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Genetics

Saccharomyces cerevisiae 4-thiouracil और आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय गतिविधि के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में नव संश्लेषित mRNA के ठहराव के साथ चयापचय लेबलिंग

Published: October 22, 2018 doi: 10.3791/57982
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3,4
1Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Illkirch, France, 2Centre National de la Recherche Scientifique, Illkirch, France, 3Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Illkirch, France, 4Université de Strasbourg

Summary

प्रोटोकॉल यहां वर्णित नए संश्लेषित mRNA खमीर 4-thiouracil के साथ लेबल कोशिकाओं से शुद्ध के जीनोम चौड़ा ठहराव पर आधारित है । इस विधि mRNA संश्लेषण mRNA क्षय से जोड़े को मापने के लिए अनुमति देता है और, इस प्रकार, आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय प्रतिलेखन की एक सटीक माप प्रदान करता है.

Abstract

आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय प्रतिलेखन में वैश्विक दोष transcriptomic अध्ययन द्वारा अनदेखी की जा सकती है संभल-राज्य आरएनए का विश्लेषण. दरअसल, mRNA संश्लेषण में वैश्विक कमी को सामान्य संभल-राज्य स्तरों को बहाल करने के लिए mRNA क्षरण में एक साथ घटने से मुआवजा दिया जाना दिखाया गया है. अत: mRNA संश्लेषण की जीनोम-वाइड ठहराव, स्वतंत्र रूप से mRNA क्षय से, आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय transcriptional कार्यकलाप का सर्वश्रेष्ठ प्रत्यक्ष प्रतिबिम्ब है. यहां, हम एक गैर Saccharomyces cerevisiae (एस cerevisiae) में नवजात RNAs के perturbing चयापचय लेबलिंग का उपयोग कर विधि पर चर्चा की । विशेष रूप से, कोशिकाओं 6 मिनट के लिए एक uracil एनालॉग, 4-thiouracil के साथ, और नए लिखित RNAs लेबल शुद्ध और quantified सभी व्यक्तिगत mRNA के संश्लेषण दरों का निर्धारण करने के लिए कर रहे हैं । इसके अलावा, आंतरिक मानक के रूप में लेबल Schizosaccharomyces pombe कोशिकाओं का उपयोग अलग एस cerevisiae उपभेदों में mRNA संश्लेषण की तुलना की अनुमति देता है । इस प्रोटोकॉल का प्रयोग और एक गतिशील काइनेटिक मॉडल के साथ डेटा फिटिंग, इसी mRNA क्षय दर निर्धारित किया जा सकता है ।

Introduction

कोशिकाओं अंतर्जात और exogenous cues का जवाब, उनके जीन अभिव्यक्ति कार्यक्रम के गतिशील परिवर्तन के माध्यम से । हाल के वर्षों में, जीनोम व्यापक तरीके के एक जबरदस्त विकास के विभिंन स्थितियों में transcriptome परिवर्तन की सटीक और व्यापक विवरण की अनुमति देता है । सबसे transcriptomic अध्ययन में, microarray संकरण या उच्च प्रवाह अनुक्रमण एक कुल स्थिर राज्य आरएनए भिन्न से आरएनए के स्तर को लगाने के लिए उपयोग किया जाता है. एक विशिष्ट गड़बड़ी के तहत Transcriptional परिवर्तन संभव परिणामों की एक विस्तृत श्रृंखला प्रदर्शित कर सकते हैं, या तो विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन या जीन का एक बड़ा स्पेक्ट्रम या तो अप-या downregulated के साथ । जीन अभिव्यक्ति एक ठीक-देखते संतुलन का नतीजा है-या आरएनए polymerases और आरएनए स्तर को प्रभावित करने वाली अन्य प्रक्रियाओं द्वारा आरएनए संश्लेषण के बीच स्थिर-राज्य-. आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय प्रतिलेखन, इसके तीन विशिष्ट चरणों (दीक्षा, बढ़ाव, और समाप्ति) सहित, उच्च और जटिलता mRNA प्रसंस्करण, cytoplasmic निर्यात, अनुवाद, और क्षरण के साथ जुड़ा हुआ है ।

कई हाल के अध्ययनों से पता चला है कि mRNAs संश्लेषण और क्षय तंत्र युग्मित कर रहे है और दिखाया है कि उत्परिवर्तन या उत्तेजनाओं के अंतर्गत पर transcriptional प्रभाव की अनदेखी की जा सकती है जब कुल स्थिर राज्य आरएनए बढ़ाता है । पहला, mRNA के स्थिर-राज्य स्तरों के विश्लेषण के माध्यम से transcriptional परिवर्तन का पता लगाना हमेशा mRNAs आधा जीवन पर निर्भर करता है । एक बार गड़बड़ी शुरू की है, लंबे समय से आधा जीवन के साथ mRNAs के स्थिर राज्य स्तर बहुत कम आधा जीवन के साथ mRNAs की तुलना में प्रभावित हो जाएगा । इसलिए, आरएनए संश्लेषण में परिवर्तन की जासूसी दृढ़ता से कम रहने वाले टेप के पक्ष में पक्षपातपूर्ण है, जबकि अब रहने वाले mRNA प्रजातियों के विश्लेषण प्रतिलेखन दर में गतिशील परिवर्तन प्रकट करने के लिए असफल हो सकता है । दूसरा, कई रिपोर्टों से पता चला है कि, दोनों खमीर और स्तनधारियों में, प्रतिलेखन में वैश्विक परिवर्तन की अनदेखी हो सकता है जब स्थिर mRNA के राज्य के स्तर का विश्लेषण । इस तंत्र के कारण संभावना है कि लिंक mRNA संश्लेषण और गिरावट mRNA बफ़रिंग में जिसके परिणामस्वरूप । यह नई लिखित mRNA के विश्लेषण के माध्यम से, mRNA संश्लेषण क्षरण से जोड़े गए के लिए नए प्रोटोकॉल के विकास के लिए प्रेरित किया । हाल के वर्षों में, वैश्विक रन पर अनुक्रमण (मूह-seq)1, और देशी बढ़ाव प्रतिलिपि अनुक्रमण (NET-seq)2,3सहित कई विकल्प प्रस्तुत किया गया है । यहां, हम शुरू में स्तनधारी कोशिकाओं4,5,6 में विकसित प्रोटोकॉल पेश कर रहे है और फिर7,8,9,10खमीर के लिए अनुकूलित, 11, जो एक thiolated nucleoside या आधार एनालॉग, 4-thiouridine (4sU) या 4-thiouracil (4tU), क्रमशः के साथ आरएनए लेबलिंग पर आधारित है ।

इस विधि विशेष रूप से सेल homeostasis में वस्तुतः कोई हस्तक्षेप के साथ 4sU के साथ जो आरएनए पल्स-लेबल कर रहे हैं कोशिकाओं से नव लिखित आरएनए शुद्ध. इसलिए, एक बार कोशिकाओं 4sU करने के लिए उजागर कर रहे हैं, अणु तेजी से किया जाता है, 4sU के लिए phosphorylated-ट्राइफॉस्फेट, और RNAs में शामिल लिखित जा रहा है । एक बार नाड़ी-लेबल, यह कुल सेलुलर आरएनए निकालने के लिए संभव है (आरएनए के स्थिर राज्य स्तर के लिए इसी), और, बाद में, 4sU-लेबल आरएनए अंश thiol-विशेष रूप से संशोधित, बायोटिन और के बीच एक डाइसल्फ़ाइड बांड के गठन के लिए अग्रणी है नव लिखित आरएनए4,5. हालांकि, 4sU केवल एक nucleoside ट्रांसपोर्टर व्यक्त कोशिकाओं द्वारा किया जा सकता है, मानव equilibrative nucleoside ट्रांसपोर्टर (hENT1) की तरह, नवोदित या विखंडन खमीर में इसके तत्काल उपयोग को रोकने. जबकि एक या तो एस pombe या एस cerevisiaeमें hENT1 व्यक्त कर सकता है, एक आसान तरीका संशोधित आधार 4tU का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है, के बाद से खमीर कोशिकाओं 4tU ले जा सकते हैं, एक nucleoside ट्रांसपोर्टर10की अभिव्यक्ति की जरूरत के बिना, 11 , 12 , 13. वास्तव में, 4tU के चयापचय एंजाइम uracil phosphoribosyltransferase (UPRT) की गतिविधि की आवश्यकता है । कई जीवों में, खमीर लेकिन नहीं स्तनधारी सहित, UPRT एक न्यूक्लियोटाइड उबार मार्ग के लिए आवश्यक है, रिसाइकिलिंग uracil uridine मोनोफोस्फेट के लिए ।

transcriptomic अध्ययन में एक महत्वपूर्ण पूर्वाग्रह विभिंन नमूनों के बीच सामांय द्वारा शुरू किया जा सकता है समानांतर में विश्लेषण किया । वास्तव में, कई deviating कारकों उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार उपभेदों के transcriptome के तुलनात्मक विश्लेषण को प्रभावित कर सकते हैं: सेल lysis की दक्षता, निष्कर्षण और आरएनए की वसूली में अंतर, और microarray विश्लेषण के लिए स्कैनर अंशांकन में विचरण , दूसरों के बीच । के रूप में ऊपर चर्चा की, इस तरह के बदलाव विशेष रूप से गुमराह किया जा सकता है जब आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय प्रतिलेखन पर वैश्विक प्रभाव की उंमीद है । एक सुरुचिपूर्ण मतलब सही अलग नमूनों के बीच mRNA संश्लेषण की दर की तुलना करने के लिए एक आंतरिक मानक के रूप में दूर से संबंधित विखंडन खमीर Schizosaccharomyces pombe का उपयोग करके डिजाइन किया गया था । उसके लिए, pombe कोशिकाओं लेबल की एक निश्चित संख्या एस cerevisiae नमूनों में जोड़ा जाता है, या तो जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती कोशिकाओं, सेल lysis और आरएनए निष्कर्षण10से पहले । बाद में, pombe और एस cerevisiae से दोनों स्थिर राज्य और नव संश्लेषित RNAs आर टी-qPCR द्वारा या microarray चिप्स या उच्च प्रवाह sequencing10के उपयोग के माध्यम से या तो quantified हैं । काइनेटिक मॉडलिंग के साथ इन आंकड़ों के संयोजन, mRNA संश्लेषण और नवोदित खमीर में क्षय की निरपेक्ष दरों मापा जा सकता है ।

