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Genetics

Saccharomyces cerevisiae Metabolica etichettatura con 4-tiouracile e la quantificazione di nuova sintesi mRNA come Proxy per attività di RNA polimerasi II

Published: October 22, 2018 doi: 10.3791/57982
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3,4
1Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Illkirch, France, 2Centre National de la Recherche Scientifique, Illkirch, France, 3Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Illkirch, France, 4Université de Strasbourg

Summary

Il protocollo qui descritto si basa sulla quantificazione genoma di nuova sintesi mRNA purificato da cellule di lievito etichettate con 4-tiouracile. Questo metodo permette di misurare la sintesi di mRNA disinserita dalla degradazione del mRNA e, quindi, fornisce una misurazione accurata della trascrizione del RNA polimerasi II.

Abstract

Globali difetti nella trascrizione del RNA polimerasi II potrebbero essere trascurati dagli studi di trascrittomica analizzando RNA allo steady-state. Infatti, la diminuzione globale nella sintesi del mRNA è stata indicata per essere compensata da una diminuzione simultanea nella degradazione di mRNA per ripristinare i livelli normali di stato stazionario. Quindi, la quantificazione del genoma di sintesi di mRNA, indipendentemente dalla degradazione del mRNA, è il miglior riflesso diretto dell'attività trascrizionale di RNA polimerasi II. Discutiamo qui, un metodo che utilizza non perturbante metabolica etichettatura degli RNA nascente in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). In particolare, le cellule sono coltivate per 6 min con un uracile analogico, 4-tiouracile e il RNAs recentemente trascritto con etichettato è purificato e quantificato per determinare i tassi di sintesi di tutti i singoli mRNA. Inoltre, utilizzando etichettati Schizosaccharomyces pombe cellule come standard interno permette di confrontare la sintesi di mRNA in diversi S. cerevisiae ceppi. Usando questo protocollo e montaggio i dati con un modello cinetico dinamico, i corrispondenti tassi di decadimento di mRNA possono essere determinati.

Introduction

Le cellule rispondono a stimoli endogeni ed esogeni, attraverso l'alterazione dinamica del loro programma di espressione genica. Negli ultimi anni, un enorme sviluppo di metodologie di genoma permette la descrizione precisa e completa delle modifiche del trascrittoma in condizioni diverse. Nella maggior parte degli studi di transcrittomica, sequenziamento di ibridazione o ad alta velocità di microarray vengono utilizzati per quantificare i livelli di RNA da una frazione di RNA totale allo steady-state. Modifiche trascrizionali sotto una perturbazione specifica possono visualizzare una vasta gamma di risultati possibili, con un ampio spettro di geni essere up - o downregulated o cambiamenti di espressione genica specifica. Espressione genica è il risultato di un equilibrio fine-tuned — o allo steady-state — tra sintesi di RNA da RNA polimerasi e altri processi che interessano i livelli del RNA. Trascrizione di RNA polimerasi II, tra cui le tre fasi distinte (iniziazione, allungamento e terminazione), è altamente e intrinsecamente connesso all'elaborazione mRNA, esportazione citoplasmico, traduzione e degradazione.

Parecchi studi recenti hanno dimostrato che il decadimento e la sintesi di mRNA sono accoppiati meccanismi e ha mostrato che trascrizionali effetti al momento della mutazione o sotto stimoli possono essere trascurati nel quantificare il RNA totale allo steady-state. In primo luogo, il rilevamento delle modifiche trascrizionale attraverso l'analisi dei livelli allo stato stazionario di mRNA sempre dipende dal mRNA Half-Life. Una volta che la perturbazione è stato introdotto, i livelli allo stato stazionario di mRNA con emivita lunga ne risentirà molto meno rispetto a quelli dei mRNAs con breve emivita. Di conseguenza, la rilevabilità dei cambiamenti nella sintesi del RNA è fortemente sbilanciata in favore di trascrizioni di breve durate, mentre l'analisi di specie più longevo di mRNA potrebbe non riuscire a rivelare i cambiamenti dinamici nel tasso di trascrizione. In secondo luogo, diversi studi hanno dimostrato che, sia nel lievito e mammiferi, cambiamenti globali nella trascrizione potrebbero essere trascurati quando si analizzano i livelli allo stato stazionario di mRNA. Ciò è probabilmente dovuto i meccanismi che collegano mRNA sintesi e degradazione conseguente mRNA buffering. Questo ha spinto lo sviluppo di nuovi protocolli per quantificare la sintesi di mRNA disinserita dal degrado, attraverso l'analisi del mRNA appena trascritto. Negli ultimi anni, sono state presentate diverse alternative, tra cui sequenziamento eseguire-sulle globale (GRO-seq)1e trascrizione di allungamento nativo sequenziamento (NET-seq)2,3. Qui, presentiamo un protocollo sviluppato inizialmente in cellule di mammifero4,5,6 e poi adattato al lievito7,8,9,10, 11, che si basa sul RNA etichettatura con un chitosani nucleosidici o base analogica, 4-thiouridine (4sU) o 4-tiouracile (4tU), rispettivamente.

Questo metodo in particolare purifica recentemente trascritto RNA dalle cellule nel quale RNA sono impulsi-etichettati con 4sU pressoché senza interferenze nell'omeostasi cellulare. Quindi, una volta che le cellule sono esposte alle 4sU, la molecola è rapidamente uptaken, fosforilato a 4sU-trifosfato e incorporata nel RNA viene trascritto. Una volta impulso-etichetta, è possibile estrarre RNA cellulare totale (corrispondenti ai livelli allo stato stazionario di RNA), e, successivamente, la frazione di RNA 4sU-labeled è tiolo-specificamente modificato, portando alla formazione di un legame disolfuro tra biotina e la recentemente trascritto RNA4,5. Tuttavia, 4sU può solo essere uptaken dalle cellule che esprimono un trasportatore nucleosidico, come il trasportatore umano dei nucleosidi (hENT1), impedendo l'uso immediato in lievito germogliante o fissione. Mentre si potrebbe esprimere hENT1 in S. pombe o S. cerevisiae, un approccio più semplice può essere raggiunto utilizzando la 4tU base modificate, poiché le cellule di lievito possono prendere 4tU, senza la necessità di espressione di un nucleoside transporter10, 11 , 12 , 13. infatti, il metabolismo di 4tU richiede l'attività dell'enzima uracile fosforibosiltransferasi (UPRT). In diversi organismi, tra cui il lievito ma non mammiferi, UPRT è essenziale per una via di salvataggio delle pirimidine, uracile a uridina monofosfato di riciclaggio.

