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Biology

नाक से चूहों में ट्रांस उपकला आयन परिवहन का अंदाजा लगाने के लिए संभावित अंतर

Published: July 4, 2018 doi: 10.3791/57934
Automatic Translation
1, 1
1Louvain Center for Toxicology and Applied Pharmacology (LTAP), Institut de Recherche Expérimentale et Clinique (IREC), Université Catholique de Louvain

Summary

यहां, हम चूहों में नाक संभावित अंतर को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । परीक्षण quantifies सिस्टिक फाइब्रोसिस transmembrane कंडक्टर नियामक और उपकला सोडियम चैनल के रूप में transmembrane आयन ट्रांसपोर्टरों के समारोह का आयोजन करता है । यह सिस्टिक फाइब्रोसिस के लिए उपंयास चिकित्सा की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए मूल्यवान है ।

Abstract

नाक संभावित अंतर परीक्षण सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF) के निदान में सहायता करने के लिए लगभग तीन दशकों के लिए इस्तेमाल किया गया है । यह तनु के मामलों में मददगार साबित हो गया है, oligo-या-cf के मोनो रोगसूचक रूपों आमतौर पर जीवन में बाद में पता चला, और cf-वॉज deferens के जन्मजात द्विपक्षीय अनुपस्थिति जैसे विकारों से संबंधित, अज्ञातहेतुक जीर्ण अग्नाशयशोथ, एलर्जी bronchopulmonary aspergillosis, और bronchiectasis । दोनों नैदानिक और नैदानिक सेटिंग्स में, परीक्षण CF के लिए लक्षित चिकित्सकीय रणनीतियों के लिए प्रतिक्रियाओं यों तो एक के रूप में इस्तेमाल किया गया है । परीक्षण करने के लिए एक माउस को अनुकूलित चुनौतीपूर्ण है और एक जुड़े मृत्यु पर जोर दे सकता है । यह कागज सतत छिड़काव के लिए सीटू में नाक कैथेटर बनाए रखने के लिए आवश्यक संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई का वर्णन करता है । यह ब्रॉन्को-समाधान नाक में perfused की आकांक्षा से बचने के उपाय सूचीबद्ध करता है । यह भी परीक्षण के अंत में पशु देखभाल का वर्णन करता है, संवेदनाहारी दवाओं की मारकों का एक संयोजन के प्रशासन सहित, तेजी से जानवरों की पूरी वसूली के साथ संज्ञाहरण पीछे करने के लिए अग्रणी. प्रतिनिधि डेटा एक cf से प्राप्त किया और एक जंगली-प्रकार माउस दिखाएँ कि परीक्षण cf और गैर-cf के बीच भेदभाव. कुल मिलाकर, यहां वर्णित प्रोटोकॉल सहज श्वास चूहों में ट्रांस उपकला क्लोराइड और सोडियम ट्रांसपोर्टरों की कार्यात्मक स्थिति के विश्वसनीय माप की अनुमति देता है, साथ ही पशु में कई परीक्षणों के रूप में अच्छी तरह से परीक्षण से संबंधित जबकि कम मृत्यु दर.

Introduction

लगभग तीन दशकों के लिए, बिजली के संभावित अंतर (पीडी) माप नाक म्यूकोसा में व्यक्त transmembrane आयन ट्रांसपोर्टरों की कार्यात्मक स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, बाहर एयरवेज1के प्रतिनिधि के रूप में । एक multistep गतिशील परीक्षण2,3, नाक पीडी के रूप में सिस्टिक फाइब्रोसिस Transmembrane कंडक्टर नियामक (CFTR) और उपकला सोडियम चैनल (ENaC) गतिविधि के कार्यात्मक विच्छेदन की अनुमति देता है, दोनों के शिखर झिल्ली पर स्थानीयकृत उपकला कोशिकाओं और airway सतह जलयोजन में महत्वपूर्ण भूमिकाओं डालती. प्रमुख नैदानिक आवेदन नाक पीडी परीक्षण CF के निदान में सहायता करने के लिए है, कोकेशियान आबादी में सबसे आम घातक आनुवंशिक विकार 1 की एक औसत घटना के साथ यूरोपीय देशों में २,५०० जीवित जंमों की । परीक्षण लंबे समय के निदान में मददगार साबित कर दिया है तनु, oligo-या मोनो-रोगसूचक cf के रूपों आम तौर पर जीवन में बाद में पता चला, और cf-वॉज deferens की जन्मजात द्विपक्षीय अनुपस्थिति जैसे विकारों से संबंधित, अज्ञातहेतुक जीर्ण अग्नाशयशोथ, एलर्जी bronchopulmonary aspergillosis, व bronchiectasis4. हाल ही में, बुनियादी CFTR दोष5,6,7,8,9,10,11 के चिकित्सीय मॉडुलन का clinometric मूल्यांकन ,12,13,14,15,16 नए CF चिकित्सा के नैदानिक परीक्षणों में नाक पीडी का उपयोग किया है. नैदानिक सेटिंग में, परीक्षण माउस17 के लिए अनुकूलित किया गया है नए CF लक्ष्य चिकित्सा18,19,20,21के लिए की जाने वाली गतिविधि की जांच की अनुमति । चूहों में, तकनीक, नाजुक है, प्रजातियों के आधार पर कुतर और मनुष्यों के बीच नाक क्षेत्र के आकार में संरचनात्मक मतभेदों से संबंधित है, और मुख्य रूप से कुतर में nasofacial क्षेत्र से संवेदी आदानों की आवश्यक भूमिका पर । यह प्रशिक्षित और कुशल ऑपरेटरों, समर्पित उपकरण और आपूर्ति की आवश्यकता है ।

CF exocrine ग्रंथियों की एक बहु-प्रणालीगत विकार है, जिसमें जीर्ण श्वसन रोग नैदानिक तस्वीर हावी है । रोग जीन में उत्परिवर्तनों के कारण होता है चक्रीय adenosine मोनोफोस्फेट (शिविर) एंकोडिंग-विनियमित CFTR क्लोराइड चैनल22। तारीख करने के लिए, से अधिक २,००० CFTR उत्परिवर्तनों की पहचान की गई है23. सबसे आम उत्परिवर्तन24,25, CF alleles के लगभग ९०% में पाया गया, प्रोटीन (F508del-CFTR) की पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला के ५०८ की स्थिति में फेनिलएलनिन के विलोपन के लिए मेल खाती है । CFTR प्रोटीन एक विशुद्ध रूप से ohmic छोटे कंडक्टर क्लोराइड चैनल है । वहां भी काफी सबूत है कि CFTR अंय परिवहन तंत्र को नियंत्रित करता है, विशेष रूप से, ENaC26,27। दोषपूर्ण इलेक्ट्रोलाइट परिवहन, कम CFTR-निर्भर क्लोराइड कंडक्टर और वृद्धि हुई ENaC-निर्भर सोडियम कंडक्टर सहित, CF epithelia की एक बानगी है । पूर्व दोष एक कम या समाप्त दोनों एक विद्युत ढाल क्लोराइड समाप्ति और isoprenaline के अलावा (एक β-एड्रीनर्जिक एगोनिस्ट कि intracellular शिविर बढ़ जाती है) या forskolin के जवाब में ध्रुवीकरण से परिलक्षित होता है (एक adenylate cyclase एगोनिस्ट, नैदानिक उपयोग के लिए अनुमोदित नहीं). बाद दोष नाक म्यूकोसा (एक अधिक नकारात्मक पीडी) और amiloride, एक मूत्रवर्धक दवा है कि28ENaC ब्लॉकों के लिए एक वृद्धि की प्रतिक्रिया के एक बेसल hyperpolarization द्वारा परिलक्षित होता है ।