इस पांडुलिपि के ढांचे में, हम बताएंगे कि कैसे नव लिखित आरएनए के विश्लेषण coactivator परिसरों सागा और नवोदित खमीर14,15में आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय प्रतिलेखन में TFIID के लिए एक वैश्विक भूमिका प्रकट करने की अनुमति दी, 16. महत्वपूर्ण बात, पिछले अध्ययन quantified स्थिर- एस cerevisiae में राज्य mRNA स्तर और सुझाव दिया है कि गाथा खमीर जीन जो दृढ़ता से गाथा में उत्परिवर्तनों से प्रभावित हैं, लेकिन अपेक्षाकृत TFIID के लिए प्रतिरोधी के एक सीमित सेट पर एक प्रमुख समारोह निभाता है उत्परिवर्तनों17,18,19। हैरानी की बात है, सागा एंजाइमी गतिविधियों को पूरे लिखित जीनोम पर कार्य दिखाया गया है, इस सह आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय प्रतिलेखन में उत्प्रेरक के लिए एक व्यापक भूमिका का सुझाव । घटी हुई आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय भर्ती में सबसे अधिक व्यक्त जीन सागा या TFIID की निष्क्रियता पर मनाया गया था, सुझाव है कि इन coactivators सबसे जीन में एक साथ काम करते हैं । इसलिए, नव लिखित mRNA के ठहराव से पता चला कि गाथा और TFIID आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय14,15,16द्वारा लगभग सभी जीनों की प्रतिलेखन के लिए आवश्यक हैं । क्षतिपूरक तंत्र के कार्यांवयन के लिए कोशिकाओं के लिए एक तरह से उभर mRNA संश्लेषण में एक वैश्विक कमी है जो mRNA क्षरण में एक साथ वैश्विक कमी से बफर है सामना करने के लिए । सागा आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय प्रतिलेखन पर एक वैश्विक प्रभाव होने कारकों की सूची के लिए कहते हैं, इस तरह के रूप में आरएनए पॉल द्वितीय यूनिटों10, मध्यस्थ coactivator परिसर20, सामान्य प्रतिलेखन कारक TFIIH21,22 , और परोक्ष रूप से, mRNA क्षरण मशीनरी के तत्वों9,10,23। इस तरह के क्षतिपूरक घटनाओं सार्वभौमिक सागा म्यूटेंट में मनाया गया, mRNA संश्लेषण14में एक वैश्विक और गंभीर कमी के बावजूद स्थिर राज्य mRNA के स्तर में मामूली और सीमित परिवर्तन के लिए लेखांकन. इसी तरह के विश्लेषण भी एक BRE1 विलोपन तनाव में प्रदर्शन किया, हिस्टोन H2B ubiquitination का एक पूरा नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप थे । दिलचस्प बात यह है कि आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय प्रतिलेखन पर एक बहुत मामूली लेकिन लगातार वैश्विक प्रभाव Bre1 के अभाव में पता लगाया जा सकता है, यह दर्शाता है कि खमीर में नव लिखित आरएनए के चयापचय लेबल का पता लगाने और mRNA में परिवर्तन की एक विस्तृत श्रृंखला यों तो कर सकते है संश्लेषण दर ।

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Protocol

1. सेल संवर्धन और एक सागा उपइकाई के Rapamycin घट

  1. प्रत्येक एस cerevisiae के लिए तनाव और जंगली प्रकार या नियंत्रण उपभेदों सहित दोहराने,, YPD मध्यम (2% Peptone, 1% खमीर निकालने, और 2% ग्लूकोज) के 5 मिलीलीटर पर एक ताजा थाली से एक ही कॉलोनी inoculate ।
  2. लगातार आंदोलन (१५० rpm) के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एस cerevisiae कोशिकाओं बढ़ाएँ ।
  3. ६०० एनएम (आयुध डिपो६००) पर ऑप्टिकल घनत्व को मापने और YPD माध्यम की १०० मिलीलीटर में लगभग ०.१ के एक आयुध डिपो६०० के लिए संस्कृति को कमजोर और यह आयुध डिपो६०० ०.८ के आसपास है जब तक बड़े हो जाओ ।
  4. समानांतर में, inoculate एक ताजा थाली से एस pombe कोशिकाओं की एक एकल कॉलोनी हां मध्यम (०.५% खमीर निकालने के ५० मिलीलीटर पर; २५० मिलीग्राम/L adenine, histidine, uracil, leucine, और lysine; 3% ग्लूकोज) और लगातार आंदोलन के साथ ३२ ° c पर रात भर कोशिकाओं को विकसित (१५० rpm) ।
  5. S. pombe रातोंरात संस्कृति के आयुध डिपो६०० को मापने और एक आयुध डिपो६०० के लिए एक लगभग ०.१ के ५०० एमएल में हां मध्यम और इसे बढ़ने तक के आयुध डिपो६०० लगभग ०.८ है ।
  6. प्रत्येक एस cerevisiae के लिए लंगर दूर तनाव और दोहराने, जंगली प्रकार या नियंत्रण उपभेदों सहित, inoculate एक ताजा प्लेट से YPD मध्यम (2% Peptone, 1% खमीर निकालने के 5 मिलीलीटर पर एक एकल कॉलोनी, और 2% ग्लूकोज) ।
  7. लगातार आंदोलन (१५० rpm) के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कोशिकाओं को विकसित ।
  8. अगली सुबह,६००आयुध डिपो को मापने, YPD माध्यम से १०० मिलीलीटर में लगभग ०.१ के एक आयुध डिपो६०० के लिए संस्कृति को कमजोर और यह आयुध डिपो६००≈ ०.८ तक बढ़ने ।
  9. rapamycin के एक शेयर समाधान से संस्कृति के लिए १०० µ एल जोड़ें 1 मिलीग्राम/एमएल (1 µ जी/एमएल के अंतिम rapamycin एकाग्रता) और जाने कोशिकाओं को 30 डिग्री सेल्सियस पर ब्याज की प्रोटीन के लिए आवश्यक समय के लिए निरंतर आंदोलन के साथ मशीन सशर्त नाभिक से समाप्त हो ( आमतौर पर, 30 मिनट पर्याप्त है) । नियंत्रण के लिए, एक समान खमीर संस्कृति का उपयोग करें, लेकिन rapamycin जोड़ने के बजाय, dimethyl sulfoxide (DMSO) के समकक्ष मात्रा में जोड़ें ।

2.4tU के साथ एक स्पाइक के रूप में एस pombe लेबलिंग-(गिनती में)

  1. 2 एम 4-thiouracil का एक ताजा समाधान तैयार करें । एक बार तैयार है, यह कमरे के तापमान पर रखने के लिए और प्रकाश से दूर ।
    1. सही वजन ६४.१ 4 के मिलीग्राम-thiouracil प्रत्येक एस cerevisiae संस्कृति के लिए और २५० µ एल में इसे भंग dimethylformamide (DMF) या में २५० µ एल के DMSO ।
    2. एस pombe संस्कृति के लिए स्पाइक के रूप में इस्तेमाल किया जा में, वजन ३२०.५ 4 के मिलीग्राम-thiouracil और DMSO के १,२५० µ एल में इसे भंग ।
  2. 5 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए एस cerevisiae और एस pombe संस्कृतियों के लिए 4-thiouracil समाधान जोड़ें और उंहें 30 डिग्री सेल्सियस और ३२ डिग्री सेल्सियस, क्रमशः पर लगातार आंदोलन के साथ 6 मिनट के लिए मशीन ।
  3. 6 मिनट के बाद, सेल गिनती के लिए प्रत्येक संस्कृति के एक छोटे से aliquot निकालें । किसी स्वचालित कक्ष काउंटर या किसी Neubauer कक्ष का उपयोग करके कक्षों की गणना करना.
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक (२,५०० x g) के माध्यम से कोशिकाओं को इकट्ठा ।
  5. supernatant त्यागें, बर्फ ठंडा 1x पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धोने, और फिर से केंद्रापसारक (२,५०० x g, 4 ° c, 5 मिनट) ।
  6. प्रत्येक एस cerevisiae और एस pombe नमूनों में कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना ।
  7. बर्फ ठंडा 1x पंजाबियों के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend और एक 3:1 अनुपात के साथ एस pombe कोशिकाओं के साथ एस cerevisiae मिश्रण ।
  8. कोशिकाओं केंद्रापसारक (२,५०० x जी, 4 ° c, 5 मिनट), पंजाबियों को हटा दें, फ्लैश-तरल एन2में कोशिकाओं को फ्रीज, और नमूना की दुकान पर-८० ° c जब तक आगे का उपयोग करें ।