Un bias importante negli studi di trascrittomica può essere introdotto tramite la normalizzazione tra diversi campioni analizzati in parallelo. Infatti, molti fattori di deviazione possono influenzare l'analisi comparativa del trascrittoma del mutante e del selvaggio-tipo ceppi: l'efficienza di lisi cellulare, differenze di estrazione e recupero di RNA e di variazioni nella calibrazione dello scanner per microarray analisi , tra gli altri. Come discusso in precedenza, tali variazioni possono essere particolarmente ingannevole quando si prevedono effetti globali sulla trascrizione del RNA polimerasi II. Un mezzo elegante da comparare con precisione i tassi di sintesi di mRNA tra diversi campioni è stato progettato utilizzando il lievito di fissione lontanamente correlate Schizosaccharomyces pombe come standard interno. Per questo, un numero fisso di etichettato S. pombe celle viene aggiunto ai campioni S. cerevisiae , cellule wild type o mutanti, prima della lisi cellulare e RNA estrazione10. Successivamente, RNA sia stazionario e recentemente sintetizzato da S. pombe e S. cerevisiae è quantificati mediante RT-qPCR o tramite l'uso di chip di microarray o sequenziamento ad alta velocità10. Combinando questi dati con la modellistica cinetica, assoluti tassi di sintesi di mRNA e di decadimento in lievito possono essere misurati.

Nel quadro di questo manoscritto, vi mostreremo come l'analisi di RNA trascritto recentemente permesso di rivelare un ruolo globale per i complessi di coactivator SAGA e TFIID nella trascrizione del RNA polimerasi II nel germogliamento lievito14,15, 16. D'importanza, gli studi passati quantificati i livelli di mRNA di stato stazionario in S. cerevisiae e suggerito che SAGA svolge una funzione predominante su un insieme limitato di geni di lievito che sono fortemente interessati dalle mutazioni nella SAGA, ma relativamente resistente agli TFIID le mutazioni17,18,19. Sorprendentemente, l'attività enzimatica di SAGA sono stati indicati per agire sul genoma intero trascritto, suggerendo un ruolo più ampio per questo co-attivatore di trascrizione del RNA polimerasi II. In diminuzione assunzione di II della polimerasi RNA in geni espressi in più è stata osservata dopo l'inattivazione della SAGA o TFIID, suggerendo che questi coattivatori lavorano insieme alla maggior parte dei geni. Quindi, la quantificazione degli mRNA appena trascritto ha rivelato che sono richiesti per la trascrizione di quasi tutti i geni di RNA polimerasi II14,15,16SAGA e TFIID. L'implementazione di meccanismi di compensazione emerge come un modo per le celle ad affrontare una globale diminuzione nella sintesi di mRNA che è tamponata da una simultanea diminuzione globale nella degradazione di mRNA. La SAGA aggiunge all'elenco di elementi che hanno un effetto globale sulla trascrizione del RNA polimerasi II, ad esempio RNA Pol II subunità10, il Mediatore coactivator complesso20, il generale trascrizione fattore TFIIH21,22 e indirettamente, elementi del mRNA degradazione macchine9,10,23. Tali eventi compensativi universalmente sono stati osservati nei mutanti di SAGA, contabilità per il modeste e limitate le modifiche nei livelli di mRNA di stazionario nonostante una diminuzione globale e severa nel mRNA sintesi14. Simili analisi sono state eseguite anche in un ceppo di eliminazione BRE1 , con conseguente perdita completa dell'istone H2B ubiquitinazione. Interessante, un molto più lieve ma costante globale effetto sulla trascrizione del RNA polimerasi II potrebbe essere rilevato in assenza di Bre1, che indica che etichettatura metabolica di RNA recentemente trascritto nel lievito può rilevare e quantificare una vasta gamma di cambiamenti in mRNA tassi di sintesi.

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Protocol

1. cellula coltura e lo svuotamento di rapamicina di una subunità SAGA

  1. Per ogni ceppo di S. cerevisiae e replicare, tra cui wild type o ceppi di controllo, inoculare una singola Colonia da una piastra fresca al 5 mL di terreno YPD (2% Peptone, Estratto di lievito 1% e 2% di glucosio).
  2. Crescere le cellule di S. cerevisiae durante la notte a 30 ° C con agitazione costante (150 rpm).
  3. Misurare la densità ottica a 600 nm (OD600) e diluire la cultura a un OD600 di circa 0,1 in 100 mL di mezzo YPD e far crescere fino a quando il OD600 è intorno a 0,8.
  4. In parallelo, inoculare una singola Colonia delle cellule di S. pombe da un piatto fresco in 50 mL di mezzo di sì (0,5% di Estratto di lievito; 250 mg/L dell'adenina, istidina, uracile, leucina e lisina; 3% glucosio) e far crescere le cellule durante la notte a 32 ° C con agitazione costante (150 giri/min).
  5. Misurare il OD600 della cultura durante la notte di S. pombe e diluire la cultura a un OD600 di circa 0,1 a 500 mL di mezzo di sì e lasciarlo crescere fino a quando il OD600 è circa 0.8.
  6. Per ogni S. cerevisiae ceppo di ancoraggio-away e replicare, tra cui wild type o ceppi di controllo, inoculare una singola Colonia da una piastra fresca al 5 mL di terreno YPD (2% Peptone, Estratto di lievito 1% e 2% di glucosio).
  7. Crescere le cellule durante la notte a 30 ° C con agitazione costante (150 rpm).
  8. La mattina successiva, misurare il OD600, diluire la cultura a un OD600 di circa 0,1 in 100 mL di mezzo YPD e lasciarlo crescere fino al OD600≈ 0,8.
  9. Aggiungere 100 µ l di rapamicina alla cultura da una soluzione madre di 1 mg/mL (concentrazione finale rapamicina di 1 µ g/mL) e lasciare che le celle Incubare a 30 ° C con agitazione costante per il tempo necessario per la proteina di interesse ad essere condizionalmente esaurito dal nucleo ( di solito, 30 min è adeguato). Per il controllo, usare una coltura di lievito simile, ma invece di aggiungere rapamicina, aggiungere il volume equivalente di solfossido dimetilico (DMSO).

2. 4tU etichettatura con S. pombe come Spike-in (conteggio)

  1. Preparare una soluzione fresca di 2 M. 4-tiouracile. Una volta preparato, tenerlo a temperatura ambiente e lontano dalla luce.
    1. Con precisione pesare 64,1 mg di 4-tiouracile per ogni cultura di S. cerevisiae e scioglierla in 250 µ l di dimetilformammide (DMF) o in 250 µ l di DMSO.
    2. Per la cultura di S. pombe essere utilizzato come spike-a, pesa 320,5 mg di 4-tiouracile e dissolverlo in 1.250 µ l di DMSO.
  2. Aggiungere la soluzione di 4-tiouracile in S. cerevisiae e S. pombe culture per una concentrazione finale di 5 mM e li Incubare per 6 min con agitazione costante a 30 ° C e 32 ° C, rispettivamente.
  3. Dopo 6 min, rimuovere una piccola aliquota di ogni cultura per conta cellulare. Contare le celle utilizzando un contatore di cellule automatica o di una camera di Neubauer.
  4. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione (2.500 x g) per 5 min a 4 ° C.
  5. Eliminare il supernatante, lavare le cellule con PBS 1X ghiacciata e centrifugare nuovamente (2.500 x g, 4 ° C, 5 min).
  6. Calcolare il numero totale di cellule in tutti gli esempi di S. cerevisiae e S. pombe .
  7. Risospendere le cellule in 5 mL di PBS 1X ghiacciata e mescolare S. cerevisiae con S. pombe le cellule con un rapporto 3:1.
  8. Centrifugare le cellule (2.500 x g, 4 ° C, 5 min), rimuovere il PBS, flash-congelare le cellule nel liquido N2e conservare il campione a-80 ° C fino all'utilizzo ulteriore.

