Summary
여기, 선물이 쥐에서 코 전위차를 측정 하는 프로토콜. 테스트는 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 및 상피 나트륨 채널 같은 막 횡단 이온 전송기의 기능을 단정. 그것은 낭 성 섬유 증에 대 한 새로운 치료의 효능을 평가 하기 위해 중요 합니다.
Abstract
비 강 잠재적인 차이 테스트 낭 성 섬유 증 (CF)의 진단에 도움을 거의 3 수십 년 동안 사용 되었습니다. 그것은의 경우에 도움이 될 감쇠, 일반적으로 나중에 진단 하는 CF와 CF 관련 장애 vas deferens, 특 발성 만성 췌 장 염, 알레르기의 선 천 성 양측 부재 등의 oligo 또는 모노 증상 형태 입증 bronchopulmonary aspergillosis, 그리고 기관지 확장 증입니다. 임상 및 전 임상 설정에서 테스트로 cf. Adapting 마우스를 테스트에 대 한 타겟된 치료 전략에 대 한 응답을 측정 하는 바이오 마커 도전 이며 관련된 사망률을 수반할 수 있습니다 사용 되었습니다. 이 문서는 비 강 카 테 터에 현장에서 지속적인 관류에 대 한 유지 하는 데 필요한 마 취의 적절 한 깊이 설명 합니다. 그것을 코에 끼얹는다 솔루션의 broncho-열망을 피하기 위해 조치를 나열 합니다. 그것은 또한 빠르게 반전 하는 전체 복구는 동물의 마 취로 이어지는 마 취 약의 해독의 조합의 관리를 포함 하 여 테스트의 끝에서 동물 관리를 설명 합니다. 대표적인 데이터는 CF와 CF와 CF 비 사이 차별 테스트 야생-타입 마우스 쇼에서 가져온. 모두, 여기에 설명 된 프로토콜 신뢰할 수 있는 측정 가능 줄이면서 동일한 동물에 여러 테스트로 서 저절로 호흡 쥐, 트랜스 상피 나트륨과 염화 물 전송기의 기능 상태의 테스트 관련 사망입니다.
Introduction
거의 3 년간 전기 잠재적인 차이 (PD) 측정 원심 항공1의 대표로 서 비 강 점 막에 표현 하는 막 횡단 이온 전송기의 기능 상태를 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 둘 다의 꼭대기 막에 지역화 다단계 동적 테스트2,3, 코 PD 수 있습니다 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 (CFTR)과 상피 나트륨 채널 (ENaC) 활동의 기능 해 부 상피 세포 하 고 기도 표면 수 분에 중요 한 역할을 발휘. 비 강 PD 테스트의 주요 임상 응용 프로그램은 CF, 유럽 국가에 1 개 2500 라이브 출생의 평균 발생률과 백인 인구에 있는 가장 일반적인 치명적인 유전 질환의 진단에 도움을. 테스트는 오랫동안 감쇠, oligo 또는 모노 증상 형태 일반적으로 나중에 진단 하는 CF와 CF 관련 장애 vas deferens, 특 발성 만성 췌 장 염, 알레르기의 선 천 성 양측 부재 등의 진단에 도움이 입증 bronchopulmonary aspergillosis, 그리고 기관지 확장 증4. 더 최근에, 기본적인 CFTR의 치료 변조의 clinometric 평가5,6,7,,89,10,11 결함 ,12,,1314,,1516 새로운 CF 치료의 임상 시험에서 비 강 PD의 사용 했다. 전 임상 설정에서 테스트 새로운 CF 대상 치료18,19,,2021의 bioactivity의 조사 수 있도록 마우스17 에 적응 되었습니다. 마우스에는 기술은 이다 섬세 한, 설치류와 인간 사이 코 영역의 크기에 종 관련 해 부 차이 설치류에 nasofacial 지역에서 감각 입력의 필수적인 역할에 주로 기반으로. 그것은 훈련 되 고 숙련 된 운영자, 전용된 장비 및 공급을 요구 한다.
CF는 전 샘의 다중 조직 장애는 만성 호흡기 질환에서 임상 그림을 지배 하고있다. 질병은 인코딩 순환 아데노신 monophosphate (캠프) 유전자에 돌연변이 의해 발생-규제 CFTR 염화 물 채널22. 날짜 하려면, 2000 개 이상의 CFTR 돌연변이 발견된23되었습니다. 가장 일반적인 돌연변이24,25, CF 대립 유전자의 거의 90%에서 발견 위치 508 (F508del-CFTR) 단백질의 polypeptide 사슬에서에서 페닐알라닌의 삭제에 해당 합니다. CFTR 단백질은 순전히 저항 작은 전도성 염화 물 채널 이다. CFTR 다른 전송 메커니즘, 특히 ENaC26,27을 조절 하는 상당한 증거가 있다. 결함이 전해질 수송, CFTR 종속 염화 전도도 감소 등 증가 ENaC 종속 나트륨 전도성, CF epithelia의 특징 이다. 전 결함 감소 또는 폐지 repolarization 전기 그라데이션 좋아하는 염화 경과 isoprenaline (는 β-아드레날린 길 항 제는 세포내 cAMP를 증가) 또는 산림 (는 adenylate의 추가에 의해 반영 된다 있고 주 작동 근, 임상 사용을 위해 승인 되지). 후자의 결점은 비 강 점 막 (더 부정적인 PD)와 amiloride, ENaC28을 차단 하는 뇨 제 약물에 대 한 증가 응답의 기저 hyperpolarization에 의해 반영 됩니다.
