Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Karakterisering av Thymus-beroende och oberoende av Thymus immunglobulin isotypen Svaren hos möss använder Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Published: September 7, 2018 doi: 10.3791/57843
Automatic Translation
1, 1, 2,3
1Department of Cell Biology and Neuroscience and Graduate Program in Cellular and Molecular Pharmacology, Rutgers University, 2Department of Cell Biology and Neuroscience, Rutgers University, 3Rutgers Cancer Institute of New Jersey

Summary

I detta papper beskriver vi ett protokoll för att karakterisera T-beroende och T-oberoende immunglobulin (Ig) isotypen svaren i möss med hjälp av ELISA. Denna metod används ensamt eller i kombination med flöde flödescytometri tillåter forskare att identifiera skillnader i B cell-medierad Ig isotypen Svaren hos möss efter T-beroende och T-oberoende antigen immunisering.

Abstract

Antikroppar, också betecknas som immunoglobuliner (Ig), utsöndras av differentierade B-lymfocyter, plasmablasts/plasma celler, i humorala immuniteten ger en formidabel försvar mot invaderande patogener via olika mekanismer. Ett huvudsyfte med vaccination är att inducera skyddande antigen-specifika antikroppar att förhindra livshotande infektioner. Både bräss-beroende (TD) och thymus-oberoende (TI) antigener kan framkalla robust antigen-specifika IgM svaren och kan även inducera produktion av isotyp-bytte antikroppar (IgG, IgA och IgE) samt generering av minnesceller B med hjälp som tillhandahålls av antigenpresenterande celler (APC). Här beskriver vi ett protokoll för att karakterisera TD och TI Ig isotypen svaren i möss med glykoproteinenzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA). I detta protokoll, är TD och TI Ig Svaren framkallas hos möss av intraperitoneal (IP) immunisering med hapten-konjugerad modell antigener TNP-KLH (i Alun) och TNP-polysackarider (i PBS), respektive. För att inducera TD minne svar, ges en booster immunisering av TNP-KLH i alum på 3 veckor efter den första immunisering med samma antigen/adjuvans. Mus sera skördas vid olika tidpunkter före och efter immunisering. Totalt Ig serumnivåer och TNP-specifika antikroppar kvantifieras därefter med Ig isotyp-specifika smörgås och indirekt ELISA, respektive. För att korrekt kvantifiera serumkoncentrationen av varje Ig isotypen, behöver proverna spädas på lämpligt sätt för att passa i det linjära området av standard kurvor. Använder detta protokoll, har vi konsekvent få pålitliga resultat med hög specificitet och känslighet. När används i kombination med andra kompletterande metoder såsom flödescytometri, in vitro- kultur av mjälten B-celler och immunhistokemisk tillåter färgning (IHC), detta protokoll forskare att få en omfattande förståelse av antikropp svaren i en viss experimentella inställning.

Introduction

B-lymfocyter är den viktigaste spelaren i humoral immunitet och den enda Celltypen i däggdjur som klarar producera antikroppar, också betecknas som immunoglobuliner (Ig)1,2. Antikroppar utsöndras av B-celler ger en formidabel försvar mot invaderande patogener via olika mekanismer, inklusive neutralisering, opsonization och komplementaktivering, leder till skyddande immunitet3. Utsöndringen av antikroppar av B-celler uppnås endast efter fullständig aktivering av specifika B-celler, vilket normalt kräver två separata signaler3. Signal 1 vidarebefordras genom direkta bindning av antigenet (Ag) till B-cells receptor (BCR) uttrycks på ytan av specifika naiva B celler3. Beroende på källan Signal 2, kan B-cellaktivering delas in i thymus-beroende (TD) eller thymus-oberoende (TI)3,4. En TD antigen svar lämnas Signal 2 aktiverade cognate CD4 T helper (TH) celler, som uttrycker CD154, liganden för co-stimulatory receptorn CD40 uttryckt på B celler1,2,3. En TI antigen svar, Signal 2 kommer från antingen engagemang av Toll-liknande receptorer (TLR vid typ 1 TI Ag) eller omfattande cross-linking av de bindande företagsbestämmelser (vid typ 2 TI Ag) på B-celler3,4. Typ 1 TI (TI-1) antigener är mikrobiell ligander av TLRs, inklusive bakteriella lipopolysackarider (LPS), viral RNAs, och mikrobiell CpG DNA4,5. Typ 2 TI (TI-2) antigener har mycket repetitiva struktur, och kan leverera långvarig och ihållande signalering till B-cellen av flera cross-linking av bindande företagsbestämmelser4,6. Typiska exempel av TI-2 antigen är pneumokocker polysackarider och hapten-konjugerade polysackaridvaccin6,7. Både TD och TI antigener kan framkalla robust antigen-specifika IgM svaren och kan även inducera produktion av isotyp-bytte antikroppar (IgG, IgA och IgE) med hjälp som tillhandahålls av antigenpresenterande celler (APC) såsom dendritiska celler (DCs)1 ,2,3. Dessutom både TD och TI antigener kan inducera minne svaren med hjälp av trupptransportfordon, men TD antigener är effektivare framkalla minne B cell generation3,8.

I detta protokoll, är TD och TI Ig Svaren framkallas hos möss av intraperitoneal (IP) immunisering med hapten-konjugerad modell antigener 2,4,6-trinitrophenyl-keyhole limpet hemocyanin (TNP-KLH) och TNP-polysackarid (neutral, mycket Grenade och stor massa) respektive9,10,11. TD antigener används vanligen med ett adjuvans för att öka produktionen av antikroppar12. Här i våra protokoll injiceras TNP-KLH med Alun, ett vanligt förekommande adjuvant i immunisering studier12. Andra exempel på tillsatser som kan användas är fullständig eller ofullständig Freund's adjuvans (CFA eller IFA), monophosphoryl-lipid A / trehalos dicorynomycolate (”Ribi” adjuvans) och CpG oligodeoxynucleotides, etc.13, 14. efter immunisering, mus sera skördas vid olika tidpunkter och TNP-specifika antikroppar i sera kvantifieras med Ig isotyp-specifika enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)9,10, 11.

