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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Caracterização das respostas de isotipo de imunoglobulina Timo-dependentes e Timo-independente nos ratos usando ensaio enzima-lig da imunoabsorção

Published: September 7, 2018 doi: 10.3791/57843
Automatic Translation
1, 1, 2,3
1Department of Cell Biology and Neuroscience and Graduate Program in Cellular and Molecular Pharmacology, Rutgers University, 2Department of Cell Biology and Neuroscience, Rutgers University, 3Rutgers Cancer Institute of New Jersey

Summary

Neste trabalho, descrevemos um protocolo para caracterizar T-dependentes e T-independentes respostas do isotipo de imunoglobulina (Ig) em camundongos usando ELISA. Este método usado sozinho ou em combinação com fluxo cytometry permitirá que os investigadores a identificar diferenças nas respostas de isotipo Ig mediada por células B em camundongos após imunização de antígenos T-dependentes e T-independentes.

Abstract

Anticorpos, também denominados como diferenciados de imunoglobulinas (Ig), secretadas por linfócitos B, células plasmablasts/plasma, na imunidade humoral fornecem uma formidável defesa contra a invasão de agentes patogénicos através de diversos mecanismos. Um dos principal objetivos da vacinação é induzir proteção anticorpos antígeno-específicos para prevenir infecções fatais. Timo-dependentes (TD) e antígenos de Timo-independente (TI) podem eliciar respostas de IgM robustas antígeno-específicas e também podem induzir a produção de anticorpos de comutação de isotipo (IgG, IgA e IgE) bem como a geração de células B de memória com a ajuda fornecido por apresentadoras de antígenos (APCs) de células. Aqui, descrevemos um protocolo para caracterizar TD e TI Ig isotipo respostas em ratos utilizando ensaio imunoenzimático (ELISA). Neste protocolo, TD e TI Ig respostas são eliciadas em camundongos intraperitoneal (i.p.) imunização com antígenos conjugados hapteno modelo TNP-KLH (em alum) e TNP-polissacarídeo (em PBS), respectivamente. Para induzir resposta de memória TD, uma imunização de reforço do TNP-KLH em alum é dado em 3 semanas após a primeira imunização com o mesmo antígeno/adjuvante. Soros de mouse são colhidos em pontos diferentes de tempo, antes e após a imunização. Total de níveis de Ig de soro e anticorpos específicos TNP são posteriormente quantificados usando o Ig isotipo específico sanduíche e ELISA indireta, respectivamente. Para corretamente quantificar a concentração de soro de cada isotipo Ig, as amostras devem ser apropriadamente diluído para caber dentro da escala linear das curvas padrão. Usando este protocolo, consistentemente obtivemos resultados confiáveis com sensibilidade e alta especificidade. Quando usado em combinação com outros métodos complementares tais como citometria de fluxo, em vitro cultura de esplênica de células B e imuno-histoquímica coloração (IHC), este protocolo permitirá aos pesquisadores uma compreensão abrangente do anticorpo respostas em um determinado ambiente experimental.

Introduction

Os linfócitos B são o principal jogador na imunidade humoral e o único tipo de célula em mamíferos que são capazes de produzir anticorpos, também denominados como imunoglobulinas (Ig)1,2. Anticorpos secretados pelas células B fornecem uma formidável defesa contra patógenos através de diversos mecanismos, incluindo a neutralização, opsonização e ativação do complemento, levando a imunidade protetora3a invadir. Secreção de anticorpos pelas células B só é alcançada após a ativação completa das células B específicas, que normalmente requer que duas distintas sinaliza3. Sinal 1 é retransmitido por ligação directa do antígeno (Ag) para o receptor de células B (BCR) expressado na superfície de de células específicas ingênua B3. Dependendo da fonte de sinal 2, ativação de células B pode ser dividida em Timo-dependentes (TD) ou Timo-independente (TI)3,4. Em uma resposta de antígeno de TD, sinal 2 é fornecida pelo cognato CD4 células T ativadas auxiliar (T,H), que expressam CD154, o ligante para o receptor co-estimulatória CD40 expressado em células de B a1,2,3. Em uma resposta de antígeno de TI, sinal 2 vem de qualquer envolvimento de receptores Toll-like (TLRs no caso tipo 1 TI Ag) ou cross-linking extensa dos BCRs (no caso do tipo 2 TI Ag) no B células3,4. Os antígenos de TI (TI-1) do tipo 1 são ligantes microbianas de TLRs, incluindo bacterianos lipopolissacarídeos (LPS), RNAs virais e microbiana CpG DNA4,5. Antígenos de TI (TI-2) do tipo 2 têm estrutura altamente repetitiva e são capazes de entregar prolongada e persistente sinalização à célula B por múltiplos do cross-linking dos BCRs4,6. Exemplos típicos de TI-2 antígenos incluem pneumocócica polissacarídeos e polissacarídeo conjugados hapteno6,7. Antígenos tanto TD e TI podem eliciar respostas de IgM robustas antígeno-específicas e também podem induzir a produção de anticorpos de comutação de isotipo (IgG, IgA e IgE) com a ajuda fornecida por apresentadoras de antígenos (APCs) de células como as células dendríticas (DCs)1 ,2,3. Além disso, ambos TD e TI antígenos são capazes de induzir respostas de memória com a ajuda de APCs, mas TD os antígenos são mais eficientes na indução de memória B célula geração3,8.