3. आरएनए निष्कर्षण और DNase उपचार

  1. बर्फ पर लगभग 20-30 मिनट के लिए कोशिकाओं गल ।
  2. कुछ ढलने के साथ एक खमीर-आरएनए निष्कर्षण किट (सामग्री तालिका) का उपयोग कर आरएनए निष्कर्षण के साथ आगे बढ़ें ।
  3. प्रत्येक नमूने के अनुसार, एक १.५-एमएल पेंच कैप ट्यूब किट के साथ आपूर्ति में बर्फ ठंडा Zirconia मोतियों की ७५० µ एल डालो । ध्यान रखें कि प्रत्येक ट्यूब के प्रति, आरएनए से 109 कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक निकाला जा सकता है । इसलिए, प्रत्येक नमूने के लिए आवश्यक ट्यूबों की संख्या तैयार करते हैं । उदाहरण के लिए, एक एस । १०० एमएल (आयुध डिपो६००≈ ०.८) के cerevisiae संस्कृति लगभग 2 x 109 से 3 x 109 कोशिकाओं को प्रस्तुत कर सकते हैं, कुल २.७ x 10 9 से 4 x 10 9 कोशिकाओं की कुल करने के लिए अग्रणी (स्पाइक के बाद एक तिहाई के साथ एस pombe कक्ष) । इस मामले में, अप करने के लिए 3-4 प्रतिक्रिया ट्यूबों प्रति एक नमूना/स्थिति/उत्परिवर्ती/दोहराने की आवश्यकता होगी ।
  4. प्रत्येक 1 x 109 कोशिकाओं के प्रति, किट के साथ प्रदान की lysis बफर के ४८० µ एल जोड़ें, ४८ µ एल के 10% एसडीएस, और ४८० µ एल के phenol: क्लोरोफॉर्म: isoamyl शराब (25:24:1, वी/वी/
  5. एक भंवर मिक्सर का उपयोग कर कोशिकाओं को मिक्स और बर्फ ठंड Zirconia मोतियों युक्त ट्यूबों के लिए उन्हें हस्तांतरण ।
  6. एक भंवर मिक्सर अनुकूलक पर ट्यूबों को समायोजित, अधिकतम गति पर भंवर बारी है, और 10 मिनट के लिए हरा (4 डिग्री सेल्सियस पर एक कमरे में) खमीर कोशिकाओं लाइसे करने के लिए । वैकल्पिक रूप से, एक स्वत: मनका-डिब्बा में कोशिकाओं के lysis प्रदर्शन ।
  7. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर १६,००० x g पर ट्यूबों केंद्रापसारक और ध्यान से ऊपरी चरण (आरएनए युक्त चरण) एक ताजा 15 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब को इकट्ठा । आमतौर पर, प्रत्येक ट्यूब प्रति बरामद मात्रा 500 के आसपास है – 600 µ एल
  8. आंशिक रूप से शुद्ध आरएनए युक्त 15 मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए, किट के साथ प्रदान की बाध्यकारी बफर जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण । प्रत्येक १०० µ एल आरएनए समाधान के प्रति, बाइंडिंग बफ़र के ३५० µ l जोड़ें (यानी, जब जलीय-चरण समाधान वॉल्यूम ६०० µ l है, तो बाइंडिंग बफ़र की २.१ मिलीलीटर जोड़ा जाना चाहिए) ।
  9. पिछले मिश्रण करने के लिए, जोड़ें १००% इथेनॉल और अच्छी तरह से मिश्रण. आरएनए समाधान के प्रत्येक १०० µ एल प्रति, १००% इथेनॉल के २३५ µ एल जोड़ने (यानी, जब जलीय चरण समाधान मात्रा ६०० µ एल है, इथेनॉल के १.४१ मिलीलीटर जोड़ें) ।
  10. एक संग्रह ट्यूब में इकट्ठे एक फिल्टर कारतूस के लिए ३.९ कदम से मिश्रण के ७०० µ एल करने के लिए लागू करें, दोनों किट के साथ प्रदान की ।
  11. १६,००० x gपर 1 मिनट के लिए केंद्रापसारक यदि केंद्रापसारक अवधि के लिए पर्याप्त नहीं था कुल मात्रा के लिए फिल्टर के माध्यम से पारित करने के लिए, 30 एस के लिए केंद्रापसारक दोहराने ।
  12. प्रवाह के माध्यम से त्यागें और एक ही संग्रह ट्यूब का पुन: उपयोग । आरएनए के एक और ७०० µ एल जोड़ें-बाध्यकारी बफर-इथेनॉल समाधान फ़िल्टर करने के लिए और फिर से 1 मिनट के लिए १६,००० x g पर केंद्रापसारक ।
  13. प्रवाह-थ्रू छोड़ें और आरएनए समाधान समाप्त होने तक ३.११ और ३.१२ चरणों को दोहराएँ.
  14. धोने समाधान 1 के ७०० µ एल के साथ फिल्टर 2x धो लो । 1 मिनट के लिए १६,००० x g पर केंद्रापसारक के माध्यम से धुलाई समाधान इकट्ठा करने और हमेशा संग्रह ट्यूब रखो ।
  15. धोने समाधान 2 के ५०० µ एल के साथ फिल्टर 2x धो लें । 1 मिनट के लिए १६,००० x g पर केंद्रापसारक के माध्यम से धुलाई समाधान इकट्ठा करने और हमेशा संग्रह ट्यूब रखो ।
  16. ट्यूबों एक बार फिर से १६,००० x जी पर 1 मिनट के लिए पूरी तरह से फिल्टर सूखी ।
  17. अंतिम संग्रह ट्यूब के लिए फिल्टर कारतूस हस्तांतरण (आरएनए-उपयुक्त ट्यूब) और DEPC के ५० µ एल के साथ elute आरएनए-इलाज, RNase-मुफ्त एच2ओ (१०० डिग्री सेल्सियस के लिए पहले से गरम) ।
  18. १६,००० x gपर 1 मिनट के लिए केंद्रापसारक
  19. Elute आरएनए फिर (एक ही ट्यूब करने के लिए) के साथ ५० µ l की कचौरी DEPC-इलाज, RNase-फ्री एच२ओ. सुनिश्चित करें कि सभी वॉल्यूम फ़िल्टर के माध्यम से बीत चुका है; अंयथा, लंबी अवधि के लिए केंद्रापसारक ।
  20. एक एकल नमूने के लिए एकाधिक ट्यूबों का उपयोग किया जाता है, एक ट्यूब में उन सब पूल ।
  21. मात्रा और उचित उपकरणों का उपयोग कर नमूने की शुद्धता की जाँच करें.
    नोट: जबकि 4tU केवल नव संश्लेषित आरएनए के भीतर शामिल किया गया है, डीएनए के साथ मामूली संदूषण का एक मौका है । कि कारण के लिए, यह हमेशा DNase मैं के साथ नमूनों का इलाज करने के लिए सलाह दी जाती है । इसके लिए, निर्माता की सिफारिशों के बाद आरएनए-निष्कर्षण किट (सामग्री तालिका) के साथ प्रदान किए गए रिएजेंट का उपयोग करें ।