ELISA är en tallrik-baserad analys som ofta används som ett diagnostiskt verktyg i medicin och även som ett analytiskt verktyg i biomedicinsk forskning15,16. Det används för att påvisa och kvantifiera analyter inklusive antikroppar, hormoner, cytokiner, chemokiner, och olika antigener, etc. ELISA kan utföras i flera olika format, inklusive direkta, indirekta, smörgås och konkurrenskraftiga ELISA15,16. I allmänhet innebär det immobilisering av antigenet på en fast yta, vanligtvis en 96 brunnar mikrotiterplattan, som ruvas av en primär antikropp. Efter inkubation tvättas den obunden antikroppen bort. I en direkt ELISA, primära antikroppen är direkt konjugerat med ett enzym (vanligtvis pepparrotsperoxidas eller alkaliskt fosfatas), som kan klyva ett kromogent substrat för att ge en synlig färgförändring upptäcks av ett signaldetektion instrument såsom en spektrofotometer15,16. Däremot om en enzymkopplad sekundär antikropp används för att binda den primär antikroppen, anses då detta som en indirekt ELISA15,16. Direkt ELISA är snabbare medan indirekt ELISA är känsligare15,16. I en sandwich-ELISA, plattorna är belagda med en ”fånga” antikropp används för att immobilisera antigenet sevärdheter i proven och sedan fångade antigenet kan upptäckas av en annan ”upptäckt” antikropp i en direkt eller indirekt sätt15, 16. Sandwich ELISA erbjuder hög specificitet eftersom antigenet påvisas genom två olika antikroppar av antigenet. I ett kompetitivt ELISA, tävlingen upprättas mellan prov antigenet och plattan-bundna antigenet för bindning till primära antikroppen och då koncentrationen av antigen i provet kvantifieras genom att mäta minskningen av signalen från underlaget 15 , 16. kompetitiva ELISA-test kan utföras i ovan nämnda direkta eller indirekta format och är användbart för att upptäcka små antigener med endast en epitop15,16.

Alternativa tekniker för mätning av antikroppar inkluderar radioimmunoassay (RIA), elektrokemiluminescens (ECL) test och ytan plasmon resonans (SPR) assay17. RIA var den första immunoassay utvecklade som mäter förekomsten av ett antigen (eller antikropp) med hög specificitet och känslighet med radiomärkt reagenser18,19. Men på grund av oro som radioaktiva toxicitet, kostnader för bortskaffande, hållbarhet och speciella licenser att arbeta med radioaktivt material, ELISA är en bättre och bekvämare teknik för common använder20,21. ECL är en mycket känslig analys där Kemiluminiscens reaktioner initieras använder el för att generera mycket reaktiva arter från stabil prekursorer på ytan av en elektrod och kan användas för att mäta mängden analyter (såsom antigener eller antikroppar)22. Dock ECL kräver ett speciellt instrument och därmed så brett används inte som ELISA23. SPR är en direkt som kan användas för att mäta bindningen av ligander (t.ex., antikroppar) till orörlig molekyler (t.ex., antigener) på en sensor chip ytan24. SPR upptäcker interaktioner i realtid mycket specifikt och kräver inte användning av märkta reagenser som i ELISA. SPR också kräver emellertid en särskild utrustning och har lägre känslighet än ELISA17. ELISA med tanke på begränsningarna av alternativa metoder, och är den mest lämpliga och bekväma tekniken för vårt syfte i detta protokoll. Här, beskriver vi användningen av sandwich-ELISA för analys av totalt Ig isotypen nivåer och förfarandena i indirekt ELISA för analys av antigen-specifika Ig isotyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Detta protokoll följer riktlinjerna i institutionella djurförsök etikkommitté Rutgers University. Alla möss används enligt NIH riktlinjer och i ett djurs protokoll som godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén.

1. beredning av möss och samling av naiva mus serum

  1. Hålla alla möss för immunisering experiment i ett specifikt patogenfria djuranläggningen.
  2. Användning kön-matchade, ung vuxen (8 – 12 veckor gamla) knockout och littermate kontroll möss som delar samma föräldrar och burar för immunisering studier.
  3. Planera immunisering och serum samling scheman som avbildas i figur 1.
  4. Skörda naiva serum hos varje mus på 7 dagar (-7 dagar) före immunisering. Följ de retro-orbital blödning och serum förberedelse förfarandena som anges nedan i steg 4.

2. beredning av TNP-polysackarid (en TI-Antigen) och TNP-KLH (en TD Antigen)

  1. Lös upp antigen pulver i sterila PBS (pH 7,4) noga för att göra 0,5 mg/mL av TNP-polysackarid materiel och 1 mg/mL av TNP-KLH stamlösningar. Alikvotens varje antigen stamlösning i sterila microfuge rör på 0,5 mL/tub, och hålla alikvoter vid-80 ° C för långsiktig lagring. Undvik flera frysa och Tina i antigen alikvoter.
  2. Den injektion dag, beräkna volymen av TNP-polysackarid (50 µg/100 µL/mus) eller TNP-KLH (100 µg/100 µL/mus) behövs beroende på antalet möss som skall injiceras. Tina lämpligt antal TNP-polysackarid eller TNP-KLH alikvoter vid rumstemperatur (RT).
  3. TNP-KLH injektionsvätska, först späd Alun adjuvans (40 mg/mL) med 3 volymdelar steril fosfatbuffrad Koksaltlösning till en slutlig koncentration på 10 mg/mL. Kontrollera att Alun adjuvant blandningen är väl svävande före utspädning.
  4. Kombinera lika stor volym av 10 mg/mL Alun adjuvant flytgödsel från steg 2.3 och den tinade TNP-KLH lösningen (1 mg/mL) i en 5 mL polypropylen rör, blanda väl och inkubera vid 37 ° C i 30 min. Förbered detta TNP-KLH/alum blanda färsk före injektionen.

3. immunisering av möss

  1. Utföra intraperitoneal (IP) injektion av TNP-polysackarid eller TNP-KLH/alum vaccinera möss med 1 mL insulinsprutor i biosäkerhet skåp. För in nålen vid cirka 30° vinkel företrädesvis i den nedre högra kvadranten av varje mus att förhindra injektion i inre organ.
  2. Injicera i.p. 100 µL TNP-polysackarid per mus på dag 0 för TI Ag immunisering (figur 1A).
  3. Injicera i.p. 200 µL TNP-KLH/alum mixen (nyberedd i steg 2,4) per mus på dag 0 för TD Ag immunisering. Upprepa samma injektion på dag 21 som en booster immunisering för minne studier (figur 1B).
  4. Efter injektionen återvända varje mus till sin bur och hålla alla injicerade mössen i specifikt patogenfria skick.