3. RNA estrazione e trattamento della dnasi

  1. Scongelare le cellule sul ghiaccio per circa 20 – 30 min.
  2. Procedere con l'estrazione di RNA utilizzando un kit di estrazione di lievito-RNA (Tabella materiali) con alcuni adattamenti.
  3. Per ogni campione, versate 750 µ l di microsfere di zirconio ghiacciate in una provetta da 1,5 mL tappo a vite fornita nel kit. Tieni presente che per ogni tubo, RNA da fino a 109 celle può essere estratta in modo efficiente. Quindi, preparare il numero di provette necessarie per ciascun campione. Ad esempio, una cultura di S. cerevisiae di 100 mL (OD600≈ 0,8) può rendere circa 2 x 109 a 3 x 109 celle, che conduce fino a un totale di 2,7 x 109 a 4 x 109 celle in totale (dopo il picco-in un terzo della S. pombe cellule). In questo caso, fino a 3-4 provette di reazione per ogni campione/condizione/mutante/replica sarebbe necessaria.
  4. Per ogni 1 x 109 celle, aggiungere 480 µ l di tampone di lisi fornito con il kit, 48 µ l di 10% SDS e 480 µ l di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25:24:1, v/v/v).
  5. Mescolare le celle utilizzando un miscelatore vortex e trasferirli ai tubi contenenti le microsfere di zirconio ghiacciate.
  6. Ospitare i tubi su un adattatore per miscelatore vortex, girare il vortice alla massima velocità e battere per 10 min a lisare le cellule di lievito (in una camera a 4 ° C). In alternativa, eseguire la lisi delle cellule in un branello-frullino automatico.
  7. Centrifugare le provette a 16.000 x g per 5 min a temperatura ambiente e raccogliere con cura la fase superiore (fase contenente RNA) di un tubo falcon fresco 15ml. In genere, il volume recuperato per ogni tubo è di circa 500 – 600 µ l.
  8. Per i tubi di 15 mL contenente il RNA parzialmente purificato, aggiungere il buffer di associazione fornito con il kit e mescolare accuratamente. Per ogni 100 µ l di soluzione di RNA, aggiungere 350 µ l di tampone di associazione (cioè, quando il volume della fase acquosa soluzione è 600 µ l, 2,1 mL di buffer di associazione deve essere aggiunto).
  9. Al composto precedente, aggiungere il 100% di etanolo e mescolare accuratamente. Per ogni 100 µ l di soluzione di RNA, aggiungere 235 µ l di etanolo al 100% (cioè, quando il volume della fase acquosa soluzione è 600 µ l, aggiungere 1,41 mL di etanolo).
  10. Applicare fino a 700 µ l della miscela dal passaggio 3.9 di una cartuccia di filtro montato in un tubo di raccolta, entrambi forniti con il kit.
  11. Centrifugare per 1 min a 16.000 x g. Se la durata di centrifugazione non era abbastanza per il volume totale di passare attraverso il filtro, ripetere la centrifugazione per 30 s.
  12. Scartare il flusso continuo e riutilizzare lo stesso tubo di raccolta. Aggiungere un altro 700 µ l di soluzione di RNA-binding buffer-etanolo al filtro e centrifugare nuovamente a 16.000 x g per 1 min.
  13. Scartare il flusso continuo e ripetere i passaggi 3.11 e 3.12 fino a quando la soluzione di RNA è finita.
  14. Lavare il filtro 2 x con 700 µ l di soluzione 1 di lavaggio. Raccogliere il lavaggio soluzione tramite centrifugazione a 16.000 x g per 1 min e tenere sempre il tubo di raccolta.
  15. Lavare il filtro 2 x con 500 µ l di soluzione 2 di lavaggio. Raccogliere il lavaggio soluzione tramite centrifugazione a 16.000 x g per 1 min e tenere sempre il tubo di raccolta.
  16. Centrifugare le provette ancora una volta a 16.000 x g per 1 min asciugare completamente il filtro.
  17. Trasferire la cartuccia filtrante nella provetta di raccolta finale (RNA-del caso tubo) ed eluire RNA con 50 µ l di DEPC-trattati, privo di RNasi H2O (preriscaldato a 100 ° C).
  18. Centrifugare per 1 min a 16.000 x g.
  19. Eluire RNA nuovamente (per lo stesso tubo) con 50 µ l di preriscaldato DEPC-trattati, privo di RNasi H2O. Assicurarsi che tutto il volume è passata attraverso il filtro; in caso contrario, centrifugare per periodi più lunghi.
  20. Se vengono utilizzati tubi multipli per un singolo campione, piscina li tutti in una provetta.
  21. Quantificare e controllare la purezza del campione utilizzando le attrezzature adeguate.
    Nota: Mentre 4tU solo è incorporato all'interno di nuova sintesi RNA, c'è una possibilità di minore contaminazione con il DNA. Per questo motivo, si consiglia sempre di trattare i campioni con dnasi I. Per questo, usare i reagenti forniti con il kit di estrazione di RNA (Tabella materiali) seguendo le raccomandazioni del produttore.