CF 마우스 모델 자주 CF 연구에 사용 되 고 CF 병 리 해 부에 귀중 한 되었습니다. 요즘, 적어도 15 모델 설명된29, 중 3 개는 되는 가장 임상 관련 F508del 돌연변이30,,3132homozygous 되었습니다. 이 세30, 로테르 담의 에라스무스 대학에서 개발 중 대학교 catholique 드 루 뱅 (UCL) 실험에서 거의 20 년 동안 사용 되었습니다. Cftrtm1Eur 모델30 CF 질병의 multiorgan 이상 공부 하 고 새로운 치료 전략18,,1920의 효능을 테스트 하는 매우 유용한 것으로 입증 되었습니다. 21. 동안 또는 후 초기 수많은 문제가 발생할 수 있습니다 (< 24 h) 쥐에서 비 강 PD 테스트. 이 논문에서는, broncho-코에 끼얹는다 솔루션의 포부를 피하는 비 강 카 테 터에 현장에서 지속적인 관류 및 측정값에 대 한 유지에 필요한 마 취의 적절 한 깊이 설명 되어 있습니다. 테스트의 끝에 동물 보호, 빠르게 반전 하는 완전 한 복구는 동물의 마 취로 이어지는 마 취 약물의 해독의 조합의 관리를 포함 하 여 설명 이기도 합니다. 이러한 절차 자발적 호흡 마우스, 감소 테스트 관련 사망률과 같은 동물에 테스트 반복에 신뢰성 높은 측정을 허용 합니다. 비 강 PD 테스트와 야생-타입 마우스는 CF에서에서 가져온 대표적인 데이터는 표시 하 고 논의.
Murine 코 PD 테스트 프로토콜은 3 개의 회의에 보고: 평가 및 관리 하기 전에, 하는 동안, 그리고 테스트 후. 사전 테스트 평가 및 관리, 지속적인 비 강 관류에 대 한 사용 되는 솔루션의 이중 루멘 비 강 카 테 터의 준비의 프로토콜 자세히 설명 되어 있습니다. 평가 시험의 관리 부분 동안 실험 설정 및 마우스의 처리는 일 분 해 부. 마지막으로, 전체 동물 복구를 향상 시키기 위해 테스트의 끝에 동물의 관리를 설명 합니다.
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Protocol
연구 및 절차 연구 (시 n ° 86/609)에서 동물 사용에 대 한 유럽 공동체 규정 동의 UCL (2017/UCL/MD/015)의 동물 연구에 대 한 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 조사 지침 2010/63/유럽 유럽의 회의 2010 년 9 월 월 22 일의 위원회의 과학적인 목적을 위해 사용 하는 동물의 보호에 따라 동물 실험에 대 한 정규화 됩니다.
1. 테스트 전 평가 및 관리
- 더블 루멘 비 강 카 테 터를 준비 합니다.
참고: 비 강 카 테 터는 더블 루멘 모 세관 튜브, 한 루멘 솔루션의 지속적인 관류에 대 한 사용 되 고 다른 하나는 측정 채널.- 폴 리 에틸렌 관 (2.0 m m 내경, 3.0 m m 외경;의 조각, 길이, 약 20 m의 중앙 단면도 열 그림 1 한) (10-15 s)를 당기기를 위한 충분히 부드러운 때까지 가스 버너의 화 염에서.
- 적절 한 길이 (~ 15 cm)와 코 프로브 (그림 1b)에 대 한 외부 직경 (~0.1 m m)의 매우 얇은 모 세관 튜브를 떨어져 두 끝을 당겨.
- 청소 하 고 degrease 순수 에탄올과 같은 두 개의 모세 혈관, 테이프그림 1(c) 그들을 함께 cyanoacrylate 접착제를 사용 하 여 함께 그들을 접착제.
- 면도날 또는 약 8 cm (그림 1의d) 더블 루멘 카 테 터의 최적의 길이 메스 프로브의 초과 길이 멀리 잘라.
- 주사 투과 하는 것을 확인 하 두 루멘을 통해 물.
- 끝에서 5 mm 거리에서 마크를 적용 합니다.
참고: 프로브 삽입 됩니다, 콧구멍에 마크까지 모든 측정은 비 강 내부 같은 사이트에 있도록. - 건조 한 상자에 더블 루멘 카 테 터를 저장 합니다.