Neste protocolo, TD e TI Ig respostas são eliciadas em camundongos intraperitoneal (i.p.) imunização com hemocianina de Lapa 2.4.6-trinitrophenyl-fechadura de antígenos conjugados hapteno modelo (TNP-KLH) e TNP-polissacarídeo (neutro, altamente ramificado e alta massa), respectivamente,10,9,11. Antígenos de TD são geralmente usados com um adjuvante para aumentar a produção de anticorpos12. Aqui em nosso protocolo, TNP-KLH é injetado com alume, um adjuvante comumente utilizado em estudos de imunização12. Outros exemplos de adjuvantes que podem ser usados incluem completa ou incompleta adjutor de Freund (CFA ou IFA), A monofosforil lipídio / dicorynomycolate trealose ("Ribi" adjuvante) e CpG oligodeoxynucleotides, etc.13, 14. após a imunização, soros de rato são colhidos nos pontos de tempo diferentes e anticorpos específicos TNP em soros são quantificados usando o Ig isotipo específico enzima-lig da imunoabsorção ensaio (ELISA)9,10, 11.

ELISA é um ensaio baseado na placa que é amplamente utilizado como uma ferramenta de diagnóstico na medicina e também como uma ferramenta analítica em investigação biomédica15,16. É usado para detectar e quantificar analitos incluindo anticorpos, hormônios, citocinas, quimiocinas e vários antígenos, etc. ELISA pode ser executada em vários formatos diferentes, incluindo directo, indirecto, sanduíche e competitiva ELISA15,16. Em geral, envolve a imobilização do antígeno para uma superfície sólida, geralmente uma placa de microtitulação 96 poços, que é incubada com anticorpo primário. Após a incubação, o anticorpo não acoplado é lavado. Em um ELISA direto, o anticorpo primário diretamente é conjugado a uma enzima (peroxidase de rábano normalmente ou fosfatase alcalina), que pode decompor um substrato cromogénico para produzir uma mudança de cor visível detectada por um instrumento de detecção do sinal tais como uma Espectrofotómetro de15,16. Em contraste, se um anticorpo secundário enzima-lig é usado para ligar o anticorpo primário, então este é considerado um de15,de ELISA indireto16. ELISA direta é mais rápido enquanto ELISA indireta é mais sensível,15,16. Em um sanduíche ELISA, as placas são revestidas com anticorpo "captura" usado para imobilizar o antígeno de interesse nas amostras, e em seguida o antígeno capturado pode ser detectado por outro anticorpo "detecção" de uma forma directa ou indirecta15, 16. ELISA sanduíche oferece alta especificidade, uma vez que o antígeno é detectado por dois diferentes anticorpos do antígeno. Em um ELISA competitivo, a competição é estabelecida entre o antígeno da amostra e o antígeno de placa-limite para a ligação com o anticorpo primário, e em seguida a concentração de antígeno na amostra é quantificada através da medição da redução no sinal do substrato 15 , 16. ELISA competitivo pode ser executada usando o formato acima mencionado direto ou indireto e é útil para a detecção de antígenos pequenos com apenas um epítopo15,16.

Técnicas alternativas para a medição de anticorpos incluem radio-imunoensaio (RIA), ensaio de eletroquimioluminescência (ECL) ensaio e superfície ressonância de plasmon (SPR)17. RIA foi o primeiro imunoensaio desenvolvido que as medidas da presença de um antígeno (ou anticorpos) com alta especificidade e sensibilidade, usando reagentes radiolabeled18,19. No entanto, devido as preocupações de toxicidade radioativa, custos de eliminação, validade e licenças especiais para trabalhar com materiais radioactivos, ELISA é um melhor e mais conveniente técnica comum usa20,21. ECL é um ensaio altamente sensível no qual quimioluminescente reações são iniciadas usando eletricidade para gerar espécies altamente reativas de precursores estáveis na superfície de um eletrodo, em podem ser usadas para medir a quantidade de analitos (tais como antígenos ou anticorpos)22. No entanto, ECL requer um instrumento especial e, portanto, não é tão amplamente usado como ELISA23. SPR é um ensaio direto que pode ser usado para medir a vinculação dos ligantes (EG., anticorpos) para moléculas de imobilizado (EG., antígenos) em um sensor chip superfície24. SPR detecta as interações em tempo real, muito especificamente e não requer a utilização de reagentes rotulados como ELISA. No entanto, SPR também requer um equipamento especial e tem uma sensibilidade mais baixa do que ELISA17. Tendo em conta as limitações dos métodos alternativos, ELISA é a técnica mais adequada e conveniente para o nosso propósito no presente protocolo. Aqui, descrevemos o uso de sanduíche ELISA para a análise dos níveis totais do isotipo Ig e os procedimentos de ELISA indireto para a análise do antígeno-específicas isotipos de Ig.

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Protocol

Este protocolo segue as diretrizes do Comitê de ética institucional pesquisa animal da Universidade de Rutgers. Todos os mouses são utilizados em conformidade com as diretrizes do NIH e sob um animal protocolo aprovado pelo Comitê de uso e cuidado institucional do Animal.