4. specifiche del tiolo Biotinylation di nuova sintesi RNA

  1. Regolare la concentrazione di RNA ottenuta con la sezione 3 del protocollo a 2 mg/mL. Aliquotare 200 µ g di RNA totale, riscaldare per 10 minuti a 60 ° C e immediatamente si chill sul ghiaccio per 2 min.
  2. L'aliquota di RNA, aggiungere i reagenti di seguito indicati nel seguente ordine: 600 µ l di DEPC-trattati, RNAsi-libera H2O, 100 µ l di tampone di biotinilazione (100 mM Tris-HCl [pH 7.5] e 10 mM EDTA, di DEPC-trattati, privo di RNasi H2O) e 200 µ l di biotina-HPDP da uno stock di 1mg/mL biotina-HPDP in DMSO o DMF.
    1. In alcune situazioni, la soluzione di biotina-HPDP tende a precipitare, probabilmente a causa della sua bassa solubilità in acqua. In questa situazione, aumentare il volume di DMSO/DMF fino al 40% del volume di reazione (per il campione di RNA, aggiungere 400 µ l di DEPC-trattati H2O, 100 µ l di tampone di biotinilazione e 400 µ l di biotina-HPDP da uno stock di 0,5 mg/mL).
  3. Incubare il campione a temperatura ambiente e al riparo dalla luce per 3 h, con agitazione delicata.
  4. Dopo l'incubazione, aggiungere un volume circa uguale di cloroformio ai tubi e mescolare energicamente.
  5. Girare il campione a 13.000 x g per 5 min a 4 ° C. Questo passaggio permette la rimozione di biotina in eccesso che ha fatto non biotinylate il RNA. In alternativa, eseguire questo passaggio utilizzando tubi di aggancio di fase (pesante). Per questo, spin giù i tubi di aggancio di fase per 1 min a 13.000 x g, aggiungere la miscela di RNA e una pari quantità di cloroformio, mescolare vigorosamente e li Centrifugare a 13.000 x g per 5 min a 4 ° C.
  6. Trasferire con cautela la fase superiore in nuove provette 2 mL.
  7. Aggiungere un decimo del volume di 5 M di NaCl e mescolare il campione.
  8. Aggiungere un uguale volume di isopropanolo, mescolare accuratamente il campione e girarla a 13.000 x g per almeno 30 min, a 4 ° C.
  9. Con cautela, rimuovere il supernatante e aggiungere 1 mL di etanolo di 75% ghiacciata.
  10. Spin a 13.000 x g per 10 min a 4 ° C.
  11. Con attenzione rimuovere il surnatante, rapido-rotazione del tubo e rimuovere la soluzione di etanolo rimanente. Assicurarsi che la pallina del RNA non secca.
  12. Sospendere il RNA in 100 µ l di DEPC-trattati, privo di RNasi H2O.

5. la purificazione della frazione recentemente sintetizzata da RNA totale e senza etichetta utilizzando biglie magnetiche rivestite con streptavidina

  1. il RNA biotinilato per 10 min a 65 ° C di calore e poi raffreddare i campioni su ghiaccio per 5 min.
  2. Aggiungere 100 µ l di biglie magnetiche rivestite con streptavidina biotinilati RNA (ad un volume finale di 200 µ l). In particolare, è consigliabile utilizzare le perline indicate nella Tabella materiali, dal momento che, dopo le conversazioni con altri laboratori, questi sembrava di essere più coerente e affidabile.
  3. Incubare il campione con lieve agitazione per 90 minuti, a temperatura ambiente.
  4. Posizionare le colonne fornite con il kit (Tabella materiali) nel supporto magnetico.
  5. Aggiungere 900 µ l di tampone di lavaggio temperatura (100 mM Tris-HCl [pH 7.5], 10 mM EDTA, 1 M di NaCl e 0,1% Tween 20, trattata DEPC, privo di RNasi H2O) per le colonne (pre-corsa ed equilibrare).
  6. Applicare perline/RNA miscela (200 µ l) per le colonne.
  7. Raccogliere il flusso continuo in provette da 1,5 mL e applicarlo nuovamente alla stessa colonna magnetica. Se necessario, tenere questo flusso continuo come esso rappresenta la frazione di RNA senza etichetta.
  8. Lavare le colonne 5 x con volumi crescenti di tampone di lavaggio (600, 700, 800, 900 e 1000 µ l).
  9. Eluire il RNA recentemente sintetizzato con 200 µ l di 0,1 M DTT.
  10. Eseguire una seconda eluizione, 3 minuti più tardi, con un volume uguale di 0,1 M DTT.
  11. Dopo l'eluizione del RNA, aggiungere 0,1 volumi di 3 M NaOAc (pH 5.2), 3 volumi di etanolo 100% ghiacciata e 2 µ l di glicogeno 20 mg/mL (RNA-grado) e lasciare il pernottamento precipitato di RNA, a-20 ° C.
  12. Recuperare il RNA mediante centrifugazione (13.000 x g per 10 min a 4 ° C) ed e risospendere in 15 µ l di DEPC-trattati, privo di RNasi H20. La proporzione di RNA totale con l'etichetta dovrebbe essere circa 2% - 4% (solitamente più verso l'estremità inferiore), rendering di circa 2,0 µ g di RNA di nuova sintesi. Questa quantità è sufficiente per fare diversi esperimenti di qPCR, nonché per le analisi di microarray/sequenziamento.

6. RT-qPCR convalida delle diverse frazioni

  1. Sintetizzare cDNA da 2 µ g di RNA totale o 10 µ l di RNA con etichettato utilizzando esameri casuali e la trascrittasi inversa di scelta, secondo le istruzioni del produttore (Tabella materiali).
  2. Amplificare il cDNA di qPCR in tempo reale utilizzando un protocollo standard (Tabella materiali).
    Nota: Tutti i campioni devono essere eseguiti in triplice copia da un minimo di due replicati biologici. Correggere tutti i valori non elaborati per l'espressione di S. pombe tubulina.

7. ibridazione di Microarray

  1. Ibridare campioni di RNA sui chip di microarray preferito secondo le istruzioni del produttore (per questo protocollo specifico, vedere Tabella materiali). Brevemente, preparare biotinilati cRNA obiettivi da 150 ng di RNA usando il Kit di amplificazione del RNA di Premier (Tabella materiali), secondo le istruzioni del produttore. Ibridare 4 mg di cRNAs frammentato per 16 h a 45 ° C e 60 rpm su chip di microarray.
  2. Lavare, macchia e la scansione i chip utilizzando lo scanner (Tabella materiali) e la stazione indicata. Estrarre i dati grezzi (file CEL intensità) dalle immagini acquisite utilizzando la console di comando (AGCC, versione 4.1.2).
  3. Elaborare ulteriormente i file CEL con versione software espressione Console 1.4.1 per calcolare sonda impostata l'intensità del segnale, utilizzando gli algoritmi basati su statistiche MAS 5.0 con le impostazioni predefinite e scala globale come metodo di normalizzazione.
    Nota: L'intensità di profilati target medio di ogni chip arbitrariamente è stato impostato su 100. Eseguire tutti gli esperimenti utilizzando almeno due replicati biologici indipendenti. Normalizzare i dati grezzi per il segnale di S. pombe e calcolare piega i cambiamenti nei livelli di RNA totali e recentemente sintetizzati.

8. analisi dei dati utilizzando una tubazione esistente R

  1. Calcolare la sintesi e il decadimento tariffe utilizzando una pipeline e R/Bioconductor pacchetto pubblicamente disponibile, come descritto in precedenza8,10.

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Representative Results

Quando si esegue etichettatura metabolica di RNA appena trascritto, diversi aspetti devono essere controllati: il tempo e l'efficienza dell'etichettatura, la proporzione di spike-a, il protocollo di estrazione e l'efficacia di biotinilazione (compreso signal-to-noise ratio), tra gli altri. Queste condizioni sono stati ampiamente e metodicamente indicate da altri7,10,11. Qui ci concentriamo principalmente sull'interpretazione e l'analisi immediate che possono essere eseguite una volta che i campioni sono stati trattati, mediante RT-qPCR, microarray o sequenziamento. Le analisi di differenti ceppi mutanti dimostrano il potere del metodo di rilevare non solo una diminuzione globale drammatica nella sintesi di mRNA, come nel caso del mutante SAGA S. cerevisiae ceppi, ma anche una molto lieve riduzione di attività di RNA polimerasi II sopra soppressione dell'istone H2B monoubiquitination.

