Summary
Aquí, presentamos un protocolo para medir diferencia de potencial nasal en ratones. La prueba cuantifica la función de transportadores transmembrana de iones tales como el regulador de conductancia transmembrana de la fibrosis quística y el canal epitelial del sodio. Es valioso para evaluar la eficacia de nuevas terapias para la fibrosis quística.
Abstract
La prueba de diferencia de potencial nasal se ha utilizado durante casi tres décadas para ayudar en el diagnóstico de fibrosis quística (FQ). Ha demostrado ser útil en casos de atenuados, formas oligo o mono sintomática de la FQ se diagnostican generalmente más tarde en la vida y de trastornos relacionados con la CF como ausencia bilateral congénita de conductos deferentes, la pancreatitis crónica idiopática, alérgica aspergilosis broncopulmonar y bronquiectasia. En ajustes clínicos y preclínicos, la prueba se ha utilizado como un biomarcador para cuantificar las respuestas a estrategias terapéuticas específicas para CF. adaptar el test a un ratón es difícil y puede exigir una mortalidad asociada. Este papel describe la adecuada profundidad de la anestesia necesaria para mantener un catéter nasal en situ para perfusión continua. Listas las medidas para evitar la Bronco-aspiración de soluciones de perfusión en la nariz. También describe el cuidado de los animales al final de la prueba, incluyendo la administración de una combinación de los antídotos de los fármacos anestésicos, a revertir rápidamente la anestesia con la recuperación completa de los animales. Datos representativos de un CF y un ratón de tipo salvaje muestran que la prueba discrimina entre CF y CF no. En conjunto, el protocolo descrito aquí permite mediciones fiables de la situación funcional de transportadores trans epitelial de cloruro y sodio en ratones de respirar espontáneamente, así como varias pruebas en el mismo animal reduciendo el relacionado con la prueba mortalidad.
Introduction
Durante casi tres décadas, se han utilizado mediciones potenciales eléctricas de la diferencia (PD) para evaluar el estado funcional de los transportadores de iones transmembrana expresada en la mucosa nasal, como representante de la de las vías aéreas distales1. Como una dinámica de varias fases de la prueba2,3, nasal PD permite disección funcional del regulador de conductancia transmembrana de la Fibrosis Quística (CFTR) y actividad del canal (ENaC) de sodio epiteliales, ambos localizan en las membranas apicales de las células epiteliales y ejercer roles críticos en la hidratación superficial de la vía aérea. La principal aplicación clínica de la prueba PD nasal es ayudar en el diagnóstico de la FQ, el desorden genético fatal más común en población Caucásica con una incidencia promedio de 1 de cada 2.500 nacidos vivos en países europeos. La prueba larga ha demostrado ser útil en el diagnóstico de formas oligo o mono sintomática atenuada, de la fibrosis quística generalmente se diagnostica más tarde en la vida y de trastornos relacionados con la CF como ausencia bilateral congénita de conductos deferentes, la pancreatitis crónica idiopática, alérgica aspergilosis broncopulmonar y bronquiectasias4. Más recientemente, clinométrica evaluación de la modulación terapéutica de la CFTR básico defecto5,6,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16 ha hecho uso de la PD nasal en los ensayos clínicos de nuevas terapias de CF. En la configuración de preclínica, la prueba ha sido adaptada a ratón17 para permitir la investigación de la bioactividad de nuevo CF blanco terapias18,19,20,21. En ratones, la técnica es delicada, basada en especies relacionadas con las diferencias anatómicas en el tamaño de la región nasal entre roedores y humanos y principalmente en el papel esencial de entradas sensoriales de la región nasofacial en roedores. Requiere operadores entrenados y calificados, maquinaria y equipo dedicado.
CF es un desorden sistémico múltiples de las glándulas exocrinas, en que la enfermedad respiratoria crónica domina el cuadro clínico. La enfermedad es causada por mutaciones en el gene que codificaba el monofosfato de adenosina cíclico (campo)-regulado de canal de cloruro CFTR22. Hasta la fecha, más de 2.000 mutaciones de CFTR han sido identificadas23. El más común mutación24,25, en casi el 90% de los alelos de la CF, corresponde a una supresión del fenilalanina en posición 508 de la cadena polipeptídica de la proteína (F508del-CFTR). La proteína CFTR es un canal puramente óhmica pequeña conductancia del cloruro. También hay evidencia considerable que la CFTR regula otros mecanismos de transporte, en particular, ENaC26,27. Transporte de electrolito defectuoso, incluyendo menor conductancia de cloruro CFTR dependiente y creciente conductancia de sodio ENaC-dependiente, es un sello de epitelios CF. El defecto anterior se refleja en una reducida o suprimida la repolarización en respuesta a una emanación de cloruro que Gradiente electroquímico y la adición de isoprenalina (un agonista β-adrenérgico que aumenta el cAMP intracelular) o forskoline (una adenilato ciclasa agonista, no aprobado para uso clínico). El defecto de este último se refleja en una hiperpolarización basal de la mucosa nasal (un EP más negativo) y una mayor respuesta a amilorida, un medicamento diurético que bloquea ENaC28.