cf माउस मॉडल cf अनुसंधान में अक्सर उपयोग किया गया है और विदारक CF विकृति में अमूल्य किया गया है । आजकल, कम से कम पंद्रह मॉडल29वर्णित किया गया है, जिनमें से तीन सबसे नैदानिक प्रासंगिक F508del उत्परिवर्तन30,31,३२के लिए homozygous हैं । इन तीन उपभेदों में से एक30, रॉटरडैम में इरास्मस विश्वविद्यालय में विकसित, विश्विद्यालय catholique डी Louvain (UCL) प्रयोगशाला में लगभग 20 वर्षों के लिए इस्तेमाल किया गया है । Cftrtm1Eur मॉडल30 बहुत CF रोग के multiorgan pathophysiology अध्ययन करने के लिए और नई चिकित्सकीय रणनीतियों की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए उपयोगी साबित हो गयाहै 18,19,20, 21. शी. कई समस्याओं के दौरान या जल्दी के बाद हो सकता है (< 24 h) चूहों में नाक पीडी परीक्षण । इस पत्र में, सतत छिड़काव के लिए सीटू में एक नाक कैथेटर रखने के लिए आवश्यक संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई, और ब्रॉन्को से बचने के उपाय-समाधान perfused नाक में की आकांक्षा वर्णित हैं । परीक्षण के अंत में पशु देखभाल भी संवेदनाहारी दवाओं की मारकों का एक संयोजन के प्रशासन सहित वर्णित है, तेजी से पशुओं की पूरी वसूली के साथ संज्ञाहरण पीछे करने के लिए अग्रणी । कुल मिलाकर, इन प्रक्रियाओं अनायास श्वास चूहों में विश्वसनीय माप, कम परीक्षण से संबंधित मृत्यु दर और एक ही जानवर में परीक्षण दोहरा अनुमति देते हैं । प्रतिनिधि एक CF में और एक जंगली प्रकार माउस में नाक पीडी परीक्षण से प्राप्त डेटा दिखाया और चर्चा कर रहे हैं.

murine नाक पीडी परीक्षण प्रोटोकॉल तीन सत्रों में सूचना दी है: मूल्यांकन और प्रबंधन से पहले, के दौरान, और परीक्षण के बाद । पूर्व परीक्षण मूल्यांकन और प्रबंधन में, डबल लुमेन नाक कैथेटर की तैयारी के प्रोटोकॉल और सतत नाक छिड़काव के लिए इस्तेमाल किया समाधान के विस्तार में वर्णित है । मूल्यांकन और परीक्षण के प्रबंधन भागों के दौरान, प्रायोगिक सेटअप और माउस की हैंडलिंग मिनट विच्छेदित है । अंत में, परीक्षण के अंत में पशु का प्रबंधन पूर्ण पशु वसूली में सुधार करने के लिए वर्णित है ।

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Protocol

UCL (2017/UCL/MD/015) के पशु अनुसंधान के लिए नीतिशास्त्र समिति द्वारा और अनुसंधान में पशु उपयोग के लिए यूरोपीय समुदाय विनियमों के साथ समझौता (CEE n ° 86/609) में अध्ययन और प्रक्रियाएं अनुमोदित की गईं । जांचकर्ताओं पशु प्रयोग के लिए अर्हता प्राप्त कर रहे है के बाद निदेशक 2010//63/यूरोपीय संसद के यूरोपीय संघ और परिषद के 22 सितंबर २०१० वैज्ञानिक प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल जानवरों के संरक्षण पर ।

1. पूर्व परीक्षण मूल्यांकन और प्रबंधन

  1. डबल लुमेन नाक कैथेटर तैयार करें ।
    नोट: एक नाक कैथेटर एक डबल लुमेन केशिका ट्यूब के रूप में किया जाता है, एक लुमेन समाधान के सतत छिड़काव के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, और एक दूसरे को मापने चैनल के रूप में एक ।
    1. एक टुकड़ा, के बारे में 20 सेमी लंबे, पॉलीथीन ट्यूब (२.० mm भीतरी व्यास; ३.० mm बाहरी व्यास के मध्य खंड गर्मी; चित्रा 1 क) एक गैस बर्नर की लौ में जब तक यह पर्याप्त खींच (10-15 s) के लिए नरम है ।
    2. दो सिरों के अलावा उचित लंबाई (~ 15 सेमी) और नाक की जांच (चित्रा 1बी) के लिए बाहरी व्यास (~ ०.१ मिमी) की एक बहुत पतली केशिका ट्यूब प्राप्त करने के लिए ।
    3. स्वच्छ और शुद्ध इथेनॉल के साथ दो ऐसी केशिकाओं को चिकना, उंहें टेप के साथ शामिल होने (1सी) और गोंद उंहें एक साथ cyanoacrylate गोंद का उपयोग कर ।
    4. दूर एक उस्तरा ब्लेड या के बारे में 8 सेमी की डबल लुमेन कैथेटर की एक इष्टतम लंबाई प्राप्त करने के लिए एक स्केलपेल के साथ जांच की अतिरिक्त लंबाई काट (चित्रा 1डी) ।
    5. दोनों लुमेन के माध्यम से पानी इंजेक्षन करने के लिए सत्यापित करें कि वे पारगंय हैं.
    6. टिप से 5 मिमी दूरी पर एक चिह्न लागू करें ।
      नोट: जांच नाक में निशान तक डाला जाता है, इतना है कि सभी माप एक ही साइट पर किया जाता है के अंदर नासिका गुहा ।
    7. एक सूखी बॉक्स में डबल लुमेन कैथेटर स्टोर.
      नोट: यह प्रयोग किया जा सकता 6-10 बार अगर उचित परीक्षण के बाद तुरंत साफ ।
  2. क्रीम मिक्स तैयार कर लीजिये.
    1. धीरे मिश्रण इलेक्ट्रोलाइट क्रीम और एक 1:1 अनुपात में 3 मीटर KCl समाधान संतृप्त (वॉल्यूम/छोटे हवा के बुलबुले के गठन से परहेज ।
      नोट: क्रीम मिश्रण मापने के लिए इलेक्ट्रोड पुलों का निर्माण और संदर्भ एजी/AgCl इलेक्ट्रोड, के रूप में चित्रा 1में सचित्र बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है.

Figure 1
चित्रा 1 : इलेक्ट्रोड और पुलों के साथ जांच. इस आंकड़े से पहले पॉलीथीन ट्यूब दिखाता है (a) और हीटिंग और खींचने के बाद (b), टेप दो केशिका (सी) भागों में शामिल होने के डबल लुमेन कैथेटर (डी), सिलिकॉन ट्यूब कनेक्टर्स (ई) और इलेक्ट्रोड (f). चित्र स्पष्टता के लिए, कनेक्टर्स क्रीम मिश्रण के साथ नहीं भरा गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

समाधान लेबल समाधान विवरण
ए बेसल बफर नमक समाधान
बी क्लोराइड-मुक्त बफर नमक समाधान
सी 10-2 एम amiloride स्टॉक समाधान
डी 10-3 एम forskolin स्टॉक समाधान

तालिका 1: चूहों में नाक पीडी परीक्षण के लिए स्टॉक समाधान.

