Summary
Burada, farelerde burun potansiyel farkı ölçmek için bir iletişim kuralı mevcut. Test transmembran iyon taşıyıcılar Kistik Fibrozis Transmembran gürültülerinden regülatör ve epitel sodyum kanalı gibi işlev quantifies. Kistik fibrozis için roman tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için değerlidir.
Abstract
Burun potansiyel farkı test neredeyse üç yıldır kistik fibrozis (CF) tanısında yardımcı olmak için kullanılmıştır. Durumlarında yardımcı olmak, zayıflatılmış oligo veya mono semptomatik formlar genellikle daha sonra hayatında tanısı CF ve vas deferens, idiyopatik kronik pankreatit, Alerjik ikili konjenital yokluğu gibi CF ile ilgili hastalıkların kanıtlamıştır bronkopulmoner aspergilloz ve bronşiektazi. CF. uyarlayarak test etmek için bir fare için hedeflenmiş tedavi stratejileri yanıtlarını ölçmek için bir biyomarker meydan okuyor ve ilişkili bir ölüm gerektirecektir preklinik ve klinik ayarları, testi kullanılmıştır. Bu kağıt için sürekli perfüzyon burun kateter in situ korumak için gerekli anestezi yeterli derinliği açıklar. Solunum-aspirasyon burnuna periosteum çözümleri önlemek için ölçülerin listeler. Ayrıca hayvan bakımı panzehir hızla anestezi hayvanların tam kurtarma ile geri için önde gelen anestezik ilaçların bir arada, yönetimi de dahil olmak üzere test sonunda açıklar. Temsilcisi veri bir CF ve test CF ve sigara-CF arasında ayrımcılık bir vahşi tipi fare Haritayı aldı. Özet olarak, burada açıklanan protokol test ile ilgili güvenilir ölçümler spontan solunum farelerde trans-epitel klorür ve sodyum taşıyıcılar gibi azaltırken aynı hayvan birden çok test fonksiyonel durumu sağlar ölüm.
Introduction
Neredeyse üç yıl için elektrik potansiyel farkı (PD) ölçümleri transmembran iyon taşıyıcılar, nazal mukoza, distal airways1temsilcisi olarak ifade edilen fonksiyonel durumunu değerlendirmek için kullanılmaktadır. Bir multistep dinamik test olarak2,3, nazal PD Kistik Fibrozis Transmembran gürültülerinden regülatörü (CFTR) ve epitel sodyum kanal (ENaC) etkinlik, fonksiyonel diseksiyon sağlar her ikisi de apikal zarı lokalize epitel hücreleri ve hava yolu yüzey hidrasyon önemli rollerde uygulamakla. Büyük klinik uygulama burun PD testinin CF, 1 dışarı-in 2500 canlı Doğum Avrupa ülkelerinde ortalama bir insidans ile beyaz nüfus en yaygın ölümcül genetik bozukluk tanısında yardımcı olmaktır. Test uzun zayıflatılmış, oligo veya mono semptomatik formlar genellikle daha sonra hayatında tanısı CF ve vas deferens, idiyopatik kronik pankreatit, Alerjik ikili konjenital yokluğu gibi CF ile ilgili hastalıkların tanısında yararlı kanıtlamıştır bronkopulmoner aspergilloz ve bronşiektazi4. Daha yakın zamanlarda,5,6,7,8,9,10,11 defect temel CFTR tedavi modülasyon clinometric değerlendirilmesi ,12,13,14,15,16 burun PD klinik çalışmalarda yeni CF tedavilerin kullanımı yaptı. Preklinik ayarında test yeni CF hedef terapiler18,19,20,21bioactivity incelenmesi izin vermek için fare17 ' ye uyarlanmıştır. Farelerde, kemirgenler ve insan arasındaki burun bölgenin boyutunu türler ile ilgili anatomik farklılıkları ve ağırlıklı olarak Rodents nasofacial bölgesinden duyusal girdilerin önemli rol dayalı hassas, bir tekniktir. Eğitimli ve vasıflı operatörler, özel ekipman ve malzemeleri gerektirir.
CF ekzokrin bezleri, çok sistemik bir hastalığı olduğunu hangi kronik solunum yolu hastalığı klinik resim hakim. Hastalığı siklik adenozin monofosfattır (kampı) kodlama gen mutasyonlar neden olur-CFTR klorür kanal22düzenlenir. Bugüne kadar 2.000'den fazla CFTR mutasyonları tespit23olmuştur. CF gen, neredeyse % 90 bulundu en yaygın mutasyon24,25, Fenilalanin polipeptid zinciri protein (F508del-CFTR) 508 pozisyonda silinmesiyle karşılık gelir. CFTR proteini bir tamamen içinden küçük gürültülerinden klorür kanalıdır. CFTR diğer taşıma mekanizmaları, özellikle de ENaC26,27düzenleyen önemli kanıtlar vardır. Arızalı elektrolit taşıma azaltılmış CFTR bağımlı klorür gürültülerinden ve artan ENaC bağımlı sodyum gürültülerinden, dahil olmak üzere, CF epiteli özelliğidir. Eski kusur küçültülmüş veya kaldırılmış repolarization bir elektrokimyasal gradyan favour klorür sızma ve isoprenaline (hücre içi kampı artıran bir β-adrenergic agonist) veya forskolin (bir adenilat eklenmesi karşısında yansıtır klinik kullanım için onaylanmamış cyclase agonist,). İkincisi kusur bazal hyperpolarization nazal mukoza (daha olumsuz PD) ve amiloride, ENaC28blok bir idrar söktürücü ilaç için artan bir tepki yansıtır.