Modelos de ratón de CF se han utilizado con frecuencia en la investigación de CF y han sido invaluables para disección de patología CF. Hoy en día, por lo menos quince modelos han sido descrito29, de los cuales tres son homocigóticos para el clínico más relevante F508del mutación30,31,32. Una de estas tres cepas30, desarrollado en la Universidad Erasmus en Rotterdam, se ha utilizado por casi 20 años en el laboratorio de Université catholique de Louvain (UCL). La Cftrtm1Eur modelo30 ha demostrado para ser muy útil para estudiar la fisiopatología multiorgánica de la enfermedad de CF y comprobar la eficacia de nuevas estrategias terapéuticas18,19,20, 21. Numerosos problemas pueden ocurrir durante o temprano después de (< 24 h) la prueba PD nasal en ratones. En este artículo se describen la profundidad adecuada de la anestesia necesaria para mantener un catéter nasal en situ para la perfusión continua y medidas para evitar la Bronco-aspiración de soluciones de perfusión en la nariz. El cuidado de los animales al final de la prueba también se describe, incluyendo la administración de una combinación de los antídotos de drogas anestésicas, a revertir rápidamente la anestesia con la recuperación completa de los animales. En conjunto, estos procedimientos permiten mediciones fiables en ratones de respiración espontánea, disminución de la mortalidad relacionada con la prueba y repetir la prueba en el mismo animal. Representante de datos obtenidos de la prueba de PD nasal en un CF y un ratón de tipo salvaje se muestran y discuten.
El protocolo de pruebas PD nasal murino se divulga en tres sesiones: evaluación y manejo antes, durante y después de la prueba. En la evaluación pre-test y la gestión, el protocolo de preparación del catéter doble lumen nasal y de las soluciones utilizadas para perfusión continua nasal se describe en detalle. Durante la evaluación y las porciones de la administración de la prueba, el montaje experimental y el manejo del ratón es disecado minuciosamente. Por último, manejo del animal al final de la prueba se describe para mejorar la recuperación completa de animal.
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Protocol
Los estudios y procedimientos fueron aprobados por el Comité de ética para la investigación animal de la UCL (2017/UCL/MD/015) de acuerdo con la normativa comunitaria europea para el uso de animales en investigación (CEE n ° 86/609). Los investigadores están capacitados para la experimentación en animales después de la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de septiembre de 2010 sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos.
1. la prueba de evaluación y gestión
- Preparar el catéter de doble lumen nasal.
Nota: Un catéter nasal es como un tubo capilar de doble luz, una luz se utilizan para la perfusión continua de soluciones, y el otro como una medición del canal.- Calentar la parte central de una pieza, de unos 20 cm de largo, de tubo de polietileno (diámetro interno de 2.0 mm, 3.0 mm de diámetro externo; Figura 1 una) en la llama de un mechero de gas hasta que esté lo suficientemente suave como para tirar (10-15 s).
- Separe los dos extremos para obtener un tubo capilar muy delgado de longitud adecuada (~ 15 cm) y diámetro exterior (~0.1 milímetros) para la sonda nasal (figura 1b).
- Limpiar y desengrasar dos tales capilares con etanol puro, unirlos con cinta adhesiva (figura 1c) y pegar con pegamento de cianocrilato.
- Corte la longitud excesiva de las sondas con una navaja o un bisturí para obtener una óptima longitud del catéter doble lumen de unos 8 cm (figura 1d).
- Inyectar agua a través de dos lúmenes para verificar que son permeables.
- Aplicar una marca en una distancia de 5 mm de la punta.
Nota: La sonda se introduce hasta la marca en la fosa nasal, por lo que todas las mediciones se hacen en el mismo sitio dentro de la cavidad nasal. - Guarde el catéter de doble lumen en una caja seca.
Nota: Puede ser usado 6 - 10 veces si adecuadamente limpiado inmediatamente después de la prueba.
- Preparar la mezcla de crema.