참고: 수 있습니다 사용된 6-10 번 적절 하 게 테스트 후 즉시 청소 하는 경우.
- 크림 믹스를 준비 합니다.
- 부드럽게 혼합 전해질 크림과 포화 3m KCl 해결책 1:1 비율 (볼륨/볼륨), 작은 기포의 형성을 방지.
참고: 크림 믹스 사용 됩니다 구축 측정 및 참조에 대 한 전극 교량 Ag/AgCl 전극, 그림 1에서 볼 수 있듯이.
- 부드럽게 혼합 전해질 크림과 포화 3m KCl 해결책 1:1 비율 (볼륨/볼륨), 작은 기포의 형성을 방지.
그림 1 : 전극과 교량 프로브. 그림 (a) 전후 난방 그리고 (b), (c)는 더블 루멘 카 테 터 (d), 실리콘 튜브 커넥터 (e)와 전극 (f)의 두 모 세관 부분에 합류 하는 테이프 폴 리 에틸렌 튜브를 보여 줍니다. 사진 선명도, 커넥터 크림 혼합으로 가득 하지는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 솔루션 레이블 | 솔루션 설명 |
| A | 기초 버퍼링 소금 솔루션 |
| B | 소금 솔루션 버퍼링 염화-무료 |
| C | 10-2 M amiloride 재고 솔루션 |
| D | 10-3 M 산림 재고 솔루션 |
표 1: 주식 쥐에서 코 PD 테스트를 위한 솔루션.
| 소금 | mM | 분자량 | g/L |
| 염화 나트륨 (NaCl) | 135 | 58.44 | 7,889 |
| 염화 칼슘이 수화물 (CaCl2.2H2O) | 2 월 25 일 | 147 | 0.331 |
| 마그네슘 염화 물 hexahydrate (MgCl2.6H2O) | 1.2 | 203.3 | 0.244 |
| Dipotassium 인산 염 (K2HPO4) | 2.4 | 174.2 | 0.418 |
| Monopotassium 인산 염 (KH2포4) | 0.4 | 136.1 | 0.054 |
표 2: 기저의 버퍼링 소금 솔루션 (솔루션 주식).
- 솔루션을 준비 합니다.
- 실험 프로토콜 (표 1)에 필요한 4 개의 재고 솔루션을 준비 합니다.
- 준비 하는 기저 버퍼 솔루션 (재고 솔루션; 표 2) 그리고 염화 무료 버퍼 솔루션 (재고 솔루션 B; 표 3) 실내 온도에서 순수한 물에 있는 소금 혼합 하 여 PH, 낮은 pH에 1 N HCl 인상 1 N NaOH를 사용 하 여 pH 7.4 (범위 7.0-7.6)를 조정 합니다. 솔루션 (275 mOsm/L)의 osmolarity를 확인 하십시오.
- 최대 6 개월까지 최대 3 개월 또는 냉동된에 플라스틱 병에 대 한 4 ° C에서 레이블이 유리병에 저장 합니다.
- 순수한 물 10 mL를 amiloride 염의 26.6 mg을 추가 하 여 10-2 M amiloride 솔루션 (재고 솔루션 C)를 준비 합니다. 70 ° c.에 5 ~ 10 분을 위한 혼합물이 열 Amiloride 빛에 민감한으로, 어두운 컨테이너에서 솔루션 C를 유지. 컨테이너 분류 하 고 최대 3 개월까지 4 ° C에서 저장.
- 순수한 물 24.36 mL에 산림의 10 밀리 그램을 추가 하 여 10-3 M 산림 솔루션 (재고 솔루션 D)를 준비 합니다. 0.1 mL aliquots 산림 재고 솔루션의 분류 하 고 최대 6 개월 동안-20 ° C에서 저장.
- 실험 프로토콜 (표 1)에 필요한 4 개의 재고 솔루션을 준비 합니다.
- 신선한 솔루션 A1, B1, b 2를 준비 (표 4).
- 신선한 솔루션 a 1을 준비 (기저 버퍼링된 소금 솔루션 플러스 10-4 M amiloride) 기저 소금 솔루션 (재고 솔루션 A)의 10 mL 한 10-2 M amiloride 솔루션 (재고 솔루션 C)의 0.1 mL을 추가 함으로써. 컨테이너 분류 하 고 준비의 24 시간 이내에 사용.
- 신선한 솔루션 B1 준비 (염화 버퍼링 솔루션 플러스 10-4 M amiloride) 염화 무료 버퍼링된 소금 솔루션 (재고 솔루션 B) 10 mL 및 10-2 M amiloride 솔루션 (재고 솔루션 C)의 0.1 mL를 추가 하 여. 컨테이너 분류 하 고 준비의 24 시간 이내에 사용.