CF fare modelleri sık CF araştırmalarında kullanılan ve CF patoloji dissekan çok değerli olmuştur. Günümüzde, en az on beş modelleri açıklanan üç olan en klinik F508del mutasyon30,31,32için homozigoz29, olmuştur. Bir Rotterdam, Erasmus Üniversitesi'nde geliştirilen bu üç suş30, yaklaşık 20 yıldır Université catholique de Louvain (UCL) laboratuvar olarak kullanılmıştır. Cftrtm1Eur modeli30 CF hastalığı multiorgan Patofizyoloji çalışmaya ve yeni tedavi stratejileri18,19,20etkinliğini test etmek için çok yararlı olduğunu kanıtlamıştır, 21. Çok sayıda sorunları sırasında veya erken sonra ortaya çıkabilir (< 24 h) farelerde burun PD testi. Bu yazıda, anestezi solunum-aspirasyon burnuna periosteum çözümleri önlemek için sürekli perfüzyon ve önlemleri burun kateter situ içinde tutmak için gereken yeterli derinliği açıklanmıştır. Test sonunda hayvan bakımı da, panzehir hızla anestezi hayvanların tam kurtarma ile geri için önde gelen anestezik ilaçların bir arada, yönetimi de dahil olmak üzere tanımlanır. Özet olarak, bu yordamları güvenilir ölçümler spontan solunum fareler, azaltılmış testi ile ilgili mortalite ve aynı hayvan içinde belgili tanımlık sınav yinelenen sağlar. Temsilcisi veri burun PD testinden bir CF ve vahşi-tipi fare elde gösterilen ve tartışıldı.
Fare burun PD test protokolü üç oturumlarda bildirilmektedir: değerlendirmesi ve yönetimi öncesinde, sırasında ve sonra testi. Ön-test değerlendirmesi ve yönetimi hazırlık çift lümen burun kateter ve çözümleri sürekli burun perfüzyon için kullanılan protokolü ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Değerlendirme ve test yönetimi bölümleri sırasında deneysel kurulum ve fare kullanımı özenle kesmiştim. Son olarak, hayvan test sonunda yönetiminin tam hayvan kurtarma geliştirmek için tanımlanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çalışmalar ve yordamlar hayvan araştırma (2017/UCL/MD/015) UCL'nin ve hayvan araştırma (CEE n ° 86/609) kullanımda Avrupa Birliği Yönetmeliği ile anlaşma için Etik Komitesi tarafından kabul edildi. Araştırmacılar bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunması yönergesi 2010/63/AB sayılı Avrupa Parlamentosu ve Konsey, 22 Eylül 2010 aşağıdaki hayvan deneme için nitelikli.
1. değerlendirmesi ve yönetimi ön test
- Çift lümen burun kateter hazırla.
Not: Bir çift lümen kılcal tüp, bir lümen için çözümler, perfüzyon sürekli kullanılan bir burun kateter yapılır ve diğer bir ölçüm olarak kanal.- Bir parça, yaklaşık 20 cm uzunluğunda, Polietilen boru (2.0 mm iç çap; 3.0 mm dış çap; orta bölümünü oluşturmak ısı Resim 1 bir) gaz (10-15 s) çekmek için yumuşak olana yakıcı Alevi olarak.
- İki ucu bir çok ince kılcal tüp uygun uzunluk (~ 15 cm) ve dış çap (~0.1 mm) (resim 1b) burun sonda için edinmek için ayır.
- Temiz ve saf etanol ile iki tür kılcal ısıtınız, onlara kaseti ile (Şekil 1c) katılmak ve birlikte cyanoacrylate tutkal kullanarak yapıştırın.
- Probları bir jilet veya çift lümen kateteri yaklaşık 8 cm (Şekil 1d) en uygun bir uzunluğu elde etmek için bir neşter ile aşırı uzunluğu kes gitsin.
- Suyu geçirgen olduklarını doğrulamak için her iki lümen yoluyla enjekte.
- Bir işareti bir 5 mm mesafe ucundan uygulanır.
Not: tüm ölçümler aynı site içinde burun boşluğuna yapılır böylece burun içine mark kadar sonda eklenir. - Çift lümen kateteri kuru bir kutuda saklayın.
Not: Bu kullanılan 6 - 10 kat uygun şekilde test hemen sonra temizlenmiş olabilir.
- Krem karışımı hazırlayın.
- Karışımı yavaşça elektrolit krem ve minik hava kabarcıkları oluşumu kaçınarak doymuş 3 M KCl çözüm 1:1 oranında (birim/birim).
Not: Krem karışımı Ag/AgCl elektrotlar, ölçme ve referans elektrot köprüler kurmak için Şekil 1' de gösterildiği gibi kullanılır.
- Karışımı yavaşça elektrolit krem ve minik hava kabarcıkları oluşumu kaçınarak doymuş 3 M KCl çözüm 1:1 oranında (birim/birim).
Resim 1 : Probes elektrotlar ve köprüleri ile. Şekilde Polietilen boru önce (a) ve Isıtma ve (b), (c), Çift lümen kateteri (d), silikon tüp bağlayıcılar (e) ve elektrotlar (f) iki kılcal damar parçalar katılmadan teyp çekerek sonra gösterilmektedir. Resim netliği için bağlayıcılar krem karışımı ile dolu değil. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Çözüm etiketi | Çözüm açıklaması |
| A | Bazal tamponlu tuz solüsyonu |
| B | Klorür-Alerjik tamponlu tuz solüsyonu |
| C | 10-2 M amiloride hisse senedi çözüm |
| D | 10-3 M forskolin hisse senedi çözüm |
Tablo 1: çözüm farelerde burun PD test için hazır.
| Tuz | mM | Molekül ağırlığı | g/M |
| Sodyum klorür (NaCl) | 135 | 58.44 | 7,889 |
| Kalsiyum klorür dihydrate (CaCl2.2H2O) | 2.25 | 147 | 0.331 |
| Magnezyum klorür hekzahidrat (MgCl2.6H2O) | 1.2 | 203.3 | 0,244 |
| Dipotassium fosfat (K2HPO4) | 2.4 | 174.2 | 0.418 |
| Monopotassium fosfat (KH2PO4) | 0,4 | 136.1 | 0.054 |
Tablo 2: Kompozisyon bazal tuz solüsyonu (stok çözelti A) arabelleğe alınmış.