4. Thiol-नव संश्लेषित आरएनए के विशिष्ट Biotinylation

  1. 2 मिलीग्राम/एमएल के लिए प्रोटोकॉल के खंड 3 के साथ प्राप्त आरएनए की एकाग्रता को समायोजित करें । Aliquot २०० कुल आरएनए के µ जी, यह ६० डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए गर्मी, और तुरंत बर्फ पर 2 मिनट के लिए ठंडा ।
  2. आरएनए aliquot करने के लिए, निम्न क्रम में नीचे बताए गए रिएजेंट जोड़ें: ६०० µ l के DEPC-स्वास्थ्यकर्मी, RNase-इव ज2हे, १०० µ l के biotinylation बफर (१०० mm Tris-HCl [pH ७.५] और 10 mm EDTA, इन DEPC-स्वास्थ्यकर्मी, RNase-फ्री एच2ओ), और २०० µ l के बायोटिन-HPDP के एक शेयर से 1 मिलीग्राम/एमएल बायोटिन-HPDP में DMSO या DMF ।
    1. कुछ स्थितियों में, बायोटिन-HPDP समाधान, पानी में कम घुलनशीलता के कारण होने की संभावना को तेज कर देते हैं । इस स्थिति में, DMSO/DMF की मात्रा को प्रतिक्रिया की मात्रा के ४०% तक बढ़ाएं (आरएनए नमूने के लिए, µ बफर के DEPC-इलाज एच2ओ, १०० biotinylation एल के ४०० µ एल जोड़ें, और ४०० µ एल के बायोटिन-HPDP से एक ०.५ मिलीग्राम/एमएल स्टॉक) ।
  3. कमरे के तापमान पर नमूना मशीन और कोमल आंदोलन के साथ 3 एच के लिए प्रकाश से सुरक्षित ।
  4. मशीन के बाद, ट्यूबों के लिए क्लोरोफॉर्म के एक लगभग बराबर मात्रा में जोड़ें और जोरदार मिश्रण ।
  5. 5 मिनट के लिए १३,००० x g पर नमूना स्पिन, 4 डिग्री सेल्सियस पर । यह चरण आरएनए biotinylate नहीं किया है कि अतिरिक्त बायोटिन को हटाने की अनुमति देता है । वैकल्पिक रूप से, चरण-लॉक ट्यूबों (भारी) का उपयोग कर इस चरण निष्पादित करें । उस के लिए, चरण नीचे स्पिन १३,००० x जीपर 1 मिनट के लिए ताला ट्यूब, आरएनए मिश्रण और क्लोरोफॉर्म की एक समान राशि जोड़ने के लिए, उन्हें जोरदार मिश्रण है, और उन्हें 5 मिनट के लिए १३,००० x g पर, 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक.
  6. ध्यान से नए 2 मिलीलीटर ट्यूबों में ऊपरी चरण स्थानांतरण ।
  7. 5 एम NaCl की मात्रा के एक-दसवें जोड़ें और नमूना मिश्रण ।
  8. isopropanol के बराबर मात्रा में जोड़ें, नमूना अच्छी तरह से मिश्रण है, और यह 4 डिग्री सेल्सियस पर, न्यूनतम 30 मिनट के लिए १३,००० x g पर स्पिन ।
  9. सावधानी से supernatant निकालें और बर्फ ठंडा ७५% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  10. 10 मिनट के लिए १३,००० x g पर स्पिन, 4 डिग्री सेल्सियस पर ।
  11. ध्यान से निकालें supernatant, जल्दी ट्यूब स्पिन, और शेष इथेनॉल समाधान निकालें । आरएनए गोली सूखी नहीं है कि सुनिश्चित करें.
  12. DEPC-स्वास्थ्यकर्मी, RNase-मुक्त एच2ओ के १०० µ एल में आरएनए निलंबित ।

5. Streptavidin-लेपित चुंबकीय मोतियों का उपयोग कुल और unlabel्ड आरएनए से नव संश्लेषित अंश का शुद्धिकरण

  1. ६५ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए biotinylated आरएनए गर्मी और फिर 5 मिनट के लिए बर्फ पर नमूनों ठंडा ।
  2. biotinylated आरएनए के लिए streptavidin-लेपित चुंबकीय मोतियों की १०० µ एल जोड़ें (२०० µ एल के एक अंतिम मात्रा में) । विशेष रूप से, यह सामग्री की तालिकामें संकेत मोतियों का उपयोग करने की सिफारिश की है, के बाद से, अंय प्रयोगशालाओं के साथ बातचीत के बाद, इन को और अधिक सुसंगत और विश्वसनीय लग रहा था ।
  3. कमरे के तापमान पर, ९० मिनट के लिए थोड़ा मिलाते हुए के साथ नमूना मशीन ।
  4. चुंबकीय स्टैंड में किट (सामग्री की तालिका) के साथ प्रदान किए गए स्तंभों को रखें ।
  5. कमरे के ९०० µ एल जोड़ें-तापमान धोने बफर (१०० मिमी Tris-एचसीएल [पीएच ७.५], 10 मिमी EDTA, 1 एम NaCl, और ०.१% के बीच 20, DEPC में इलाज, RNase-मुक्त एच2ओ) कॉलम (पूर्व भागो और equilibrate) के लिए.
  6. स्तंभों के लिए मोती/आरएनए मिश्रण (२०० µ l) लागू करें ।
  7. १.५-एमएल ट्यूबों में प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा करने और इसे फिर से एक ही चुंबकीय स्तंभ के लिए लागू होते हैं । यदि आवश्यक हो, इस प्रवाह के माध्यम से रखने के रूप में यह unlabel्ड आरएनए अंश का प्रतिनिधित्व करता है ।
  8. वाशिंग बफर की मात्रा बढ़ाने के साथ कॉलम 5x धो (६००, ७००, ८००, ९००, और १,००० µ एल) ।
  9. Elute ने ०.१ मीटर डीटीटी के २०० µ l के साथ नव संश्लेषित आरएनए का वाचन कया.
  10. एक दूसरा रेफरेंस, 3 मिनट बाद, ०.१ मीटर डीटीटी की बराबर मात्रा के साथ प्रदर्शन करें ।
  11. आरएनए eluting के बाद, 3 एम NaOAc (पीएच ५.२) के ०.१ संस्करणों, बर्फ ठंडा १००% इथेनॉल के 3 संस्करणों, और 20 मिलीग्राम/एमएल ग्लाइकोजन (आरएनए ग्रेड) के 2 µ एल जोड़ने और आरएनए रात भर तेज, पर-20 डिग्री सेल्सियस ।
  12. (10 मिनट के लिए १३,००० एक्स जी , 4 डिग्री सेल्सियस पर) केंद्रापसारक द्वारा आरएनए पुनर्प्राप्त करें और 15 µ l में DEPC-इलाज, RNase-मुक्त एच20 में इसे पुनः निलंबित । लेबल करने वाली कुल आरएनए के अनुपात के आसपास 2%-4% (आमतौर पर अधिक कम अंत की ओर), नव संश्लेषित आरएनए के लगभग २.० µ जी प्रतिपादन होने की उम्मीद है. यह मात्रा कई qPCR प्रयोगों, microarray/अनुक्रमण विश्लेषण के लिए के रूप में अच्छी तरह से करने के लिए पर्याप्त है ।

6. RT-qPCR विभिन्न भागों के सत्यापन

  1. निर्माता के निर्देश (सामग्री की तालिका) के अनुसार यादृच्छिक hexamers और पसंद के रिवर्स transcriptase का उपयोग कर कुल आरएनए या लेबल आरएनए के 10 µ एल के 2 µ जी से संश्लेषित सीडीएनए.
  2. एक मानक प्रोटोकॉल (सामग्री की तालिका) का उपयोग कर वास्तविक समय qPCR द्वारा सीडीएनए बढ़ाना.
    नोट: सभी नमूने तपसिल में दो जैविक प्रतिकृति की एक ंयूनतम से चलाया जाना चाहिए । एस pombe tubulin की अभिव्यक्ति के लिए सभी कच्चे मूल्यों को सही ।

7. Microarray संकरण

  1. संकरण आरएनए नमूने पसंदीदा microarray चिप्स पर निर्माता के निर्देशों के अनुसार (इस विशिष्ट प्रोटोकॉल के लिए, सामग्री की तालिकादेखें). संक्षेप में, निर्माता के निर्देशों के अनुसार, प्रमुख आरएनए प्रवर्धन किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके आरएनए के १५० एनजी से biotinylated cRNA लक्ष्य तैयार करें । संकरण 4 ४५ डिग्री सेल्सियस पर 16 ज के लिए खंडित cRNAs की मिलीग्राम और microarray चिप्स पर ६० rpm ।
  2. धोने, दाग, और संकेत स्टेशन और स्कैनर (सामग्री की तालिका) का उपयोग कर चिप्स स्कैन । कमांड कंसोल (AGCC, संस्करण 4.1.2) का उपयोग कर स्कैन छवियों से रॉ डेटा (CEL तीव्रता फ़ाइलें) निकालें ।
  3. आगे की प्रक्रिया अभिव्यक्ति के साथ CEL फ़ाइलें सांत्वना सॉफ्टवेयर संस्करण 1.4.1 जांच सेट संकेत तीव्रता, का उपयोग आँकड़े-आधारित एल्गोरिदम ५.० MAS डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स और सामान्यीकरण विधि के रूप में वैश्विक स्केलिंग के साथ.
    नोट: छंटनी की प्रत्येक चिप का मतलब लक्ष्य तीव्रता मनमाने ढंग से १०० के लिए सेट किया गया था । न्यूनतम दो स्वतंत्र जैविक प्रतिकृति का उपयोग कर सभी प्रयोगों को निष्पादित करें । एस pombe संकेत करने के लिए कच्चे डेटा को सामान्य और कुल और नव संश्लेषित आरएनए के स्तर में गुना परिवर्तन की गणना.