4. retro-orbital blödning och Serum förberedelse

  1. Skörda mus sera vid olika tidpunkter: för TNP-polysackarid immunisering, samla mus sera dag -7 och 7 (figur 1A). för TNP-KLH/alum immunisering, samla in mus sera dag -7, 7, 14 och 28 (figur 1B).
  2. För Retro-orbital blödning, söva varje mus med 5% isofluran i 1 – 2 min i en biosäkerhet skåp25. Utföra pedal reflex för att säkerställa adekvat anestesi av varje mus.
  3. Håll sövda musen i ena handen med pekfingret och tummen att dra huden runt ögongloben tillbaka så att ögongloben sticker ut ur uttaget25. Infoga en icke-hepariniserad Pasteur-pipett eller kapillärrör med en vinkel på 45° i inre hörnet av ögonhålan under ögongloben25.
  4. Applicera lätt nedåtgående tryck och rotera pipett eller röret försiktigt att bryta in i venen och samla 150 – 200 µL blod i pipett eller tube. Omedelbart överföra blod till en steril 1,5 mL mikrofugrör och återgå musen till sin bur att återvinna.
  5. Låt blodet prover sitta vid RT för 1 – 2 h koagulerar.
  6. Centrifugera koagulerat blodproverna vid 13 000 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Överföra klart serum ovanpå blodpropp till en ny steril 1,5 mL mikrofugrör.
  7. Upprepa steg 4,6 en gång att ta bort kvarvarande blodpropp och samla tydlig serum.
  8. Alikvot serumet in sterila 1,5 mL microfuge rören på 50 µL/tube, och lagra sera vid-80 ° C.
  9. Alternativa ögat för blödning vid olika tidpunkter så att varje öga är blödde högst två gånger för hela experimentet. Vid terminalen blödning, samla upp till 1 mL blod från varje mus innan eutanasi. Avliva musen med 5% CO2 följt av cervikal dislokation.
    Obs: Mjälten B-celler kan skördas för flödescytometrisk flödesanalyser och in vitro- kultur och samhälle. Vi förbereder också genomisk DNA från splenocytes att kontrollera vilken genotyp av varje mus.