- Çözümleri hazırlayın.
- Deneysel iletişim kuralı (Tablo 1) için gerekli dört hisse senedi çözümleri hazırlayın.
- Bazal tamponlu çözüm (hisse senedi çözüm A; hazırlamak Tablo 2) ve klorür-Alerjik tamponlu çözüm (hisse senedi çözüm B; Tablo 3) Oda sıcaklığında saf suda tuzu karıştırarak. 1 N NaOH pH, düşük pH 1 N HCl yükseltmek için kullanarak pH 7,4 (aralığı 7.0-7,6) için ayarlayın. (275 mOsm/L) çözümünün Osmolarite kontrol edin.
- Etiketli cam şişe 4 ° C'de 3 aya kadar veya donmuş olarak plastik şişeler için 6 aya kadar saklayın.
- 10-2 M amiloride çözüm (hisse senedi çözüm C) amiloride hidroklorid 26,6 mg 10 mL saf su ekleyerek hazırlayın. 70 ° C'de 5-10 dakika için karışım ısı Amiloride ışığa duyarlı olduğu için çözüm C karanlık bir kap içinde tutun. Etiket kapsayıcının ve 4 ° C'de 3 aya kadar saklayın.
- 10-3 M forskolin çözüm (hisse senedi çözüm D) forskolin 10 mg 24.36 mL saf su ekleyerek hazırlayın. 0.1 mL aliquots forskolin hisse senedi çözüm etiket ve 6 aya kadar-20 ° C'de depolayın.
- Deneysel iletişim kuralı (Tablo 1) için gerekli dört hisse senedi çözümleri hazırlayın.
- Taze çözümleri A1, B1 ve B2 hazırlamak (Tablo 4).
- Taze çözüm A1 hazırlamak (bazal tamponlu tuz solüsyonu artı 10-4 M amiloride) 10 mL bazal tuz çözeltisi (stok çözelti A) alma ve 0.1 mL 10-2 M amiloride çözeltisi (hisse senedi çözüm C) ekleyerek. Etiket kapsayıcının ve hazırlık içinde 24 h kullanın.
- Taze çözüm B1 hazırlamak (klorür arabelleğe alınmış çözüm artı 10-4 M amiloride) klorür-Alerjik tamponlu tuz solüsyonu (hisse senedi çözüm B) 10 mL alma ve 0.1 mL 10-2 M amiloride çözeltisi (hisse senedi çözüm C) ekleyerek. Etiket kapsayıcının ve hazırlık 24 saat içinde kullanın.
- Taze çözüm B2 hazırlamak (klorür-Alerjik tamponlu tuz solüsyonu artı 10-4 M amiloride ve 10-5 M forskolin) klorür-Alerjik tamponlu tuz solüsyonu (hisse senedi çözüm B) 10 mL elde etmek ve 10-2 M 0.1 mL ekleyerek amiloride çözüm (hisse senedi çözüm C) ve 0.1 mL 10-3 M forskolin çözeltisi (hisse senedi çözüm D). Etiket kapsayıcının ve hazırlık 2 saat içinde kullanın.
| Tuz | mM | Molekül ağırlığı | g/M |
| Sodyum Glukonat (Monosodyum tuz) | 135 | 218.1 | 29,444 |
| Kalsiyum glukonat (susuz toz) | 2.2 | 430.4 | 0.947 |
| Magnezyum sülfat heptahydrate (MgCl2.6H2O) | 1.2 | 246.5 | 0.296 |
| Dipotassium fosfat (K2HPO4) | 2.4 | 174.2 | 0.418 |
| Monopotassium fosfat (KH2PO4) | 0,4 | 136.1 | 0.054 |
Tablo 3: Çözüm (hisse senedi çözüm B) klorür-Alerjik kompozisyon arabelleğe alınmış.
Resim 2 : Nazal mukoza perfüzyon sırasında farenin konumunu. Şekilde gösterilmektedir (a) ısıtma yastığını, voltmetre (b), bir arka bacak (c), proksimal (d) ve distal (e) çıkışları peristaltik pompa, yastık (f), subkutan uzayda takılı referans elektrot ve yatak levha (g). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
2. değerlendirme ve Test sırasında yönetim
- Deneysel kurulum hazırlamak.
- Hipotermi sırasında ve sonra testi engellemek için ölçüm Kur (18,8 x 37,5 cm; için fizyolojik sıcaklıklarda muhafaza iki Isıtma pedleri kullanın Resim 2 bir) ve diğeri (15,5 x 15,5 cm) kutusunda hangi hayvan kurtarma test sonunda için alınacaktır.
- Veri yakalama için veri bellek yüksek giriş empedansı bağlı yazılımı yüklü bilgisayarda geçiş (> 1012Ω) ve yüksek çözünürlüklü (0,1 mV) Voltmetre (Şekil 2b).
- Elektrotlar için voltmetre bağlanır. Olumlu ölçüm elektrot burun kateter ve arka bacak, subkutan uzayda takılı kateter için olumsuz referans elektrot Şekil 2cgösterildiği gibi bağlayın.
- Krem karışımı içinde birlikte elektrot uçları daldırma. İlk elektrot uzaklık değeri denetleyin. Değeri (±) 2 mV büyükse, elektrotlar reddetmek (ideal olarak 0 mV).
- Peristaltik pompa geçiş ve pompa tüp pozisyona, Şekil 2' de gösterildiği gibi yerleştirin.
- Burun perfüzyon (Şekil 2d) için seçili solüsyon içeren flakon pompa tüp proksimal çıkış bağlayın. Pompa tüp distal çıkış burun kateter (Şekil 2e) perfüzyon lümen bağlayın.