नमक मिमी आण्विक वजन g/L
सोडियम क्लोराइड (NaCl) १३५ ५८.४४ ७,८८९
कैल्शियम क्लोराइड डाईहाइड्रेट (CaCl२. 2H२हे) २.२५ १४७ ०.३३१
मैग्नीशियम क्लोराइड hexahydrate (MgCl2. 6H2ओ) १.२ २०३.३ ०.२४४
Dipotassium फॉस्फेट (K2HPO4) २.४ १७४.२ ०.४१८
Monopotassium फॉस्फेट (KH2PO4) ०.४ १३६.१ ०.०५४

तालिका 2: बेसल बफ़र्ड नमक समाधान (स्टॉक समाधान A) की संरचना ।

  1. समाधान तैयार करें ।
    1. प्रायोगिक प्रोटोकॉल (तालिका 1) के लिए आवश्यक चार स्टॉक समाधानों को तैयार करें ।
      1. बेसल बफ़र्ड समाधान तैयार करें (स्टॉक समाधान A; तालिका 2) और क्लोराइड-मुक्त बफर समाधान (शेयर समाधान बी; तालिका 3) शुद्ध पानी में लवण को कमरे के तापमान पर मिलाकर सेवन करने से । ७.४ के लिए पीएच समायोजित करें (रेंज ७.०-७.६) 1 n NaOH का उपयोग पीएच, 1 एन एचसीएल कम पीएच को उठाने के लिए । हल का osmolarity जांचें (२७५ mOsm/
      2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 महीने के लिए या 6 महीने तक के लिए प्लास्टिक की बोतलों में जमे हुए कांच की बोतलों में स्टोर ।
      3. 10 मिलीलीटर शुद्ध पानी के लिए amiloride हाइडरोक्लॉराइड के २६.६ मिलीग्राम जोड़कर १०-२ मीटर amiloride सॉल्यूशन (स्टॉक सॉल्यूशन सी) तैयार करें । ७० डिग्री सेल्सियस पर 5 से 10 मिनट के लिए मिश्रण गर्मी । के रूप में amiloride प्रकाश के प्रति संवेदनशील है, एक अंधेरे कंटेनर में समाधान सी रखो । 3 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर कंटेनर और स्टोर को लेबल करें ।
      4. 10 मिलीग्राम forskolin के शुद्ध पानी की २४.३६ मिलीलीटर को जोड़कर (शेयर समाधान डी) १०-३ मीटर forskolin घोल तैयार करें । लेबल ०.१ एमएल aliquots के forskolin स्टॉक समाधान और स्टोर-20 ° c 6 महीनों के लिए ।
  2. नए समाधान A1, B1 और B2 (तालिका 4) तैयार करें ।
    1. बेसल नमक समाधान (स्टॉक समाधान A) के 10 मिलीलीटर प्राप्त करने और 10-2 m amiloride समाधान (स्टॉक समाधान C) के ०.१ मिलीलीटर को जोड़ने के द्वारा ताजा समाधान A1 (बेसल बफ़र्ड नमक समाधान प्लस 10-4 एम amiloride) तैयार करें । कंटेनर लेबल और तैयारी के 24 ज के भीतर का उपयोग करें ।
    2. (स्टॉक समाधान B) क्लोराइड-मुक्त बफर नमक समाधान (शेयर हल ख) के 10 मिलीलीटर प्राप्त करने और 10-2 एम amiloride समाधान (स्टॉक समाधान सी) के ०.१ मिलीलीटर को जोड़ने के द्वारा ताजा समाधान B1 (क्लोराइड बफर समाधान प्लस 10-4 मीटर amiloride) तैयार करें । कंटेनर लेबल और तैयारी के 24 घंटे के भीतर का उपयोग करें ।
    3. तैयार ताजा समाधान B2 (क्लोराइड-मुक्त बफर नमक समाधान प्लस 10-4 एम amiloride और 10-5 मीटर forskolin) क्लोराइड के 10 मिलीलीटर मुक्त बफर नमक समाधान (शेयर समाधान ख) प्राप्त करने और 10-2 मीटर की ०.१ मिलीलीटर जोड़ने के द्वारा amiloride सॉल्यूशन (स्टॉक सॉल्यूशन सी) और ०.१ एमएल का 10-3 एम forskolin सॉल्यूशन (स्टॉक सॉल्यूशन डी) । कंटेनर लेबल और तैयारी के 2 घंटे के भीतर का उपयोग करें ।
नमक मिमी आण्विक वजन g/L
सोडियम gluconate (मोनोसोडियम नमक) १३५ २१८.१ २९,४४४
कैल्शियम gluconate (निर्जल powder) २.२ ४३०.४ ०.९४७
मैग्नीशियम सल्फेट heptahydrate (MgCl2. 6H2O) १.२ २४६.५ ०.२९६
Dipotassium फॉस्फेट (K2HPO4) २.४ १७४.२ ०.४१८
Monopotassium फॉस्फेट (KH2PO4) ०.४ १३६.१ ०.०५४

तालिका 3: क्लोराइड की संरचना-मुक्त बफर समाधान (स्टॉक समाधान ख) ।

Figure 2
चित्रा 2 : नाक म्यूकोसा के छिड़काव के दौरान माउस की स्थिति । आंकड़ा हीटिंग पैड (ए) दिखाता है, वाल्टमीटर (ख), संदर्भ इलेक्ट्रोड एक हिंद अंग में चमड़े के नीचे अंतरिक्ष में डाला (सी), समीपस्थ (डी) और बाहर (ई) सिकुड़नेवाला पंप के आउटलेट, तकिया (एफ), और बिस्तर शीट (छ) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