8. एक मौजूदा आर पाइपलाइन का उपयोग कर डेटा विश्लेषण

  1. संश्लेषण और क्षय एक पाइप लाइन और आर/सार्वजनिक रूप से उपलब्ध पैकेज का उपयोग कर, के रूप में पहले8,10वर्णित दरों की गणना ।

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Representative Results

जब नव लिखित आरएनए के चयापचय लेबलिंग प्रदर्शन, कई पहलुओं को नियंत्रित करने की जरूरत है: समय और लेबलिंग की दक्षता, स्पाइक-में अनुपात, निष्कर्षण प्रोटोकॉल, और biotinylation प्रभावकारिता (सिग्नल के लिए शोर अनुपात सहित), अंय लोगों के अलावा । इन शर्तों को बड़े पैमाने पर किया गया है और प्रक्रिया दूसरों द्वारा दिखाया7,10,11। यहां हम मुख्य रूप से व्याख्या पर ध्यान केंद्रित करने और तुरंत विश्लेषण है कि एक बार किया जा सकता है नमूनों संसाधित किया गया है, या तो आर टी-qPCR, microarray, या अनुक्रमण द्वारा । अलग उत्परिवर्ती उपभेदों के विश्लेषण विधि की शक्ति का पता लगाने के लिए न केवल mRNA संश्लेषण में एक नाटकीय वैश्विक कमी, सागा उत्परिवर्ती एस cerevisiae उपभेदों के मामले में के रूप में, लेकिन यह भी आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय गतिविधि के एक बहुत ही हल्के कमी पर हिस्टोन H2B monoubiquitination का दमन ।

सागा एंजाइमी गतिविधियों के हमारे विश्लेषण15क्रोमेटिन, जो सागा उत्परिवर्ती उपभेदों में स्थिर राज्य mRNA के स्तर के विश्लेषण से नहीं पता चला था एक व्यापक भर्ती का सुझाव दिया । आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय भर्ती सागा निष्क्रियता पर बिगड़ा हुआ था के रूप में, हम mRNA संश्लेषण दरों विश्व स्तर पर प्रभावित किया जाएगा कि क्या विश्लेषण करने का फैसला किया. इसलिए, जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती एस cerevisiae उपभेदों एक 6 मिनट की अवधि के लिए 4tU के संपर्क में थे, के लिए नए लिखित RNAs लेबल । 3:1 के एक अनुपात में लेबल कोशिकाओं (एस pombe) में स्पाइक के साथ मिश्रण के बाद, कुल आरएनए निकाला गया था, और नव संश्लेषित आरएनए biotinylated और यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल के अनुसार शुद्ध किया गया था, के रूप में चित्रा 1में दिखाया chronogram. लेबल RNAs की कुल से शुद्ध थे २०० आरएनए के µ जी, सुनिश्चित करना है कि शुद्ध उत्पाद की राशि किसी भी बहाव आवेदन के लिए पर्याप्त होगा. किसी भी जीनोम चौड़ा विश्लेषण से पहले एक प्रारंभिक और व्यवस्थित कदम के रूप में, नव संश्लेषित आरएनए शुद्धि RT-qPCR द्वारा मान्य किया गया था. जीन विभिन्न मापदंडों के अनुसार चुने गए, जिनमें अभिव्यक्ति का स्तर, विनियामक मार्ग, और विभिन्न आरएनए polymerases पर निर्भरता शामिल है.

यह पुष्टि करने के लिए कि इस प्रोटोकॉल विशेष रूप से लेबल शाही सेना को शुद्ध, हम के साथ या 4tU के बिना संस्कृति थे कि जंगली प्रकार के कोशिकाओं से शुद्ध अंशों में टेप के स्तर quantified. विश्लेषण RNAs के नगण्य पृष्ठभूमि स्तर कोशिकाओं है कि 4tU (चित्रा 2ए) के संपर्क में नहीं थे से पता लगाया गया । नव लिखित आरएनए शुद्धि आगे मनाया संवर्धन द्वारा मान्य किया गया intron-युक्त ACT1 प्री-mRNA (डेटा नहीं दिखाया गया है). नमूनों की गुणवत्ता की मांयता के बाद, हम परीक्षण किया है कि mRNA संश्लेषण SPT20, जो सागा परिसर विधानसभा को बाधित करने के लिए जाना जाता है को हटाने पर प्रभावित होगा । के रूप में दूसरों के द्वारा रिपोर्ट, mRNA ठहराव कुल पर प्रदर्शन किया (स्थिर राज्य) spt20Δ तनाव से आरएनए का पता चला ज्यादातर अपरिवर्तित या हल्के से परीक्षण जीन (चित्रा 2बी) के लिए स्तर कम । इसी तरह के परिणाम BRE1 (चित्रा 2बी) के लिए नष्ट कर दिया उपभेदों के लिए प्राप्त किया गया । इसके विपरीत, spt20Δ तनाव से नव लिखित आरएनए के विश्लेषण तीन-सभी परीक्षण जीन के लिए पंचगुना करने के लिए mRNA संश्लेषण में एक नाटकीय कमी का पता चला (चित्रा 2सी). Bre1 का नुकसान अध्ययन जीन (चित्रा 2सी) के लिए नव संश्लेषित mRNA के स्तर में एक अधिक विचारशील लेकिन अभी भी दिखाई कमी के लिए नेतृत्व किया । आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय प्रतिलेखन में गाथा और Bre1 की भूमिका के साथ अच्छे समझौते में, या तो Spt20 या Bre1 के नुकसान RDN25 या snR6 जीन की अभिव्यक्ति को प्रभावित नहीं किया, आरएनए पोलीमरेज़ मैं और आरएनए पोलीमरेज़ III द्वारा लिखित, क्रमशः ( चित्रा 2सी) ।

हालांकि, SPT7 या SPT20की तरह, सागा परिसर के संरचनात्मक उपइकाईयों के लिए नष्ट कर दिया उपभेदों, जो मनाया transcriptional परिवर्तन के लिए खाते मई गंभीर धीमी गति से वृद्धि phenotypes प्रदर्शन । अवांछित माध्यमिक प्रभाव बाहर शासन करने के लिए, हम सशर्त नाभिक से Spt7 समाप्त, लंगर का उपयोग कर दूर एस cerevisiae उपभेदों14,24। rapamycin उपचार के ६० मिनट पर, से पहले नाड़ी-4tU के साथ लेबल (एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व के लिए चित्र 1 देखें), नव लिखित mRNA स्तर एक समान हद तक कम किया गया के रूप में है कि विलोपन तनाव (चित्रा 2d और 2E में मनाया ). इस विश्लेषण, इस प्रकार, हमारे पूर्व परिणामों की पुष्टि की है और इस inducible घट प्रणाली के लिए प्रोटोकॉल मांय । एक समय में पाठ्यक्रम के विश्लेषण, जहां कोशिकाओं को एक समय 0 से २४० मिनट में फैले के लिए rapamycin के संपर्क में थे, कम अभिव्यक्ति तुरंत दवा के लिए जोखिम के 15 मिनट के बाद सबूत था । और अधिक दिलचस्प है, स्थिर राज्य mRNA स्तर शुरू में कम करने के लिए खड़ा है, लेकिन ६० मिनट, एक संकेत है कि एक क्षतिपूरक तंत्र इस बीच में जगह लेता है के बाद सामांय स्तर पर लौट आए (चित्रा 2ई) ।

कुल मिलाकर, लेबलिंग और नव संश्लेषित आरएनए के ठहराव गाथा परिसर के लिए नई नियामक भूमिकाओं का खुलासा करने की अनुमति दी । वर्णित प्रोटोकॉल भी आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय गतिविधि पर उदारवादी प्रभाव प्रकट कर सकता है और सफलतापूर्वक सशर्त घट खमीर उपभेदों के लिए लागू किया गया था ।