1. preparação dos ratos e coleção de ingênuo Mouse Sera

  1. Manter todos os ratos para experimentos de imunização em uma determinada instalação livre de patógeno animal.
  2. Nocaute de gênero de correspondência, jovem adulto (8-12 semanas de idade) de uso e littermate controle de ratos que têm os mesmos pais e gaiolas para estudos de imunização.
  3. Planeje a imunização e horários de coleta do soro conforme representado na Figura 1.
  4. Colher soro ingênuo de cada rato em 7 dias (-7) antes de imunização. Siga os procedimentos retro-orbital hemorragia e soro preparação conforme detalhado abaixo na etapa 4.

2. preparação do TNP-polissacarídeo (um antigénio de TI) e TNP-KLH (um antigénio TD)

  1. Dissolva o pó de antígeno em PBS estéril (pH 7,4) completamente para fazer 0,5 mg/mL do TNP-polissacarídeo estoque e 1 mg/mL de soluções estoque TNP-KLH. Alíquota cada antigénio solução reserva para tubos de microcentrífuga estéril em 0,5 mL/tube e manter as alíquotas a-80 ° C para armazenamento a longo prazo. Evite múltiplas congelamento e degelo das alíquotas do antígeno.
  2. No dia da injeção, calcular o volume do TNP-polissacarídeo (50 µ g/100 µ l/mouse) ou TNP-KLH (100 µ g/100 µ l/mouse) necessários de acordo com o número de ratos para ser injetado. Descongele o número apropriado de alíquotas TNP-polissacarídeo ou TNP-KLH à temperatura ambiente (RT).
  3. Para a injeção do TNP-KLH, primeiro dilua o adjuvante de alum (40mg/mL) com 3 volumes de PBS estéril para uma concentração final de 10 mg/mL. Certifique-se que a mistura de adjuvante de alúmen é bem suspensa antes de diluição.
  4. Combinar a igual volume de chorume de adjuvante de alúmen de 10 mg/mL da etapa 2.3 e a solução de TNP-KLH descongelada (1 mg/mL) em um tubo de polipropileno de 5 mL, misture bem e incubar a 37 ° C por 30 min. Prepare este TNP-KLH/alum misturar na hora antes da injeção.

3. imunização de camundongos

  1. Execute a injeção intraperitoneal (i.p.) do TNP-polissacarídeo ou alum/TNP-KLH para imunizar os ratos com seringas de insulina 1 mL em um gabinete de segurança biológica. Introduza a agulha em ângulo de aproximadamente 30° de preferência no quadrante inferior direito de cada rato para evitar a injeção em órgãos internos.
  2. Injete i.p. 100 µ l do TNP-polissacarídeo por rato no dia 0 para a imunização de TI Ag (Figura 1A).
  3. Injete i.p. 200 µ l da mistura TNP-KLH/alum (preparada na etapa 2.4) por rato no dia 0 para imunização TD Ag. Repita a mesma injeção no dia 21 como uma imunização de reforço para estudos de memória (Figura 1B).
  4. Após a injeção, retornar cada mouse para sua gaiola e manter todos os ratos injetados na condição de isentos de agentes patogénicos específica.

4. retro-orbital de sangramento e preparação de soro

  1. Soros de rato em pontos diferentes do tempo da colheita: para a imunização do TNP-polissacarídeo, coletar sera rato em dia -7 e 7 (Figura 1A); para a imunização do TNP-KLH/alum, colete sera rato em dia -7, 7, 14 e 28 (Figura 1B).
  2. Para Retro-orbital de sangramento, anestesiamos a cada rato com 5% de isoflurano por 1 – 2 min em um armário de biossegurança25. Execute o reflexo pedal para garantir a adequada anestesia de cada rato.
  3. Segure o mouse anestesiado com uma mão com o indicador e o polegar, puxando a pele ao redor do globo ocular para que o olho se projeta fora do soquete25. Inserir uma pipeta de Pasteur não heparinizado ou tubo capilar em um ângulo de 45° para o canto interno do olho perfurado por baixo do globo ocular,25.
  4. Exerça uma ligeira pressão para baixo e gire a pipeta ou tubo suavemente a invadir a veia e coletar 150-200 µ l de sangue na pipeta ou tubo. Imediatamente transferir o sangue para um tubo de microcentrífuga estéril 1,5 mL e retornar o mouse para sua gaiola para recuperar.
  5. Deixe amostras sentar na RT para 1 – 2 h coagular o sangue.
  6. Centrifugar as amostras de sangue coagulado em 13.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Transferi o soro claro em cima o coágulo de sangue para um novo tubo de microcentrífuga estéril 1,5 mL.
  7. Repita a etapa 4.6 mais uma vez para remover o coágulo de sangue residual e coletar o soro claro.
  8. Alíquota do soro em tubos de microcentrífuga estéril 1,5 mL em 50 µ l/tube e armazenar o sera a-80 ° C.
  9. Alternam o olho para o sangramento em pontos diferentes de tempo para que cada olho é sangrou no máximo duas vezes por todo o experimento. No terminal do sangramento, recolha a 1 mL de sangue de cada rato antes de eutanásia. Eutanásia o mouse com 5% CO2 , seguido por deslocamento cervical.
    Nota: As células B esplênica podem ser colhidas para fluxo cytometric análises e estudos de cultura em vitro . Também preparamos o DNA genômico de splenocytes para verificar o genótipo de cada rato.

