир 125b целевой идентификации ПЦР. Уровни mRNA (A) с помощью набора грунт, который усиливает регионе ORF таргетинг мРНК. Более высокие уровни выражения ППА-1 и p53 мРНК (положительный контроль) наблюдались по сравнению с актина мРНК (отрицательный контроль). (B) усиление 3' УТР региона цели мРНК, используя праймер набор II. Нет усиления наблюдалась не шаблон элементов управления (NTC). Все реакции были выполнены в triplicates, и данные были проанализированы с использованием программного обеспечения анализа соответствующих данных, основанную на методе 2-ΔCt . Планки погрешностей представляют Среднеквадратичная ошибка среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Компонент | Фондовая | Окончательный объем 20 мкл реакции |
| Шаблон (РНК) | 50 нг/мкл | 1.0 МКЛ |
| Реакция буфер | 5 x | 4.0 МКЛ |
| Праймера Oligo dT | Мастер фондовой | 2 МКЛ |
| Обратной транскриптазы | Мастер фондовой | 1 МКЛ |
| Нуклеаза бесплатная дистиллированная вода | - | 12 МКЛ |
| Общая реакция объем | 20 МКЛ |
Таблица 1: синтез cDNA реакционной смеси.
| 105 ° C = 30 s |
| 42 ° C = 60 мин |
| 95 ° C = 5 мин |
| 10 ° C = Hold |
Таблица 2: cDNA тепловой Велоспорт условий синтеза.
| Компонент | Фондовая | Окончательный объем 10 мкл реакции |
| cDNA продукт | - | 1.0 МКЛ |
| iTaq универсальный SYBR микс | 2 x | 5.0 МКЛ |
| Целевой (ORF/3 ' УТР) ф.п. | 10 МКМ | 0.5 МКЛ |
| Целевой (ORF/3 ' УТР) р.п. | 10 МКМ | 0.5 МКЛ |
| Нуклеаза бесплатная дистиллированная вода | - | 3 МКЛ |
| Общая реакция объем | 10 МКЛ |
Таблица 3: ПЦР реакционной смеси.
| 95 ° C = 10 мин |
| 30 циклов: |
| 95 ° C = 10 s |
| 56 ° C = 30 s |
| 72 ° C = 30 s |
| Расплава анализа кривой |
| S 65 ° C = 31 |
| Линейная скорость рамп = 0,5 ° C/s |
| Приобретение = интервалы 0.5 ° C |
Таблица 4: ПЦР термических условий Велоспорт.
| (A): биотинилированным Oligos | ||
| Biotinlyated Oligos | Фондовая | Последовательность (5' к 3') |
| имеет мир 125b | 25 МКМ | UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA-биотин |
| Кинулись управления | 25 МКМ | GAUGGCAUUCGAUCAGUUCUA-биотин |
| (B) грунты | ||
| Целевой грунт (ORF) | Фондовая | Последовательность (5' к 3') |
| ППА-1 (FP) | 100 МКМ | GAGGTGGATGGGTTCTCTGA |
| ППА-1 (RP) | 100 МКМ | ACACCCCTTGCACGTACTTC |
| p53 (FP) | 100 МКМ | TGTGACTTGCACGTACTCCC |
| p53 (RP) | 100 МКМ | ACCATCGCTATCTGAGCAGC |
| АКТИНА (FP) | 100 МКМ | GCTCGTCGTCGACAACGGCTC |
| АКТИНА (RP) | 100 МКМ | CAAACATGATCTGGGTCATCTT |
| (C) грунты | ||
| Целевой грунт (3' УТР) | Фондовая | Последовательность (5' к 3') |
| ППА-1 (FP) | 100 МКМ | ATTGGGAGAGGTAGCCGAGT |
| ППА-1 (RP) | 100 МКМ | CTACCCATCAGCAACTTAGCG |
| p53 (FP) | 100 МКМ | GGCCCATATCTGTGAAATGC |
| p53 (RP) | 100 МКМ | CTGCAGGAAGGCAGGTTTT |
Таблица 5: Олигонуклеотида имена и последовательности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Определение мРНК-мишеней сотовой интерферирующим имеет важное значение для понимания их функции регулирования. Несколько вычислительных средств используются для прогнозирования цели, основанные на взаимодополняемости семян последовательности и сохранения целевого объекта последовательности19,20. Хотя эти инструменты являются ценными, они могут генерировать высокий уровень ложных срабатываний и негативы ложных. Таким образом эти прогнозы являются наряду с экспериментальными методами например иммунопреципитации RISC комплекс и pull-down miRNA:mRNA комплекс для подтверждения прямой привязки интерферирующим27,их соответствующих целей31. Этот доклад детали экспериментальная стратегия, которая использует биотинилированным Мирна имитирует пулдаун целевой мРНК. Биотин пулдаун может использоваться для идентификации целей Мирна с высокой чувствительностью и низкий уровень ложных положительных35,43. Таким образом этот метод также