शुद्ध नव संश्लेषित आरएनए के लिए अनुप्रवाह अनुप्रयोगों में से एक microarray संकरण या अनुक्रमण (4tU-seq) का उपयोग कर टेप की एक जीनोम चौड़ा ठहराव है । उच्च प्रवाह अनुक्रमण अधिक मात्रात्मक, संवेदनशील और जानकारीपूर्ण है, जबकि microarray संकरण वैश्विक mRNA स्तर बदल रहे हैं कि क्या यह निर्धारित करने के लिए बहुत उपयोगी हो सकता है । इस संदर्भ में जहां सामान्यीकरण निर्णायक है, हम नमूना है कि हम विश्लेषण करने के लिए उद्देश्य के लिए एक स्पाइक-जीव में जोड़ा. विशेष रूप से, हम एस. cerevisiae कोशिकाओं को 3:1 के अनुपात में एस pombe कोशिकाओं को मिलाया, दोनों पहले 4tU को उजागर किया जा रहा है । जब शुद्ध, लेबल RNAs उच्च प्रवाह अनुक्रमण के अधीन हैं, किसी भी मानक पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल इस्तेमाल किया जा सकता है, सबसे अधिक बार राइबोसोमल आरएनए घट का पालन. विभिन्न नमूनों से 4tU-seq डेटा के बीच सामांयीकरण एक अलग प्रजातियों से या तो लेबल आरएनए जोड़कर किया गया है (यानी, मिश्रण एस cerevisiae और एस pombe कोशिकाओं के ऊपर के रूप में)22 या इन विट्रो- प्रतिलिखित, thiolated स्पाइक-आरएनए12,25,26,27में । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध microarray चिप्स दोनों नवोदित और विखंडन खमीर के पूरे transcriptome के लिए जांच होते हैं, एक ही प्रयोग में दोनों जीवों से mRNA के ठहराव की अनुमति । Microarray hybridizations के साथ प्रदर्शन किया गया कुल और नव संश्लेषित आरएनए द्वारा मान्य RT-qPCR के रूप में ऊपर संकेत (जंगली-प्रकार, spt20Δ, और bre1Δ). इसके अलावा, हम एक तनाव है कि हिस्टोन H2B के monoubiquitination का समर्थन नहीं करता शामिल है, ubiquitinable अवशेषों (K123R) के बिंदु उत्परिवर्तन के माध्यम से । क्योंकि एस pombe कोशिकाओं के ठीक उसी अनुपात अलग नमूनों में इस्तेमाल किया और दोहराने, यह संभव है रैखिक arrays ' तीव्रता rescale करने के लिए इतना है कि कुल और लेबल एस pombe जांच एक ही औसत गहनता है । यह सामान्यीकरण, या rescaling, एक प्रवाहकीय पैट्रिक Cramer की प्रयोगशाला द्वारा विकसित पैकेज का उपयोग किया जा सकता है और समानांतर में सभी विश्लेषण नमूनों में प्रयोग किया जाता है, कुल और लेबल भागों और जंगली-प्रकार और म्यूटेंट उपभेदों8. संक्षेप में, इस पाइपलाइन के इनपुट एक एक्सेल फ़ाइल है जिसमें सभी नमूनों और अंशों के लिए जांच और उनकी गहनता (MAS5 या RMA) शामिल है । जांच है कि पता लगाने की सीमा से बाहर है को छोड़कर के बाद, संकेत तीव्रता rescale, एस pombe जांच की तीव्रता मूल्यों को ध्यान में रखते हुए है । अंत में, आप नवोदित और विखंडन खमीर जीनोम के लिए जांच मैप कर सकते हैं, एक अभिव्यक्ति स्पाइक के लिए सामान्यीकृत मूल्यों वाले मैट्रिक्स के साथ समाप्त । ये मान आगे संसाधित किया जा सकता (अगला अनुभाग देखें) या के रूप में उपयोग किया जाता है । निंनलिखित उदाहरण में, हम उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार के तनाव के बीच हर प्रतिलिपि के मोड़ बदल निर्धारित किया है ।

विश्लेषणों दोनों स्थिर राज्य या आरएनए के नव संश्लेषित स्तर के लिए प्रदर्शन किया और उनके सांख्यिकीय महत्व (पीमूल्य) (चित्रा 3) के खिलाफ साजिश रची गई । अन्य अध्ययनों के साथ समझौते में, जब कुल आरएनए स्तर का विश्लेषण किया गया, केवल कुछ जीन उनकी अभिव्यक्ति बदल गया था, या तो अप-या downregulated (आंकड़ा 3सी 3). हालांकि, नव लिखित आरएनए के विश्लेषण के लिए हड़ताली अलग निष्कर्ष के नेतृत्व में । ४,००० से अधिक जीन के नव लिखित mRNA के स्तर काफी कम दोहरा SPT20के विलोपन पर से कम थे, आरएनए पर सागा के एक वैश्विक सकारात्मक प्रभाव का सुझाव पोलीमरेज़ द्वितीय प्रतिलेखन नवोदित खमीर में (चित्रा 3डी ). इसके अतिरिक्त, bre1Δ और K123R म्यूटेंट में, परिणाम अधिक विचारशील थे: अधिकांश जीनों के लिए अपनी अभिव्यक्ति कम दिखाई दिया, लेकिन downregulation की हद तक और काफी प्रभावित जीन की संख्या (≈ ३००-५००) वास्तव में अधिक था लिमिटेड (फिगर 3E and 3F).

जैसा कि पहले उल्लेख किया, स्थिर राज्य या mRNA के कुल स्तर संश्लेषण और क्षय के बीच तंग संतुलन द्वारा तय कर रहे हैं (चित्रा 4ए). जब आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय प्रतिलेखन विश्व स्तर पर बिगड़ा हुआ है, दो परिदृश्यों चित्र किया जा सकता है: (i) या तो कुल mRNA स्तर कम संश्लेषण लेकिन लगातार क्षय के लिए एक प्रतिक्रिया के रूप में, दुनिया भर में कमी, या (II) mRNA क्षरण एक ही हद तक कमी आई है, जिसके परिणामस्वरूप ज्यादातर अपरिवर्तित स्थिर-राज्य mRNA स्तरों में । दूसरे परिदृश्य में गाथा या TFIID व्यवधान9,10,14,16,22के संदर्भ में सहित कई शर्तों के लिए सूचित किया गया है । एक प्रक्रिया 4tU लेबलिंग और गतिशील काइनेटिक मॉडलिंग के आधार पर तुलनात्मक गतिशील transcriptome विश्लेषण (cDTA) कहा जाता है हमें mRNA संश्लेषण का निर्धारण और हर प्रतिलिपि8,10के लिए क्षय दरों का अनुमान करने की अनुमति देता है । एक बार फिर, हम पहले उल्लेख किया उपभेदों के लिए एकत्र आंकड़ों का लाभ लिया (वंय-प्रकार, spt20Δ, bre1Δ, और K123R) । के रूप में की उंमीद है, SPT20के विलोपन पर, हम mRNA संश्लेषण और गिरावट दरों में एक साथ कमी मनाया जब जंगली प्रकार के तनाव की तुलना में । इस उत्परिवर्ती तनाव में, मुआवजा लगभग इष्टतम था, ३.८ के संश्लेषण में एक औसत कमी के साथ-गुना और ४.१ के क्षय में एक औसत कमी-गुना (चित्रा 4बी), corroborating क्यों केवल सीमित transcriptional परिवर्तन हो सकता है कुल mRNA स्तरों पर पाया गया (चित्रा 3ए) । दो अंय उत्परिवर्ती उपभेदों में (bre1Δ और K123R), mRNA संश्लेषण और क्षय में सहवर्ती परिवर्तन भी मनाया गया, लेकिन परिवर्तन एक बहुत छोटे पैमाने पर थे और अधिक फैलाया (आंकड़ा 4c और 4d) ।

Figure 1
चित्रा 1 : आरएनए का चयापचय लेबलिंग के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व 4tU का उपयोग. नए सिरे से तैयार 4tU संस्कृति माध्यम में जोड़ा जाता है और कोशिकाओं को 6 मिनट के लिए लेबल कर रहे हैं. लेबल एस cerevisiae और एस pombe कोशिकाओं 3:1 के अनुपात में मिलाया जाता है और कुल आरएनए निकाली जाती है । इसके बाद, नव संश्लेषित आरएनए biotinylated है और streptavidin-लेपित चुंबकीय मोतियों का उपयोग कर शुद्ध किया जा सकता है । अंत में, कुल (स्थिर राज्य) आरएनए और लेबल नव संश्लेषित आरएनए आर टी-qPCR और microarray संकरण या अनुक्रमण सहित बहाव अनुप्रयोगों, की एक किस्म में इस्तेमाल किया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : RT-qPCR द्वारा निर्धारित दोनों स्थिर-राज्य और नव लिखित आरएनए में transcriptional परिवर्तनों का चित्रण विश्लेषण. (क) पांच अलग जीन के आरएनए स्तर लेबल आरएनए भिन्न जंगली प्रकार की कोशिकाओं है कि या तो उजागर किया गया था या नहीं 4tU से शुद्ध से quantified थे. अगले दो पैनलों शो (ख) कुल और (ग) नव संश्लेषित आरएनए ठहराव द्वारा आर टी-qPCR के लिए जंगली प्रकार (WT), spt20Δ, और bre1Δ खमीर कोशिकाओं । Spt7 लंगर-दूर उपभेदों, अनुपचारित या ६० मिनट के लिए rapamycin के साथ इलाज किया, 4tU के साथ लेबल थे, और (घ) कुल या (ई) नव लिखित आरएनए RT-qPCR द्वारा quantified था । (च) यह पैनल Spt7 परमाणु घट पर स्थिर-राज्य और नव संश्लेषित mRNA में परिवर्तन के समय-पाठ्यक्रम का विश्लेषण दिखाता है. सभी नमूनों के लिए, पांच आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय जीन के लिए mRNA स्तर RT-qPCR द्वारा quantified किए गए. आरएनए पोलीमरेज़ मैं और आरएनए पोलीमरेज़ III जीन (RDN25 और snR6, क्रमशः) नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया. अभिव्यक्ति मूल्यों (तीन स्वतंत्र प्रयोगों के ± एसडी मतलब) नुकीला- एस pombe संकेत में और नियंत्रण के नमूने में 1 के लिए सेट करने के लिए सामान्यीकृत थे । पैनल डी एफ Baptista एट अल से संशोधित किया गया है । 14. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : कुल या लेबल आरएनए भिन्न का उपयोग mRNA स्तरों के जीनोम चौड़ा विश्लेषण. इन पैनलों ज्वालामुखी भूखंडों दिखा (एक-सी) स्थिर राज्य mRNA स्तर या (डी एफ) नए संश्लेषित mRNA अपने महत्व के सापेक्ष स्तर (पीमूल्य) में परिवर्तन दिखा । गुना परिवर्तन (एफसी) के रूप में प्रत्येक जीन की अभिव्यक्ति मूल्य के अनुपात के log2 के रूप में की गणना की गई एस pombe संकेत में (ए और डी) spt20Δ, (बी और ई) bre1Δ, या ( सी और एफ) K123R तनाव बनाम वन्य-प्रकार में एक ही जीन की अभिव्यक्ति मूल्य एस. cerevisiae. कुल ५,३८५ जीन का विश्लेषण किया गया, और दोहरा परिवर्तन की दहलीज (नीली बिंदी: एक दोहरा से अधिक कमी; पीला डॉट्स: एक दोहरा वृद्धि से अधिक) और ०.०५ पी-मूल्यों पर विचार किया गया । पैनलों ए और डी Baptista एट अल से संशोधित किया गया है । 14. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4 : mRNA संश्लेषण और mRNA क्षय में समानांतर परिवर्तन mRNA बफ़रिंग में परिणाम । (क) इस पैनल स्थिर राज्य आरएनए स्तर पर आरएनए संश्लेषण गड़बड़ी के परिणाम का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व से पता चलता है. (बी-डी) इन पैनलों mRNA संश्लेषण की गणना और कुल और नव संश्लेषित आरएनए के विश्लेषण से क्षय दर दिखाते हैं । संश्लेषण और क्षय की दर प्रत्येक एस cerevisiae प्रतिलिपि के लिए निर्धारित किया गया था (ख) spt20Δ, (ग) bre1Δ, और (घ) K123R. संश्लेषण दर में परिवर्तन (उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार के बीच अनुपात के log2 के रूप में गणना) क्षय दरों में परिवर्तन के खिलाफ साजिश रची गई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