- 신선한 솔루션 B2 준비 (염화 무료 버퍼링된 소금 솔루션 플러스 10-4 M amiloride, 10-5 M 산림) 염화 무료 버퍼링된 소금 솔루션 (재고 솔루션 B) 10 mL 및 10-2 M의 0.1 mL를 추가 하 여 amiloride 솔루션 (재고 솔루션 C) 그리고 10-3 M 산림 솔루션 (재고 솔루션 D)의 0.1 mL. 컨테이너에 레이블을 고 준비의 2 시간 이내에 사용 합니다.
| 소금 | mM | 분자량 | g/L |
| 글 루 콘 산 나트륨 (monosodium 소금) | 135 | 218.1 | 29,444 |
| 글 루 콘 산 칼슘 (무수 분말) | 2.2 | 430.4 | 0.947 |
| 마그네슘 황산 염 heptahydrate (MgCl2.6H2O) | 1.2 | 246.5 | 0.296 |
| Dipotassium 인산 염 (K2HPO4) | 2.4 | 174.2 | 0.418 |
| Monopotassium 인산 염 (KH2포4) | 0.4 | 136.1 | 0.054 |
표 3: 염화 무료의 버퍼 솔루션 (재고 솔루션 B).
그림 2 : 비 강 점 막의 관류 동안 마우스의 위치. 그림에서는 (a)가 열 패드, 전압계 (b), 뒷 다리 (c)는 인접 (d), 연동 펌프는 베개 (f)의 원심 (e) 매장에서 피하 공간에 삽입 참조 전극 그리고 침대 시트 (g). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
2. 평가 및 테스트 기간 동안 관리
- 실험적인 체제를 준비 합니다.
- 측정 설치 (18.8 x 37.5 cm; 한 생리 적인 온도에서 유지 두 난방 패드를 사용 하는 동안 그리고 테스트 후 저체온증을 방지 하기 위해 그림 2 는), 그리고 다른 하나 (15.5 x 15.5 c m)는 동물 시험의 끝에 복구에 대 한 배치 됩니다 상자.
- 데이터 캡처 데이터 메모리 높은 입력된 임피던스에 연결 된 소프트웨어와 함께 로드 된 컴퓨터에서 전환 (> 1012Ω)와 고해상도 (0.1 mV) 전압계 (그림 2b).
- 전극은 전압계에 연결 합니다. 그림 2c와 같이 긍정적인 측정 전극 비 강 카 테 터와 뒷 다리에 피하 공간에 삽입 된 카 테 터를 부정적인 참조 전극에 연결 합니다.
- 딥 크림 믹스에서 함께 전극의 팁. 초기 전극 오프셋된 값을 확인 합니다. 값 (±) 2 mV 보다 크면 전극 거부 (이상적으로 0 mV).
- 연동 펌프에 전환 하 고 그림 2에서 볼 수 있듯이 위치, 펌프 튜브를 삽입 합니다.
- 비 강 관류 (그림 2d)에 대 한 선택 된 솔루션에 포함 된 유리병에 펌프 튜브의 인접 콘센트를 연결 합니다. (그림 2e) 비 강 카 테 터의 관류 루멘에 펌프 관의 원심 콘센트를 연결 합니다.
- 비 강 카 테 터의 한 루멘 전해질 크림 믹스 10 µ L 피 펫 팁을 통해에 채우십시오. 적응을 실리콘 튜브 커넥터 (그림 1e) 카 테 터, 커넥터 크림 믹스와 커넥터 (그림 1f)에 긍정적인 전극 삽입. 측정 전극 브리지 오프셋된 값을 확인 합니다. 값이 (±) 2 mV 보다 큰 다리를 거부 (이상적으로 0 mV).
- 신선한 솔루션 a 1 비 강 카 테 터의 두 번째 루멘을 채우십시오. 유리병을 포함 하는 솔루션 10에 해당 하는 코 카 테 터의 길이 채우기 위해 A. 반대로 연동 펌프의 방향에서 비 강 카 테 터의 끝을 찍어 관류의 s.
참고:이 허용 기저 PD 값 10에 대 한 기록 amiloride를 적용 하기 전에 s. (그림 1) 참조 전극의 커넥터 안에 크림 믹스에서 비 강 카 테 터의 끝을 찍어.
- 마우스 처리를 시작 합니다.
- 마우스 무게를 계산 하는 복 (ip) 노선17에 의해 주입에 마 취약의 정확한 복용량을 기록 합니다.
- 26 G (0.45 x 10 m m) 바늘을 사용 하 여 주사 마 취의 유도 홍보 하는 intraperitoneally premedication: 5 mg/mL midazolam의 50 µ L의 고정된 복용량. 5 분 기다립니다.
- 마 취 믹스를 준비 (각각, 펜타닐, medetomidine, droperidol 0.05, 0.40, 및 20 mg/kg의 최종 농도에 몸 무게와 0.375 µ g의 고정 된 복용량에서 clonidine) 최적의 고 안정적인 깊이 마 취 (단계 III, 비행기 2)17 수 있도록 . Intraperitoneally, 마 취 믹스의 볼륨을 주입 하 고 clonidine의 볼륨을 주입.