5. Mouse Ig isotipo específico ELISA

  1. Prepare os amortecedores e soluções antes de ELISA.
    1. Prepare 500 mL de tampão de acoplamento (PBS, pH 7,4).
    2. Preparar 500 mL de solução de lavagem (PBS-T (0,05% Tween 20), pH 7,4).
    3. Preparar 100 mL de tampão de bloqueio (1% BSA em PBS, pH 7,4, armazenada a 4 ° C).
    4. Preparar 1 L de tampão de substrato (dietanolamina 1m, pH 9,8 (97 mL de dietanolamina em 1 litro de H2O, pH ajustado usando 10 M HCl) e 0,5 mM MgCl2). Protege o tampão de substrato de luz envolvendo o frasco com papel alumínio. Loja a 4 ° C.
    5. Prepare 100 mL de solução de paragem (3 M NaOH).
  2. Revesti as placas de ELISA:
    1. Para isotipo Ig do soro total ELISA, revestir as placas de 96 poços imuno com 10 µ g/mL de isotipo específico captura anti-rato policlonal de cabra Ig (M, G1, G2a, G2b, G3, A ou E) Abs no Buffer de acoplamento (PBS) 100 µ l/poço.
    2. Para o isotipo Ig TNP específicos do ELISA, revesti as placas de 96 poços imuno com 10 µ g/mL do TNP(38)-BSA em PBS em 100 µ l/poço.
    3. Para alta afinidade específica TNP Ig isotipo ELISA, revesti as placas de 96 poços imuno com 10 µ g/mL do TNP(3)-BSA em PBS em 100 µ l/poço26. Incube as placas a 4 ° C durante a noite.
  3. Após a incubação do revestimento, lavar os pratos 2 vezes com 200 µ l/poço de PBS-T. Descartar o tampão de lavagem e borrão secar as placas (toque cada placa de cabeça para baixo sobre uma pilha de toalhas de papel) depois de cada lavagem.
  4. Bloquear as placas: Adicionar 200 µ l/poço de bloqueio de Buffer (1% de BSA em PBS) para as placas revestidas e incubar as placas por 1h no RT
  5. Enquanto as placas estão bloqueando, prepare diluições de padrões de isotipo Ig e amostras de soro no bloqueio de Buffer em uma placa de 96 poços separada, não tratada na 150 µ l/poço.
    1. Preparar as normas isotipo Ig da 250 ng/mL como a concentração inicial padrão (St01) e fazer 7 a 10 de 1:2 diluições em série dos padrões de Ig (St02 St07 ou St10, Figura 2).
    2. Prepare o soro de rato amostras a uma diluição de 1: 100 ou 1: 500 fator como a diluição inicial e fazer 3 ou 4 de 01:10 diluições em série por total isotipo Ig ou 1:5 diluições em série para isotipo Ig TNP específicos de cada amostra de soro(Figura 2). Para IgE ELISA, preparar amostras de soro de rato em um fator de diluição 1:2 como a diluição inicial e fazer 3 de 1:5 diluições de série de cada amostra de soro.
  6. Após o bloqueio, lavar os pratos da etapa 5.4 três vezes com 200 µ l/poço de PBS-T e borrão secar as placas depois de cada lavagem.
  7. Transferi 100 µ l/poço de diluídos padrões de isotipo Ig (adequados para a captura e detecção Abs) e amostras de soro diluído de passo 5.5 para as placas preparadas na etapa 5.6. Incube as placas com os padrões e amostras a 4 ° C durante a noite.
  8. Lavar as placas 3 vezes com 200 µ l/poço de PBS-T e borrão seca as placas depois de cada lavagem.
  9. Em cada prato, adicionar 100 µ l/poço de 10 µ g/mL de uma apropriado da fosfatase alcalina (AP)-anti-rato conjugados específicos do isotipo cabra Ig (M, G1, G2a, G2b, G3, A ou E) Abs diluído em tampão de bloqueio.
  10. Incubar as placas com Abs AP-conjugado para 1-2 h em RT Para a deteção de IgE, incubar as placas por 1 – 2 h a 37 ° C.
  11. Prepare-se 1 mg/mL de solução de substrato dissolvendo-se dois comprimidos de substrato de fosfatase 5 mg em 10 mL de tampão de substrato.
  12. Lavar cada placa 5 vezes com 200 µ l/poço de PBS-T e borrão seca as placas depois de cada lavagem.
  13. Adicione 100 µ l/poço de solução de substrato em cada prato. Permitir que a reação a desenvolver no RT, que normalmente leva apenas alguns minutos.
  14. Leia cada placa em 405 nm, utilizando um leitor de microplacas com seu software associado.
    1. Clique em "configurações" para definir os comprimentos de onda "Lm1" no "405 nm" e clique em "Okey".
    2. Clique em "modelo" para atribuir "em branco" poços, poços de "normas" e "desconhecido" poços de acordo com a configuração da placa de 96 poços.
    3. Para poços de "padrões", clique em "série" para definir o "Primeiro exemplo"como"St01", selecione "Iniciar do" no "Top" e definir "Replica" como "2". Verifique o"Amostra Descriptor" e "Valor padrão" de entrada: selecione "unidades"como"ng/mL", definir "valor inicial" como "250", defina o "passo", como "2". Clique em "Okey".
    4. Clique em "Ler" para ler a placa quando a maioria concentrada padrão atinge uma densidade óptica (OD) de ~ 1.
    5. Clique no menu "arquivo" e clique em "salvar" para salvar o arquivo.
    6. Clique em "ler" para ler a placa novamente quando o padrão mais concentrado se aproxima OD405 de ~ 1,5, 2 e 2,5, respectivamente.
  15. Pare a reação adicionando 25 µ l/poço de 3 M de NaOH. Conclua etapas 5.12 a 5.15 por um prato de cada vez.
  16. Analise dados de ELISA utilizando o software associado com o leitor de microplacas:
    1. Verifique os valores de OD405 as normas de isotipo Ig de ler arquivos e selecione uma leitura adequada, com boa variedade linear das normas para análise de dados detalhados.
    2. Selecione o programa de montagem de 4 parâmetros para traçar curvas padrão. Verifica o coeficiente da curva padrão (R2), que é necessária para ser > 0,98 para assegurar dados de boa qualidade.
    3. Verifique se os valores de OD405 de cada amostra diminuem com o aumento de fatores de diluição. Recupere a concentração de todos os poços da amostra diluída, clicando em "Desconhecidos".
    4. Selecione um poço apropriado de cada amostra com OD405 na faixa linear da curva padrão do isotipo Ig para o cálculo da concentração.
    5. Calcular o concentração de isotipo Ig de cada amostra usando a fórmula do soro: soro concentração Ig = concentração bem selecionada x fator de diluição.
  17. Plotar gráficos e realizar análises estatísticas usando um software adequado9,10,11. Fazer gráficos de dispersão vertical de soro níveis de isotipo Ig para comparar as respostas de Ig no mesmo ponto do tempo. Para estudos de resposta de memória TD, fazer as curvas de resposta do tempo-curso para examinar as respostas do isotipo Ig antes e após a imunização de reforço. Use barras de erro para mostrar o desvio padrão (SD) de cada grupo de amostras. Para comparar respostas de isotipo Ig entre dois genótipos de ratos, use o teste pareado t para dados bicaudal para determinar a significância estatística. Defina o valor de p < 0,05 como significativamente diferentes.