5. mus Ig isotyp-specifik ELISA

  1. Förbereda den buffrar och lösningar innan ELISA.
    1. Förbereda 500 mL koppling buffert (PBS, pH 7,4).
    2. Förbereda 500 mL tvättlösning (PBS-T (0,05% Tween-20), pH 7,4).
    3. Bereda 100 mL blockerande buffert (1% BSA i PBS, pH 7,4, lagras vid 4 ° C).
    4. Förbereda 1 L substratbuffert (1 M dietanolamin, pH 9,8 (97 mL av dietanolamin i 1 L H2O, pH justeras med 10 M HCl) och 0,5 mM MgCl2). Ljuskänsligt Substratbufferten genom att Linda flaskan med aluminiumfolie. Förvaras vid 4 ° C.
    5. Förbereda 100 mL stopplösning (3 M NaOH).
  2. Päls ELISA-plattorna:
    1. För totala serum Ig isotypen ELISA, täck 96 brunnar immuno plattor med 10 µg/mL isotyp-specifika fånga polyklonala get antimus Ig (M, G1, G2a, G2b, G3, A eller E) Abs i koppling buffert (PBS) på 100 µL per brunn.
    2. För TNP-specifika Ig isotypen ELISA, täck 96 brunnar immuno plattor med 10 µg/mL TNP(38)-BSA i PBS på 100 µL per brunn.
    3. För hög affinitet TNP-specifika Ig isotypen ELISA, täck 96 brunnar immuno plattor med 10 µg/mL TNP(3)-BSA i PBS 100 µL per brunn26. Inkubera plattorna vid 4 ° C över natten.
  3. Efter beläggning inkubation, tvätta plattorna 2 gånger med 200 µL per brunn i PBS-T. Kassera tvättbufferten och blot torka plattorna (Knacka på varje tallrik uppochner på en bunt hushållspapper) efter varje tvätt.
  4. Blockera plattorna: Tillsätt 200 µL per brunn av Blocking buffert (1% BSA i PBS) belagda plattorna och inkubera plattorna för 1 h på RT.
  5. Medan plattorna blockerar, preparera utspädningar av Ig isotypen standarder och serumprover i blockerande buffert i en separat, obehandlade plattan med 96 brunnar på 150 µL per brunn.
    1. Förbereda 250 ng/mL Ig isotypen standarder som start standard koncentration (St01) och göra 7 till 10 av 1:2 seriespädningar av Ig standarder (St02 St07 eller St10, figur 2A).
    2. Förbereda mus serum prover vid spädningen 1: 100 eller 1: 500 faktor som den börja utspädningen och göra 3 eller 4 i 1:10 seriespädningar för totalt Ig isotypen eller 1:5 seriespädningar för TNP-specifika Ig isotypen i varje serumprov (figur 2A). För IgE ELISA, förbereda mus serumprover på en 1:2 utspädningsfaktor som den börja utspädningen och göra 3 av 1:5 seriespädningar av varje serumprov.
  6. Efter blockering, tvätta plattorna från steg 5,4 tre gånger med 200 µL per brunn av PBS-T och blot torka plattorna efter varje tvätt.
  7. Överför 100 µL per brunn av utspädda Ig isotypen standarder (lämplig för att fånga och upptäcka Abs) och utspädda serumprover från steg 5,5 till plattorna bereddes i steg 5,6. Inkubera plattorna med de standarder och prover vid 4 ° C över natten.
  8. Tvätta plattorna 3 gånger med 200 µL per brunn av PBS-T och blot torka plattorna efter varje tvätt.
  9. I varje platta, tillsätt 100 µL per brunn på 10 µg/mL av en lämplig alkaliskt fosfatas (AP)-konjugerade isotyp-specifika get antimus Ig (M, G1, G2a, G2b, G3, A eller E) Abs utspätt i blockerande buffert.
  10. Inkubera plattorna med AP-konjugerad Abs för 1-2 h på RT. För IgE detektering, inkubera plattorna för 1 – 2 timmar vid 37 ° C.
  11. Laga 1 mg/mL av substratlösningen genom att lösa två tabletter à 5 mg fosfatas substrat i 10 mL substratbuffert.
  12. Tvätta varje platta 5 gånger med 200 µL per brunn av PBS-T och blot torka plattorna efter varje tvätt.
  13. Tillsätt 100 µL per brunn av substratlösningen i varje platta. Låt reaktionen utvecklas i RT, som vanligtvis tar bara några minuter.
  14. Läs varje platta vid 405 nm med en microplate reader med dess tillhörande programvara.
    1. Klicka på ”Inställningar” för att ställa våglängderna ”Lm1” på ”405 nm” och klicka ”OK”.
    2. Klicka på ”mall” för att tilldela ”tomt” wells, ”standarder” wells och ”okänd” brunnar enligt inställningen för plattan med 96 brunnar.
    3. För ”standarder” wells, klicka ”Series” för att ange ”Första provet” som ”St01”, Välj ”Starta från” på ”topp” och ange ”replikerar” som ”2”. Kontrollera ”prov Descriptor” och ange ”Standardvärde”: Välj ”enheter” som ”ng/mL”, ”Start värde” som ”250”, ange ”steg” som ”2”. Klicka på ”OK”.
    4. Klicka på ”Läs” för att läsa plattan när mest koncentrerade standarden når en optisk densitet (OD) ~ 1.
    5. Klicka på denfil-menyn och klicka på ”Spara” för att spara filen.
    6. Klicka på ”Läs” för att läsa plattan igen när den mest koncentrerade standarden närmar sig OD405 ~ 1.5, 2 och 2.5, respektive.
  15. Stoppa reaktionen genom att lägga till 25 µL per brunn 3 M NaOH. Slutför steg 5.12 till 5.15 för en platta i taget.
  16. Analysera ELISA data med hjälp av programvara som är associerad med microplate reader:
    1. Kontrollera OD405 värdena Ig isotypen normer Läs filer och välj en lämplig läsning med bra linjär utbud av standarderna för detaljerad analys.
    2. Välj 4-Parameter montering programmet att rita standard kurvor. Kontrollera den co-effektiv standardkurvan (R2), som ska vara > 0,98 att säkerställa god datakvalitet.
    3. Kontrollera huruvida de OD405 värdena för varje prov minskar med ökande utspädningsfaktorer. Hämta koncentrationen av alla utspädda provet brunnar genom att klicka på ”okända”.
    4. Välj en lämplig väl av varje prov med OD405 i det linjära området av Ig isotypen standardkurvan för beräkning av koncentration.
    5. Beräkna serumet Ig isotypen koncentrationen av varje prov med hjälp av formeln: serum Ig koncentration = valda väl koncentrationen x utspädningsfaktor.
  17. Rita diagram och utföra statistiska analyser med hjälp av en lämplig programvara9,10,11. Gör lodräta spridningsdiagram serum Ig isotypen nivåer att jämföra Ig svaren vid samma tidpunkt. För TD minne svar studier, gör de tidsförlopp responskurvorna att undersöka Ig isotypen Svaren före och efter den booster immunisering. Använda felstaplar som visar standardavvikelsen (SD) för varje grupp av prover. För att jämföra Ig isotypen Svaren mellan två genotyper av möss, använda den oparat t -testet för tvåsidiga data för att avgöra den statistisk signifikansen. Ange den p värdet < 0,05 som betydligt olika.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har använt detta protokoll för att undersöka roller en kritisk regulator av immunförsvaret, TRAF3, TI och TD Ig isotypen Svaren9,10,11. TRAF3 direkt eller indirekt reglerar den signalera transductionen av ett antal medfödd och adaptiv immun receptorer, inklusive TNF receptor överfamiljen, Toll-liknande receptorer och T cell receptor/CD28, bland annat27,28. Vi bygger på att TRAF3 spelar olika roller i olika immunceller underdelar att reglera antikroppssvar. För att testa denna hypotes, bestäms vi TI och TD Ig isotypen svaren med hjälp av villkorliga TRAF3 knockoutmöss som har den Traf3 genen specifikt bort i B-celler, T-celler eller myeloida celler, respektive9,10, 11. Representativa immunisering och serum samling scheman för TI och TD Ig studier avbildas i figur 1. Representant IgG1 och IgG2b ELISA resultaten visas i figur 2 och figur 3 för att illustrera hur ELISA fungerar. Dessa inkluderar plattan inställningen av utspädda standarder och prover (figur 2A), en bild av plattan efter tillsats av AP substrat (figur 2B), Läs resultatet av OD405 (figur 2C, 2D), värdena för standard utspädningar (figur 2E, 2F), standard kurvorna (figur 3A, 3B), värdena för utspädda prover (figur 3C, 3D) och beräkningen av serum IgG1 och IgG2b koncentrationer i proverna (figur 3E, 3F). Figur 4 visar representativa resultat av totalt Ig isotyper i serum av naiva möss. Vi visat statistiskt ökad basal serumnivåer av IgG2a, IgG3, IgG2b, IgM och IgA i B-specifika TRAF3- / - (B-TRAF3- / -) möss jämfört med genus - och åldersmatchade TRAF3-tillräcklig littermate kontroll möss (LMC). Denna hyperglobulinemia av B-TRAF3- / - möss orsakas av det utökade B-cell facket i perifera lymfoida organ på grund av förlängd överlevnad av mogen TRAF3- / - B celler9. Figur 5 visar representativa resultat av TI och TD Ig isotypen Svaren av möss till immunisering med TNP-polysackarid och TNP-KLH, respektive. Dessa resultat visade en signifikant högre TI, TNP-specifika IgG3 nivå och även förhöjda TD, TNP-specifika IgG2b nivåer hos myeloida cell-specifika TRAF3- / - (M-TRAF3- / -) möss än i LMC. Sådana ökade TI IgG3 och TD IgG2b svar observerades i M-TRAF3- / - möss är sannolikt på grund av ökad produktion av den pro-inflammatoriska cytokiner som IL-6 och IL-12 av TRAF3- / - makrofager och DCs efter immunisering11. Figur 6 visar representativa resultat av TD primära och minne Svaren av möss till TNP-KLH immunisering. Dessa resultat visade delvis minskat TD IgM primära svar och defekta IgG1 primära och minne svaren i T-cell-specifika TRAF3- / - (T-TRAF3- / -) möss. Den defekta TD primära och minne svar av T-TRAF3- / - möss resultatet från nedsatt aktivering av TRAF3- / - CD4 T-celler vid T-cells receptor och CD28 samtidig förlovning10. Sammantaget det protokoll som beskrivs i denna artikel som tillät oss att avgränsa TRAF3 specifika roller i olika immunceller delmängder reglera TI och TD Ig isotypen Svaren hos möss.