참고: 15 분 후 마우스 자 고 마 취 30 분 이상 지속 될 수 있습니다. - 3 cm 넓은 '베개' (그림 2f) 마우스 머리에 대 한 지원으로 (그림 2는) 난방 패드의 상단 부분을 다룰 것입니다 수 있도록 조직 흡수의 시트를 접어.
- 생리대 흡수 하는 조직 ('침대 시트';의 시트와 커버 그림 2 g). 난방 패드에 그것의 뒤에 마우스를 놓는다. 테이프는 사지 및 꼬리 (그림 2).
- 뒷 다리의 피하 공간에서 참조 정 맥 카 테 터 (그림 1g)을 삽입 합니다. 바늘을 제거 하 고 실리콘 튜브 커넥터 (그림 12 c e) 적응.
- 카 테 터와 커넥터 크림 믹스 및 커넥터 (그림 1f)에서 부정적인 전극 삽입.
- 카 테 터 및 전극으로 어떤 변위를 방지 하는 데 필요한 테이프와 수정. 기준 전극과 다리의 배치, 후 IV 카 테 터의 커넥터 내부 전극 크림 믹스에서 비 강 카 테 터의 끝을 담거 서 측정 전극 브리지 오프셋된 값을 다시 확인 합니다. (이상적으로 보다는 더 적은 (±) 2 mV) 안정적인 최종 오프셋된 값을 기록 합니다.
- "부드러운" 테이프에 흡수 하는 조직 ('베개' (그림 2f)과 '침대 시트';의 2 개 조각 사이 공간에서가 열 패드와 마우스 귀를 수정 (그림 2g)). 눈을 건드리지 않고 털 (뻣 뻣 한 머리카락 콧구멍 근처 성장)을 수정.
- 구강에서 액체를 흡수 하는 혀 옆으로 (그림 3는) 이동 하 고 필터 종이 ('파이프';의 뾰족한 심지를 삽입 그림 3 b) 입에 약 1 cm. 유동성 부족 perfused 콧구멍을 흡수, 필터 종이 ('손수건';의 두 번째 조각 장소 그림 3 c) 코 끝에서 개최.
- 입의 내부와 접촉 하 여 비 강 카 테 터의 끝을 배치 하 여 상피 잠재력의 긍정적인 제어 값을 확인 합니다.
참고: 읽기 해야 안정적이 고-10 사이의 범위 mV와-20 mV. - 좋은 직접 조명 아래 좋은 집게와 그것을 잡고, 섬세 하 게 비 강 카 테 터에 소개 4-까지 한 콧구멍 mm 코에서에서 6 팁.
참고: 비 강 PD 카 테 테 르는 최대한 안정 기준선 PD 값17,20를 주는 위치에 중간 비 강 외에 있습니다. - 마 취 약물의 주입 후 5 분 부드럽게 동물 머리 아래쪽으로 약 30 °에 의해가 열 패드를 기울기. 최대한 기초 PD 값을 모니터링 합니다.
- 때 그것은 약 30의 기간 동안 안정적인 s, 시작 10 µ L의 일정 한 속도로 비 강 점 막 perfusing / 분, 4 버퍼 솔루션 (A, A1, B1, B2) 연속에서. 10에 대 한 첫 번째 솔루션 (단계 1.3.1.1) perfuse s 고 각 다음 솔루션 (1.4 단계) 5 분 또는 때까지 안정적인 값에 도달 했습니다. 산림 (B2) 과도 산림 응답 추락 시작 될 때 perfusing 중지 합니다.
- 기록 데이터에 대 한 1 s 간격을 선택 합니다. 관류 시작의 시간에 데이터를 기록 하는 시작 합니다. 컴퓨터 화면에 시간의 기능으로 데이터를 표시 합니다.
- 중지 데이터 캡처 솔루션 B2 관류의 끝에. 스프레드시트 파일로 데이터를 저장 합니다.
- 마지막 오프셋된 값을 빼서 올바른 데이터입니다.
그림 3 : 비 강 카 테 터와 필터 종이 생리대에 마우스의 장소에 위치. 그림 옆으로 (a)는 파이프 (b), 손수건 (c)를 넣어 혀를 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
3. 테스트 후 평가 및 관리
- 난방 장치 패드에서 마우스를 놓습니다.
- '침대 시트'와 마우스 코를 닦아 (그림 2g).
- Intraperitoneally 주사 마 취 적 믹스 naloxone, 경쟁력 있는 모 르 핀 길 항 제, atipamezole, medetomidine 특정 해독 제 (2 mg/kg 체중)의 고정 된 복용량 (4 µ g)의 구성.
- 일반적으로 1 ~ 2 시간 후 관찰 하는 전체 복구까지 복구 상자에서 작은 손 난로에 마우스를 놓는다.