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Representative Results

Nós usamos este protocolo para investigar as funções de um regulador crítico do sistema imunológico, TRAF3, em TI e TD Ig isotipo respostas9,10,11. TRAF3, directa ou indirectamente regula a transdução de sinal de um número de receptores imunes inatos e adaptativos, incluindo a superfamília de receptores TNF, receptores Toll-like e T celular receptor/CD28, entre outros27,28. Nós hypothesize que TRAF3 desempenha funções distintas em subconjuntos de células imunes diferentes para regular as respostas de anticorpos. Para testar esta hipótese, determinamos a TI e TD Ig isotipo respostas usando ratos do KO TRAF3 condicionais que têm o gene Traf3 especificamente excluído em células B, células T ou células mieloides, respectivamente9,10, 11. Programações de coleção imunização e soro representativas para TI e TD Ig estudos são descritas na Figura 1. Representante de IgG1 e IgG2b ELISA resultados são mostrados na Figura 2 e Figura 3 para ilustrar como funciona a ELISA. Estes incluem a instalação de placa de padrões diluídos e amostras(Figura 2),uma imagem da placa após a adição do substrato AP (Figura 2B), os resultados de leitura de OD405 (C, 2D(Figura 2), os valores de diluições padrão (Figura 2E, 2F), as curvas padrão (Figura 3A, 3B), os valores das amostras diluídas (Figura 3C, 3D) e o cálculo de soro IgG1 e IgG2b concentrações nas amostras (Figura 3E, 3F). A Figura 4 mostra os resultados representativos de isotipos de Ig totais no soro de ratos ingênuos. Temos demonstrado aumento estatisticamente basal sérica de IgM, IgG2a, IgG2b, IgG3 e IgA na célula B-específica TRAF3- / - (B-TRAF3- / -) ratos em relação ao sexo e idade-correspondência TRAF3-suficiente littermate controle os ratos (LMC). Este hiperglobulinemia de B-TRAF3- / - ratos é causada pelo compartimento expandido de células B em órgãos linfoides secundários devido a sobrevivência prolongada de maduro TRAF3- / - B células9. A Figura 5 mostra os resultados representativos de TI e TD Ig isotipo respostas de ratos a imunização com TNP-polissacarídeo e TNP-KLH, respectivamente. Estes resultados revelaram um TI significativamente maior, IgG3 TNP específicos e também TD elevado, TNP específicas IgG2b níveis em mieloide célula específica TRAF3- / - (M-TRAF3- / -) ratos do que na LMC. Tal aumento TI IgG3 e TD IgG2b respostas observadas em M-TRAF3- / - ratos são provavelmente devido a aumento da produção de citocinas pró-inflamatórias IL-6 e IL-12 por TRAF3- / - macrófagos e DCs imunização11a seguir. A Figura 6 mostra os resultados representativos de TD primária e as respostas de memória de ratos a imunização do TNP-KLH. Estes resultados demonstraram resposta primária de TD IgM parcialmente diminuída e IgG1 com defeito primário e respostas de memória em ratos de células T específicas TRAF3- / - (T-TRAF3- / -). O TD com defeito primário e respostas de memória do T-TRAF3- / - resultado de ratos de ativação prejudicada de TRAF3- / - células T CD4 receptor de células T e CD28 noivado co10. Tomados em conjunto, o protocolo descrito neste artigo nos permitiu delinear as funções específicas de TRAF3 em subconjuntos de células imunes diferentes na regulação de TI e TD Ig isotipo respostas em camundongos.