может быть использована для идентификации целей Мирна, связывая на основе последовательности скрининг захваченных пула РНК. Однако существует несколько ограничений для этого метода44. Гиперэкспрессия экзогенных Мирна может изменить транскрипционный анализ сети клеток, вызывая последующего изменения в мРНК, которые не из-за регулирования Мирна. Они могут быть преодолены с помощью очень низкое количество имитирует чтобы не возмущают эндогенного Мирна регулирования. Кроме того надлежащего контроля требуются при адаптивной экзогенно выражаются избежать неспецифических привязки. Тщательное мытье и преграждать шаги можно эффективно уменьшить фоновый шум и увеличить специфика целевых Мирна. Несколько исследований показали, что изменения Мирна 3' или 5' концы не являются хорошо переносится45, тем не менее, ряд исследований эффективно использовали биотина меткой мир имитирует как эффективный инструмент для изучения мРНК-мишеней.
Другим преимуществом этого метода является использование на основе LNA (заблокированные нуклеиновой кислоты) имитирует Мирна. Модификация LNA нуклеиновой кислоты позволяет формирование стабильной олигонуклеотиды дуплексы с высоким сродством46,47. Кроме того пользовательские сделал биотинилированным LNA Мирна имитирует состоят из трех нитей РНК. 3'-биотинилированным Мирна прядь с последовательностью согласно аннотации miRBase и прядь пассажиров дополняет Мирна, который делится на два МШУ модифицированные РНК нити47. RISC включает только стренги Мирна, а два пассажира, которые пряди быстро деградировали, повышая тем самым специфики целевой. Для повышения доверия наших выводов, мы также включили утвержденных целевых p53 мир 125b как положительный контроль и β-актина, которые не имеют привязки сайта мир 125b в мРНК как отрицательный контроль. Результаты, полученные с помощью этого метода с этими элементами управления (рис. 3) показывают специфику идентификации mRNA цели. Хотя LNA Мирна имитирует стабилизировать и значительно в пользу Уотсона-крика низкопробный спаривать, следует отметить, что использование имитирует Мирна LNA с лейблом биотина устранит ложных срабатываний ни негативов. Кроме того вполне вероятно, что они могут привести к подтверждение вычислительной прогнозов, которые не могут быть биологически соответствующих. С другой стороны если этот метод наряду с последовательности для определения мРНК-мишеней, ложные негативы могут быть созданы, потому что LNA имитирует пользу канонические спаривание, может исключить нестандартные спаривание взаимодействия, которые происходят с родной адаптивной.
Протокол, представленные здесь заимствован из Вани и др., с несколько модификаций35. Чтобы дополнительно уменьшить фоновый шум, мы имеем включены обширные Стиральная шаги, изменение параметров на эффективность трансфекции, подготовка буфера и инкубации, выпадающих условий и ПЦР сбора и анализа данных. Кроме того, мы использовали два набора грунтовка для усиления целевой мРНК после выпадающее, один набор разработан для усиления региона ORF из целевых мРНК и второй набор праймеров для того чтобы усилить региона в течение 3' УТР целевого мРНК. Использование двух наборов праймеров повышает специфичность для обогащения mRNA цели.
Следует отметить, что ограничение этого метода является базальный уровень шума, который возникает от неспецифических целей. Дальнейшие изменения таких улучшений, в блокировке, мытье и инкубации условия могут предоставлять выше целевого специфичность и чувствительность. В резюме проба, описанные в настоящем докладе это быстрый и надежный метод, который может быть принят для проверки мРНК-мишеней интерферирующим с помощью ПЦР на основе стратегии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют не конкурирующие интересы финансовых и нефинансовых.