Le nostre analisi delle attività enzimatiche SAGA ha suggerito un ampio reclutamento di cromatina15, che non è stato rivelato dall'analisi dei livelli di mRNA di stato stazionario in ceppi mutanti di SAGA. Come assunzione di RNA polimerasi II è stata alterata all'inattivazione di SAGA, abbiamo deciso di analizzare se ne risentirebbe a livello globale tassi di sintesi di mRNA. Quindi, wild-type o mutanti ceppi di S. cerevisiae sono stati esposti a 4tU per un periodo di 6 min, etichettare recentemente trascritto RNAs. Dopo la miscelazione con le spike-in etichettati cellule (S. pombe) in una proporzione di 3:1, RNA totale è stato estratto, e recentemente sintetizzato RNA è stato biotinilato e purificato secondo il protocollo presentato qui, come nel Cronogramma illustrato nella Figura 1. Con etichetta RNAs sono stati purificati da un totale di 200 µ g di RNA, assicurando che la quantità di prodotto purificato sarebbe sufficiente per qualsiasi applicazione a valle. Come un passo iniziale e sistematico prima di qualsiasi analisi del genoma, recentemente sintetizzato purificazione di RNA è stato convalidato da RT-qPCR. Geni sono stati selezionati secondo diversi parametri, tra cui un livello di espressione, vie regolarici e una dipendenza da differenti RNA polimerasi.

Per confermare che questo protocollo purifica specificamente identificato RNA, abbiamo quantificato i livelli dei trascritti in frazioni purificate dal selvaggio-tipo celle che sono state coltivate con o senza 4tU. Livelli di fondo trascurabile degli RNA analizzati sono stati rilevati dalle cellule che non sono stati esposti a 4tU (Figura 2A). Purificazione di RNA recentemente trascritto ulteriormente è stata convalidata dall'arricchimento osservato dell'introne-contenente ACT1 pre-mRNA (dati non mostrati). Dopo la convalida della qualità dei campioni, abbiamo provato se ne risentirebbe sintesi mRNA dopo l'eliminazione di SPT20, che è noto per disturbare l'assemblaggio del complesso di SAGA. Come riportato da altri utenti, quantificazione di mRNA eseguita sul RNA totale (stazionario) dal ceppo Δ di spt20hanno rivelato livelli per lo più invariati o leggermente ridotti per i geni analizzati (Figura 2B). Risultati simili sono stati ottenuti per ceppi cancellati per BRE1 (Figura 2B). Al contrario, l'analisi di RNA recentemente trascritto dal ceppo Δ di spt20ha rivelato una diminuzione drammatica nella sintesi di mRNA da tre-testati a cinque volte per tutti i geni (Figura 2C). La perdita di Bre1 hanno portato a una diminuzione più discreta ma ancora visibile nei livelli di mRNA recentemente sintetizzato per i geni studiati (Figura 2C). In buon accordo con un ruolo di SAGA e Bre1 nella trascrizione del RNA polimerasi II, la perdita di Spt20 o Bre1 non ha influenzato l'espressione dei geni RDN25 o snR6 , trascritti dalla RNA polimerasi I e RNA polimerasi III, rispettivamente ( Figura 2C).

Tuttavia, ceppi eliminati per le unità strutturali secondarie della SAGA complessa, come SPT7 o SPT20, visualizzano gravi fenotipi di crescita lenta che possono rappresentare per le alterazioni osservate trascrizionale. Per escludere gli effetti secondari indesiderati, che abbiamo impoverito condizionalmente Spt7 dal nucleo, mediante ancoraggio-via s. cerevisiae ceppi14,24. Dopo 60 min di trattamento rapamicina, prima l'impulso-etichettatura con 4tU (vedere la Figura 1 per una rappresentazione schematica), recentemente trascritto i livelli di mRNA sono stati ridotti in misura analoga a quella osservata nel ceppo di eliminazione (Figura 2D e 2E ). Questa analisi, dunque, ha confermato i nostri risultati ex e convalidato il protocollo per questo sistema di svuotamento inducibile. In un'analisi di tempo-corso, dove le cellule sono state esposte alla rapamicina per un tempo che va da 0 a 240 min, ridotta espressione è stata provata immediatamente dopo 15 min di esposizione al farmaco. Più interessante, i livelli di mRNA di stazionario tendevano a diminuire inizialmente ma rinviato ai livelli normali dopo 60 min, un'indicazione che un meccanismo compensativo si svolge nel frattempo (Figura 2E).

Complessivamente, l'etichettatura e la quantificazione di RNA recentemente sintetizzato permesso rivelare nuovi ruoli normativi per il complesso SAGA. Il protocollo descritto potrebbe anche rivelare moderare gli effetti su attività di RNA polimerasi II ed è stata con successo applicata al condizionale svuotamento ceppi di lievito.

Una delle applicazioni a valle per la nuova sintesi RNA purificato è una quantificazione del genoma delle trascrizioni usando l'ibridazione del microarray o sequenziamento (4tU-seq). Mentre il sequenziamento ad alte prestazioni è più quantitativa, sensibili e informativo, ibridazione di microarray può essere molto utile per determinare se i livelli di mRNA globale sono alterati. In questo contesto in cui la normalizzazione è fondamentale, abbiamo aggiunto un organismo spike-in per il campione che abbiamo mirato ad analizzare. In particolare, abbiamo mescolato S. cerevisiae e le celle di S. pombe in un rapporto di 3:1, entrambi precedentemente esposti a 4tU. Quando i RNA purificati, con etichettati sono sottoposti a sequenziamento ad alte prestazioni, qualsiasi protocollo di preparazione libreria standard può essere utilizzato, più spesso a seguito di svuotamento di RNA ribosomiale. Normalizzazione tra 4tU-seq dati provenienti da diversi campioni è stata eseguita aggiungendo sia etichettato RNA da una specie diversa(ad esempio, miscelazione s. cerevisiae e s. pombe le celle come sopra)22 o in vitro- trascritto, chitosani spike-in RNA12,25,26,27. Chip di microarray disponibili in commercio contengono sonde per l'intero trascrittoma di lievito germogliante e la fissione nucleare, che permette la quantificazione di mRNA da entrambi gli organismi in un singolo esperimento. Ibridazioni di microarray sono state realizzate con RNA totale e recentemente sintetizzato convalidato dal RT-qPCR come indicato sopra (wild-type, spt20Δ e bre1Δ). Inoltre, abbiamo incluso un ceppo che non supporta monoubiquitination dell'istone H2B, attraverso la mutazione di punto del residuo ubiquitinable (K123R). Perché la stessa proporzione esatta delle cellule di s. pombe sono stati utilizzati in diversi campioni e replicati, è possibile scalare linearmente le matrici intensità in modo che il totale e con etichetta S. pombe sonde hanno la stessa intensità mediana. Questa normalizzazione o ridimensionamento, può essere eseguito utilizzando un pacchetto di Bioconductor sviluppato dal laboratorio di Patrick Cramer ed è utilizzato in parallelo in tutti i campioni analizzati, totali ed etichettato frazioni e wild-type e mutanti ceppi8. Brevemente, l'input di questo oleodotto è un file di Excel contenente le sonde e la loro intensità (MAS5 o RMA) per tutti i campioni e le frazioni. Dopo aver escluso le sonde che sono compresi nell'intervallo di rilevamento, l'intensità del segnale è rescaled, prendendo in considerazione i valori di intensità delle sonde S. pombe . Infine, è possibile mappare le sonde per il germogliamento e genomi di lievito di fissione, terminando con una matrice contenente i valori di espressione normalizzati per lo spike-in. Questi valori possono essere ulteriormente elaborati (Vedi sezione successiva) o utilizzato così com'è. Nell'esempio seguente, abbiamo determinato di che modifica la piega di ogni trascrizione tra il mutante e il ceppo selvaggio-tipo.