2. परीक्षण के दौरान मूल्यांकन और प्रबंधन

  1. प्रायोगिक सेटअप तैयार करें ।
    1. हाइपोथर्मिया के दौरान और परीक्षण के बाद रोकने के लिए, शारीरिक तापमान पर बनाए रखा दो हीटिंग पैड का उपयोग करें, मापने सेटअप के लिए एक (१८.८ x ३७.५ सेमी; चित्रा 2 एक), और दूसरे एक (१५.५ x १५.५ सेमी) बॉक्स जिसमें पशु परीक्षण के अंत में वसूली के लिए रखा जाएगा के लिए ।
    2. डेटा कैप्चर डेटा स्मृति उच्च इनपुट प्रतिबाधा से जुड़े के लिए सॉफ्टवेयर के साथ लोड कंप्यूटर पर स्विच (> 1012Ω) और उच्च संकल्प (०.१ एमवी) वाल्टमीटर (चित्रा 2बी).
    3. वाल्टमीटर के लिए इलेक्ट्रोड कनेक्ट । नाक कैथेटर और एक हिंद अंग में चमड़े के नीचे अंतरिक्ष में डाला कैथेटर के लिए नकारात्मक संदर्भ इलेक्ट्रोड करने के लिए सकारात्मक मापने इलेक्ट्रोड कनेक्ट, के रूप में चित्रा 2सीमें दिखाया गया है
    4. क्रीम मिश्रण में एक साथ इलेक्ट्रोड के सुझावों डुबकी. प्रारंभिक इलेक्ट्रोड ऑफ़सेट मान की जाँच करें । यदि मान (±) 2 एमवी (आदर्श 0 एमवी) से बड़ा है इलेक्ट्रोड अस्वीकार ।
    5. सिकुड़नेवाला पंप पर स्विच और स्थिति में पंप ट्यूब डालें, के रूप में चित्रा 2में सचित्र ।
    6. नाक छिड़काव (चित्रा 2डी) के लिए चयनित समाधान युक्त शीशी के लिए पंप ट्यूब के समीपस्थ आउटलेट से कनेक्ट करें । नाक कैथेटर (चित्रा 2ई) के छिड़काव लुमेन के लिए पंप ट्यूब के बाहर की दुकान से कनेक्ट करें ।
    7. एक 10 µ एल पिपेट टिप के माध्यम से इलेक्ट्रोलाइट क्रीम मिश्रण के साथ नाक कैथेटर के एक लुमेन भरें । कैथेटर एक सिलिकॉन ट्यूब कनेक्टर (चित्रा 1ई) करने के लिए अनुकूलित, क्रीम मिश्रण के साथ कनेक्टर भरें और कनेक्टर (चित्रा 1एफ) में सकारात्मक इलेक्ट्रोड डालें. मापने इलेक्ट्रोड पुल ऑफ़सेट मान की जाँच करें । यदि मान (±) 2 एमवी (आदर्श 0 एमवी) से बड़ा है पुलों को अस्वीकार ।
    8. ताजा समाधान A1 के साथ नाक कैथेटर का दूसरा लुमेन भरें । घोल युक्त शीशी में नाक कैथेटर के टिप डुबकी सिकुड़नेवाला पंप की दिशा रिवर्स करने के लिए नाक कैथेटर की एक लंबाई को भरने के लिए इसी छिड़काव के 10 एस ।
      नोट: यह amiloride लागू करने से पहले 10 s के लिए बेसल पीडी मान रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है । संदर्भ इलेक्ट्रोड के कनेक्टर के अंदर क्रीम मिश्रण में नाक कैथेटर की नोक डुबकी (चित्रा 1).
  2. माउस हैंडलिंग शुरू करते हैं ।
    1. निश्चेतक की सटीक खुराक की गणना करने के लिए माउस वजन रिकॉर्ड intraperitoneal (आईपी)17मार्ग द्वारा इंजेक्ट किया जा करने के लिए ।
    2. एक 26G (०.४५ x 10 मिमी) सुई का उपयोग करना, संज्ञाहरण के प्रेरण को बढ़ावा देने के लिए intraperitoneally सुई: एक निश्चित खुराक की ५० µ एल के 5 मिलीग्राम/एमएल मिदाजोलम. 5 मिनट के लिए रुको ।
    3. संवेदनाहारी मिश्रण तैयार (fentanyl, medetomidine, droperidol ०.०५, ०.४० के अंतिम सांद्रता पर, और 20 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन क्रमशः, और ०.३७५ clonidine जी की निश्चित खुराक पर µ) के इष्टतम और स्थिर गहराई की अनुमति संज्ञाहरण (स्टेज III, विमान 2)17 . संवेदनाहारी मिश्रण intraperitoneally की मात्रा सुई, और फिर clonidine की मात्रा इंजेक्षन.
      नोट: के बाद 15 मिनट, माउस सो जाना चाहिए और संज्ञाहरण के लिए पिछले कर सकते है कम से 30 मिनट ।
    4. ऊतक को अवशोषित एक 3 सेमी चौड़ा ' तकिया ' (चित्रा 2एफ) है कि हीटिंग पैड के ऊपरी भाग (चित्रा 2ए) माउस सिर के लिए एक समर्थन के रूप में कवर किया जाएगा बनाने के लिए एक पत्रक गुना ।
    5. ऊतक को अवशोषित के एक पत्रक के साथ हीटिंग पैड को कवर (' बेड शीट '; चित्रा 2 छ). हीटिंग पैड पर अपनी पीठ पर माउस रखना । अंग और पूंछ (चित्रा 2) बाहर टेप ।
    6. एक हिंद अंग के चमड़े के नीचे अंतरिक्ष में नसों में कैथेटर (चित्रा 1जी) संदर्भ डालें । सुई निकालें और सिलिकॉन ट्यूब कनेक्टर (चित्रा 1ई, 2c) अनुकूलन ।
    7. कैथेटर और क्रीम मिश्रण के साथ कनेक्टर भरें और कनेक्टर (चित्रा 1एफ) में नकारात्मक इलेक्ट्रोड डालें.
    8. कैथेटर और किसी भी विस्थापन को रोकने के लिए आवश्यक के रूप में टेप के साथ इलेक्ट्रोड को ठीक करें । संदर्भ इलेक्ट्रोड और पुलों की जमावट के बाद, माप इलेक्ट्रोड ब्रिज ऑफ़सेट मान फिर से के चतुर्थ कैथेटर कनेक्टर के अंदर इलेक्ट्रोड क्रीम मिश्रण में नाक कैथेटर की नोक डूबा द्वारा सत्यापित करें । स्थिर अंतिम ऑफ़सेट मान रिकॉर्ड (आदर्श रूप से कम (±) 2 एमवी) ।
    9. ऊतक अवशोषित के दो टुकड़े के बीच एक मुक्त स्थान में हीटिंग पैड पर "कोमल" टेप के साथ माउस कान फिक्स (' तकिया ' (चित्रा 2एफ) और ' बेड शीट '; (चित्रा 2जी)). ठीक vibrissae (कड़ी नाक के पास बढ़ रही बाल) आंखों को छूने के बिना ।
    10. मौखिक गुहा से तरल पदार्थ को अवशोषित करने के लिए, बग़ल में जीभ (चित्रा 3a) चाल और फिल्टर कागज की एक नुकीले बाती डालने (' पाइप '; चित्रा 3 ख) मुंह में लगभग 1 सेमी । perfused नाक से बाहर चल द्रव को अवशोषित करने के लिए, फिल्टर कागज का एक दूसरा टुकड़ा जगह (' रूमाल '; चित्रा 3 ग) नाक की नोक पर आयोजित किया ।
    11. मुंह के अंदर के साथ संपर्क में नाक कैथेटर की नोक रखकर उपकला क्षमता का एक सकारात्मक नियंत्रण मूल्य की जाँच करें ।
      नोट: पढ़ना स्थिर होना चाहिए और के बीच सीमा-10 एमवी और-20 एमवी.
    12. यह ठीक संदंश और अच्छा प्रत्यक्ष रोशनी के तहत के साथ पकड़े, नाजुक नाक के टिप से 4-6 mm तक एक नाक में नाक कैथेटर परिचय ।
      नोट: नाक पीडी कैथेटर की स्थिति है कि अधिक से अधिक स्थिर आधारभूत पीडी मान17,20देता है पर मध्य नाक concha में स्थित है ।
    13. संवेदनाहारी दवाओं के इंजेक्शन के बाद 5 मिनट, धीरे पशु सिर के नीचे के साथ के बारे में 30 डिग्री के द्वारा हीटिंग पैड झुकाव । अधिक से अधिक बेसल पीडी मूल्य की निगरानी ।
    14. जब यह के बारे में 30 एस की अवधि में स्थिर है, नाक के म्यूकोसा perfusing शुरू, 10 µ एल के एक स्थिर दर पर, 4 buffered समाधान के साथ (a, A1, B1, B2) उत्तराधिकार में । Perfuse पहले समाधान (चरण 1.3.1.1) के लिए 10 s और प्रत्येक निम्न समाधान (चरण १.४) के लिए 5 मिनट या एक स्थिर मान तक पहुँच गया है । Stop perfusing forskolin (B2) जब क्षणिक forskolin प्रतिक्रिया नीचे जा रहा शुरू होता है ।
    15. डेटा रिकॉर्डिंग के लिए 1 s अंतराल का चयन करें । छिड़काव प्रारंभ करने के समय डेटा रिकॉर्ड करना प्रारंभ करें । कंप्यूटर स्क्रीन पर समय के किसी फ़ंक्शन के रूप में डेटा प्रदर्शित करें ।
    16. समाधान B2 के साथ छिड़काव के अंत में डेटा कैप्चर रोकें । डेटा को स्प्रेडशीट फ़ाइल के रूप में सहेजें ।
    17. अंतिम ऑफ़सेट मान को घटा कर डेटा सही करना ।