Figure 1
Figura 1 : Típico de TI e TD Ag imunização e soro programações coleção. (A) TNP-polissacarídeo experimentos. (B) TNP-KLH experiências. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Representante IgG1 e IgG2b ELISA. (A), a configuração da placa de 96 poços inclui poços de blank, 7 diluições em série (1:2) de rato IgG1 e IgG2b padrões (St01 para St07), e 4 diluições em série (às 01:10) do soro 8 rato amostras (S1 a S8). A concentração das normas é dado bem na parte inferior de cada padrão. O fator de diluição das amostras é dado bem no fundo de cada amostra. (B) uma imagem da placa em 5 min após a adição do substrato AP. A placa ler resultados de IgG1 (C) e IgG2b (D) em 405 nm. Os valores de OD405 e concentrações de diferentes diluições do rato IgG1 (E) e mouse IgG2b (F) padrões. Conc, concentração; BackCalcConc, volta calculada a concentração; OD, densidade óptica; AvgOD, OD média das repetições; SD, desvio-padrão; CV, coeficiente de variação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Análise de dados representante IgG1 e ELISA IgG2b. As curvas padrão de IgG1 (A) e IgG2b (B). O coeficiente R2 é > 0,98 em ambas as curvas padrão. As setas indicam o intervalo linear das curvas padrão. Valores de OD405 e concentrações de IgG1 (C) e IgG2b (D) em incógnitas (amostras de soro diluído). R, gama; Conc, concentração. Cálculo das concentrações de soro de rato de IgG1 (E) e mouse IgG2b (F) para as 8 amostras. ND, não detectável por este ELISA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Resultados representativos de isotipos de Ig totais no soro de ratos ingênuos. Soros foram coletados de gênero-combinadas, 10-12 semanas de idade ingênua LMC e B-TRAF3- / - ratos (n = 10 para cada genótipo; fundo genético: 129xC57BL/6). Os níveis séricos basais de IgM total, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA e IgE foram determinados por ELISA. Determinou-se a significância estatística com o teste pareado t para dados bicaudal. *, significativamente diferente entre LMC e B-TRAF3- / - ratos (p < 0,05); * *, muito significativamente diferentes entre LMC e B-TRAF3- / - ratos (p < 0,01). Esta figura foi modificada de Xie et al. 9. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : Resultados representativos de TI e TD Ig isotipo respostas ao TNP-polissacarídeo e TNP-KLH imunização, respectivamente. Sexo-combinadas, 8-12 semanas de idade LMC e M-TRAF3- / - ratos (fundo genético: C57BL/6) foram imunizadas com 50 µ g de TI Ag TNP-polissacarídeo (painel superior, n = 9 para cada genótipo) ou 100 µ g de TD Ag TNP-KLH misturado com alum (painel inferior, n = 12 para cada genótipo). Soros foram coletados no dia 7 após a imunização. Concentração de soro de IgM anti-TNP, IgG1, IgG2b, IgG3, IgA e IgE foram analisada por ELISA. Significância estatística foi analisada com o teste pareado t para dados bicaudal. *, significativamente diferente entre LMC e M-TRAF3- / - ratos (p < 0,05). Esta figura foi modificada de leite et al. 11. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6 : Resultados representativos de respostas de Ig primária e memória TD a imunização do TNP-KLH. Sexo-combinadas, 8-10 semanas de idade LMC e T-TRAF3- / - ratos (n = 10 para cada genótipo; fundo genético: 129xC57BL/6) foram imunizadas com 100 µ g do TD Ag TNP-KLH misturado com alum no dia 0. Cada rato também recebeu uma imunização de reforço com o mesmo Ag e adjuvante no dia 21, após a primeira imunização. Amostras de soro foram coletadas de ratos no dia -7, 7, 14 e 28, respectivamente. Níveis de IgM e IgG1 TNP específicos em amostras de soro foram medidos por ELISA. Gráficos mostram os resultados de 10 pares de LMC e T-TRAF3- / - os ratos (média ± DP). Significância estatística foi analisada com o teste pareado t para dados bicaudal. *, significativamente diferente entre LMC e T-TRAF3- / - ratos (p < 0,05); * *, muito significativamente diferentes entre LMC e T-TRAF3- / - ratos (p < 0,01); , altamente significativamente diferentes entre LMC e T-TRAF3- / - ratos (p < 0,001). Esta figura foi modificada de Xie et al. 10. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Aqui, descrevemos o protocolo para a caracterização de TD e TI Ig isotipo respostas nos ratos usando ELISA. Sucesso da implementação do presente protocolo requer o uso de materiais especificados na tabela 1, incluindo placas de ensaio de ELISA, imunização Ags, anticorpos de isotipo específico do Ig e padrões. Deve ter cuidado para evitar o uso de placas de cultura de tecidos tratada por ELISA. Diluições dos padrões e amostras de soro devem ser feitas em chapas separadas não tratadas (fundo redondo) e em seguida adicionadas para as placas de ELISA. Usando este protocolo, consistentemente obtivemos resultados confiáveis com sensibilidade e alta especificidade.