Le analisi sono state eseguite per entrambi allo steady-state o recentemente sintetizzato i livelli di RNA e tramato contro loro significatività statistica (p-valore) (Figura 3). In accordo con altri studi, quando i livelli di RNA totale sono stati analizzati, solo poche geni aveva loro espressione alterata, up - o downregulated (Figura 3A-3 C). Tuttavia, l'analisi del RNA trascritto recentemente ha portato a conclusioni sorprendentemente diverse. I livelli di mRNA appena trascritto di più di 4.000 geni sono stati ridotti significativamente di almeno duplice dopo l'eliminazione di SPT20, suggerendo un effetto positivo globale della SAGA sulla trascrizione del RNA polimerasi II in lieviti germoglianti (Figura 3D ). Inoltre, nel bre1Δ e K123R mutanti, i risultati sono stati più discreti: maggior parte dei geni sono sembrato avere loro espressione ridotta, ma l'entità della downregulation e il numero di geni significativamente colpite (≈ 300-500) era infatti più limitata (Figura 3E e 3F).

Come precedentemente accennati, stazionario o totali i livelli di mRNA sono dettati dal stretto equilibrio tra sintesi e decadimento (Figura 4A). Quando la trascrizione del RNA polimerasi II è alterata a livello globale, possono essere dipinto due scenari: (i) o il mRNA totale livelli diminuiscono a livello mondiale, come risposta alla ridotta sintesi ma costante decadimento, o degradazione (ii) mRNA è diminuito nella stessa misura, risultante in gran parte invariato allo steady-state i livelli del mRNA. Il secondo scenario è stato segnalato per parecchi termini, compreso nel contesto della SAGA o TFIID rottura9,10,14,16,22. Una procedura chiamata dinamico comparativo transcriptome analisi (DDAT) basato su 4tU etichettatura e modellazione cinetica dinamica permette di determinare la sintesi di mRNA e dedurre i tassi di decadimento per ogni trascrizione8,10. Ancora una volta, abbiamo approfittato dei dati raccolti per i ceppi menzionati in precedenza (wild-type, spt20Δ, bre1Δ e K123R). Come previsto, dopo l'eliminazione di SPT20, abbiamo osservato una diminuzione simultanea nel mRNA tassi di sintesi e degradazione rispetto al ceppo selvaggio-tipo. In questo ceppo mutante, la compensazione era quasi ottima, con una media diminuire nella sintesi di 3,8 e una media diminuire nel decadimento del 4.1-fold (Figura 4B), che confermano perche ' potrebbero essere solo limitate modifiche trascrizionali rilevato sui livelli di mRNA totale (Figura 3A). In due altri ceppi mutanti (bre1Δ e K123R), inoltre sono stati osservati cambiamenti concomitante nella sintesi di mRNA e decadimento, ma i cambiamenti erano su una scala molto più piccola e più dispersa (Figura 4 e 4D).

Figure 1
Figura 1 : Rappresentazione schematica dell'etichettatura metabolica del RNA usando 4tU. 4tU preparata al momento viene aggiunto al terreno di coltura e le cellule sono etichettate per 6 min. con l'etichetta S. cerevisiae e S. pombe cellule sono mescolate in un rapporto di 3:1 e viene estratto il RNA totale. In seguito, appena sintetizzato RNA è biotinilato e può essere purificato mediante biglie magnetiche rivestite con streptavidina. Infine, totale (stazionario) RNA ed etichettati recentemente sintetizzato RNA può essere utilizzato in una varietà di applicazioni a valle, compreso l'ibridazione RT-qPCR e microarray o sequenziamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Analisi raffigurante modifiche trascrizionali in entrambi allo steady-state e recentemente trascritto RNA determinato dalla RT-qPCR. (A), RNA livelli di cinque geni differenti sono stati quantificati dalla frazione con etichetta RNA purificata da cellule wild-type che sono stati esposti sia o non 4tU. I prossimi due pannelli Visualizza totale (B) e (C) recentemente sintetizzato quantificazione di RNA da RT-qPCR per wild-type (WT), spt20Δ e cellule di lievito Δ bre1. Spt7 ancoraggio-via ceppi, non trattati o trattati con rapamicina per 60 min, sono stati etichettati con 4tU, e totale (D) o (E) recentemente trascritto RNA è stato quantificato dal RT-qPCR. (F) questo pannello mostra che l'analisi di tempo-corso dei cambiamenti in stato stazionario e recentemente sintetizzato mRNA all'impoverimento nucleare Spt7. Per tutti i campioni, i livelli di mRNA per cinque geni del RNA polimerasi II sono stati quantificati da RT-qPCR. RNA polimerasi I e geni del RNA polimerasi III (RDN25 e snR6, rispettivamente) sono stati usati come controllo. I valori dell'espressione (media ± SD di tre esperimenti indipendenti) sono stati normalizzati per la a spillo-in S. pombe segnale e impostato su 1 nel campione di controllo. Pannelli D-F sono stati modificati da Baptista et al. 14. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Analisi del genoma dei livelli di mRNA usando frazioni di RNA totale o etichettate. Questi pannelli mostrano vulcano trame visualizzando piega cambiamenti nei livelli di mRNA di stato stazionario (A-C) o (D-F) recentemente sintetizzato i livelli del mRNA rispetto al loro significato (p-valore). Le modifiche di piega (FC) sono state calcolate come log2 del rapporto tra il valore dell'espressione di ciascun gene dopo la normalizzazione del segnale S. pombe in Δ di spt20(A e D), Δ bre1(B ed E) o ( C e F) K123R ceppo contro il valore dell'espressione del gene stesso nel selvaggio-tipo S. cerevisiae. Un totale di 5.385 geni sono stati analizzati, e modificare le soglie di duplice (puntino blu: più di un duplice diminuire; giallo punti: più che un aumento duplice) e 0,05 p-valori sono stati considerati. Pannelli A e D sono state modificate da Baptista et al. 14. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Cambiamenti nella sintesi del mRNA e mRNA decay risultati in buffering di mRNA paralleli. (A), questo pannello mostra una rappresentazione schematica dell'esito della perturbazione di sintesi di RNA su livelli di RNA allo steady-state. (B-D) Questi pannelli mostrano il calcolo della sintesi di mRNA e i tassi di decadimento dalle analisi di RNA totale e recentemente sintetizzato. I tassi di sintesi e di decadimento sono stati determinati per ogni trascrizione di S. cerevisiae in (B) spt20Δ, Δ bre1(C) e (D) K123R. Variazioni (calcolate come log2 del rapporto tra mutanti e wild-type) nei tassi di sintesi sono state tracciate contro variazioni nei tassi di decadimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Mentre per analizzare i cambiamenti nella trascrizione del genoma strumenti ancora stanno migliorando, l'esclusiva analisi del trascrittoma attraverso la quantificazione dei livelli allo stato stazionario di RNA potrebbe non riflettere accuratamente le modifiche nell'attività di RNA polimerasi II. Infatti, i livelli di mRNA sono regolati non solo dalla sintesi di RNA, ma anche dalla loro maturazione e degradazione. Per misurare la sintesi di mRNA disinserita dalla degradazione di mRNA, distinti protocolli sono stati sviluppati negli ultimi anni per l'analisi della trascrizione nascente in lievito ed in mammiferi.