जबकि जीनोम चौड़ा उपकरण प्रतिलेखन में परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए अभी भी सुधार कर रहे हैं, transcriptome के ठहराव के माध्यम से एकमात्र विश्लेषण आरएनए के स्थिर राज्य स्तर की सही ढंग से आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय गतिविधि में परिवर्तन को प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है । वास्तव में, mRNA स्तर न केवल आरएनए संश्लेषण द्वारा विनियमित रहे हैं, लेकिन यह भी उनकी परिपक्वता और क्षरण से. mRNA संश्लेषण mRNA क्षरण से जोड़ा उपाय करने के लिए, अलग प्रोटोकॉल दोनों खमीर और स्तनधारियों में नवजात प्रतिलेखन के विश्लेषण के लिए हाल के वर्षों में विकसित किया गया है ।

नवजात प्रतिलेखन के ठहराव के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल में से एक है मूह-seq1. जबकि मूह है seq मुख्य लाभ अपनी क्षमता उच्च संकल्प और कम पृष्ठभूमि में transcriptionally सगाई और सक्रिय पोलीमरेज़ अनावरण करने के लिए है, यह दो अलग अंक है कि अपनी आंखो में कमी: (i) यह तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है और की आवश्यकता है नाभिक के अलगाव और, (ii) नाभिक जोड़तोड़ प्रणाली28के लिए कुछ perturbations परिचय । एक अन्य विकल्प शुद्ध seq, जो नवजात आरएनए के बीच गठित अत्यंत स्थिर त्रिगुट परिसर के immunoprecipitation पर प्राप्त टेप के 3 सिरों के अनुक्रमण पर निर्भर करता है, डीएनए टेम्पलेट, और आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय. इस दृष्टिकोण एक आधार जोड़ी संकल्प पर नवजात RNAs के लक्षण वर्णन की अनुमति देता है और संशोधित आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय के immunoprecipitation के माध्यम से mRNA प्रसंस्करण की घटनाओं का पता लगाने कर सकते हैं (serine-5 फास्फारिलीकरण, उदाहरण के लिए)2,3 , 29. फिर भी, यह कुछ बाधाएं प्रस्तुत करता है, जिसमें से हम तीन को हाइलाइट करते हैं । सबसे पहले, एक ओर जहां एंटीबॉडी आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय लक्ष्यीकरण आमतौर पर अत्यधिक विशिष्ट हैं, यह एंटीबॉडी दक्षता पर निर्भर करता है । दूसरा, शाही सेना के लिए गर्मी की अवधि के दौरान गिरावट का खतरा हो सकता है, इस प्रकार हमें पिछले बिंदु (कम कुशल एंटीबॉडी अब गर्मी की आवश्यकता हो सकती है के लिए वापस अग्रणी, आरएनए अधिक क्षरण के लिए अतिसंवेदनशील)29। तीसरा, और विशेष रूप से स्तनधारियों में, MNase पाचन और आकार चयन अद्वितीय अनुक्रम संरेखण29,30बाहर हो सकता है ।

यहाँ हम cerevisiae में 4tU का उपयोग करते हुए नव संश्लेषित आरएनए की चयापचय लेबलिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है कि अन्य उपलब्ध दृष्टिकोण की तुलना में विभिन्न लाभ है. क्योंकि प्रतिलेखन अत्यधिक perturbations के प्रति संवेदनशील है, कोशिकाओं को सबसे अधिक शारीरिक स्थितियों में बनाए रखा जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, मूह-seq से निकलता है transcriptionally रत आरएनए पोलीमरेज़ II के एक्सपोजर के माध् यम से sarkosyl को नाभिक/ हालांकि, sarkosyl उपचार कई सेलुलर प्रक्रियाओं11के निरोधात्मक के रूप में वर्णित किया गया है । इस मामले में, वर्णित एकाग्रता पर 4tU या 4sU के साथ चयापचय लेबलिंग गैर perturbing है और नहीं दिख रहा सेल homeostasis, विशेष रूप से जोखिम की छोटी अवधि के लिए प्रभावित करता है । mRNA आधा जीवन, cDTA या 4tU-seq और गतिशील मॉडलिंग के साथ फिटिंग उपाय करने के लिए प्रतिलेखन निषेध का उपयोग अंय तरीकों के विपरीत बेफिक्र कोशिकाओं में हर एक mRNA की गिरावट दर निर्धारित करता है । इसलिए, एक ही विधि एक साथ दोनों संश्लेषण और पूरे transcriptome के क्षय दर एक विशिष्ट कोशिका प्रकार पर पता कर सकते हैं. चूंकि cDTA या 4tU-seq अत्यधिक विश्वसनीय सामान्यीकरण विधियों का लाभ लेता है, अर्थात स्पाइक-इन के उपयोग के माध्यम से, विभिन्न डेटासेट का एक साथ विश्लेषण किया जा सकता है और सीधे तुलना की जाती है. अंत में, चयापचय लेबलिंग और नव संश्लेषित आरएनए के ठहराव एक तकनीक है कि आसानी से किसी भी आणविक जीवविज्ञान प्रयोगशाला में कार्यांवित किया जा सकता है के रूप में यह किसी भी विशिष्ट उपकरणों की आवश्यकता नहीं है । इस संभावना को इस तकनीक के बजाय बड़े प्रसार बताते हैं, जो अधिक से अधिक व्यवस्थित इस्तेमाल किया जा करने के लिए कर रहे है आरएनए उत्पादन और खमीर में गिरावट का पता लगाने के लिए, के रूप में अच्छी तरह के रूप में उच्च eukaryotes ।

आरएनए अन्य nucleoside अनुरूप, अर्थात् 5-bromouridine (बरू)31,३२ या 5-ethynyluridine (ईयू)३३,३४का उपयोग कर कोशिकाओं को जीवित रहने में लेबल किया जा सकता है । बरू नाड़ी का अलगाव-त्यसपछि आरएनए विरोधी BrdU एंटीबॉडी शुद्धि पर निर्भर करता है जो प्रयोगों के बीच विभिन्न क्षमता हो सकती है. यूरोपीय संघ लेबल आरएनए covalently संयुग्मित के लिए क्लिक करें रसायन thiol संशोधन के साथ इसके विपरीत में एक गैर प्रतिवर्ती विकार के लिए अग्रणी का उपयोग कर सकते हैं, जो एजेंटों को कम करने के साथ उलट जा सकता है । बरू और यूरोपीय संघ लेबलिंग स्तनधारी कोशिकाओं में जीनोम-वाइड आरएनए क्षय दर31,३२ या नवजात आरएनए संश्लेषण३४,३५का आकलन करने के लिए निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हालांकि एस cerevisiaeमें बरू या ईयू लेबलिंग का वर्णन नहीं किया गया है । दरअसल, nucleoside सादृश्यों के nucleoside ट्रांसपोर्टर की अभिव्यक्ति की आवश्यकता है और, इस प्रकार, इन तरीकों 4tU के साथ लेबल की तुलना में नवोदित खमीर में कम लचीला दिखाई देते हैं ।

4tU लेबलिंग की अवधि को अनुकूलित किया जा सकता है और प्रश्न के अनुसार बदलता रहता है । जब एस cerevisiaeमें mRNA संश्लेषण का आकलन, 6 मिनट की एक छोटी लेबलिंग पल्स सुनिश्चित करता है कि नव लिखित mRNA स्तर न्यूनतम आरएनए क्षरण से प्रभावित कर रहे हैं. यह देखते हुए कि संशोधित न्यूक्लियोटाइड से पहले अंतराल के समय नवजात आरएनए में शामिल किया जा सकता है से कम 1 मिनट, इस 6-ंयूनतम लेबलिंग अवधि वारंट है कि नव संश्लेषित आरएनए के एक उचित मात्रा में शुद्ध किया जा सकता है । इस तरह के प्रोटोकॉल, के रूप में मिलर एट अल द्वारा परिभाषित । 11, अलग एस में इस्तेमाल किया गया है cerevisiae म्यूटेंट mRNA संश्लेषण और आरएनए क्षय में वैश्विक परिवर्तन प्रकट करने के लिए9,10,22,26,27, ३६. एक लंबी लेबलिंग अवधि (3 एच) में एक चयापचय पल्स-चेस लेबलिंग 4tU के साथ एस cerevisiae12 में सभी mRNAs की क्षय दर निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । अंत में, अत्यंत लघु (१.५ मिनट से) 4tU लेबलिंग नवोदित और विखंडन खमीर13,25,३७में आरएनए प्रसंस्करण कैनेटीक्स की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ।

फिर भी, इस विधि जैसे लेबल आरएनए के अपेक्षाकृत कम उपज पूरे प्रोटोकॉल के अंत में बरामद के रूप में कुछ सीमाएं हैं । जबकि खमीर में, वहां शुरू सामग्री में कोई सीमा नहीं है, और यह एक मुद्दा हो सकता है जब metazoan कोशिकाओं का विश्लेषण, विशेष रूप से अगर इस प्रोटोकॉल vivo मेंउपयोग किया जा रहा है । प्रोटोकॉल के सीमित चरणों में से एक लेबल आरएनए पूल, जिनकी दक्षता पूरी से दूर है और लेबल आरएनए5में तीन 4sU अवशेषों में से एक को संशोधित करने का अनुमान था की biotinylation है । यह हाल ही में पता चला है कि methanethiosulfonate (MTS) के उपयोग-बायोटिन, के बजाय बायोटिन-HPDP, बरामद आरएनए३८की उपज बढ़ जाती है । हालांकि, इस अनुसंधान समूह और Rutkowski और Dölken से परिणाम के अप्रकाशित परिणामों के अनुसार, MTS-बायोटिन पूरी तरह से thiol-विशिष्ट नहीं है, जो विशेष रूप से समस्याग्रस्त है जब लेबल आरएनए के कम मात्रा में है, जो unpublisheded आरएनए की शुद्धि के लिए अग्रणी ३९शुद्ध । 4tU/4sU का उपयोग कर चयापचय लेबलिंग की एक और सीमा जो आरएनए पोलीमरेज़ बढ़ाव निहित गति है । आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय की औसत गति लगभग ३.५ kb/न्यूनतम४०,४१,४२होने का अनुमान था । इसलिए, एक 6 मिनट लेबलिंग में, पोलीमरेज़ 15 टाइप करने की क्षमता-20 केबी होगा । इस प्रकार, 4tU/4sU के साथ एक लघु पल्स लेबलिंग के साथ एक प्रयोग में, केवल ' 3 नव लिखित आरएनए के अंत भाग लेबल है, जबकि 5 ' अंत क्षेत्रों पूर्व मौजूदा थे 4tU/4sU के अलावा पहले । इस प्रकार, लेबल RNAs की शुद्धि भी पहले से समृद्ध, टेप के मौजूदा 5 ' समाप्त होता है, विशेष रूप से लंबी टेप के लिए स्तनधारी कोशिकाओं में के रूप में । आदेश में इस पूर्वाग्रह को दूर करने के लिए, एक परिष्कृत प्रोटोकॉल में टीटी-seq कहा जाता है, निकाले लेबल आरएनए नई संश्लेषित प्रजातियों४३की शुद्धि करने से पहले sonication द्वारा खंडित है ।

कुल मिलाकर, 4tU-seq एक शानदार तरीका है एक दिए गए संदर्भ में transcriptional परिवर्तन पता है । फिर भी, और जब प्रोटोकॉल काफी सरल है, यह कई विभिंन चरणों के होते हैं, अंततः जा रहा है अपेक्षाकृत व्यापक । और सबसे पहले, के बाद से इस प्रोटोकॉल शुरू से ही आरएनए संभालती खत्म करने के लिए, यह अनिवार्य है कि सभी एक स्वच्छ और क्षरण मुक्त नमूना के लिए आवश्यक आवश्यकताओं को पूरा कर रहे हैं । इसलिए, सभी एजेंट RNase-मुक्त होना चाहिए, और सभी सामग्री आरएनए जोड़ तोड़ करने के लिए समर्पित किया जाना चाहिए, अच्छी तरह से और नियमित रूप से RNase दूषण समाधान के साथ सब कुछ साफ । दूसरा, जबकि बायोटिन की प्रतिक्रिया अत्यधिक विशिष्ट है, बायोटिन की अधिकता-HPDP कि प्रतिक्रिया नहीं की जानी चाहिए नमूना से हटा दिया जाना चाहिए (बायोटिन है कि आरएनए के लिए बाध्य covalently नहीं है के साथ streptavidin मोतियों की संतृप्ति से बचने के लिए, उदाहरण के लिए). तीसरे, के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित है, संकेत streptavidin लेपित चुंबकीय मोतियों का उपयोग अत्यधिक की सिफारिश की है, के बाद से कई अनुसंधान समूहों हम सब से बात की है संकेत दिया है कि इन मोतियों की पृष्ठभूमि के स्तर को कम करने के लिए नेतृत्व किया । चौथा, उपयुक्त गुणवत्ता और प्रायोगिक नियंत्रण किया जाना चाहिए । 4tU/4sU करने के लिए उजागर नहीं किए गए कक्षों से व्युत्पंन नमूने शामिल करें । इन नमूनों की पृष्ठभूमि के स्तर का पता करने के लिए और यह सुनिश्चित करने के लिए महान मूल्य की होगी कि, प्रयोग के दौरान, गैर लेबल वाली आरएनए के साथ एक संदूषण उत्पन्न नहीं होता है. इसके अलावा, नमूना नए संश्लेषित आरएनए के लिए समृद्ध है कि क्या परीक्षण करने के लिए एक और उत्कृष्ट विकल्प एक परिचय युक्त जीन के खिलाफ प्राइमरों का उपयोग कर एक आरटी qPCR प्रदर्शन करने के लिए है. प्राइमरों दो लगातार एक्सॉन और intron, या इसके विपरीतके 3 ' अंत और 5 ' के अंत के पूरक होना चाहिए । अंत में, microarray संकरण के sequencing करने से पहले, RT-qPCR द्वारा नमूनों को मान्य. इसके लिए अभिव्यक्ति और नियमन के विभिन्न स्तरों वाले विभिन्न जीनों का चयन और विश्लेषण किया जाना चाहिए । बेहतर है, यह दो आरएनए के विभिंन भागों (स्थिर राज्य और नव संश्लेषित आरएनए) के लिए किया जाना चाहिए ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम उनके समर्थन और वी. फिशर, के शूमाकर, और एफ एल Saafin उनके लिए चर्चा के लिए लैस्ज़लो तोरा धंयवाद । T.B. एक मैरी क्यूरी-ITN फैलोशिप (PITN-GA-2013-606806, NR-NET) और स्नेहन चाप द्वारा समर्थित किया गया था । इस काम के Agence नेशनल डे ला सभ्य (ANR-15-CE11-0022 SAGA2) से धन द्वारा समर्थित किया गया था । इस अध्ययन में ANR-10-LABX-0030-INRT, एक फ्रांसीसी राज्य कोष द्वारा प्रबंधित Agence सभ्य Investissements-10-d'Avenir-0002-02 के तहत फ़्रेम प्रोग्राम ANR नेशनल डे ला IDEX द्वारा भी समर्थित था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Thiouracil Sigma-Aldrich Cat# 440736
Rapamycin Euromedex Cat# SYN-1185
Countess II FL Automated Cell Counter ThermoFisher N/A
RiboPure RNA Purification kit, yeast ThermoFisher Cat# AM1926
NanoDrop 2000 Spectrophotometer ThermoFisher ND-2000
TURBO DNA-free Kit ThermoFisher AM1907
EZ-Link HPDP Biotin ThermoFisher Cat# 21341
Thiolutin Abcam ab143556
µMACS Streptavidin kit Miltenyi Biotec Cat# 130-074-101
Transcriptor Reverse Transcriptase Roche 03 531 295 001
SYBR Green I Master Roche 4707516001
GeneChip Yeast Genome 2.0 ThermoFisher 900555
GeneChip Fluidics Station 450 ThermoFisher 00-0079
GeneChip Scanner 3000 7G ThermoFisher 00-0210

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व्यवहार अंक १४० एस cerevisiae आरएनए प्रतिलेखन नव संश्लेषित आरएनए 4-thiouracil आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय सागा कॉम्प्लेक्स
<em>Saccharomyces cerevisiae</em> 4-thiouracil और आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय गतिविधि के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में नव संश्लेषित mRNA के ठहराव के साथ चयापचय लेबलिंग
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Baptista, T., Devys, D.… More

Baptista, T., Devys, D. Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity. J. Vis. Exp. (140), e57982, doi:10.3791/57982 (2018).

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