- Burun kateterin bir lümen 10 µL pipet ucu ile elektrolit krem karışımı ile doldurun. Silikon tüp konektörüne (Şekil 1e) kateter uyum, bağlayıcı krem karışımı ile doldurun ve pozitif elektrot konektörünü (Şekil 1f) takın. Ölçüm elektrot köprü uzaklık değeri denetleyin. Değeri (±) 2 mV büyükse, köprüleri reddetmek (ideal olarak 0 mV).
- Burun kateter ikinci lümen taze çözüm A1 ile doldurun. A. 10'a karşılık gelen burun Kateter uzunluğu doldurmak için ters yönde peristaltik pompa solüsyon içeren flakon burun kateter ucu daldırma perfüzyon s.
Not: Bu 10 için bazal PD değerleri kayıt imkanı sunan amiloride uygulamadan önce s. Krem karışımı içine referans elektrot (Şekil 1) bağlayıcı burun kateter ucu daldırma.
- Fare işleme başlayın.
- Anestezi mayi (IP) rota17tarafından enjekte edilir tam doz hesaplamak için fare ağırlık kaydedin.
- 26 G (0.45 x 10 mm) iğne kullanarak enjekte premedication intraperitoneally anestezi indüksiyon tanıtmak için: sabit doz 5 mg/mL midazolam 50 µL. İçin 5 dakika bekleyin.
- Anestezik karışım hazırlamak (fentanil, medetomidine, droperidol son konsantrasyonlarda 0,05, 0,40 ve 20 mg/kg vücut ağırlığı sırasıyla ve klonidin 0.375 µg sabit doz itibariyle) en iyi ve istikrarlı derinlik17 anestezi (Aşama III, uçak 2) izin . Anestezik mix hacmi intraperitoneally enjekte ve klonidin hacmi enjekte et.
Not: 15 dk sonra fare uyuyor olmalı ve anestezi en az 30 dakika sürebilir. - 3 cm 'ısıtma yastığını (Şekil 2bir) üst kısmındaki fare kafa için bir destek olarak kapsayacak geniş yastık' (Şekil 2f) yapmak için doku emici bir sayfa katlayın.
- Isıtma yastığını doku ('çarşaf'; emici bir levha ile kapak Resim 2 g). ısıtma yastığını sırtını fare yatıyordu. Teyp bacaklarda ve kuyruk (Şekil 2).
- Başvuru intravenöz kateter (Şekil 1g) hind riske subkutan alana yerleştirin. İğneyi çıkarın ve silikon tüp konektörü (Şekil 1e, 2 c) uyum.
- Kateter doldurun ve krem konektörle mix ve negatif elektrot (Şekil 1f) konektöre takın.
- Kateter ve elektrot herhangi bir öteleme önlemek için gerektiği şekilde bant ile düzeltmek. Köprüler ve referans elektrot yerleştirme sonra elektrot krem karışımı IV kateter bağlayıcı içinde burun kateter ucu daldırma tarafından ölçüm elektrot köprü uzaklık değeri tekrar doğrulayın. Kayıt istikrarlı son uzaklık değeri (ideal daha az (±) 2 mV).
- "Nazik" bant Isıtma panelindeki emici doku ('yastık' (Şekil 2f) ve 'çarşaf'; iki parça arasında boş bir alan ile kulakları fare düzeltmek (Şekil 2g)). Vibrissae (sert kıllar burun delikleri büyüyen) gözleri dokunmadan düzeltmek.
- Ağız boşluğu sıvı emmek için dili yanları gösteren (Şekil 3bir) taşıyın ve filtre kağıdı ('boru'; sivri uçlu bir fitil ekleyin Şekil 3 b) yaklaşık 1 cm ağız içine. Perfused burun sıvı çalışan emmek için filtre kağıdı ('mendil'; ikinci bir parça yerleştirin Şekil 3 c) burun ucunda düzenledi.
- Ağız içi temas burun kateter ucu yerleştirerek epitel potansiyeli olumlu denetim değerini denetleyin.
Not: Okuma istikrarlı ve Aralık -10 arasında olmalıdır mV ve -20 mV. - İyi forseps ile ve iyi doğrudan aydınlatma altında tutarak, ince burun kateter içine bir burun deliği en fazla 4 - 6 mm burun ucu tanıtmak.
Not: Burun PD kateter orta burun concha maksimal istikrarlı temel PD değeri17,20verir konumda yer alır. - 5 dakika sonra enjeksiyon anestezik ilaçların hafifçe tarafından yaklaşık 30° hayvan baş aşağı doğru ile ısıtma yastığını eğ. Maksimal bazal PD değeri izlemek.
- Olduğunda istikrarlı bir yaklaşık 30 boyunca s, 10 µL sabit bir hızda nazal mukoza ventriküler Başlat / min, art arda 4 tamponlu çözümleri (A, A1, B1, B2) ile. Belgili tanımlık ilk eriyik (adım 1.3.1.1) 10 için sıvı s ve her aşağıdaki çözüm (adım 1.4) 5 min için veya sabit bir değere ulaşıncaya kadar. Geçici forskolin yanıt düşmeye başladığında forskolin (B2) ventriküler durdurmak.
- Veri kayıt için 1 s aralığı seçin. Perfüzyon başlangıç sırasında veri kaydetmeye başlamak. Zaman bilgisayar ekranından bir fonksiyonu olarak verileri görüntüler.
- Çözüm B2 ile perfüzyon sonundaki dur veri yakalama. Verilerini bir elektronik tablo dosyası olarak kaydedin.
- Son uzaklık değeri çıkarılarak tarafından doğru veri.