Figure 3
चित्रा 3 : नाक कैथेटर और जगह में फिल्टर कागज के साथ हीटिंग पैड पर माउस की स्थिति । चित्रा (क), पाइप (ख), और रूमाल (सी) बग़ल में डाल जीभ दिखाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

3. परीक्षण के बाद मूल्यांकन और प्रबंधन

  1. हीटिंग पैड से माउस छोड़ें ।
  2. माउस नाक को ' बेड शीट ' (चित्रा 2जी) से पोंछें ।
  3. सोन, एक प्रतियोगी अफ़ीम विरोधी, और atipamezole, एक medetomidine विशिष्ट मारक (2 मिलीग्राम/किलो शरीर के वजन) की एक निश्चित खुराक (4 µ जी) से बना संवेदनाहारी विरोधी मिश्रण intraperitoneally इंजेक्षन ।
  4. पूर्ण वसूली, कि आम तौर पर 1 से 2 घंटे के बाद मनाया जाता है जब तक वसूली बॉक्स में छोटे हीटिंग पैड पर माउस रखना ।
    नोट: UCL प्रयोगशाला में, के बारे में 10% मृत्यु दर, मुख्य रूप से जांच के दौरान नाक गुहा में समाधान perfused के bronchoaspiration से संबंधित है, लिंग या जीनोटाइप की परवाह किए बिना मनाया ।

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Representative Results

के लिए cf में विशेषता आयन परिवहन विषमता वर्णन करने के लिए, नाक पीडी माप प्रोटोकॉल एक F508del-CF माउस में और एक जंगली प्रकार के नियंत्रण में ऊपर वर्णित के बाद प्रदर्शन किया गया FVB/129 आनुवंशिक पृष्ठभूमि के ब्रसेल्स कॉलोनी से Cftrtm1Eur चूहों30. यह चिकित्सकीय प्रासंगिक मॉडल, सबसे आम बंदरगाह और सबसे गंभीर F508del में से एक-CFTR उत्परिवर्तन23,24,25, सबसे अच्छा वर्तमान में उपलब्ध CF माउस मॉडल30,31, ३२.

प्रतिनिधि नाक पीडी अनुरेखण, F508del-CF उत्परिवर्तन के लिए एक 4 महीने की पुरानी महिला माउस homozygous में और एक उंर में प्राप्त-और सेक्स मिलान जंगली-प्रकार littermate, चित्रा 4में दिखाए जाते हैं । परीक्षण के पहले दो चरणों के दौरान, ENaC के कार्यात्मक स्थिति perfusing समाधान एक और A1, amiloride युक्त उत्तरार्द्ध द्वारा अध्ययन किया गया था । CFTR के कार्यात्मक स्थिति (और forskolin के अभाव में वैकल्पिक क्लोराइड ट्रांसपोर्टरों की) परीक्षण के अंतिम दो चरणों के दौरान मूल्यांकन किया गया था, जब ENaC के योगदान amiloride द्वारा अवरुद्ध रह गया ।

F508del-CF माउस में, एक hyperpolarized आधार रेखा मान (एक अधिक ऋणात्मक PDmax की तुलना में वाइल्ड-प्रकार माउस मान) के साथ एक बढ़ी हुई amiloride प्रतिक्रिया स्वीकार्य थे; दोनों निष्कर्षों CFTR-जुड़े ENaC अधिक सक्रियता को प्रतिबिंबित करते हैं । और लगातार, दोनों एक विद्युत क्लोराइड समाप्ति और forskolin के अलावा के लिए अनुकूल ढाल, कुल क्लोराइड प्रतिक्रिया के रूप में यहां नाम के जवाब में एक काफी कम ध्रुवीकरण, मनाया गया था । हालांकि जंगली में forskolin प्रतिक्रिया की भयावहता-प्रकार चूहों छोटे है (-3 एमवी), CF में, प्रतिक्रिया आमतौर पर कुंद है, CFTR हानि के साथ संगत-समारोह.

Figure 4
चित्र 4 -प्रतिनिधि नाक पीडी अनुरेखण । प्रतिनिधि नाक पीडी एक homozygous सामांय माउस से अनुरेखण (एक) और F508del के लिए एक माउस homozygous-CFTR उत्परिवर्तन (बी), व्यक्तिगत नाक पीडी पैरामीटर (सी और डी) के लिए प्राप्त मूल्यों के साथ । PDmax: अधिक से अधिक आधार रेखा स्थिर मान । Amiloride प्रतिक्रिया: अंत में नाक पीडी के मूल्यों के बीच और Amiloride (समाधान A1) युक्त बेसल बफर नमक समाधान के साथ नाक म्यूकोसा के छिड़काव की शुरुआत में अंतर. क्लोराइड-मुक्त प्रतिक्रिया: अंत में नाक पीडी के मूल्यों के बीच और क्लोराइड के साथ नाक म्यूकोसा के छिड़काव की शुरुआत में अंतर-मुक्त बफर नमक समाधान प्लस amiloride (समाधान B1) । Forskolin प्रतिक्रिया: अंत में नाक पीडी के मूल्यों के बीच और क्लोराइड के साथ नाक म्यूकोसा के छिड़काव की शुरुआत में अंतर-मुक्त बफर नमक समाधान प्लस Forskolin और amiloride (समाधान B2) । कुल क्लोराइड प्रतिक्रिया: शून्य क्लोराइड छिड़काव के तहत प्राप्त पिछले दो मापदंडों की राशि. तीर नाक में perfused समाधान के परिवर्तन का संकेत मिलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

निश्चेतक के मारक परीक्षण के अंत में लागू किए गए थे, इस प्रकार संज्ञाहरण, जो परीक्षण पूरा होने से परे ४५ मिनट तक हो सकता है की अवधि को कम करने । के रूप में पशुओं की वसूली के बाद प्रभाव के बिना हुई, वे फिर से सात दिनों के अंतराल के बाद परीक्षण किया गया, जब एक ही प्रोटोकॉल लागू किया गया था । दोनों परीक्षणों के दौरान ही नाक की खोजबीन की गई. दो परीक्षणों के बीच प्रत्येक व्यक्ति नाक पीडी पैरामीटर के दूसरे परीक्षण और युग्मित अंतर के उदाहरण चित्रा 5में दिखाए गए हैं । के रूप में पहले की रिपोर्ट३५, के बीच परीक्षण मतभेद शूंय के करीब थे, विशेष रूप से कुल क्लोराइड प्रतिक्रिया के लिए, CFTR के कार्यात्मक स्थिति पर निर्भर क्लोराइड परिवहन, CF में दोषपूर्ण परिलक्षित करती है ।

Figure 5
चित्रा 5 -नाक पीडी मापदंडों के व्यक्तिगत मूल्यों । मान एक दूसरे परीक्षण (टी 2) में एक homozygous सामांय माउस (ए) और F508del के एक माउस homozygous-CFTR उत्परिवर्तन (बी), एक साथ दूसरे और पहले परीक्षण (t1) के बीच युग्मित मतभेदों के साथ एक संगत पैरामीटर के लिए प्रदर्शन में प्राप्त किया गया । PDmax: अधिक से अधिक आधार रेखा स्थिर मान । Amiloride प्रतिक्रिया: अंत में नाक पीडी के मूल्यों के बीच अंतर और Amiloride (समाधान A1) युक्त बेसल बफर नमक समाधान के साथ नाक म्यूकोसा के छिड़काव की शुरुआत में. क्लोराइड-मुक्त प्रतिक्रिया: अंत में नाक पीडी के मूल्यों के बीच अंतर और क्लोराइड के साथ नाक म्यूकोसा के छिड़काव की शुरुआत में मुक्त बफर नमक समाधान प्लस amiloride (समाधान B1) । Forskolin प्रतिक्रिया: अंत में नाक पीडी के मूल्यों का अंतर और क्लोराइड से मुक्त बफर नमक समाधान प्लस Forskolin और amiloride (समाधान B2) के साथ नाक म्यूकोसा के छिड़काव की शुरुआत में । कुल क्लोराइड प्रतिक्रिया: शून्य क्लोराइड छिड़काव के तहत प्राप्त पिछले दो मापदंडों की राशि. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

समाधान लेबल समाधान विवरण
A1 बेसल बफर नमक समाधान (ए) प्लस 10-4 एम amiloride
B1 क्लोराइड-मुक्त बफर नमक समाधान (बी) प्लस 10-4 एम amiloride
B2 क्लोराइड-मुक्त बफर नमक समाधान (बी) प्लस 10-4 एम amiloride प्लस 10-5 एम forskolin

तालिका 4: चूहों में नाक पीडी परीक्षण के लिए ताजा समाधान की सूची ।

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Discussion

इस पेपर का उद्देश्य आयन ट्रांसपोर्टरों की अखंडता के परीक्षण के लिए आवश्यक समय की लंबाई के लिए सहज श्वास चूहों में समाधान के सतत छिड़काव के तहत नाक पीडी को मापने के लिए एक पर्याप्त प्रोटोकॉल का वर्णन है, मुख्यतः CFTR और ENaC. प्रोटोकॉल के सभी कदम ध्यान से पूर्ण पशु वसूली और अच्छी गुणवत्ता और reproducible डेटा सुनिश्चित करने के लिए अनुकूलित किया गया है । विशेष रूप से, महत्वपूर्ण कदम संज्ञाहरण मूल्यांकन और प्रबंधन, और पर्याप्त पशुओं की स्थिति और देखभाल के दौरान और परीक्षण के बाद कर रहे हैं ।

पिछले अध्ययनों से पता चला है कि विमान संवेदनाहारी जोखिम है, जो कॉकटेल17यहां इस्तेमाल मिश्रण लागू करने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है 2 चरण III, नियमित रूप से सांस लेने के साथ जुड़ा हुआ है और नकारात्मक inotropic प्रभाव और पलक, pupillary और पेडल के अभाव के साथ आहरण सजगता । संवेदनाहारी गहराई के इस स्तर पर, नाक कैथेटर नाक गुहा के सतत छिड़काव के लिए और अच्छी सहिष्णुता के साथ मापने इलेक्ट्रोड के एक पुल के रूप में उपयोग के लिए सीटू में रखा जा सकता है । इसके अलावा, चमड़े के नीचे अंतरिक्ष में कैथेटर की प्रविष्टि, संदर्भ इलेक्ट्रोड के पुल के रूप में सेवारत, किसी भी दर्दनाक प्रतिक्रिया या हानिकारक प्रभाव का संकेत द्वारा पीछा नहीं किया गया था । कुतर में nasofacial क्षेत्र से संवेदी इनपुट की आवश्यक भूमिका व्यवहार की तुलना में एक बाहरी स्थिति, एक खतरा भी शामिल है के नियंत्रण में, संज्ञाहरण विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण जब नाक गुहा में सक्रिय की पर्याप्त गहराई बनाता है । Nebulization के बजाय लगातार नाक छिड़काव कुछ माउस अध्ययन३३,३४में नाक पीडी परीक्षण प्रदर्शन करने के लिए लागू किया गया है । हालांकि, इस विधि गैर-विश्वसनीय परिणाम की ओर जाता है, दोहराया हटाने और नाक जांच के संमिलन के कारण । तथ्य की बात के रूप में, गैर माउस नाक म्यूकोसा में सेल प्रकार के समरूप वितरण के कारण20, नाक में एक ही स्थान पर जांच की नोक की स्थिति महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, समाधान के परिवर्तन के लिए प्रतिक्रियाओं, विशेष रूप से क्लोराइड में मुक्त समाधान, तेजी से गायब हो जाता है जब छिड़काव बाधित है ।

ब्रॉन्को-श्वसन गिरफ्तारी के लिए अग्रणी समाधान की आकांक्षा प्रक्रिया की एक महत्वपूर्ण सीमा है और परीक्षण की मृत्यु का प्रमुख कारण है । कई आवश्यक उपाय इसे रोकने में उद्देश्य, पशु की एक पृष्ठीय decubitus स्थिति सहित, हल्के से इसे अपने सिर के नीचे के साथ झुकाव, और मौखिक और नाक गुहाओं17से अतिरिक्त तरल पदार्थ को अवशोषित । पशुओं की पूरी वसूली के साथ संज्ञाहरण के एक तेजी से और प्रतिवर्ती स्तर परीक्षण के अंत में संवेदनाहारी दवाओं के मारक लागू करने से सुनिश्चित किया जाता है । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल अनायास श्वास चूहों में विश्वसनीय माप देता है और उसी पशु में परीक्षण को दोहराता है । यह सांख्यिकीय महत्व प्राप्त करने के लिए आवश्यक चूहों की संख्या पर प्रभाव३५ और 3R का पालन करने पर (बदलने के लिए, परिष्कृत और कम) प्रायोगिक प्रक्रियाओं में पशु उपयोग के लिए नियम३६. चूहों में के रूप में मनुष्यों में, सबसे कम के बीच परीक्षण परिवर्तनशीलता कुल क्लोराइड प्रतिक्रिया के लिए पाया गया है, सुझाव है कि यह नई CF चिकित्सीय रणनीतियों की प्रभावकारिता का पता लगाने के लिए सबसे विश्वसनीय नाक पीडी पैरामीटर के रूप में. CF चूहों में, कुल क्लोराइड प्रतिक्रिया के माप त्रुटि ± १.७ एमवी३५से कम होने के लिए दिखाया गया था. दूसरे शब्दों में, जब F508del-CF चूहों में एक CFTR-सही दवा की गैर-गतिविधि का मूल्यांकन, अनुपस्थिति में कुल क्लोराइड प्रतिक्रिया के बीच एक अंतर और अधिक से अधिक उपचार की उपस्थिति में 2 एमवी एक दवा के ९५% संभावना को सुधार प्रभाव से संबंधित इंगित करता है.