- Suavemente mezcle crema de electrólito y 3 M KCl solución saturada en una proporción de 1:1 (volumen), evitando formación de burbujas de aire pequeñas.
Nota: La mezcla de crema se utiliza para construir los puentes de electrodo para la medición y la referencia de Ag/AgCl electrodos, como se ilustra en la figura 1.
- Suavemente mezcle crema de electrólito y 3 M KCl solución saturada en una proporción de 1:1 (volumen), evitando formación de burbujas de aire pequeñas.
Figura 1 : Sondas con electrodos y puentes. La figura muestra el tubo de polietileno antes (a) y después del calentamiento y tracción (b), la cinta de unión de las dos partes capilares (c) de catéter doble lumen (d), los conectores de tubo de silicona (e) y electrodos (f). Para mayor claridad de imagen, los conectores no han sido llenados con la mezcla de crema. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Etiqueta de la solución | Descripción de la solución |
| A | Solución salina tamponada basal |
| B | Cloruro-libre tamponada con solución salina |
| C | 10-2 M solución amilorida |
| D | La forskoline solución 10-3 M |
Tabla 1: Solución de valores para la prueba de PD nasal en ratones.
| Sal | mM | Peso molecular | g/L |
| Cloruro de sodio (NaCl) | 135 | 58.44 | 7.889 |
| Dihidrato del cloruro de calcio (CaCl2.2 h2O) | 2.25 | 147 | 0.331 |
| Hexahidrato de cloruro de magnesio (MgCl2.6H2O) | 1.2 | 203.3 | 0.244 |
| Fosfato dipotásico (K2HPO4) | 2.4 | 174.2 | 0.418 |
| Fosfato monopotásico (KH2PO4) | 0.4 | 136.1 | 0.054 |
Tabla 2: Composición de basal tamponada con solución salina (solución stock A).
- Preparar las soluciones.
- Prepare las cuatro soluciones madre necesarias para el protocolo experimental (tabla 1).
- Preparar la solución basal (solución A; Tabla 2) y la solución tamponada de cloruro-libre (solución madre B; Tabla 3) mezclando las sales en agua pura a temperatura ambiente. Ajustar el pH a 7.4 (gama 7.0-7.6) utilizando 1 N NaOH para elevar el pH, 1 N HCl a pH más bajo. Controlar la osmolaridad de la solución (275 mOsm/L).
- Almacenar en botellas de vidrio etiquetados a 4 ° C hasta por 3 meses o congeladas en botellas de plástico hasta por 6 meses.
- Preparar la solución de amilorida 10-2 M (solución C) mediante la adición de 26,6 mg de clorhidrato de amilorida a 10 mL de agua pura. Calienta la mezcla durante 5 a 10 minutos a 70 ° C. Como amilorida es sensible a la luz, conservar la solución C en un recipiente oscuro. Marque el recipiente y almacenar a 4 ° C hasta por 3 meses.
- Preparar la solución de forskoline 10-3 M (solución D) mediante la adición de 10 mg de Forskolina a 24,36 mL de agua pura. Etiqueta de alícuotas de 0,1 mL de la solución madre de forskoline y almacenar a-20 ° C hasta por 6 meses.
- Prepare las cuatro soluciones madre necesarias para el protocolo experimental (tabla 1).
- Preparar soluciones frescas de A1, B1 y B2 (cuadro 4).
- Preparar solución fresca A1 (solución salina tamponada basal plus 10-4 M amilorida) obtener 10 mL de solución salina basal (solución stock A) y agregando 0,1 mL de 10-2 M solución de amilorida (solución C). Marque el recipiente y utilizar dentro de 24 horas de preparación.
- Preparar solución fresca B1 (cloruro tampón solución además de 10-4 M amilorida) obtener 10 mL de solución salina tamponada libre de cloro (solución stock B) y agregando 0,1 mL de 10-2 M solución de amilorida (solución C). Marque el recipiente y use dentro de las 24 horas de preparación.
- Preparar solución fresca B2 (amilorida de solución salina tamponada de cloruro libre y 10-4 M y 10-5 M forskoline) obtener 10 mL de solución salina tamponada libre de cloro (solución stock B) y agregando 0,1 mL de 10-2 M amilorida (solución stock C) y 0,1 mL de 10-3 M forskoline solución (solución D). Marque el recipiente y usar dentro de 2 horas de preparación.
| Sal | mM | Peso molecular | g/L |
| Gluconato de sodio (sal monosódica) | 135 | 218.1 | 29.444 |
| Gluconato de calcio (anhidro polvo) | 2.2 | 430,4 | 0.947 |
| Heptahidrato del sulfato de magnesio (MgCl2.6H2O) | 1.2 | 246.5 | 0.296 |
| Fosfato dipotásico (K2HPO4) | 2.4 | 174.2 | 0.418 |
| Fosfato monopotásico (KH2PO4) | 0.4 | 136.1 | 0.054 |
Tabla 3: Composición de cloruro-libre amortiguada (solución stock B).