참고: UCL 실험실에서 약 10% 사망률, 주로 bronchoaspiration, 테스트 기간 동안 비 강에 끼얹는다 솔루션의 관련은 관찰 성별 또는 유전자 형에 관계 없이.
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Representative Results
CF에서 특성 이온 수송 이상을 설명 하기 위해 비 강 PD 측정 수행한 다음 위에서 설명한 F508del CF 마우스와의 브뤼셀 식민지의 유전 배경 FVB/129의 야생 유형 제어 프로토콜 Cftrtm1Eur 마우스30. 가장 일반적인 및 가장 심각한 F508del CFTR 돌연변이23,,2425, 중 하나를 품고이 임상 관련 모델은 최고의 현재 CF 마우스 모델30,31, 32.
Homozygous F508del CF 돌연변이 대 한 4 달 오래 된 여성 마우스와는 나이 및 성 일치 야생-타입 littermate에서 얻은 대표적인 비 강 PD 경시는 그림 4에 나와 있습니다. 테스트의 처음 두 단계 ENaC의 기능 상태 A와 A1, 후자 포함 amiloride 솔루션 perfusing에 의해 연구 했다. CFTR (와 산림의 부재에서 대체 염화 운송업의) 기능 상태 ENaC 기여 남아 amiloride에 의해 차단 된 경우는 테스트의 마지막 두 단계 평가 했다.
F508del-CF 마우스에 hyperpolarized 기준 값 (더 부정적인 PDmax에 비해 야생-타입 마우스 값) 증가 amiloride 응답 함께 관찰 했다; 두 연구 결과 CFTR 관련 ENaC overactivity를 반영합니다. 모두에 대 한 응답에 크게 감소 repolarization 전기 그라데이션 염화 경과 산림, 라는 여기로 총 염화 응답의 추가에 유리한 더 일관 되 게 관찰 되었다. 야생-타입 마우스의 산림 응답의 크기는 작은 비록 (-3 mV), CF에 응답은 일반적으로 무딘, 일치는 CFTR 손실의 기능.
그림 4 -대표적인 비 강 경찰 경시. Homozygous 일반적인 마우스 (A)와 마우스 코 PD 매개 변수 (C 및 D)에 대 한 가져온 개별 값 함께 F508del CFTR 돌연변이 (B)를 위한 homozygous에서 대표적인 비 강 경찰 경시. PDmax: 최대한 초기 안정적인 값. Amiloride 응답: 끝에와 기저와 비 강 점 막의 관류의 시작 부분에서 코 PD의 값 차이 버퍼링 amiloride (솔루션 A1)를 포함 하는 소금 솔루션. 염화 물 자유로운 응답: 끝에와 염화 무료와 비 강 점 막의 관류의 시작 부분에서 코 PD의 값 차이 버퍼링 소금 솔루션 플러스 amiloride (솔루션 B1). 산림 응답: 끝에와 염화 무료와 비 강 점 막의 관류의 시작 부분에서 코 PD의 값 차이 버퍼링 소금 솔루션 플러스 산림 및 amiloride (솔루션 B2). 총 염화 응답: 마지막 두 매개 변수의 합 제로 염화 관류에서 얻은. 화살표는 콧구멍에 끼얹는다 솔루션의 변화를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
따라서 최대 45 분 넘어 테스트 완료 될 수 있는 마 취의 기간을 단축 테스트의 끝에는 마 취약의 해독 적용 되었다. 동물의 복구 효과 없이 발생, 그들은 동일한 프로토콜 적용 때 7 일 간격 후 다시 테스트 했다. 같은 콧구멍 두 테스트 동안 탐험 했다. 두 번째 테스트의 예과 짝된 차이 각 개별 코 PD 매개 변수의 두 테스트는 그림 5에 표시 됩니다. 이전에 보고 된35, 테스트 사이의 차이 했다 전무, 가까이 특히 총 염화 응답, CFTR 종속 염화 수송, CF에서 결함의 기능 상태를 반영.
그림 5 -비 강 PD 매개 변수의 개별 값. 값 homozygous 일반적인 마우스 (A) 및 두 번째 각 해당 매개 변수에 대 한 첫 번째 테스트 (t1)의 짝된 차이점 함께 F508del CFTR 돌연변이 (B)의 homozygous 마우스에서 수행 되는 두 번째 테스트 (t2)에서 얻은 했다. PDmax: 최대한 초기 안정적인 값. Amiloride 응답: 끝에와 기저와 비 강 점 막의 관류의 시작 부분에서 코 PD의 값 차이 버퍼링 amiloride (솔루션 A1)를 포함 하는 소금 솔루션. 염화 물 자유로운 응답: 끝에와 염화 무료와 비 강 점 막의 관류의 시작 부분에서 코 PD의 값 차이 버퍼링 소금 솔루션 플러스 amiloride (솔루션 B1). 산림 응답: 비 강 PD 끝 및 염화 무료와 비 강 점 막의 관류의 시작 부분에서의 값의 차이 버퍼링 소금 솔루션 플러스 산림 및 amiloride (솔루션 B2). 총 염화 응답: 마지막 두 매개 변수의 합 제로 염화 관류에서 얻은. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 솔루션 레이블 | 솔루션 설명 |
| A 1 | 기초 10-4 M amiloride 플러스 소금 솔루션 (A)를 버퍼링 |
| B1 | 10-4 M amiloride 플러스 소금 솔루션 (B)를 버퍼링 염화-무료 |
| B2 | 소금 솔루션 (B) 10-4 M amiloride 플러스 10-5 M 산림 버퍼링 염화-무료 |
표 4: 쥐에서 코 PD 시험에 대 한 신선한 솔루션의 목록입니다.