Passos críticos neste protocolo incluem imunização Ag retrô-orbital de sangramento e Ig isotipo específico ELISA. Para a imunização de TD Ag, mistura do TNP-KLH/alum deve ser completamente resuspended para garantir o correto montante de Ag/adjuvante é injetado. Se os coágulos de sangue no tubo capilar ou pipeta durante retrô-orbital de sangramento, imediatamente mude para um novo tubo de pipeta ou capilar. Buffers e reagentes usados em ELISA devem ser soluções claras e não devem conter precipitados, que podem dar resultados falso-positivos com valores anormais de405 OD. Além disso, as bolhas devem ser evitadas em poços em todas as etapas de ELISA, que também podem dar resultados falsos positivos ou falsos negativos com valores anormais de405 OD. Esses erros ocasionais podem ser minimizados através da análise de amostras em duplicatas. Etapas de lavagem em ELISA remover os reagentes não acoplados e anticorpos dos poços. Lavagem insuficiente faz com que o ruído de fundo elevado, mas a lavagem excessiva pode conduzir a uma diminuição da sensibilidade, removendo antígenos revestidos ou limite de anticorpos29. O número de vezes de lavagem descritas no presente protocolo de ELISA é otimizado com base em nossa experiência.

Deve notar-se que a ELISA tem limites de detecção, que normalmente são definidos pela faixa linear das curvas padrão. Para corretamente quantificar a concentração de soro de cada isotipo Ig, as amostras devem ser apropriadamente diluído para caber dentro da escala linear das curvas padrão. Recomendamos que teste diluições em série das amostras para selecionar os fatores de diluição adequada para o cálculo da concentração de Ig conforme descrito neste protocolo. No entanto, se os resultados mostram que os fatores de diluição testados não dão resultados na faixa linear da curva padrão, adicionais ELISA precisa ser executada usando fatores de diluição, ajustados de acordo com os resultados iniciais de ELISA. Se todas as diluições testadas estão abaixo do limite inferior de detecção, amostras de soro original e menor diluição de fatores precisa ser usado. Se os valores de OD405 não mostram diminuição proporcional com aumentar o factor de diluição para todas as diluições de série testada, isso indica que a captura Ab ou revestimento Ag está saturado por todas amostras diluídas e ainda mais fatores de diluição maiores precisam ser usado. Na sequência deste protocolo, serão obtidos resultados conclusivos com no máximo 2 rodadas de ELISA.

Fatores que são conhecidos por influenciar respostas de anticorpos em ratos incluem a estirpe (fundo genético), gênero, idade, dieta e facilidade animais ambiente30,31,32,33,34 . Por exemplo, embora muitas estirpes de rato produzem IgG2a, certas cepas como camundongos C57BL/6 não produzem IgG2a mas produzem IgG2c em vez de35,36. Evidências recentes também identifica microbiota comensal como um fator que afeta a anticorpo respostas37,38,39,40. Tomar esses fatores em consideração, recomendamos o uso do gênero de correspondência, jovens adultos littermates de genótipos diferentes que compartilham os mesmos pais e gaiolas para TD e TI Ag experiências de imunização. Além disso, do rato a variação é frequentemente observada para ratos com o mesmo genótipo (Figura 4–6), números suficientes de replicar (tipicamente, n > 8) dos ratos são necessários para cada genótipo ou grupo para obter estatisticamente resultados significativos.

O Ig isotipo específico ELISA é útil para determinar a concentração de diferentes isotipos de Ig. No entanto, este método sozinho não é suficiente para revelar as causas subjacentes das diferenças observadas nos títulos do isotipo Ig e, portanto, é frequentemente usado em combinação com uma variedade de abordagens complementares. Para diferenciar se a diferença de concentração de isotipo Ig é causada por diferentes números de células B produtoras de Ig ou eficiência diferente de células B na produção de Ig, fluxo cytometry41,42,43 e Enzyme-Linked ImmunoSpot (ELISPOT)43,44,45 pode ser usado. Para analisar a célula B sobrevivência, proliferação e formação do centro germinativo, métodos alternativos incluem citometria de fluxo, em vitro cultura de pilhas de B splenic e coloração imuno-histoquímica, seguido por microscopia9,26 ,41,46,47. Para elucidar as mudanças no isotipo Ig respostas nas células B, em vitro cultura de pilhas de B splenic e quantitativos de comutação RT-PCR do germline transcrições de Ig de segmentos de gene da cadeia pesada são comumente usado41,43 ,48,49. Para investigar a causa das diferenças de maturação de afinidade, somática (SHM) do gene da cadeia pesada Ig é determinada pelo sequenciamento do VDJ região50,,51,52. Para entender as diferenças nas respostas de células B de memória, a frequência e o número de subconjuntos de células B de memória diferente após imunização Ag pode ser analisada pelo fluxo cytometry usando recentemente identificados marcadores de células de memória B do mouse, incluindo CD38, CD80, CD73, PD-L2, CD62L e CCR68,53,54,55. Juntos, esses métodos complementares utilizados em combinação com o atual protocolo permitirá aos pesquisadores uma compreensão abrangente das respostas de anticorpos em um determinado ambiente experimental.