प्रतिनिधि tracers के डेटा व्याख्या CF और वंय-प्रकार चूहों18,19,20,21,३५ के बीच भेदभाव करने के लिए नाक पीडी परीक्षण की क्षमता को दर्शाता है और पता चलता है कि F508del-CF इरास्मस माउस मॉडल30 ठेठ नैदानिक आयन परिवहन विषमता के संबंध में मानव नाक म्यूकोसा की नकल । हालांकि, पशु मॉडल में, एक अवशिष्ट क्लोराइड कंडक्टर, एक अवशिष्ट F508del-CFTR समारोह से या वैकल्पिक गैर CFTR निर्भर क्लोराइड चैनलों के योगदान से या तो जिसके परिणामस्वरूप, detectable है । नैदानिक सेटिंग्स में नैदानिक से CF अनुसंधान से परिणाम का अनुवाद दो सेटिंग्स के बीच कई प्रमुख मतभेदों से निपटने का तात्पर्य है. माउस CF phenotype एक तनु श्वसन सिंड्रोम प्रदर्शित करता है । तथ्य यह है कि माउस मॉडल स्वच्छ बाधाओं के साथ विशेषाधिकार प्राप्त शर्तों में स्थित है के साथ कई चिकित्सा के अभाव भी मतभेद३७में योगदान करते हैं । प्रोटोकॉल यहां वर्णित एक बहुत कम परिवर्तनशीलता३५ से पता चलता है और यह सुअर३८,३९ और फेर्रेट मॉडल४०के लिए अनुकूलित किया गया है । एक पिछले अध्ययन में, प्रायोगिक प्रोटोकॉल वैकल्पिक क्लोराइड ट्रांसपोर्टरों की एक अवरोध करनेवाला के साथ माउस नाक म्यूकोसा के छिड़काव सहित द्वारा संशोधित किया गया था, गैर CFTR निर्भर कैल्शियम के संभावित योगदान का पता लगाने के लिए क्लोराइड सक्रिय चैनल18. परीक्षण के लिए भी β-ENaC माउस मॉडल४१में सोडियम परिवहन अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, CF-फेफड़ों के रोग४२की नकल करने के लिए इंजीनियर. भविष्य में, परीक्षण के आगे अनुप्रयोगों के लिए इस तरह के ATP12A, एक CFTR-स्वतंत्र एच के रूप में अंय ट्रांसपोर्टरों, अध्ययन पर विचार किया जा सकता है+-पंप मानव में और सुअर में व्यक्त प्रोटीन लेकिन माउस एयरवेज४३में अनुपस्थित । कुल मिलाकर, यहां वर्णित प्रोटोकॉल सहज श्वास चूहों में transepithelial क्लोराइड और सोडियम ट्रांसपोर्टरों की कार्यात्मक स्थिति के विश्वसनीय माप, कम परीक्षण से संबंधित मृत्यु दर और एक ही जानवर में कई परीक्षणों की अनुमति देता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों ने गंभीर रूप से पांडुलिपि के संपादन के लिए प्रो जे Lebacq का शुक्रिया अदा किया । Cftrtm1Eur (homozygous F508del-Cftr (FVB/चूहों इरास्मस MC, रॉटरडैम, नीदरलैंड द्वारा विकसित किया गया था, यूरोपीय आर्थिक समुदाय यूरोपीय समंवय कार्रवाई के समर्थन के साथ सिस्टिक फाइब्रोसिस यूरोपीय संघ में अनुसंधान के लिए FP6 LHHM-सीटी-2005-018932.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Portex polyethylene tube  Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD to prepare capillary tubes for nasal probe
Electrode cream Parker, Fairfield, NJ, USA Redux cream to build electrode bridges
Ag/AgCl electrodes Biomedical, Clinton Township, MI, USA JNS BNT131-1,0 measuring and reference electrodes
amiloride hydrochloride Sigma, St Louis, MI, USA A7410 to prepare perfusion solutions
forskolin Sigma, St Louis, MI, USA F6886 to prepare perfusion solutions
Knick Portamess voltmeter Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany Portavo 904 pH to measure potential difference
Paraly SW 112 Software  Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany Paraly SW112 software to capture potential difference data
midazolam  Mylan, Hoeilaart, Belgium Dormicum 15mg/3ml to serve as anaesthetic premedication
fentanyl Janssen Cilag, Berchem, Belgium Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml to serve as anaesthetic medication
medetomidine Orion Pharma, Espoo, Finland Domitor 1 mg/ml to serve as anaesthetic medication
droperidol  Janssen  Cilag, Berchem, Belgium Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml to serve as anaesthetic medication
clonidine  Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany Catapressan 0.15 mg/ml, to serve as anaesthetic medication
refernce IV catheter Becton Dickinson, Sandy, UT, USA 24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W to build electrode bridges
forceps  Fine science Tools, Heidelberg, Germany Dumont #5, Fine science Tools to place the nasal catheter
naloxone  Braun Medical, Brussels, Belgium Narcan, 0.4 mg/ml to serve as anaesthetic antagonist
atipamezole  Zoetis, Bloomberg, Belgium Antisedan, 5 mg/ml to serve as a medetomedine specific antidote 
Heating pads  Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA 18,8x37,5 cm; 15,5x15,5 cm to avoid hypothermia during and after the test
Peristaltic pump P1 GE Life Sciences, Uppsala, Sweden 18111091 to perfuse solutions in the mouse nose
cyanoacrylate glue Loctite, Henkel, Düsseldorf, Germany  super glue 3 to glue together two capillary tubes  for nasal probe
NaCl Sigma, St Louis, MI, USA RES0926S-A7 Pharma-Grade, USP
CaCl2.2H2O Sigma, St Louis, MI, USA M7304 Pharma-Grade, USP
MgCl2.6H2O Sigma, St Louis, MI, USA 1551128 Pharma-Grade, USP
K2HPO4 Sigma, St Louis, MI, USA 1551139 Pharma-Grade, USP
Na gluconate Sigma, St Louis, MI, USA S2054 Pharma-Grade, USP
Ca gluconate Sigma, St Louis, MI, USA C8231 Pharma-Grade, USP
MgSO4.7H2O Sigma, St Louis, MI, USA RES0089M-A7 Pharma-Grade, USP
BD needle  Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA BD 26G (0.45x10 mm) intraperitoneal injection