Figure 1
Figur 1 : Typiska TI och TD Ag samling scheman för immunisering och serum. (A) TNP-polysackarid experiment. (B) TNP-KLH experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Representant IgG1 och IgG2b ELISA. (A), inställningen för plattan med 96 brunnar innehåller brunnarna av Tom, 7 seriella utspädningar (1:2) av Mus IgG1 och IgG2b standarder (St01 till St07), och 4 seriespädningar (på 1:10) av 8 mus serum prover (S1 till S8). Koncentrationen av standarder ges på botten av varje standard väl. Utspädningsfaktorn för proverna ges längst ned på varje prov väl. (B) en bild av plattan på 5 min efter tillsats av AP substrat. Plattan läsa resultat av IgG1 (C) och IgG2b (D) vid 405 nm. Värdena av OD405 och koncentrationer av olika spädningar av Mus IgG1 (E) och mus IgG2b (F) standarder. Conc, koncentration. BackCalcConc, tillbaka beräknas koncentrationen. OD, optisk täthet; AvgOD, genomsnittliga OD av replikerar den; SD, standardavvikelse; CV, variationskoefficient. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Representant IgG1 och IgG2b ELISA dataanalys. IgG1 standard kurvor (A) och IgG2b (B). Den co-effektiva R2 är > 0.98 i både standard kurvor. Pilar indikerar det linjära området av standard kurvor. Värden av OD405 och koncentrationer av IgG1 (C) och IgG2b (D) i okända (utspädda serumprov). R, räckvidd; Conc, koncentration. Beräkning av mus serumkoncentrationer av IgG1 (E) och mus IgG2b (F) för 8 prover. ND, inte upptäckas av denna ELISA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Representativa resultat av totalt Ig isotyper i sera naiva möss. Sera samlades in från kön-matchade, 10-12 veckor gamla naiva LMC och B-TRAF3- / - möss (n = 10 för varje genotyp, genetisk bakgrund: 129xC57BL/6). Basala serumnivåer av totala IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA och IgE bestämdes genom ELISA. Statistisk signifikans bestämdes med oparat t -test för tvåsidiga data. *, signifikant skillnad mellan LMC och B-TRAF3- / - möss (p < 0,05); **, mycket signifikant skillnad mellan LMC och B-TRAF3- / - möss (p < 0,01). Denna siffra har ändrats från Xie et al. 9. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Representativa resultat för TI och TD Ig isotypen Svaren till TNP-polysackarid och TNP-KLH immunisering, respektive. Kön-matchade, 8-12 veckor gamla LMC och M-TRAF3- / - möss (genetisk bakgrund: C57BL/6) vaccinerades med 50 µg av TI Ag TNP-polysackarid (övre panelen, n = 9 för varje genotyp) eller 100 µg av TD Ag TNP-KLH blandat med Alun (nedre panelen, n = 12 för varje genotyp). Sera samlades på dag 7 efter immunisering. Serum-titrar av anti-TNP IgM, IgG1, IgG2b, IgG3, IgA och IgE analyserades av ELISA. Statistisk signifikans analyserades med oparat t -test för tvåsidiga data. *, signifikant skillnad mellan LMC och M-TRAF3- / - möss (p < 0,05). Denna siffra har ändrats från Lalani et al. 11. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Representativa resultat av TD primär och minne Ig Svaren till TNP-KLH immunisering. Kön-matchade, 8-10 veckor gamla LMC och T-TRAF3- / - möss (n = 10 för varje genotyp, genetisk bakgrund: 129xC57BL/6) vaccinerades med 100 µg av den TD Ag TNP-KLH blandas med Alun på dag 0. Varje mus fick också en booster immunisering med samma Ag och adjuvant på dag 21 efter den första immunisering. Serumprover samlades in från möss på dagen -7, 7, 14 och 28, respektive. TNP-specifika IgM och IgG1 nivåer i serumprov mättes med ELISA. Grafer visar resultaten av 10 par LMC och T-TRAF3- / - möss (genomsnitt ± SD). Statistisk signifikans analyserades med oparat t -test för tvåsidiga data. *, signifikant skillnad mellan LMC och T-TRAF3- / - möss (p < 0,05); **, mycket signifikant skillnad mellan LMC och T-TRAF3- / - möss (p < 0,01); , mycket signifikant skillnad mellan LMC och T-TRAF3- / - möss (p < 0,001). Denna siffra har ändrats från Xie et al. 10. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här beskriver vi protokollet för karakterisering av TD och TI Ig isotypen svaren i möss med hjälp av ELISA. Framgångsrikt genomförande av detta protokoll kräver användning av material som anges i tabell 1, inklusive immunisering Ags, mus Ig isotyp-specifika antikroppar, ELISA assay tallrikar och standarder. Vård bör vidtas för att undvika att använda vävnadsodling behandlade plattor för ELISA. Utspädningar av standarder och serumprov bör göras i separata obehandlad plattor (runda-ner) och sedan läggas in ELISA-plattorna. Använder detta protokoll, har vi konsekvent få pålitliga resultat med hög specificitet och känslighet.

Kritiska steg inom detta protokoll inkluderar Ag immunisering, retro-orbital blödning och Ig isotyp-specifik ELISA. För TD Ag immunisering, bör vara grundligt resuspended TNP-KLH/alum mix för att säkerställa att rätt mängd Ag/adjuvant injiceras. Om blodproppar i Pipettera eller kapillärrör under retro-orbital blödning, omedelbart byta till en ny Pipettera eller kapillär tub. Buffertar och reagenser som används i ELISA bör klara lösningar och bör inte innehålla fällningar, vilket kan ge falskt positivt resultat med onormal OD405 värden. Dessutom undvikas bubblor i brunnarna på alla ELISA steg, vilket också kan ge falska positiva eller falska negativa resultat med onormal OD405 värden. Dessa enstaka fel kan minimeras genom att analysera prover i dubbletter. Tvätt steg i ELISA bort obundna reagenser och antikroppar från brunnarna. Otillräcklig tvätt orsakar höga bakgrundsljud, men överdriven tvättning kan leda till en minskning i känslighet genom att ta bort belagda antigener eller bundna antikroppar29. Numrerar av tvätt gånger beskrivs i detta ELISA protokoll är optimerade utifrån vår erfarenhet.

Det bör noteras att ELISA har detektionsgränser, som oftast definieras av det linjära området av standard kurvor. För att korrekt kvantifiera serumkoncentrationen av varje Ig isotypen, behöver proverna spädas på lämpligt sätt för att passa i det linjära området av standard kurvor. Vi rekommenderar att du testar seriespädningar av proverna att välja lämplig utspädningsfaktorer för beräkning av Ig koncentration som beskrivs i detta protokoll. Dock om resultaten visar att de utspädningsfaktorer som testats inte ger resultat i det linjära området av standardkurvan, ytterligare ELISA måste utföras med utspädningsfaktorer justeras enligt de första resultaten av ELISA. Om alla de utspädningar som testats under nedre detektionsgränsen, behöver ursprungliga serumprover och mindre utspädningsfaktorer användas. Om OD405 -värdena inte visar proportionell minskning med ökande utspädningsfaktorn för alla seriespädningar testade, detta indikerar att fånga Ab eller beläggning Ag är mättad av alla utspädda prover och ytterligare högre utspädningsfaktorer behöver användas. Efter detta protokoll, har avgörande resultat uppnås med högst 2 rundor av ELISA.