Figura 2 : Posición del ratón durante la perfusión de la mucosa nasal. La figura ilustra el cojín de calentamiento (a) el voltímetro (b), el electrodo de referencia en el espacio subcutáneo en una extremidades (c), la proximal (d) y distales (e) salidas de la bomba peristáltica, la almohadilla (f), y la cama de la hoja (g). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. evaluación y manejo durante la prueba
- Preparar la instalación experimental.
- Para prevenir la hipotermia durante y después de la prueba, utilice dos almohadillas mantenidas a temperaturas fisiológicas, uno para la instalación de medición (18,8 x 37,5 cm; Figura 2 una) y el otro (15.5 x 15.5 cm) para el cuadro en el que se colocará el animal para la recuperación al final de la prueba.
- Encienda el equipo cargado con el software para captura de datos conectado a la impedancia de entrada alta datos memoria (> 1012Ω) y alta resolución (0,1 mV) voltímetro (figura 2b).
- Conecte los electrodos al voltímetro. Conectar el electrodo positivo de la medición el catéter nasal y el electrodo de referencia negativa para el catéter que se inserta en el espacio subcutáneo en un miembro trasero, como se muestra en la figura 2c.
- Sumergir las puntas de los electrodos en la mezcla de crema. Compruebe el valor del offset del electrodo inicial. Rechazar los electrodos Si el valor es mayor de (±) 2 mV (idealmente 0 mV).
- Encienda la bomba peristáltica e Inserte el tubo de la bomba en posición, como se ilustra en la figura 2.
- Conecte la salida proximal del tubo de la bomba al frasco que contiene la solución seleccionada para perfusión nasal (figura 2d). Conecte la salida distal del tubo de la bomba a la luz de la perfusión del catéter nasal (figura 2e).
- Llene un lumen del catéter nasal con mezcla de crema de electrolitos a través de una pipeta de 10 μl. Adaptar el catéter a un conector de tubo de silicona (figura 1e), llene el conector con la mezcla de crema e Inserte el electrodo positivo en el conector (fde lafigura 1). Compruebe el valor de desplazamiento de puente electrodo de medición. Rechazar los puentes si el valor es mayor de (±) 2 mV (idealmente 0 mV).
- Llene el segundo lumen del catéter nasal con solución fresca A1. Sumergir la punta del catéter nasal en el frasco que contenga solución inversa A. la dirección de la bomba peristáltica para cubrir una longitud de catéter nasal correspondiente a 10 s de perfusión.
Nota: Esto permite registrar valores basales de PD por 10 s antes de aplicar el amiloride. Sumerja la punta del catéter nasal en la mezcla de crema dentro del conector del electrodo de referencia (figura 1).
- Comenzar a manejar el ratón.
- Registrar el peso del ratón para calcular la dosis exacta de anestesia para ser inyectada por vía intraperitoneal (ip)17.
- Utilizando una aguja de 26G (0.45 x 10 mm), inyectar premedicación por vía intraperitoneal para promover la inducción de la anestesia: una dosis fija de 50 μl de midazolam 5 mg/mL. Espere 5 minutos.
- Preparar la mezcla anestésica (fentanilo, medetomidina, droperidol en concentración final de 0.05 0.40 y 20 mg/kg de peso corporal respectivamente y clonidina a la dosis fija de 0,375 μg) permitiendo profundidad óptima y estable de la anestesia (etapa III, avión 2)17 . Inyectar el volumen de mezcla anestésica por vía intraperitoneal y luego inyectar el volumen de la clonidina.
Nota: Después de 15 minutos, el ratón debe estar dormido y la anestesia puede durar al menos 30 minutos. - Doblar una hoja de tejido para hacer una 3 cm ancho 'almohada' (figura 2f) que cubra la parte superior de la almohadilla de la calefacción (figura 2a) como un apoyo para la cabeza de ratón que absorbe.
- Cubrir la almohada con una lámina de absorción de tejido ('sábana'; Figura 2 g). Coloque el ratón sobre su parte posterior en la almohadilla de la calefacción. Cinta hacia fuera de las extremidades y la cola (figura 2).