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Disclosures

Os autores têm sem interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Este estudo foi suportado pelos institutos nacionais de subsídios saúde R01 CA158402 (P. Xie) e R21 AI128264 (P. Xie), o departamento de defesa conceder W81XWH-13-1-0242 (P. Xie), um prêmio de piloto o Cancer Institute de New Jersey através do Grant número P30CA072720 do Instituto Nacional de câncer (P. Xie), uma concessão biomédica Busch (P. Xie), uma bolsa de Victor Stollar (a. leite) e um B. Anne e James B. Leathem Fellowship (S. Zhu).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VersaMax Tunable Microplate Reader MDS Analytical Technologies VERSAMAX Equipment to read the plates
SOFTmax PRO 5.3 MDS Analytical Technologies SOFTmax PRO 5.3 Software for the plate reader
GraphPad Prism GraphPad Prism Software for graphing and statistics
TNP-AECM-polysaccharide (FICOLL) Biosearch Technologies F-1300-10 A TI Ag for immunization
TNP-KLH Biosearch Technologies T-5060-5 A TD Ag for immunization
TNP(38)-BSA Biosearch Technologies T-5050-10 (conjugation ratio: 38) Coating Ag for TNP-specific ELISA
TNP(3)-BSA Biosearch Technologies T-5050-10 (conjugation ratio: 3) Coating Ag for high affinity TNP-specific Ig
Imject Alum Fisher Scientific  PI-77161 Alum adjuvant for immunization
Falcon Polypropylene tubes Fisher Scientific  14-959-11A For incubation of TNP-KLH/alum
BD Insulin Syringe Fisher Scientific  14-829-1B For i.p. injection of mice
Immuno 96-Well Plates, Flat-Bottom Fisher Scientific  14-245-61 For ELISA
Untreated 96-Well Microplates, Round-Bottom VWR 82050-622 For serial dilutions of standards and samples
Phosphatase substrate, 5 mg Tablets Sigma S0942-200TAB AP substrate
Diethanolamine VWR IC15251690 A component of AP substrate buffer
Goat anti-mouse IgM SouthernBiotech 1020-01 Capture Ab for mouse IgM
Goat anti-mouse IgG1 SouthernBiotech 1070-01 Capture Ab for mouse IgG1
Goat anti-mouse IgG2a SouthernBiotech 1080-01 Capture Ab for mouse IgG2a
Goat anti-mouse IgG2b SouthernBiotech 1090-01 Capture Ab for mouse IgG2b
Goat anti-mouse IgG3 SouthernBiotech 1100-01 Capture Ab for mouse IgG3
Goat anti-mouse IgA SouthernBiotech 1040-01 Capture Ab for mouse IgA
Goat anti-mouse IgE SouthernBiotech 1110-01 Capture Ab for mouse IgE
AP-Goat anti-mouse IgM SouthernBiotech 1020-04 Detection Ab for mouse IgM
AP-Goat anti-mouse IgG1 SouthernBiotech 1070-04 Detection Ab for mouse IgG1
AP-Goat anti-mouse IgG2a SouthernBiotech 1080-04 Detection Ab for mouse IgG2a
AP-Goat anti-mouse IgG2b SouthernBiotech 1090-04 Detection Ab for mouse IgG2b
AP-Goat anti-mouse IgG3 SouthernBiotech 1100-04 Detection Ab for mouse IgG3
AP-Goat anti-mouse IgA SouthernBiotech 1040-04 Detection Ab for mouse IgA
AP-Goat anti-mouse IgE SouthernBiotech 1110-04 Detection Ab for mouse IgE
Mouse IgM standard BD Biosciences 553472 TNP-specific IgM, Clone  G155-228
Mouse IgG1 standard BD Biosciences 554054 TNP-specific IgG1, Clone  107.3
Mouse IgG2a standard BD Biosciences 556651 TNP-specific IgG2a, Clone  G155-178
Mouse IgG2b standard BD Biosciences 554055 TNP-specific IgG2b, Clone  49.2
Mouse IgG3 standard BD Biosciences 553486 KLH-specific IgG3, Clone  A112-3
Mouse IgA standard BD Biosciences 550924 Mineral oil-induced IgA, Clone  MOPC-320
Mouse IgE standard BD Biosciences 557079 TNP-specific IgE, Clone  C38-2

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Imunologia e infecção edição 139 antigénio de Timo-dependentes (TD) antígeno de (TI) timo-independente imunoglobulinas (Ig) isotipo Ig resposta de memória imunização adjuvante ensaio imunoenzimático (ELISA)
Caracterização das respostas de isotipo de imunoglobulina Timo-dependentes e Timo-independente nos ratos usando ensaio enzima-lig da imunoabsorção
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Lalani, A. I., Zhu, S., Xie, P. Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay. J. Vis. Exp. (139), e57843, doi:10.3791/57843 (2018).

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