Şekil 3 : Burun kateter ve filtre kağıtları ile ısıtma yastığını üzerinde farenin konumunu yerde. Şekilde yana doğru (a), kanal (b) ve mendil (c) koymak dil gösterilmektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
3. test değerlendirmesi ve yönetimi sonrası
- Isıtma yastığını üzerinden fare düğmesini serbest bırakın.
- 'Çarşaf' ile fare burun silin (Şekil 2g).
- İntraperitoneally bir sabit doz nalokson, rekabetçi morfin antagonisti ve atipamezole, bir medetomidine belirli panzehir (2 mg/kg vücut ağırlığı) (4 µg) oluşan anestezik antagonisti karışımı enjekte et.
- Fare kurtarma kutusunda küçük ısıtma yastığını genellikle 1-2 h sonra gözlenen tam kurtarma kadar yatıyordu.
Not: UCL laboratuvarda yaklaşık % 10 mortalite, esas olarak bronchoaspiration nazal kavite test sırasında periosteum çözümleri ile ilgili cinsiyet veya genotip bağımsız olarak görülmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CF karakteristik iyon taşıma anormallikleri göstermek için burun PD ölçümleri bir F508del-CF fare ve Brüksel kolonisi FVB/129 genetik kökenli bir vahşi tipi kontrol yukarıda açıklanan protokol sonrası gerçekleştirilen CFTRtm1Eur fareler30. En yaygın ve en ağır F508del-CFTR mutasyon23,24,25, birini barındıran bu klinik modeli en iyisi şu anda mevcut CF fare modeli30,31, 32.
4 - aylık dişi fare F508del-CF mutasyon için homozigoz ve bir yaş ve cinsiyet uyumlu vahşi tipli littermate elde edilen temsilcisi burun PD tracings Şekil 4' te gösterilmiştir. İlk iki test aşamalarında ENaC fonksiyonel durumunu çözümler A ve A1, ikinci içeren amiloride ventriküler tarafından incelenmiştir. ENaC katkısını amiloride tarafından bloke kaldı zaman fonksiyonel durum CFTR (ve alternatif klorür taşıyıcılar forskolin yokluğu) testi, son iki aşamalarında değerlendirildi.
F508del-CF fare (daha olumsuz bir PDmax vahşi tipi fare değerle karşılaştırılan) bir hyperpolarized temel değeri ile birlikte bir artan amiloride yanıt gözlendi; Her iki bulgularını CFTR ilişkili ENaC aşırı faaliyeti yansıtır. Daha tutarlı bir şekilde, her ikisi de yanıt olarak büyük ölçüde azaltılmış bir repolarization klorür sızma ve forskolin, burada olarak toplam klorür yanıt, diye eklenmesi için olumlu bir elektrokimyasal gradyan gözlendi. Vahşi tipi fareler forskolin yanıtta büyüklüğü küçük olsa bile (-3 mV), CF, yanıt genellikle, CFTR kaybı of-fonksiyonu ile tutarlı kör.
Şekil 4 -Temsilcisi burun PD tracings. Homozigoz normal bir farenin (A) ve fare burun PD parametrelerini (C ve D) elde edilen tek tek değerleri ile birlikte F508del-CFTR mutasyon (B), için homozigoz temsilcisi burun PD tracings. PDmax: maksimal temel sabit değer. Amiloride yanıt: burun PD sonunda ve nazal mukoza ile bazal perfüzyon başında değerleri arasındaki farkı tamponlu tuz solüsyonu amiloride (çözüm A1) içeren. Klorür-Alerjik tepki: burun PD sonunda ve perfüzyon ile klorür-Alerjik burun Fibromu başında değerleri arasındaki farkı tamponlu tuz solüsyonu artı amiloride (çözüm B1). Forskolin yanıt: burun PD sonunda ve perfüzyon ile klorür-Alerjik burun Fibromu başında değerleri arasındaki farkı tamponlu tuz solüsyonu artı forskolin ve amiloride (çözüm B2). Toplam klorür yanıt: son iki parametre toplamı sıfır-klorür perfüzyon altında elde. Oklar çözümleri burun derin değişiklikleri gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Panzehir anestezikler, böylece 45 dakikaya kadar test tamamlama ötesinde olabilir anestezi süresini azaltma konusuna testleri, sonunda uygulandı. Hayvan kurtarma etkiler oluştu olarak, yine yedi gün, ne zaman aynı iletişim kuralını uygulandığı bir aralıktan sonra test edildi. Aynı burun deliği her iki test sırasında incelenmiştir. İkinci test örnekleri ve tek tek her burun PD parametre eşleştirilmiş farklılıklar arasında iki test Şekil 5' te gösterilmektedir. Daha önce raporlanmış35, test arasında farklılıklar nil yakın, özellikle için toplam klorür yanıt, CFTR bağımlı klorür taşıma, CF hasarlı fonksiyonel durumunu yansıtan vardı.
Şekil 5 -Burun PD parametrelerinin bireysel değerleri. Değerleri homozigoz normal fare (A) ve bir fare homozigoz ikinci ve karşılık gelen her parametre için ilk test (t1) eşleştirilmiş farklılıkları ile birlikte F508del-CFTR mutasyon (B), yapılan ikinci testte (t2) elde. PDmax: maksimal temel sabit değer. Amiloride yanıt: burun PD sonunda ve nazal mukoza ile bazal perfüzyon başında değerleri arasındaki farkı tamponlu tuz solüsyonu amiloride (çözüm A1) içeren. Klorür-Alerjik tepki: burun PD sonunda ve klorür ücretsiz ile nazal mukoza perfüzyon başında değerleri arasındaki farkı tamponlu tuz solüsyonu artı amiloride (çözüm B1). Forskolin yanıt: fark burun PD sonunda ve klorür ücretsiz ile nazal mukoza perfüzyon başında değerlerden tamponlu tuz solüsyonu artı forskolin ve amiloride (çözüm B2). Toplam klorür yanıt: son iki parametre toplamı sıfır-klorür perfüzyon altında elde. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Çözüm etiketi | Çözüm açıklaması |
| A1 | Bazal tamponlu tuz solüsyonu (A) 10-4 M amiloride |
| B1 | Tuz solüsyonu (B) 10-4 M amiloride arabelleğe alınmış klorür-ücretsiz |
| B2 | Klorür-Alerjik tamponlu tuz solüsyonu (B) artı 10-4 M amiloride artı 10-5 M forskolin |
Tablo 4: Liste-in farelerde burun PD test için taze eriyik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu kağıt amacı çözümleri farelerde kendiliğinden nefes iyon taşıyıcılar, esas olarak CFTR ve ENaC bütünlüğünü test etmek için gereken süreyi için sürekli perfüzyon altında burun PD ölçmek için yeterli bir iletişim kuralı tarif etmektir. İletişim kuralının tüm adımları dikkatlice tam hayvan kurtarma ve kaliteli ve tekrarlanabilir veri sağlamak için optimize edilmiştir. Özellikle, kritik adımlarda anestezi değerlendirmesi ve yönetimi ve yeterli hayvan pozisyon ve bakım sırasında ve sonra testi.
Önceki çalışmalarda uçak 2 Aşama III kokteyl karışımı uygulayarak elde anestezik maruz kalma burada17, kullanılan gösterdi düzenli nefes ve devamsızlık olumsuz inotropic etkisi ve yanıp, gözbebeği ve pedal ile ilişkili para çekme refleksleri. Anestezi derinliği bu düzeyde, burun kateter ile iyi toleransını in situ burun boşluğuna sürekli perfüzyon ve ölçüm elektrot bir köprü olarak kullanmak için tutulabilir. Ayrıca, ekleme subkutan uzayda kateterin referans elektrodu, köprü hizmet veren tarafından herhangi bir acı reaksiyon ya da zararlı etki belirtisi izledi değil. Kemirgen, davranış kontrolü nasofacial bölgesinden duyusal girdi önemli rol vis-à-vis bir tehdit de dahil olmak üzere dış bir durum yeterli özellikle burun boşluğunda çalışırken zorlu anestezi derinliği yapar. Nebulization sürekli burun perfüzyon yerine bazı fare çalışmalar33,34burun PD testi gerçekleştirmek için uygulanmıştır. Ancak, bu yöntem güvenilir olmayan sonuçlar, tekrarlanan çıkarma ve burun sonda reinsertions yol açar. Aslına bakarsan, sayesinde homojen olmayan dağıtım hücre tiplerinin fare nazal mukoza20sonda ucu burun aynı konumda yeniden konumlandırma önemlidir. Perfüzyon kesildiğinde Ayrıca, çözümleri, çözümleri, özellikle klorür-Alerjik değişikliklere yanıt hızla yok olur.
Solunum-aspirasyon solunum durması için önde gelen çözümleri yordam kritik bir sınırlama ve ölüm testin önemli nedeni. Bunu önlemek, hayvan dorsal dekübitus konumunu da dahil olmak üzere, hafifçe başını aşağıya doğru eğerek ve ağız ve burun boşlukları17aşırı sıvı emici birkaç gerekli önlemleri nişan. Anestezi hızlı ve geri dönüşümlü düzeyini hayvanların tam kurtarma ile panzehir test sonunda anestezik ilaçların uygulayarak sağlanır. Burada sunulan Protokolü kendiliğinden fareler nefes ve aynı hayvan içinde belgili tanımlık sınav yinelenen güvenilir ölçümler sağlar. İstatistiksel anlamlılık35 almak için gerekli fare sayısı ve 3R için uygun etkileri (eski yerine koymak, rafine ve azaltmak) kuralları hayvan için deneysel prosedürler36kullanın. Fareler gibi insanlarda en düşük test arasında değişkenlik düşündüren toplam klorür yanıt için bu yeni CF tedavi stratejileri etkinliğini algılamak için en güvenilir burun PD parametre olarak bulundu. CF farelerde ölçüm hatası toplam klorür yanıtının ±1.7 mV35daha az olduğu gösterilmiştir. Başka bir deyişle, ne zaman bioactivity CFTR düzeltmek değerlendirilmesi uyuşturucu F508del-CF farelerde, toplam klorür yanıt arasında bir fark olmaması ve tedavi 2'den daha büyük huzurunda mV uyuşturucuya bağlı gelişen etkisi ihtimali % 95 gösterir.