Acknowledgments
Эта работа частично поддерживается DA037779 национальных институтов здравоохранения (НИЗ) гранты (до Ю.П.), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 и MD007586 (для ПД). Работа также была поддержана RCMI Грант G12MD007586, Вандербильт CTSA Грант UL1RR024975, Мехарри переводческая научно-исследовательский центр (MeTRC) CTSA Грант (U54 RR026140 от NCRR/низ, Грант MD007593 U54 от NIMHD/низ и Теннесси центр СПИДа Исследования (P30 AI110527).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell line- HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS) | GIBCO/Thermofisher | 10438-026 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | GIBCO/Thermofisher | 11995-065 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (1x) | GIBCO/Thermofisher | 20012-027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | GIBCO/Thermofisher | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin solution (100x) | Cellgro/Mediatech | 30-002-CI | |
| DNase | Ambion | AM2238 | |
| Opti-MEM Reduced serum media | GIBCO/Thermofisher | 3198-088 | |
| Liopfectamine 2000 Transfection reagent | Invitrogen/ Thermofisher | 11668-019 | |
| Biotinylated hsa-miR-125b | Exiqon | 339178/ID-27281622 | |
| Biotinylated scrambled control | Exiqon | 479997-671/ID-714884 | |
| IGEPAL | Sigma-Aldrich | 18896 | |
| Streptavidin Magnetic beads | Pierce | 88816 | |
| Yeast tRNA | Invitrogen/Thermofisher | 15401-011 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Potassium chloride (KCl) solution | Sigma-Aldrich | 60142 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) solution | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0 | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Superase | Ambion/Thermofisher | AM2694 | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| RNAse/DNAse free water | GIBCO/Thermofisher | 10977-015 | |
| RNeasy extraction kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript-Select cDNA synthesis kit | Biorad | 170-8897 | |
| qPCR Primers | Invitrogen/Thermofisher | ||
| iTaq-Universal SYBR green supermix | Biorad | 172-5120 | |
| DynaMag-Spin Magnet | Invitrogen/Thermofisher | 12320D |
References
- Behm-Ansmant, I., Rehwinkel, J., Izaurralde, E. MicroRNAs silence gene expression by repressing protein expression and/or by promoting mRNA decay. Cold Spring Harborsymposia on quantitative biology. 71, 523-530 (2006).
- Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome research. 14, 1902-1910 (2004).
- Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Meyer, J., Borkhardt, A., Tuschl, T. New microRNAs from mouse and human. RNA. 9, 175-179 (2003).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Lee, Y., Jeon, K., Lee, J. T., Kim, S., Kim, V. N. MicroRNA maturation: Stepwise processing and subcellular localization. The EMBO journal. 21, 4663-4670 (2002).
- Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131, 1097-1108 (2007).
- Perron, M. P., Provost, P. Protein interactions and complexes in human microRNA biogenesis and function. Frontiers in bioscience: A journal and virtual library. 13, 2537-2547 (2008).
- Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75, 843-854 (1993).
- Kloosterman, W. P., Wienholds, E., Ketting, R. F., Plasterk, R. H. Substrate requirements for let-7 function in the developing zebrafish embryo. Nucleic acids research. 32, 6284-6291 (2004).
- Lee, I., et al. New class of microRNA targets containing simultaneous 5'-UTR and 3'-UTR interaction sites. Genome research. 19, 1175-1183 (2009).
- Djuranovic, S., Nahvi, A., Green, R. miRNA-mediated gene silencing by translational repression followed by mRNA deadenylation and decay. Science. 336, 237-240 (2012).
- Iwakawa, H. O., Tomari, Y. The Functions of MicroRNAs: mRNA Decay and Translational Repression. Trends in cell biology. 25, 651-665 (2015).
- Wilczynska, A., Bushell, M. The complexity of miRNA-mediated repression. Cell deathand differentiation. 22, 22-33 (2015).
- Selbach, M., et al. Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs. Nature. 455, 58-63 (2008).
- Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
- Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
- Sayed, D., Abdellatif, M.
- Steinkraus, B. R., Toegel, M., Fulga, T. A. Tiny giants of gene regulation: Experimental strategies for microRNA functional studies. Wiley interdisciplinary reviews. Developmental biology. 5, 311-362 (2016).
- Watanabe, Y., Tomita, M., Kanai, A. Computational methods for microRNA target prediction. Methods in enzymology. , 65-86 (2007).