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References

  1. Knowles, M., Gatzy, J., Boucher, R. Increased bioelectric potential difference across respiratory epithelia in cystic fibrosis. New England Journal of Medicine. 305 (25), 1489-1495 (1981).
  2. Middleton, P. G., Geddes, D. M., Alton, E. F. W. Protocols for in vivo measurement of the ion transport defects in cystic fibrosis nasal epithelium. European Respiratory Journal. 7 (11), 2050-2056 (1994).
  3. Knowles, M. R., Paradiso, A. M., Boucher, R. C. In vivo nasal potential difference: techniques and protocols for assessing efficacy of gene transfer in cystic fibrosis. Human Gene Therapy. 6 (4), 445-455 (1995).
  4. Paranjape, S. M., Zeitlin, P. L. Atypical cystic fibrosis and CFTR-related disorders. Clinical Reviews in Allergy & Immunology. 35 (3), 116-123 (2008).
  5. Wilschanski, M., et al. A pilot study of the effect of gentamicin on nasal potential difference measurements in CF patients carrying stop mutations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (3), Pt 1 860-865 (2000).
  6. Clancy, J. P., et al. Evidence that systemic gentamicin suppresses premature stop mutations in patients with CF. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163 (7), 1683-1692 (2001).
  7. Wilschanski, M., et al. Gentamicin-induced correction of CFTR function in patients with CF and CFTR stop mutations. New England Journal of Medicine. 349 (15), 1433-1441 (2003).
  8. Sermet-Gaudelus, I., et al. In vitro prediction of stop-codon suppression by intravenous gentamicin in patients with CF: a pilot study. BMC Medicine. 5, 5 (2007).
  9. Clancy, J. P., et al. No detectable improvements in CF transmembrane conductance regulator by nasal aminoglycosides in patients with CF with stop mutations. American Journal of Respiratory and Cell Molecular Biology. 37 (1), 57-66 (2007).
  10. Kerem, E., et al. Effectiveness of PTC124 treatment of CF caused by nonsensemutations: a prospective phase II trial. Lancet. 372 (9640), 719-727 (2008).
  11. Sermet-Gaudelus, I., et al. Ataluren (PTC124) induces CF transmembrane conductance regulator protein expression and activity in children with nonsense mutation CF. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182 (10), 1262-1272 (2010).
  12. Wilschanski, M., et al. Chronic ataluren (PTC124) treatment of nonsense mutation cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 38 (1), 59-69 (2011).
  13. Accurso, F. J., et al. Effect of VX-770 in persons with CF and the G551D-CFTR mutation. New England Journal of Medicine. 363 (21), 1991-2003 (2010).
  14. Clancy, J. P., et al. Results of a phase IIa study of VX-809, an investigational CFTR corrector compound, in subjects with cystic fibrosis homozygous for the F508del-CFTR mutation. Thorax. 67 (1), 12-18 (2012).
  15. Leonard, A., Lebecque, P., Dingemanse, J., Leal, T. A randomized placebo-controlled trial of miglustat in cystic fibrosis based on nasal potential difference. Journal of Cystic Fibrosis. 11 (3), 231-236 (2012).
  16. De Boeck, K., et al. CFTR biomarkers: time for promotion to surrogate end-point. European Respiratory Journal. 41, 203-216 (2013).
  17. Leal, T., et al. Successful protocol of anaesthesia for measuring transepithelial nasal potential difference in spontaneously breathing mice. Laboratory Animals. 40 (1), 43-52 (2006).
  18. Lubamba, B., et al. Preclinical evidence that sildenafil and vardenafil activate chloride transport in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (5), 506-515 (2008).
  19. Lubamba, B., et al. Airway delivery of low-dose miglustat normalizes nasal potential difference in F508del cystic fibrosis mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 179 (11), 1022-1028 (2009).
  20. Lubamba, B., et al. Inhaled PDE5 inhibitors restore chloride transport in cystic fibrosis mice. European Respiratory Journal. 37 (1), 72-78 (2011).
  21. Vidovic, D., et al. rAAV-CFTRΔR Rescues the Cystic Fibrosis Phenotype in Human Intestinal Organoids and Cystic Fibrosis Mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 288-298 (2016).
  22. Stutts, M. J., et al. CFTR as a cAMP-dependent regulator of sodium channels. Science. 269 (5225), 847-850 (1995).
  23. Lubamba, B., Dhooghe, B., Noel, S., Leal, T. Cystic fibrosis: insight into CFTR pathophysiology and pharmacotherapy. Clinical Biochemistry. 45 (15), 1132-1144 (2012).
  24. Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
  25. Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4925), 1066-1073 (1989).
  26. Stutts, M. J., Rossier, B. C., Boucher, R. C. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inverts protein kinase A-mediated regulation of epithelial sodium channel single channel kinetics. Journal of Biological Chemistry. 272 (22), 14037-14040 (1997).
  27. Ismailov, I. I., et al. Regulation of epithelial sodium channels by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Biological Chemistry. 271 (9), 4725-4732 (1996).
  28. Althaus, M. ENaC inhibitors and airway re-hydration in cystic fibrosis: state of the art. Current Molecular Pharmacology. 6 (1), 3-12 (2013).
  29. Wilke, M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, Suppl 2 152-171 (2011).
  30. Van Doorninck, J. H., et al. A mouse model for the cystic fibrosis delta F508 mutation. The EMBO Journal. 14 (18), 4403-4411 (1995).
  31. Colledge, W. H., et al. Generation and characterization of a delta F508 cystic fibrosis mouse model. Nature Genetics. 10 (4), 445-452 (1995).
  32. Zeiher, B. G., et al. A mouse model for the delta F508 allele of cystic fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 96 (4), 2051-2064 (1995).
  33. Ghosal, S., Taylor, C. J., McGray, J. Modification of the nasal membrane potential difference with inhaled amiloride and loperamide in the cystic fibrosis (CF) mouse. Thorax. 51 (12), 1229-1232 (1996).
  34. Ghosal, S., Taylor, C. J., Colledge, W. H., Ratcliff, R., Evans, M. J. Sodium channel blockers and uridine triphosphate: effects on nasal potential difference in cystic fibrosis mice. European Respiratory Journal. 15 (1), 146-150 (2000).
  35. Leonard, A., et al. Comparative Variability of Nasal Potential Difference Measurements in Human and Mice. Open Journal of Respiratory Disease. 2, 43-56 (2012).
  36. Tannenbaum, J., Bennett, B. T. Russell and Burch's 3Rs then and now: the need for clarity in definition and purpose. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 120-132 (2015).
  37. Pritchett-Corning, K. R., et al. AALAS/FELASA Working Group on Health Monitoring of rodents for animal transfer. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (6), 633-640 (2014).
  38. Salinas, D. B., et al. CFTR involvement in nasal potential differences in mice and pigs studied using a thiazolidinone CFTR inhibitor. American Journal of Physiology. Lung Cell Molecular Physiology. 287 (5), 936-943 (2004).
  39. Fisher, J. T., et al. Comparative processing and function of human and ferret cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Journal of Biological Chemistry. 287 (26), 21673-21685 (2012).
  40. Kaza, N., et al. Use of ferrets for electrophysiologic monitoring of ion transport. PLoS One. 12 (10), 0186984 (2017).
  41. Leal, T., Beka, M., Panin, N., Mall, M. A., Noel, S. Nasal potential difference in βENaC-overexpressing mouse reveals pH-sensitive channel hyperactivity and shift of subunits stoichiometry. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (S1), 72 (2017).
  42. Mall, M., Grubb, B. R., Harkema, J. R., O'Neal, W. K., Boucher, R. C. Increased airway epithelial Na+ absorption produces cystic fibrosis-like lung disease in mice. Nature Medicine. 10 (5), 487-493 (2004).
  43. Shah, V. S., et al. Airway acidification initiates host defense abnormalities in cystic fibrosis mice. Science. 351 (6272), 503-507 (2016).

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जीव विज्ञान अंक १३७ सिस्टिक फाइब्रोसिस CFTR ENaC नाक संभावित अंतर आयन परिवहन माउस रोग के मॉडल चिकित्सीय प्रभावकारिता के जैव-चिह्न निदान
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