Temsilcisi tracings veri yorumlanması burun PD test CF ve vahşi-tipi fareler18,19,20,21,35 arasında ayrımcılık yeteneği gösterir ve gösteriyor ki F508del-CF Erasmus fare modeli30 insan nazal mukoza ile ilgili tipik klinik iyon taşıma anormallikler taklit eder. Ancak, hayvan modelinde bir kalıntı klorür gürültülerinden kaynaklanan bir kalıntı F508del-CFTR işlev veya alternatif CFTR bağımlı klorür kanalları katkısını algılanabilir. Klinik ayarları içine preklinik CF araştırma sonuçlarından çeviri iki ayarları arasında birkaç büyük farklılıklar ile ilgili anlamına gelir. Fare CF fenotip zayıflatılmış bir solunum Sendromu görüntüler. Fare modeli ile hijyenik engelleri ayrıcalıklı koşullarda yer alır aslında birlikte birden çok terapiler yokluğu da farklılıklar37için katkıda bulunur. Protokol, burada bir çok düşük değişkenlik35 ve bu adapte domuz39 38,gösterir açıklanan ve gelincik40modelleri. Bir önceki çalışmada, fare nazal mukoza perfüzyon alternatif klorür taşıyıcılar, CFTR bağımlı klorür kalsiyum-harekete geçirmek mümkün katkısını keşfetmek için bir inhibitörü ile dahil ederek Deneysel protokol güncellenmiştir Kanal18. Test da CF-akciğer hastalığı42taklit etmek için tasarlanmış β-ENaC overexpressing fare modeli41, sodyum Ulaştırma eğitim için kullanılmıştır. Gelecekte, daha fazla test uygulamaları ATP12A, CFTR bağımsız H+gibi diğer taşıyıcılar çalışma olarak kabul edilebilir-pompa insan ve domuz ifade protein ama yok fare airways43. Özet olarak, burada açıklanan protokol transepithelial fonksiyonel durumu güvenilir ölçümler kendiliğinden fareler, azaltılmış testi ile ilgili mortalite ve aynı hayvan birden çok test nefes içinde sodyum ve klorür taşıyıcılar sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Prof. J. Lebacq eleştirel yazının düzenleme için teşekkür ederiz. CFTRtm1Eur (homozigoz F508del-CFTR (FVB/129) fareler tarafından geliştirilen Erasmus MC, Rotterdam, Hollanda, Avrupa Ekonomik Topluluğu Avrupa koordinasyon eylem kistik fibrozis Avrupa Birliği FP6 araştırma desteği ile LHHM-CT-2005-018932.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Portex polyethylene tube | Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL | Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD | to prepare capillary tubes for nasal probe |
| Electrode cream | Parker, Fairfield, NJ, USA | Redux cream | to build electrode bridges |
| Ag/AgCl electrodes | Biomedical, Clinton Township, MI, USA | JNS BNT131-1,0 | measuring and reference electrodes |
| amiloride hydrochloride | Sigma, St Louis, MI, USA | A7410 | to prepare perfusion solutions |
| forskolin | Sigma, St Louis, MI, USA | F6886 | to prepare perfusion solutions |
| Knick Portamess voltmeter | Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany | Portavo 904 pH | to measure potential difference |
| Paraly SW 112 Software | Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany | Paraly SW112 software | to capture potential difference data |
| midazolam | Mylan, Hoeilaart, Belgium | Dormicum 15mg/3ml | to serve as anaesthetic premedication |
| fentanyl | Janssen Cilag, Berchem, Belgium | Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| medetomidine | Orion Pharma, Espoo, Finland | Domitor 1 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| droperidol | Janssen Cilag, Berchem, Belgium | Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| clonidine | Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany | Catapressan 0.15 mg/ml, | to serve as anaesthetic medication |
| refernce IV catheter | Becton Dickinson, Sandy, UT, USA | 24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W | to build electrode bridges |
| forceps | Fine science Tools, Heidelberg, Germany | Dumont #5, Fine science Tools | to place the nasal catheter |
| naloxone | Braun Medical, Brussels, Belgium | Narcan, 0.4 mg/ml | to serve as anaesthetic antagonist |
| atipamezole | Zoetis, Bloomberg, Belgium | Antisedan, 5 mg/ml | to serve as a medetomedine specific antidote |
| Heating pads | Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA | 18,8x37,5 cm; 15,5x15,5 cm | to avoid hypothermia during and after the test |
| Peristaltic pump P1 | GE Life Sciences, Uppsala, Sweden | 18111091 | to perfuse solutions in the mouse nose |
| cyanoacrylate glue | Loctite, Henkel, Düsseldorf, Germany | super glue 3 | to glue together two capillary tubes for nasal probe |
| NaCl | Sigma, St Louis, MI, USA | RES0926S-A7 | Pharma-Grade, USP |
| CaCl2.2H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | M7304 | Pharma-Grade, USP |
| MgCl2.6H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | 1551128 | Pharma-Grade, USP |
| K2HPO4 | Sigma, St Louis, MI, USA | 1551139 | Pharma-Grade, USP |
| Na gluconate | Sigma, St Louis, MI, USA | S2054 | Pharma-Grade, USP |
| Ca gluconate | Sigma, St Louis, MI, USA | C8231 | Pharma-Grade, USP |
| MgSO4.7H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | RES0089M-A7 | Pharma-Grade, USP |
| BD needle | Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA | BD 26G (0.45x10 mm) | intraperitoneal injection |
References
- Knowles, M., Gatzy, J., Boucher, R. Increased bioelectric potential difference across respiratory epithelia in cystic fibrosis. New England Journal of Medicine. 305 (25), 1489-1495 (1981).
- Middleton, P. G., Geddes, D. M., Alton, E. F. W. Protocols for in vivo measurement of the ion transport defects in cystic fibrosis nasal epithelium. European Respiratory Journal. 7 (11), 2050-2056 (1994).
- Knowles, M. R., Paradiso, A. M., Boucher, R. C. In vivo nasal potential difference: techniques and protocols for assessing efficacy of gene transfer in cystic fibrosis. Human Gene Therapy. 6 (4), 445-455 (1995).
- Paranjape, S. M., Zeitlin, P. L. Atypical cystic fibrosis and CFTR-related disorders. Clinical Reviews in Allergy & Immunology. 35 (3), 116-123 (2008).
- Wilschanski, M., et al. A pilot study of the effect of gentamicin on nasal potential difference measurements in CF patients carrying stop mutations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (3), Pt 1 860-865 (2000).
- Clancy, J. P., et al. Evidence that systemic gentamicin suppresses premature stop mutations in patients with CF. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163 (7), 1683-1692 (2001).
- Wilschanski, M., et al. Gentamicin-induced correction of CFTR function in patients with CF and CFTR stop mutations. New England Journal of Medicine. 349 (15), 1433-1441 (2003).
- Sermet-Gaudelus, I., et al. In vitro prediction of stop-codon suppression by intravenous gentamicin in patients with CF: a pilot study. BMC Medicine. 5, 5 (2007).
- Clancy, J. P., et al. No detectable improvements in CF transmembrane conductance regulator by nasal aminoglycosides in patients with CF with stop mutations. American Journal of Respiratory and Cell Molecular Biology. 37 (1), 57-66 (2007).