- Inserte el catéter intravenoso de referencia (figura 1g) en el espacio subcutáneo de un miembro trasero. Retire la aguja y adaptar el conector del tubo de silicona (figura 1e, 2 c).
- Llene el catéter y el conector con la crema mezclar e Introduzca el electrodo negativo en el conector (fde lafigura 1).
- Fijar el catéter y el electrodo con cinta adhesiva según sea necesario para evitar cualquier desplazamiento. Después de la colocación de los puentes y electrodo de referencia, para comprobar el valor de desplazamiento de puente electrodo de medición otra vez sumergir la punta del catéter nasal en la mezcla de crema de electrodo dentro del conector del catéter IV. Registre el valor de offset final estable (idealmente menos de (±) 2 mV).
- Fijar el ratón orejas con la cinta "suave" en el cojín de calentamiento en un espacio libre entre las dos piezas de absorción del tejido ('almohada' (figura 2f) y 'sábana'; (Figura 2g)). Fijar los vibrissae (los pelos tiesos que crecen cerca de las fosas nasales) sin tocar los ojos.
- Para absorber el líquido de la cavidad oral, mover la lengua hacia los lados (figura 3a) e inserte una punta mecha de papel de filtro (el ' tubo'; Figura 3 b) alrededor de 1 cm en la boca. Para absorber el fluido funcionamiento de la fosa inundada, coloque un segundo pedazo de papel de filtro (el ' pañuelo'; Figura 3 c) llevó a cabo en la punta de la nariz.
- Compruebe un valor de control positivo del potencial epitelial colocando la punta del catéter nasal en contacto con el interior de la boca.
Nota: La lectura debe ser estable y oscilan entre los -10 mV y -20 mV. - Sujetándola con unas pinzas finas y bajo buena iluminación directa, introduzca delicadamente el catéter nasal en un orificio nasal hasta 4 - punta de 6 mm de la nariz.
Nota: El catéter nasal de PD se encuentra en la concha nasal media en la posición que da la línea de base estable máxima PD valor17,20. - 5 minutos después de la inyección de las drogas anestésicas, incline suavemente el cojín de calentamiento unos 30 ° con la cabeza del animal hacia abajo. Supervisar el valor de PD basal máximo.
- Cuando es estable durante un período de cerca de 30 s, Inicio perfundiendo la mucosa nasal, con una velocidad constante de 10 μl / min, con las soluciones tampón 4 (A, A1, B1, B2) en sucesión. Inundar la primera solución (paso 1.3.1.1) durante 10 s y cada siguiente solución (paso 1.4) durante 5 minutos o hasta alcanzar un valor estable. Parada perfundiendo forskoline (B2) cuando la respuesta transitoria forskoline comienza a bajar.
- Seleccione un intervalo de s 1 para registro de datos. Iniciar la grabación de datos en el momento de iniciar la perfusión. Mostrar los datos en función del tiempo en la pantalla del ordenador.
- Captura de datos parados al final de la perfusión con solución B2. Guardar los datos como un archivo de hoja de cálculo.
- Datos correctos restando el valor de desvío final.
Figura 3 : Posición del ratón sobre el cojín de calentamiento con el catéter nasal y los papeles de filtro en lugar. La figura muestra la lengua poner hacia un lado (a), el tubo (b) y el pañuelo (c). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
3. la prueba de evaluación y gestión
- Suelte el ratón de la almohada.
- Limpiar la nariz del ratón con la 'sábana' (figura 2g).
- Inyectar por vía intraperitoneal la mezcla anestésica antagonista compuesta de una dosis fija (4 μg) de naloxona, un antagonista competitivo de la morfina y atipamezole, un antídoto específico de la medetomidina (2 mg/kg de peso corporal).
- Coloque el ratón sobre la almohada más pequeñas en el cuadro de recuperación hasta total recuperación, que generalmente se observa después de 1 a 2 h.
Nota: En el laboratorio de la UCL, alrededor del 10% la mortalidad, principalmente relacionadas con broncoaspiración de soluciones de perfusión en la cavidad nasal durante la prueba, se observa independientemente del género o genotipo.
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Representative Results
Para ilustrar las anormalidades del transporte de iones característicos en la FQ, se realizaron mediciones PD nasal siguiendo el protocolo descrito en un ratón de F508del-CF y en un control de tipo salvaje del FVB/129 fondo genético de la colonia de Bruselas de Ratones detm1Eur 30de CFTR. Este modelo clínico relevante, albergar los más comunes y uno de los más graves F508del-CFTR mutación23,24,25, es el mejor actualmente disponible CF ratón modelo30,31, 32.