- Lewis, B. P., Shih, I. H., Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Burge, C. B.
- Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455, 64-71 (2008).
- Thomson, D. W., Bracken, C. P., Goodall, G. J. Experimental strategies for microRNA target identification. Nucleic acids research. 39, 6845-6853 (2011).
- Ebert, M. S., Neilson, J. R., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: Competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells. Nature. 4, 721-726 (2007).
- Elmen, J., et al. Antagonism of microRNA-122 in mice by systemically administered LNA-antimiR leads to up-regulation of a large set of predicted target mRNAs in the liver. Nucleic acids research. 36, 1153-1162 (2008).
- Jin, H. Y., et al. Transfection of microRNA mimics should be used with caution. Frontiersin genetics. 6, 340 (2015).
- Beitzinger, M., Peters, L., Zhu, J. Y., Kremmer, E., Meister, G. Identification of human microRNA targets from isolated argonaute protein complexes. RNA biology. 4, 76-84 (2007).
- Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps. Nature. 460, 479-486 (2009).
- Easow, G., Teleman, A. A., Cohen, S. M. Isolation of microRNA targets by miRNP immunopurification. RNA. 13, 1198-1204 (2007).
- Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141, 129-141 (2010).
- Cambronne, X. A., Shen, R., Auer, P. L., Goodman, R. H. Capturing microRNA targets using an RNA-induced silencing complex (RISC)-trap approach. Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America. , 20473-20478 (2012).
- Mili, S., Steitz, J. A. Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses. RNA. 10, 1692-1694 (2004).
- Meister, G., et al. Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs. Molecular cell. 15, 185-197 (2004).
- Su, H., Trombly, M. I., Chen, J., Wang, X. Essential and overlapping functions for mammalian Argonautes in microRNA silencing. Genes & development. 23, 304-317 (2009).
- Wani, S., Cloonan, N. Profiling direct mRNA-microRNA interactions using synthetic biotinylated microRNA-duplexes. bioRxiv. , (2014).
- Grunweller, A., Hartmann, R. K. Locked nucleic acid oligonucleotides: The next generation of antisense agents? BioDrugs: clinical immunotherapeutics,biopharmaceuticals and gene therapy. 21, 235-243 (2007).
- Guerard, M., et al. Locked nucleic acid (LNA): Based single-stranded oligonucleotides are not genotoxic. Environmental and molecular mutagenesis. 58, 112-121 (2017).
- Song, R., Ro, S., Yan, W. In situ hybridization detection of microRNAs. Methods inmolecular biology. , 287-294 (2010).
- Edbauer, D., et al. Regulation of synaptic structure and function by FMRP-associated microRNAs miR-125b and miR-132. Neuron. 65, 373-384 (2010).
- Le, M. T., et al. MicroRNA-125b promotes neuronal differentiation in human cells by repressing multiple targets. Molecular and cellular biology. 29, 5290-5305 (2009).
- Dash, S., et al. Poly (ADP-Ribose) Polymerase-1 (PARP-1) induction by cocaine is post-transcriptionally regulated by miR-125b. eNeuro. 4, (2017).
- Micheli, F., et al. Regulation of proapoptotic proteins Bak1 and p53 by miR-125b in an experimental model of Alzheimer's disease: Protective role of 17beta-estradiol. Neuroscience letters. 629, 234-240 (2016).
- Orom, U. A., Lund, A. H. Isolation of microRNA targets using biotinylated synthetic microRNAs. Methods. 43, 162-165 (2007).
- Cloonan, N. Re-thinking miRNA-mRNA interactions: Intertwining issues confound target discovery. BioEssays: News and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 37, 379-388 (2015).
- Guo, Y. E., Steitz, J. A. 3'-Biotin-tagged microRNA-27 does not associate with Argonaute proteins in cells. RNA. 20, 985-988 (2014).
- Mook, O., et al. In vivo efficacy and off-target effects of locked nucleic acid (LNA) and unlocked nucleic acid (UNA) modified siRNA and small internally segmented interfering RNA (sisiRNA) in mice bearing human tumor xenografts. Artificial DNA, PNA & XNA. 1, 36-44 (2010).
- Owczarzy, R., You, Y., Groth, C. L., Tataurov, A. V. Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes. Biochemistry. 50, 9352-9367 (2011).