- Kerem, E., et al. Effectiveness of PTC124 treatment of CF caused by nonsensemutations: a prospective phase II trial. Lancet. 372 (9640), 719-727 (2008).
- Sermet-Gaudelus, I., et al. Ataluren (PTC124) induces CF transmembrane conductance regulator protein expression and activity in children with nonsense mutation CF. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182 (10), 1262-1272 (2010).
- Wilschanski, M., et al. Chronic ataluren (PTC124) treatment of nonsense mutation cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 38 (1), 59-69 (2011).
- Accurso, F. J., et al. Effect of VX-770 in persons with CF and the G551D-CFTR mutation. New England Journal of Medicine. 363 (21), 1991-2003 (2010).
- Clancy, J. P., et al. Results of a phase IIa study of VX-809, an investigational CFTR corrector compound, in subjects with cystic fibrosis homozygous for the F508del-CFTR mutation. Thorax. 67 (1), 12-18 (2012).
- Leonard, A., Lebecque, P., Dingemanse, J., Leal, T. A randomized placebo-controlled trial of miglustat in cystic fibrosis based on nasal potential difference. Journal of Cystic Fibrosis. 11 (3), 231-236 (2012).
- De Boeck, K., et al. CFTR biomarkers: time for promotion to surrogate end-point. European Respiratory Journal. 41, 203-216 (2013).
- Leal, T., et al. Successful protocol of anaesthesia for measuring transepithelial nasal potential difference in spontaneously breathing mice. Laboratory Animals. 40 (1), 43-52 (2006).
- Lubamba, B., et al. Preclinical evidence that sildenafil and vardenafil activate chloride transport in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (5), 506-515 (2008).
- Lubamba, B., et al. Airway delivery of low-dose miglustat normalizes nasal potential difference in F508del cystic fibrosis mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 179 (11), 1022-1028 (2009).
- Lubamba, B., et al. Inhaled PDE5 inhibitors restore chloride transport in cystic fibrosis mice. European Respiratory Journal. 37 (1), 72-78 (2011).
- Vidovic, D., et al. rAAV-CFTRΔR Rescues the Cystic Fibrosis Phenotype in Human Intestinal Organoids and Cystic Fibrosis Mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 288-298 (2016).
- Stutts, M. J., et al. CFTR as a cAMP-dependent regulator of sodium channels. Science. 269 (5225), 847-850 (1995).
- Lubamba, B., Dhooghe, B., Noel, S., Leal, T. Cystic fibrosis: insight into CFTR pathophysiology and pharmacotherapy. Clinical Biochemistry. 45 (15), 1132-1144 (2012).
- Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4925), 1066-1073 (1989).
- Stutts, M. J., Rossier, B. C., Boucher, R. C. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inverts protein kinase A-mediated regulation of epithelial sodium channel single channel kinetics. Journal of Biological Chemistry. 272 (22), 14037-14040 (1997).
- Ismailov, I. I., et al. Regulation of epithelial sodium channels by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Biological Chemistry. 271 (9), 4725-4732 (1996).
- Althaus, M. ENaC inhibitors and airway re-hydration in cystic fibrosis: state of the art. Current Molecular Pharmacology. 6 (1), 3-12 (2013).
- Wilke, M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, Suppl 2 152-171 (2011).
- Van Doorninck, J. H., et al. A mouse model for the cystic fibrosis delta F508 mutation. The EMBO Journal. 14 (18), 4403-4411 (1995).
- Colledge, W. H., et al. Generation and characterization of a delta F508 cystic fibrosis mouse model. Nature Genetics. 10 (4), 445-452 (1995).
- Zeiher, B. G., et al. A mouse model for the delta F508 allele of cystic fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 96 (4), 2051-2064 (1995).
- Ghosal, S., Taylor, C. J., McGray, J. Modification of the nasal membrane potential difference with inhaled amiloride and loperamide in the cystic fibrosis (CF) mouse. Thorax. 51 (12), 1229-1232 (1996).
- Ghosal, S., Taylor, C. J., Colledge, W. H., Ratcliff, R., Evans, M. J. Sodium channel blockers and uridine triphosphate: effects on nasal potential difference in cystic fibrosis mice. European Respiratory Journal. 15 (1), 146-150 (2000).
- Leonard, A., et al. Comparative Variability of Nasal Potential Difference Measurements in Human and Mice. Open Journal of Respiratory Disease. 2, 43-56 (2012).
- Tannenbaum, J., Bennett, B. T. Russell and Burch's 3Rs then and now: the need for clarity in definition and purpose. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 120-132 (2015).
- Pritchett-Corning, K. R., et al. AALAS/FELASA Working Group on Health Monitoring of rodents for animal transfer. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (6), 633-640 (2014).
- Salinas, D. B., et al. CFTR involvement in nasal potential differences in mice and pigs studied using a thiazolidinone CFTR inhibitor. American Journal of Physiology. Lung Cell Molecular Physiology. 287 (5), 936-943 (2004).
- Fisher, J. T., et al. Comparative processing and function of human and ferret cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Journal of Biological Chemistry. 287 (26), 21673-21685 (2012).
- Kaza, N., et al. Use of ferrets for electrophysiologic monitoring of ion transport. PLoS One. 12 (10), 0186984 (2017).
- Leal, T., Beka, M., Panin, N., Mall, M. A., Noel, S. Nasal potential difference in βENaC-overexpressing mouse reveals pH-sensitive channel hyperactivity and shift of subunits stoichiometry. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (S1), 72 (2017).
- Mall, M., Grubb, B. R., Harkema, J. R., O'Neal, W. K., Boucher, R. C. Increased airway epithelial Na+ absorption produces cystic fibrosis-like lung disease in mice. Nature Medicine. 10 (5), 487-493 (2004).
- Shah, V. S., et al. Airway acidification initiates host defense abnormalities in cystic fibrosis mice. Science. 351 (6272), 503-507 (2016).