Representante nasal PD registros de encabezamientos secundarios, obtenidos en un ratón hembra 4 meses - viejo homocigótico para la mutación F508del-CF y en un littermate de tipo salvaje pareados por edad y sexo, se muestran en la figura 4. Durante las dos primeras fases de la prueba, el estado funcional de ENaC fue estudiado por perfundiendo soluciones A y A1, el último que contiene amilorida. Se evaluó el estado funcional de CFTR (y de transportistas alternativos cloruro en ausencia de Forskolina) durante las dos últimas fases de la prueba, cuando la contribución de ENaC permanecía bloqueada por amilorida.
En el ratón de la F508del-CF, se observó un valor de referencia hyperpolarized (un PDmax más negativo comparado con el valor de tipo wild mouse) junto con una respuesta mayor amilorida; ambos resultados reflejan la hiperactividad de la CFTR asociadas ENaC. Forma más consistente, una repolarización drásticamente reducida en respuesta a ambos un gradiente electroquímico favorable a emanación de cloruro y adición de forskoline, denominada aquí como total cloruro de respuesta, observó. A pesar de la magnitud de la respuesta de Forskolina en ratones de tipo salvaje es pequeña (-3 mV), en la FQ, la respuesta es generalmente blunted, consistente con la pérdida de función de la CFTR.
Figura 4 -Trazos representativos de PD nasal. Representante nasal PD los trazos de un ratón normal homocigótico (A) y un ratón homocigoto para la mutación F508del-CFTR (B), junto con los valores individuales obtenidos para los parámetros de PD nasal (C y D). PDmax: valor estable de la referencia máxima. Respuesta de amilorida: diferencia entre los valores de PD nasal al final y al comienzo de la perfusión de la mucosa nasal con basal tamponada con solución salina que contiene amilorida (solución A1). Respuesta libre de cloro: diferencia entre los valores de PD nasal al final y al comienzo de la perfusión de la mucosa nasal con cloruro-libre tamponada con solución salina más amilorida (solución B1). La forskoline respuesta: diferencia entre los valores de PD nasal al final y al comienzo de la perfusión de la mucosa nasal con cloruro-libre tamponada con solución de sal además de forskoline y amilorida (solución B2). Respuesta de cloruro total: suma de los dos últimos parámetros obtenidos bajo perfusión de cloruro de cero. Las flechas indican cambios de soluciones de perfusión en la fosa nasal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Antídotos de los anestésicos se aplicaron al final de las pruebas, reduciendo así la duración de la anestesia, que puede ser hasta 45 minutos más allá de la finalización de la prueba. Como la recuperación de los animales ocurrió sin secuelas, se probaron otra vez después de un intervalo de siete días, cuando se aplicó el mismo protocolo. La misma fosa nasal fue explorada durante ambas pruebas. Ejemplos de la segunda prueba y las diferencias pareadas de cada parámetro de PD nasal individual entre las dos pruebas se muestran en la figura 5. Como previamente divulgados35, las diferencias entre la prueba estuvieron cerca de nil, en particular para la respuesta de cloruro total, lo que refleja el estado funcional del transporte de cloruro CFTR dependiente, defectuoso en la FQ.
Figura 5 -Valores individuales de parámetros PD nasal. Valores se obtuvieron en una segunda prueba (t2) realizada en un ratón normal homocigótico (A) y un ratón homocigoto de la mutación F508del-CFTR (B), junto con las diferencias pareadas entre la segunda y la primera prueba (t1) para cada parámetro correspondiente. PDmax: valor estable de la referencia máxima. Respuesta de amilorida: diferencia entre los valores de PD nasal al final y al comienzo de la perfusión de la mucosa nasal con la basal tamponada con solución salina que contiene amilorida (solución A1). Respuesta libre de cloro: diferencia entre los valores de PD nasal al final y al comienzo de la perfusión de la mucosa nasal con el cloruro libre tamponada con solución salina más amilorida (solución B1). La forskoline respuesta: diferencia de los valores de PD nasal al final y al comienzo de la perfusión de la mucosa nasal con el cloruro libre tamponada con solución de sal además de forskoline y amilorida (solución B2). Respuesta de cloruro total: suma de los dos últimos parámetros obtenidos bajo perfusión de cloruro de cero. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Etiqueta de la solución | Descripción de la solución |
| A1 | Basales tamponada con solución salina (A) más 10-4 M amilorida |
| B1 | Cloruro-libre tamponada con solución salina (B) más 10-4 M amilorida |
| B2 | Cloruro-libre tamponada con solución salina (B) más 10-4 M amilorida más 10-5 M forskoline |
Tabla 4: Lista de las soluciones frescas para la prueba de PD nasal en ratones.