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Discussion
이 문서의 목적은 이온 운송업 자, 주로 CFTR 그리고 ENaC의 무결성을 테스트 하는 데 필요한 시간의 길이 대 한 자발적 호흡 생쥐에서 솔루션의 지속적인 관류에서 비 강 PD를 측정 하기 위한 적절 한 프로토콜을 설명 하는 것입니다. 프로토콜의 모든 단계 완전 동물 복구 및 좋은 품질 및 재현성 데이터도 최적화 되었습니다. 특히, 중요 한 단계는 마 취 평가 및 관리, 그리고 적절 한 동물 위치 그리고 시험 동안에 관심.
비행기 2 단계 III 칵테일 혼합물을 적용 하 여 얻을 수 있는 마 취 노출의 사용17, 여기 보여 이전 연구는 일반 호흡과 부정적인 inotropic 효과 블 링크, 동 공 및 페달의 부재와 관련 철수의 반사 마 취 깊이의이 수준, 비 강 카 테 터 좋은 공차와 제자리에서 연속 관류 비 강에의 한 측정 전극의 교량으로 사용 하기 위해 보관 수 있습니다. 또한, 기준 전극의 다리 역할 피하 공간에 테의 삽입 하지 어떤 고통 스러운 반응 또는 유해한 영향의 표시에 선행 되었다. 설치류, 동작 제어에 nasofacial 지역에서 감각 입력의 필수적인 역할 마주-à-마주 한 외부 상황, 위협를 포함 하 여 게 코 구멍에서 작동할 때 특히 도전 하는 마 취의 적절 한 깊이. 지속적인 비 강 관류 대신 nebulization 일부 마우스 연구33,34에서 비 강 PD 테스트를 수행 하 여 적용 되었습니다. 그러나,이 방법은 비-신뢰할 수 있는 결과, 반복된 제거와 코 프로브의 reinsertions 때문에 이끌어 낸다. 사실은,20마우스 비 강 점 막 있는 세포 유형의 균질 성 비 분포 때문에 콧구멍에서 같은 위치에 프로브 팁을 재배치이 중요 합니다. 또한, 솔루션, 특히 염화 무료 솔루션의 변화에 대 한 응답은 급속 하 게 관류 중단 사라지다.
호흡 마비로 이어지는 솔루션의 Broncho-열망 절차의 중요 한 한계 이며 테스트의 사망률의 주요 원인입니다. 몇 가지 필수 조치를 방지, 동물의 등 쪽 decubitus 위치를 포함 하 여, 가볍게 아래쪽으로, 머리와 틸팅 및 구강 및 비 강 충 치17에서 초과 하는 액체를 흡수를 목표로 합니다. 동물의 완전 한 복구와 마 취의 빠르고 가역 레벨 테스트의 끝에 마 취 약물의 해독을 적용 하 여 보장 됩니다. 여기에 제시 된 프로토콜 신뢰할 수 있는 측정을 저절로 호흡 쥐와 같은 동물에 테스트를 반복 수 있습니다. 통계적 의미35 를 얻을 하는 데 필요한 마우스의 수 고는 3R을 준수에 영향 (대체, 수정 하 고 감소) 실험 절차36에서는 동물에 대 한 규칙. 쥐에서 인간, 낮은 테스트 사이 가변성 발견 되었습니다 총 염화 응답, 그 제안에 대 한 그것은 새로운 CF 치료 전략의 효능을 검색 하는 가장 신뢰할 수 있는 비 강 PD 매개 변수로. CF 마우스에서 총 염화 반응의 측정 오차는 ±1.7 mV35보다 작은 표시 했다. 즉 때 평가 CFTR 교정의 bioactivity F508del CF 마우스, 총 염화 반응의 차이에서 마약 된다 치료 2 보다 더 큰 존재와 부재에 mV 마약 관련 개선 효과의 95% 기회를 나타냅니다.
대표 경시의 데이터 해석 수 코 PD 테스트의 CF와 야생-타입 마우스18,19,20,,2135 사이 차별 이며 보여줍니다. F508del-CF 에라스무스 마우스 모델30 전형적인 임상 이온 수송 이상에 관하여 인간의 비 강 점 막을 모방합니다. 그러나, 동물 모델에서 잔여 염화 전도성은 감지, 잔여 F508del CFTR 함수 또는 대체 비 CFTR 종속 염화 물 채널의 기여 금에서. CF에서 임상 설정으로 전 임상 연구에서 결과 번역 두 설정 사이의 몇 가지 주요 차이점을 다루는 의미 합니다. 마우스 CF 형 감쇠 호흡기 증후군을 표시합니다. 사실 마우스 모델 위생 장벽 특권된 조건에서 보관 되어 함께 여러 요법의 부재도 차이37에 기여. 흰 족제비 모델40과 프로토콜 설명 여기 쇼 매우 낮은 다양성35 그리고 그것 돼지38,39 에 맞게 조정 되었습니다. 이전 연구에서 실험 프로토콜 CFTR 종속 되지 않은 칼슘 활성화 염화의 가능한 기여를 탐험 다른 염화 운송업의 억제제와 마우스 코 점 막의 관류를 포함 하 여 수정 채널18. 테스트도 공부는 β-ENaC overexpressing 마우스 모델41, CF-폐 질환42를 모방 하도록 설계에 나트륨 전송 사용 되었습니다. 나중에 추가 응용 프로그램 테스트의 간주 될 수 ATP12A, CFTR 독립적인 H+같은 다른 전송기 공부-단백질 및 돼지 인간에 펌프 하지만 결 석 마우스 항공43에. 모두, 여기에 설명 된 프로토콜 신뢰할 수 있는 transepithelial의 기능 상태 측정 저절로 호흡 마우스, 감소 테스트 관련 사망률과 같은 동물에 여러 테스트에서 염화 물과 나트륨 전송기를 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 비판적 원고 편집에 대 한 교수 J. Lebacq 감사 합니다. Cftrtm1Eur (homozygous F508del-CFTR (FVB/129) 마우스는 에라스무스, 로테르 담, 네덜란드, 낭 성 섬유 증 EU FP6 연구를 위한 유럽 경제 공동체 유럽 조정 작업의 지원에 의해 개발 되었다 LHHM-CT-2005-018932입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Portex polyethylene tube | Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL | Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD | to prepare capillary tubes for nasal probe |
| Electrode cream | Parker, Fairfield, NJ, USA | Redux cream | to build electrode bridges |
| Ag/AgCl electrodes | Biomedical, Clinton Township, MI, USA | JNS BNT131-1,0 | measuring and reference electrodes |
| amiloride hydrochloride | Sigma, St Louis, MI, USA | A7410 | to prepare perfusion solutions |
| forskolin | Sigma, St Louis, MI, USA | F6886 | to prepare perfusion solutions |
| Knick Portamess voltmeter | Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany | Portavo 904 pH | to measure potential difference |
| Paraly SW 112 Software | Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany | Paraly SW112 software | to capture potential difference data |
| midazolam | Mylan, Hoeilaart, Belgium | Dormicum 15mg/3ml | to serve as anaesthetic premedication |
| fentanyl | Janssen Cilag, Berchem, Belgium | Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| medetomidine | Orion Pharma, Espoo, Finland | Domitor 1 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| droperidol | Janssen Cilag, Berchem, Belgium | Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| clonidine | Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany | Catapressan 0.15 mg/ml, | to serve as anaesthetic medication |
| refernce IV catheter | Becton Dickinson, Sandy, UT, USA | 24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W | to build electrode bridges |
| forceps | Fine science Tools, Heidelberg, Germany | Dumont #5, Fine science Tools | to place the nasal catheter |
| naloxone | Braun Medical, Brussels, Belgium | Narcan, 0.4 mg/ml | to serve as anaesthetic antagonist |
| atipamezole | Zoetis, Bloomberg, Belgium | Antisedan, 5 mg/ml | to serve as a medetomedine specific antidote |
| Heating pads | Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA | 18,8x37,5 cm; 15,5x15,5 cm | to avoid hypothermia during and after the test |
| Peristaltic pump P1 | GE Life Sciences, Uppsala, Sweden | 18111091 | to perfuse solutions in the mouse nose |
| cyanoacrylate glue | Loctite, Henkel, Düsseldorf, Germany | super glue 3 | to glue together two capillary tubes for nasal probe |
| NaCl | Sigma, St Louis, MI, USA | RES0926S-A7 | Pharma-Grade, USP |
| CaCl2.2H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | M7304 | Pharma-Grade, USP |
| MgCl2.6H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | 1551128 | Pharma-Grade, USP |
| K2HPO4 | Sigma, St Louis, MI, USA | 1551139 | Pharma-Grade, USP |
| Na gluconate | Sigma, St Louis, MI, USA | S2054 | Pharma-Grade, USP |
| Ca gluconate | Sigma, St Louis, MI, USA | C8231 | Pharma-Grade, USP |
| MgSO4.7H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | RES0089M-A7 | Pharma-Grade, USP |
| BD needle | Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA | BD 26G (0.45x10 mm) | intraperitoneal injection |
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