Faktorer som är kända att påverka antikroppssvaret hos möss inkluderar stam (genetisk bakgrund), kön, ålder, diet och djuranläggningen miljö30,31,32,33,34 . Till exempel även många mus stammar producera IgG2a, vissa stammar som C57BL/6 möss producerar inte IgG2a men producera IgG2c istället35,36. Nya rön identifierar också kommensaler bakterieflora som en faktor som påverkar antikroppen Svaren37,38,39,40. Beakta dessa faktorer, rekommenderar vi användning av kön-matchade, unga vuxna syskon av olika genotyper som delar samma föräldrar och burar för TD och TI Ag immunisering experiment. Dessutom musen till musen variation ofta observeras för möss av samma genotyp (figur 4–6), tillräcklig replikera nummer (vanligtvis n > 8) möss behövs för varje genotyp eller grupp att få statistiskt meningsfulla resultat.

Ig-isotyp-specifik ELISA är användbar för att fastställa titrarna av olika Ig isotyper. Men denna metod ensam räcker inte för att avslöja de bakomliggande orsakerna till observerade skillnader i Ig isotypen titrar, och därför används ofta i kombination med en mängd kompletterande strategier. För att särskilja huruvida skillnaden i Ig isotypen titrar orsakas av olika antal Ig-producerande B-celler eller olika effektivitet av B-celler på Ig produktion, flow flödescytometri41,42,43 och Enzyme-Linked ImmunoSpot (ELISPOT)43,44,45 kan användas. För att analysera B cellöverlevnad, spridning och germinal center bildandet, inkluderar alternativa metoder flödescytometri, in vitro- kultur av mjälten B-celler och immunhistokemisk färgning följt av mikroskopi9,26 ,41,46,47. För att belysa förändringar i Ig isotypen byta svaren i B-celler, i vitro kultur av mjälten B-celler och kvantitativ används RT-PCR av könsceller avskrifter av Ig tung kedja gen segment är vanligen41,43 ,48,49. För att undersöka orsaken till skillnader i samhörighet mognad, bestäms somatisk hypermutation (SHM) av Ig tung kedja genen av sekvensering av VDJ regionen50,51,52. För att förstå skillnader i minne B cell svaren, frekvens och antal olika minne B cell undergrupper efter Ag immunisering kan analyseras genom flöde identifierat flödescytometri med nyligen markörer för mus minne B celler, inklusive CD38, CD80, CD73, PD-L2, CD62L och CCR68,53,54,55. Tillsammans, tillåter dessa kompletterande metoder som används i kombination med det nuvarande protokollet forskare att få en omfattande förståelse av antikroppssvaret hos en viss experimentella inställning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingen konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av National Institutes of Health bidrag R01 CA158402 (P. Xie) och R21 AI128264 (P. Xie), Department of Defense bevilja W81XWH-13-1-0242 (s. Xie), en Pilot Award från den Cancer Institute New Jersey genom Grant nummer P30CA072720 från National Cancer Institute (s. Xie), Busch biomedicinsk bidrag (s. Xie), en Stollar Victor-stipendiet (A. Lalani), och en Anne B. och James B. Leathem Fellowship (S. Zhu).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VersaMax Tunable Microplate Reader MDS Analytical Technologies VERSAMAX Equipment to read the plates
SOFTmax PRO 5.3 MDS Analytical Technologies SOFTmax PRO 5.3 Software for the plate reader
GraphPad Prism GraphPad Prism Software for graphing and statistics
TNP-AECM-polysaccharide (FICOLL) Biosearch Technologies F-1300-10 A TI Ag for immunization
TNP-KLH Biosearch Technologies T-5060-5 A TD Ag for immunization
TNP(38)-BSA Biosearch Technologies T-5050-10 (conjugation ratio: 38) Coating Ag for TNP-specific ELISA
TNP(3)-BSA Biosearch Technologies T-5050-10 (conjugation ratio: 3) Coating Ag for high affinity TNP-specific Ig
Imject Alum Fisher Scientific  PI-77161 Alum adjuvant for immunization
Falcon Polypropylene tubes Fisher Scientific  14-959-11A For incubation of TNP-KLH/alum
BD Insulin Syringe Fisher Scientific  14-829-1B For i.p. injection of mice
Immuno 96-Well Plates, Flat-Bottom Fisher Scientific  14-245-61 For ELISA
Untreated 96-Well Microplates, Round-Bottom VWR 82050-622 For serial dilutions of standards and samples
Phosphatase substrate, 5 mg Tablets Sigma S0942-200TAB AP substrate
Diethanolamine VWR IC15251690 A component of AP substrate buffer
Goat anti-mouse IgM SouthernBiotech 1020-01 Capture Ab for mouse IgM
Goat anti-mouse IgG1 SouthernBiotech 1070-01 Capture Ab for mouse IgG1
Goat anti-mouse IgG2a SouthernBiotech 1080-01 Capture Ab for mouse IgG2a
Goat anti-mouse IgG2b SouthernBiotech 1090-01 Capture Ab for mouse IgG2b
Goat anti-mouse IgG3 SouthernBiotech 1100-01 Capture Ab for mouse IgG3
Goat anti-mouse IgA SouthernBiotech 1040-01 Capture Ab for mouse IgA
Goat anti-mouse IgE SouthernBiotech 1110-01 Capture Ab for mouse IgE
AP-Goat anti-mouse IgM SouthernBiotech 1020-04 Detection Ab for mouse IgM
AP-Goat anti-mouse IgG1 SouthernBiotech 1070-04 Detection Ab for mouse IgG1
AP-Goat anti-mouse IgG2a SouthernBiotech 1080-04 Detection Ab for mouse IgG2a
AP-Goat anti-mouse IgG2b SouthernBiotech 1090-04 Detection Ab for mouse IgG2b
AP-Goat anti-mouse IgG3 SouthernBiotech 1100-04 Detection Ab for mouse IgG3
AP-Goat anti-mouse IgA SouthernBiotech 1040-04 Detection Ab for mouse IgA
AP-Goat anti-mouse IgE SouthernBiotech 1110-04 Detection Ab for mouse IgE
Mouse IgM standard BD Biosciences 553472 TNP-specific IgM, Clone  G155-228
Mouse IgG1 standard BD Biosciences 554054 TNP-specific IgG1, Clone  107.3
Mouse IgG2a standard BD Biosciences 556651 TNP-specific IgG2a, Clone  G155-178
Mouse IgG2b standard BD Biosciences 554055 TNP-specific IgG2b, Clone  49.2
Mouse IgG3 standard BD Biosciences 553486 KLH-specific IgG3, Clone  A112-3
Mouse IgA standard BD Biosciences 550924 Mineral oil-induced IgA, Clone  MOPC-320