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Discussion
El objetivo de este trabajo es describir un protocolo adecuado para la medición de PD nasal bajo perfusión continua de soluciones espontáneamente de respiración ratones por un periodo de tiempo necesario para probar la integridad de los transportadores de iones, principalmente CFTR y ENaC. Todos los pasos del protocolo han sido cuidadosamente optimizados para asegurar recuperación completa animal y buena calidad y datos reproducibles. En particulares, importantes pasos son evaluación de anestesia y manejo y adecuada posición animal y cuidado durante y después de la prueba.
Estudios anteriores demostraron que el plano 2 etapa III de exposición anestésica, que se puede alcanzar mediante la aplicación de la mezcla de Cóctel aquí utilizada17, se asocia con la respiración regular y con la ausencia de efecto inotrópico negativo y de blink, pupilar y pedal reflejos de retirada. En este nivel de profundidad anestésica, el catéter nasal puede conservarse en situ de perfusión continua de la cavidad nasal y uso como puente del electrodo medición con buena tolerancia. También, inserción del catéter en el espacio subcutáneo, sirviendo como el puente del electrodo de referencia, no fue seguida por ninguna reacción dolorosa o signo de efecto nocivo. En roedores, el papel esencial de entrada sensorial de la región nasofacial en el control de la conducta frente a una situación externa, como una amenaza, hace adecuada profundidad de la anestesia, particularmente desafiante en la cavidad nasal. Nebulización en lugar de perfusión continua nasal se ha aplicado para realizar prueba de PD nasal en algunos mouse estudios33,34. Sin embargo, este método conduce a resultados no fiables, debido a reiteradas Mudanzas y reinsertions de la sonda nasal. De hecho, debido a una distribución no homogénea de tipos celulares en la mucosa nasal de ratón20, colocar de nuevo la punta de la sonda en la misma ubicación en la fosa nasal es fundamental. Además, las respuestas a los cambios de soluciones, en particular libre de cloro, se desvanecen rápidamente cuando se interrumpe la perfusión.
Bronco-aspiración de soluciones lleva a paro respiratorio es una limitación fundamental del procedimiento y es la principal causa de mortalidad de la prueba. Varias medidas esenciales objetivo evitando que, incluyendo una posición de decúbito dorsal del animal, ligeramente inclinando su cabeza hacia abajo y absorber el exceso de líquido de las cavidades oral y nasal17. Un nivel rápido y reversible de la anestesia con la recuperación completa de los animales está garantizado mediante la aplicación de antídotos de los fármacos anestésicos al final de la prueba. El protocolo que presentamos permite mediciones fiables en ratones la respiración espontáneamente y repetir la prueba en el mismo animal. Impactos sobre el número de ratones para obtener significación estadística35 y conforme a la 3R (reemplazar, afinar y reducir) reglas para el animal utilizan en procedimientos experimentales36. En los seres humanos como en ratones, la menor variabilidad entre prueba se ha encontrado respuesta de cloruro total, lo que sugiere que lo como el parámetro más confiable de PD nasal para detectar la eficacia de nuevas estrategias terapéuticas de CF. En ratones CF, el error en la medición de la respuesta de cloruro total fue demostrado para ser menos de ±1.7 mV35. En otras palabras, cuando de evaluar la bioactividad de una corrección de CFTR drogas en ratones de F508del-CF, una diferencia entre la respuesta de cloruro total en ausencia y en presencia de tratamiento mayor de 2 mV indica que 95% de probabilidad de un efecto de mejora relacionadas con las drogas.