Uno dei protocolli più utilizzati per la quantificazione della nascente trascrizione è GRO-seq1. Mentre il vantaggio principale di GRO-seq è la sua capacità di svelare polimerasi trascrizionalmente attiva e impegnata ad alta risoluzione e basso fondo, ha due punti distinti che fanno diminuire l'attrattiva: (i) esso è tecnicamente impegnativo e richiede la isolamento dei nuclei e, manipolazioni di nuclei (ii) introdurre alcune perturbazioni al sistema28. Un'altra alternativa è NET-seq, che si basa sul sequenziamento delle estremità 3' delle trascrizioni ottenute sopra immunoprecipitazione del complesso ternario estremamente stabile formato tra il nascente RNA, modello DNA e RNA polimerasi II. Questo approccio consente la caratterizzazione degli RNA nascente ad una risoluzione di coppie di basi e può esplorare gli eventi di elaborazione di mRNA attraverso immunoprecipitazione di modifica per la RNA polimerasi II (fosforilazione della serina-5, per esempio)2,3 , 29. Tuttavia, presenta alcuni ostacoli, da cui si evidenziano tre. In primo luogo, mentre gli anticorpi targeting RNA polimerasi II sono solitamente altamente specifici, dipende l'efficienza dell'anticorpo. In secondo luogo, RNA potrebbe essere soggetto a degrado durante i periodi di incubazione, così ci conduce al punto precedente (meno efficienti anticorpi potrebbero essere necessari più lunga incubazione volte, lasciando più suscettibile alla degradazione del RNA)29. Terzo e soprattutto nei mammiferi, la digestione di MNase e la selezione della dimensione potrebbero escludere sequenza univoca allineamento29,30.

Qui abbiamo presentato un protocollo dettagliato per l'etichettatura metabolica di nuova sintesi RNA utilizzando 4tU in S. cerevisiae che presenta diversi vantaggi rispetto ad altri approcci disponibili. Perché la trascrizione è altamente sensibile alle perturbazioni, cellule dovrebbero essere mantenute in condizioni più fisiologiche. Per esempio, GRO-seq implica l'arresto di trascrizionalmente impegnata RNA polimerasi II attraverso l'esposizione di cellule/nuclei a sarkosyl. Tuttavia, trattamento sarkosyl è stato descritto come inibitori di diversi processi cellulari11. In questo caso, etichettatura metabolica 4tU o 4sU alla concentrazione descritta è non perturbante e visibilmente non influisce l'omeostasi cellulare, soprattutto per brevi periodi di esposizione. A differenza di altri metodi tramite inibizione di trascrizione per misurare mRNA emivite, DDAT o 4tU-seq e raccordo con modellazione dinamica determina tassi di degradazione di ogni singolo mRNA in cellule senza scomporsi. Quindi, un singolo metodo può affrontare contemporaneamente sia la sintesi e i tassi di decadimento del trascrittoma intero su uno specifico tipo cellulare. Poiché DDAT o 4tU-seq si avvale di metodi di normalizzazione altamente affidabile, vale a dire attraverso l'utilizzo di spike-a, possono essere analizzati insieme di set di dati diversi e confrontate direttamente. Infine, etichettatura metabolica e quantificazione di RNA recentemente sintetizzato è una tecnica che può essere implementata facilmente in qualsiasi laboratorio di biologia molecolare come non richiede alcuna attrezzatura specifica. Questo probabilmente spiega la diffusione piuttosto grande di questa tecnica, che tende ad essere usato più sistematicamente per esplorare RNA produzione e degradazione in lieviti, così come negli eucarioti superiori.

RNA possa essere etichettato in cellule viventi mediante altri analoghi nucleosidici, vale a dire 5-bromouridine (BrU)31,32 o 5-ethynyluridine (UE)33,34. L'isolamento di BrU impulso-identificato RNA si basa sulla purificazione dell'anticorpo anti-BrdU che può avere diversa efficienza tra esperimenti. EU-identificato RNA può coniugato covalentemente alla biotina utilizzando clic chimica che conduce a una coniugazione non reversibile in contrasto con la modifica del tiolo, che può essere invertito con agenti riducenti. BrU ed etichettatura UE sono stati utilizzati in cellule di mammifero per determinare il genoma RNA decadimento tariffe31,32 o per valutare il nascente RNA sintesi34,35. Tuttavia, BrU o UE di etichettatura non è stata descritta in S. cerevisiae. Infatti, l'assorbimento di analoghi nucleosidici richiede l'espressione del trasportatore nucleosidico e, quindi, questi metodi vengono visualizzati meno flessibili nel lievito gemmante etichettatura con 4tU.

La durata di 4tU etichettatura può essere adattata e varia a seconda della domanda. Nel valutare il mRNA sintesi in S. cerevisiae, un breve impulso d'etichettatura di 6 min assicura che i livelli di mRNA appena trascritto risentono minimamente degradazione del RNA. Considerando che il tempo di ritardo prima che il nucleotide modificato può essere incorporato in RNA nascente è meno di 1 min, questa durata di etichettatura 6-min garantisce che una quantità ragionevole di nuova sintesi RNA può essere purificata. Tale protocollo, come definito da Miller et al. 11, è stato utilizzato in diversi S. cerevisiae mutanti per rivelare cambiamenti globali nel RNA e la sintesi di mRNA decadono9,10,22,26,27, 36. una durata più etichettatura (3h) è stata usata in un impulso metabolico-inseguimento etichettatura con 4tU per determinare i tassi di decadimento di tutti gli mRNA in S. cerevisiae12. Infine, estremamente breve (da 1,5 min) 4tU etichettatura è stato utilizzato per esaminare la cinetica di elaborazione del RNA in erba e fissione lievito13,25,37.

Tuttavia, questo metodo presenta alcune limitazioni, ad esempio il rendimento relativamente basso di RNA con etichettato recuperato alla fine dell'intero protocollo. Mentre nel lievito, non c'è nessuna limitazione nel materiale di partenza, e questo può essere un problema quando si analizzano le cellule dei metazoi, in particolare se questo protocollo è essere utilizzati in vivo. Uno dei passaggi di limitazione del protocollo è biotinilazione della piscina RNA con etichetta, cui efficienza è lungi dall'essere completo ed è stato stimato per modificare uno su tre 4sU residui con etichetta RNA5. Ha recentemente indicato che l'uso di methanethiosulfonate (MTS)-biotina, invece di biotina-HPDP, aumenta il rendimento di recuperati RNA38. Tuttavia, secondo i risultati pubblicati da questo gruppo di ricerca e risultati da Rutkowski e Dölken, MTS-biotina non è completamente tiolo-specifico, che porta alla purificazione del RNA senza etichetta, che è particolarmente problematica quando bassa quantità di RNA con etichettato sono purificata39. Un'altra limitazione di etichettatura metabolica utilizzando 4tU/4sU è la velocità intrinseca al quale RNA polimerasi si allunga. La velocità media della RNA polimerasi II è stata stimata per essere di circa 3,5 kb/min40,41,42. Quindi, in un 6 min di etichettatura, la polimerasi avrà la capacità di trascrivere 15 – 20 kb. Così, in un esperimento con un breve impulso-etichettatura con 4tU/4sU, solo il 3' estremità parte di RNA recentemente trascritto è etichettato, mentre le regioni di estremità 5' erano pre-esistenti prima dell'aggiunta di 4tU/4sU. Così, la purificazione di RNA con etichetta arricchisce anche pre-esistenti 5' estremità di trascrizioni, particolarmente per le trascrizioni lunghe come in cellule di mammifero. Al fine di superare questo pregiudizio, in un raffinato protocollo chiamato TT-seq, l'etichettato RNA estratti è frammentato di sonicazione prima la purificazione della specie recentemente sintetizzato43.

Complessivamente, 4tU-seq è un ottimo modo per risolvere le modifiche trascrizionali in un dato contesto. Tuttavia, e mentre il protocollo è abbastanza semplice, si compone di diverse fasi, essendo in definitiva relativamente estese. Innanzitutto, poiché questo protocollo gestisce RNA dall'inizio alla fine, è obbligatorio che sono soddisfatti tutti i requisiti necessari per un campione pulito e privo di degradazione. Quindi, tutti i reagenti devono essere RNAsi-libera, e tutti i materiali devono essere dedicati a manipolare RNA, pulizia tutto accuratamente e regolarmente con soluzione di decontaminazione di RNAsi. In secondo luogo, mentre la reazione di biotina è altamente specifico, l'eccesso di biotina-HPDP che non ha reagito dovrebbe essere rimosso dal campione (per evitare la saturazione dei branelli streptavidina marcata con biotina non covalentemente associata al RNA, per esempio). Terzo, come descritto nel protocollo, l'uso delle perle magnetiche rivestite con streptavidina indicate è altamente raccomandato, poiché i diversi gruppi disponiamo di ricerca ha parlato di avere tutti indicato che queste perle condotto per abbassare i livelli di sfondo. In quarto luogo, appropriata qualità e controlli sperimentali devono essere utilizzati. Sono campioni derivati da cellule che non sono stati esposti a 4tU/4sU. Questi campioni saranno di grande valore ai livelli di fondo di indirizzo e per assicurarsi che, durante l'esperimento, non si verifica una contaminazione con RNA non marcato. Inoltre, un'altra ottima alternativa per verificare se il campione è arricchito per RNA recentemente sintetizzato è quello di eseguire un RT-qPCR utilizzando primers contro un gene intro-contenente. I primer dovrebbero essere complementari all'estremità 3' e 5' alla fine di due consecutivi esone e introne o viceversa. Infine, prima del sequenziamento di ibridazione di microarray, convalidare i campioni di RT-qPCR. Per questo, diversi geni con diversi livelli di espressione e la regolazione dovrebbero essere selezionati ed analizzati. In modo ottimale, questo deve essere eseguito per le due diverse frazioni di RNA (RNA-stazionario e recentemente sintetizzato).

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo Laszlo Tora per il suo sostegno e V. Fisher, K. Schumacher e F. El Santoliquido per le loro discussioni. T.B. è stata sostenuta da una borsa di studio Marie Curie-ITN (PITN-GA-2013-606806, NR-NET) e l'arco di Fondation. Questo lavoro è stato sostenuto dall'Agence Nationale de la Recherche (ANR-15-CE11-0022 SAGA2). Questo studio è stato supportato anche da ANR-10-LABX-0030-INRT, un fondo di stato francese gestito dall'Agence Nationale de la Recherche sotto il telaio programma Investissements d'Avenir ANR-10-IDEX-0002-02.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Thiouracil Sigma-Aldrich Cat# 440736
Rapamycin Euromedex Cat# SYN-1185
Countess II FL Automated Cell Counter ThermoFisher N/A
RiboPure RNA Purification kit, yeast ThermoFisher Cat# AM1926
NanoDrop 2000 Spectrophotometer ThermoFisher ND-2000
TURBO DNA-free Kit ThermoFisher AM1907
EZ-Link HPDP Biotin ThermoFisher Cat# 21341
Thiolutin Abcam ab143556
µMACS Streptavidin kit Miltenyi Biotec Cat# 130-074-101
Transcriptor Reverse Transcriptase Roche 03 531 295 001
SYBR Green I Master Roche 4707516001
GeneChip Yeast Genome 2.0 ThermoFisher 900555
GeneChip Fluidics Station 450 ThermoFisher 00-0079
GeneChip Scanner 3000 7G ThermoFisher 00-0210

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References

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Comportamento problema 140 S. cerevisiae RNA trascrizione recentemente sintetizzato 4-tiouracile RNA RNA polimerasi II SAGA complessa
<em>Saccharomyces cerevisiae</em> Metabolica etichettatura con 4-tiouracile e la quantificazione di nuova sintesi mRNA come Proxy per attività di RNA polimerasi II
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Baptista, T., Devys, D.… More

Baptista, T., Devys, D. Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity. J. Vis. Exp. (140), e57982, doi:10.3791/57982 (2018).

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