Mouse IgE standard BD Biosciences 557079 TNP-specific IgE, Clone  C38-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moise, A., Nedelcu, F. D., Toader, M. A., Sora, S. M., Tica, A., Ferastraoaru, D. E., Constantinescu, I. Primary immunodeficiencies of the B lymphocyte. Journal of Medicine and Life. 3, 60-63 (2010).
  2. Bishop, G. A., Haxhinasto, S. A., Stunz, L. L., Hostager, B. S. Antigen-specific B-lymphocyte activation. Critical Reviews in Immunology. 23, 149-197 (2003).
  3. Murphy, K. Janeway's Immunobiology. 8th Edition. 1, (2012).
  4. Vinuesa, C. G., Chang, P. P. Innate B cell helpers reveal novel types of antibody responses. Nature Immunology. 14, 119-126 (2013).
  5. Bekeredjian-Ding, I., Jego, G. Toll-like receptors--sentries in the B-cell response. Immunology. 128, 311-323 (2009).
  6. Mond, J. J., Lees, A., Snapper, C. M. T cell-independent antigens type 2. Annual Review of Immunology. 13, 655-692 (1995).
  7. Garcia de Vinuesa, C., O'Leary, P., Sze, D. M., Toellner, K. M., MacLennan, I. C. T-independent type 2 antigens induce B cell proliferation in multiple splenic sites, but exponential growth is confined to extrafollicular foci. European Journal of Immunology. 29, 1314-1323 (1999).
  8. Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nature Reviews Immunology. 15, 149-159 (2015).
  9. Xie, P., Stunz, L. L., Larison, K. D., Yang, B., Bishop, G. A. Tumor necrosis factor receptor-associated factor 3 is a critical regulator of B cell homeostasis in secondary lymphoid organs. Immunity. 27, 253-267 (2007).
  10. Xie, P., Kraus, Z. J., Stunz, L. L., Liu, Y., Bishop, G. A. TNF Receptor-Associated Factor 3 Is Required for T Cell-Mediated Immunity and TCR/CD28 Signaling. The Journal of Immunology. 186, 143-155 (2011).
  11. Lalani, A. I., Moore, C. R., Luo, C., Kreider, B. Z., Liu, Y., Morse, H. C., Xie, P. Myeloid Cell TRAF3 Regulates Immune Responses and Inhibits Inflammation and Tumor Development in Mice. The Journal of Immunology. 194, 334-348 (2015).
  12. Lee, S., Nguyen, M. T. Recent advances of vaccine adjuvants for infectious diseases. Immune Network. 15, 51-57 (2015).
  13. Gavin, A. L., Hoebe, K., Duong, B., Ota, T., Martin, C., Beutler, B., Nemazee, D. Adjuvant-enhanced antibody responses in the absence of toll-like receptor signaling. Science. 314, 1936-1938 (2006).
  14. Klinman, D. M., Currie, D., Gursel, I., Verthelyi, D. Use of CpG oligodeoxynucleotides as immune adjuvants. Immunological Reviews. 199, 201-216 (2004).
  15. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133, 12 (2013).
  16. Shah, K., Maghsoudlou, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): the basics. British Journal of Hospital Medicine. 77, 98-101 (2016).
  17. Nencini, F., Pratesi, S., Petroni, G., Matucci, A., Maggi, E., Vultaggio, A. Assays and strategies for immunogenicity assessment of biological agents. Drug Development Research. 75, Suppl 1 4-6 (2014).
  18. Haber, E., Page, L. B., Richards, F. F. Radio immunoassay employing gel filtration. Analytical Biochemistry. 12, 163-172 (1965).
  19. Yalow, R. S., Berson, S. A. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man. 1960. Obesity Research. 4, 583-600 (1996).
  20. Lequin, R. M. Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Clinical Chemistry. 51, 2415-2418 (2005).
  21. Wreghitt, T. G., Tedder, R. S., Nagington, J., Ferns, R. B. Antibody assays for varicella-zoster virus: comparison of competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), competitive radioimmunoassay (RIA), complement fixation, and indirect immunofluorescence assays. Journal of Medical Virology. 13, 361-370 (1984).
  22. Mathew, B. C., Biju, R. S., Thapalia, N. An overview of electrochemiluminescent (ECL) technology in laboratory investigations. Kathmandu University Medical Journal. 3, 91-93 (2005).
  23. Mikulskis, A., Yeung, D., Subramanyam, M., Amaravadi, L. Solution ELISA as a platform of choice for development of robust, drug tolerant immunogenicity assays in support of drug development. The Journal of Immunological Methods. 365, 38-49 (2011).
  24. Wadhwa, M., Bird, C., Dilger, P., Gaines-Das, R., Thorpe, R. Strategies for detection, measurement and characterization of unwanted antibodies induced by therapeutic biologicals. The Journal of Immunological Methods. 278, 1-17 (2003).
  25. Wolforth, J. B. Methods of Blood Collection in the Mouse. Laboratory Animals. 29, 47-53 (2000).
  26. Stunz, L. L., Busch, L. K., Munroe, M. E., Sigmund, C. D., Tygrett, L. T., Waldschmidt, T. J., Bishop, G. A. Expression of the Cytoplasmic Tail of LMP1 in Mice Induces Hyperactivation of B Lymphocytes and Disordered Lymphoid Architecture. Immunity. 21, 255-266 (2004).
  27. Xie, P. TRAF molecules in cell signaling and in human diseases. Journal of Molecular Signaling. 8, 7 (2013).
  28. Lalani, A. I., Zhu, S., Gokhale, S., Jin, J., Xie, P. TRAF molecules in inflammation and inflammatory diseases. Current Pharmacology Reports. 4, 64-90 (2018).
  29. Tate, J., Ward, G. Interferences in immunoassay. The Clinical Biochemist Reviews. 25, 105-120 (2004).
  30. Specter, S., Friedman, H. Age- and sex-related differences in antibody formation and blastogenic responsiveness of splenocytes from RIII mice developing virus-induced mammary adenocarcinoma. The Journal of the National Cancer Institute. 67, 1347-1351 (1981).
  31. Giefing-Kroll, C., Berger, P., Lepperdinger, G., Grubeck-Loebenstein, B. How sex and age affect immune responses, susceptibility to infections, and response to vaccination. Aging Cell. 14, 309-321 (2015).
  32. Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. International Immunology. 19, 545-556 (2007).