Interpretación de los datos de trazos representativos ilustra la capacidad de la prueba de PD nasal para discriminar entre CF y los ratones de tipo salvaje18,19,20,21,35 y muestra que la F508del-CF Erasmus ratón modelo30 imita la mucosa nasal humana con respecto a las anormalidades del transporte de iones clínicas típicas. Sin embargo, en el modelo animal, una conductancia de cloruro residual es detectable, dando por resultado una función residual de la F508del-CFTR o de una contribución de canales de cloruro dependientes de CFTR no alternativos. Traducir los resultados de investigación de CF de preclínica en ajustes clínicos implica tratar con varias diferencias importantes entre las dos posiciones. El fenotipo de CF de ratón muestra un síndrome respiratorio atenuado. La ausencia de terapias múltiples junto con el hecho de que el modelo de ratón se encuentra en condiciones privilegiadas con barreras higiénicas también contribuyen a la diferencias de37. El protocolo aquí descrito muestra una variabilidad muy baja35 y ha sido adaptado para el cerdo38,39 y40los modelos el hurón. En un estudio anterior, el protocolo experimental fue modificado mediante la inclusión de la perfusión de la mucosa nasal de ratón con un inhibidor de los transportadores alternativos cloruro, para explorar la posible contribución de cloruro activados por calcio dependiente de CFTR no canales de18. La prueba también se ha utilizado para estudiar el transporte de sodio en el β-ENaC expresando ratón modelo41, diseñado para imitar el pulmón con FQ enfermedad42. En el futuro, más aplicaciones de la prueba podrían considerarse para el estudio de otros transportadores, como la ATP12A, una independiente de la CFTR H+-bomba proteína expresada en humanos y en cerdos pero ausente en el ratón airways43. En conjunto, el protocolo aquí descrito permite mediciones confiables de la situación funcional de transepithelial transportadores de cloruro y sodio en la respiración espontáneamente ratones, disminución de la mortalidad relacionada con la prueba y pruebas múltiples en el mismo animal.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen la Prof. J. Lebacq edición crítica del manuscrito. CFTRtm1Eur (ratones homocigóticos de F508del-CFTR (FVB/129) fueron desarrollados por el Erasmus MC, Rotterdam, los países bajos, con el apoyo de la Comunidad Económica Europea acción de coordinación europea para la investigación en Fibrosis Quística Unión Europea FP6 LHHM-CT-2005-018932.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Portex polyethylene tube | Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL | Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD | to prepare capillary tubes for nasal probe |
| Electrode cream | Parker, Fairfield, NJ, USA | Redux cream | to build electrode bridges |
| Ag/AgCl electrodes | Biomedical, Clinton Township, MI, USA | JNS BNT131-1,0 | measuring and reference electrodes |
| amiloride hydrochloride | Sigma, St Louis, MI, USA | A7410 | to prepare perfusion solutions |
| forskolin | Sigma, St Louis, MI, USA | F6886 | to prepare perfusion solutions |
| Knick Portamess voltmeter | Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany | Portavo 904 pH | to measure potential difference |
| Paraly SW 112 Software | Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany | Paraly SW112 software | to capture potential difference data |
| midazolam | Mylan, Hoeilaart, Belgium | Dormicum 15mg/3ml | to serve as anaesthetic premedication |
| fentanyl | Janssen Cilag, Berchem, Belgium | Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| medetomidine | Orion Pharma, Espoo, Finland | Domitor 1 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| droperidol | Janssen Cilag, Berchem, Belgium | Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| clonidine | Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany | Catapressan 0.15 mg/ml, | to serve as anaesthetic medication |
| refernce IV catheter | Becton Dickinson, Sandy, UT, USA | 24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W | to build electrode bridges |
| forceps | Fine science Tools, Heidelberg, Germany | Dumont #5, Fine science Tools | to place the nasal catheter |
| naloxone | Braun Medical, Brussels, Belgium | Narcan, 0.4 mg/ml | to serve as anaesthetic antagonist |
| atipamezole | Zoetis, Bloomberg, Belgium | Antisedan, 5 mg/ml | to serve as a medetomedine specific antidote |
| Heating pads | Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA | 18,8x37,5 cm; 15,5x15,5 cm | to avoid hypothermia during and after the test |
| Peristaltic pump P1 | GE Life Sciences, Uppsala, Sweden | 18111091 | to perfuse solutions in the mouse nose |
| cyanoacrylate glue | Loctite, Henkel, Düsseldorf, Germany | super glue 3 | to glue together two capillary tubes for nasal probe |
| NaCl | Sigma, St Louis, MI, USA | RES0926S-A7 | Pharma-Grade, USP |
| CaCl2.2H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | M7304 | Pharma-Grade, USP |
| MgCl2.6H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | 1551128 | Pharma-Grade, USP |
| K2HPO4 | Sigma, St Louis, MI, USA | 1551139 | Pharma-Grade, USP |
| Na gluconate | Sigma, St Louis, MI, USA | S2054 | Pharma-Grade, USP |
| Ca gluconate | Sigma, St Louis, MI, USA | C8231 | Pharma-Grade, USP |
| MgSO4.7H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | RES0089M-A7 | Pharma-Grade, USP |
| BD needle | Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA | BD 26G (0.45x10 mm) | intraperitoneal injection |
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