  33. Sellers, R. S., Clifford, C. B., Treuting, P. M., Brayton, C. Immunological variation between inbred laboratory mouse strains: points to consider in phenotyping genetically immunomodified mice. Veterinary Pathology. 49, 32-43 (2012).
  34. Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research--issues to consider for rodents and rabbits. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 47, 283-293 (2006).
  35. Vlkova, M., Rohousova, I., Hostomska, J., Pohankova, L., Zidkova, L., Drahota, J., Valenzuela, J. G., Volf, P. Kinetics of antibody response in BALB/c and C57BL/6 mice bitten by Phlebotomus papatasi. PLOS Neglected Tropical Diseases. 6, 1719 (2012).
  36. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172, 2731-2738 (2004).
  37. Ruane, D., Chorny, A., Lee, H., Faith, J., Pandey, G., Shan, M., Simchoni, N., Rahman, A., Garg, A., Weinstein, E. G., et al. Microbiota regulate the ability of lung dendritic cells to induce IgA class-switch recombination and generate protective gastrointestinal immune responses. The Journal of Experimental Medicine. 213, 53-73 (2016).
  38. Chorny, A., Puga, I., Cerutti, A. Innate signaling networks in mucosal IgA class switching. Advances in Immunology. 107, 31-69 (2010).
  39. Van Praet, J. T., Donovan, E., Vanassche, I., Drennan, M. B., Windels, F., Dendooven, A., Allais, L., Cuvelier, C. A., van de Loo, F., Norris, P. S., et al. Commensal microbiota influence systemic autoimmune responses. The EMBO Journal. 34, 466-474 (2015).
  40. Nguyen, Q. N., Himes, J. E., Martinez, D. R., Permar, S. R. The Impact of the Gut Microbiota on Humoral Immunity to Pathogens and Vaccination in Early Infancy. PLOS Pathogens. 12, 1005997 (2016).
  41. Jeevan-Raj, B. P., Robert, I., Heyer, V., Page, A., Wang, J. H., Cammas, F., Alt, F. W., Losson, R., Reina-San-Martin, B. Epigenetic tethering of AID to the donor switch region during immunoglobulin class switch recombination. The Journal of Experimental Medicine. 208, 1649-1660 (2011).
  42. Chen, Z., Getahun, A., Chen, X., Dollin, Y., Cambier, J. C., Wang, J. H. Imbalanced PTEN and PI3K Signaling Impairs Class Switch Recombination. The Journal of Immunology. 195, 5461-5471 (2015).
  43. Boboila, C., Yan, C., Wesemann, D. R., Jankovic, M., Wang, J. H., Manis, J., Nussenzweig, A., Nussenzweig, M., Alt, F. W. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of Experimental Medicine. 207, 417-427 (2010).
  44. Shah, H. B., Koelsch, K. A. B-Cell ELISPOT: For the Identification of Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells. Methods in Molecular Biology. 1312, 419-426 (2015).
  45. Bonsignori, M., Moody, M. A. Simultaneous Detection of Antigen-Specific IgG- and IgM-Secreting Cells with a B Cell Fluorospot Assay. Cells. 1, 15-26 (2012).
  46. Sasaki, Y., Derudder, E., Hobeika, E., Pelanda, R., Reth, M., Rajewsky, K., Schmidt-Supprian, M. Canonical NF-kappaB activity, dispensable for B cell development, replaces BAFF-receptor signals and promotes B cell proliferation upon activation. Immunity. 24, 729-739 (2006).
  47. Goodlad, J. R., Macartney, J. C. Germinal-center cell proliferation in response to T-independent antigens: a stathmokinetic, morphometric and immunohistochemical study in vivo. European Journal of Immunology. 25, 1918-1926 (1995).
  48. Xie, P., Poovassery, J., Stunz, L. L., Smith, S. M., Schultz, M. L., Carlin, L. E., Bishop, G. A. Enhanced Toll-like receptor (TLR) responses of TNFR-associated factor 3 (TRAF3)-deficient B lymphocytes. Journal of Leukocyte Biology. 90, 1149-1157 (2011).
  49. Kaku, H., Horikawa, K., Obata, Y., Kato, I., Okamoto, H., Sakaguchi, N., Gerondakis, S., Takatsu, K. NF-kappaB is required for CD38-mediated induction of C(gamma)1 germline transcripts in murine B lymphocytes. International Immunology. 14, 1055-1064 (2002).
  50. Dudley, D. D., Chaudhuri, J., Bassing, C. H., Alt, F. W. Mechanism and control of V(D)J recombination versus class switch recombination: similarities and differences. Advances in Immunology. 86, 43-112 (2005).
  51. Lange, H., Hecht, O., Zemlin, M., Trad, A., Tanasa, R. I., Schroeder, H. W., Lemke, H. Immunoglobulin class switching appears to be regulated by B-cell antigen receptor-specific T-cell action. European Journal of Immunology. 42, 1016-1029 (2012).
  52. Moore, C. R., Liu, Y., Shao, C. S., Covey, L. R., Morse, H. C., Xie, P. Specific deletion of TRAF3 in B lymphocytes leads to B lymphoma development in mice. Leukemia. 26, 1122-1127 (2012).
  53. Bergmann, B., Grimsholm, O., Thorarinsdottir, K., Ren, W., Jirholt, P., Gjertsson, I., Martensson, I. L. Memory B cells in mouse models. Scandinavian Journal of Immunology. 78, 149-156 (2013).
  54. McHeyzer-Williams, L. J., Milpied, P. J., Okitsu, S. L., McHeyzer-Williams, M. G. Class-switched memory B cells remodel BCRs within secondary germinal centers. Nature Immunology. 16, 296-305 (2015).
  55. Elgueta, R., Marks, E., Nowak, E., Menezes, S., Benson, M., Raman, V. S., Ortiz, C., O'Connell, S., Hess, H., Lord, G. M., et al. CCR6-dependent positioning of memory B cells is essential for their ability to mount a recall response to antigen. The Journal of Immunology. 194, 505-513 (2015).

Tags

Immunologi och infektion fråga 139 Thymus-beroende (TD) antigen thymus-oberoende (TI) antigen immunglobulin (Ig) Ig-isotyp respons från minnet immunisering adjuvant enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Karakterisering av Thymus-beroende och oberoende av Thymus immunglobulin isotypen Svaren hos möss använder Enzyme-linked Immunosorbent Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lalani, A. I., Zhu, S., Xie, P.… More

Lalani, A. I., Zhu, S., Xie, P. Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay. J. Vis. Exp. (139), e57843, doi:10.3791/57843 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter