Summary
Este protocolo mede aprendizagem espacial e memória usando o labirinto de Barnes. Um novo paradigma de donzela em apuros é usado para avaliar a atividade locomotora e comportamento pró-social em camundongos.
Abstract
O labirinto de Barnes é uma medida confiável de aprendizado espacial e memória que não necessita de restrição alimentar ou a exposição a estímulos extremamente estressantes. O labirinto de Barnes também pode avaliar outros comportamentos do mouse, como motivação geral para escapar da plataforma do labirinto e comportamento exploratório. O labirinto de Barnes pode medir se uma mutação genética ou ambiental variável pode impactar a aquisição e retenção de memória espacial, bem como fornecer informações sobre a estratégia de pesquisa utilizada pelos ratos. Aqui usamos o labirinto Barnes para detectar um défice de memória em ratos adultos após um evento de exposição de etanol no desenvolvimento único. O paradigma de donzela em apuros recém descrito expõe um rato masculino para um rato fêmea preso em uma câmara no campo aberto do centro da arena. Ele fornece uma oportunidade para o rato socialmente responder a fêmea presa e exibem comportamento pró-social. O paradigma de donzela em apuros também pode ser usado para examinar o comportamento do mouse em uma atividade de locomoção novela arena e medida. Tanto o labirinto de Barnes e os protocolos de donzela em perigo exigem investimento financeiro mínimo e quase todos os aspectos dos testes podem ser construídos a partir de fontes comuns de laboratório. Essas ferramentas flexíveis e acessíveis também podem ser usadas para detectar mudanças de comportamento ao longo do desenvolvimento.
Introduction
O propósito do presente protocolo é medir a aprendizagem espacial e memória em camundongos usando o labirinto de Barnes, bem como capacidade de resposta social e locomoção utilizando o paradigma de donzela em perigo. Comumente usado testes de aprendizagem e memória espaciais para roedores incluem o labirinto radial do braço, que mede a capacidade de um mouse para encontrar comida escondida em um braço de um aparelho multi-raiadas, e o labirinto de água Morris, que coloca um rato em uma banheira grande ou poça de água e avalia o tempo que demora para encontrar uma plataforma escondida debaixo d'água. Normalmente, a formação para esses paradigmas abrange vários ensaios e permite a medição de ambos aprendizagem taxas de aquisição e retenção através de curto prazo e testes de memória a longo prazo.
Embora o labirinto radial-braço e o labirinto de água de Morris são formas confiáveis para testar a memória em roedores, apresentam complicações para alguns pesquisadores. Ambos os labirintos usam privação ou fortes estímulos aversive como reforço1. O labirinto de braço radial usa privação de comida para garantir que os roedores são devidamente motivados para encontrar uma recompensa de comida. No labirinto de água de Morris, os efeitos do estresse induzido por um mergulho forçado podem alterar resultados no2ratos.
O labirinto de Barnes é uma tarefa de consciência espacial alternativa que requer roedores aprender a posição de um buraco para escapar a superfície brilhante, aberto labirinto3. Estimulação aversive fraca (luz ou som) é então aplicada para aumentar a probabilidade de que os ratos vão escapar da plataforma. O labirinto de Barnes não requer privação de comida, então a quantidade de animal preparação é menor do que no labirinto de braço radial. Pode ser usada sem conflito por pesquisadores que estão investigando comportamentos ou moléculas associadas com comer, regulação hormonal ou vias hipotalâmicas.
O labirinto de Barnes também tem vantagens sobre o labirinto de água de Morris. É menos estressante do que o labirinto de água Morris, causando menos elevados níveis de corticosterona em ratos4. Além disso, é muito mais simples de montar e requer menos dedicado espaço durante o procedimento de teste e armazenamento.
O ensaio de donzela em apuros é um experimento simples de duas partes que pode avaliar a atividade locomotora, seguida por comportamento pró-social. O ensaio de donzela em apuros é projetado para avaliar comportamentos exploratórios e responsividade social de um roedor masculino em resposta a um roedor feminino aprisionado. Um método comumente usado para avaliar a sociabilidade (bem como preferência por novidade social) é o uso do teste de sociabilidade da três-câmara de Crawley, que avalia a livre escolha de um mouse para passar o tempo perto ou longe de outros ratos5.
Semelhante ao teste de sociabilidade da três-câmara de Crawley, o ensaio de donzela em apuros também medidas de livre escolha sobre como gastar tempo na presença de outro rato, mas ele também fornece medições para aspectos mais profundos de funcionamento social: 1) na Ensaio de donzela em perigo, o rato encurralado feminino é realizado no centro de um campo aberto, portanto aversão ao potencial do macho, para um campo aberto é confrontado com sua unidade socialmente explorar ou investigar uma fêmea angustiada coespecífica. 2) o modelo de donzela em apuros também fornece uma forma de avaliar o comportamento pró-social e empático, em resposta ao rato encurralado, que não tem sido explorado com frequência em camundongos.
Empatia animal é definitivamente observáveis e mensuráveis, embora não muitos paradigmas existem para esta finalidade. Por exemplo, em ratos, um companheiro de gaiola preso pode induzir um estado de motivação pró-social, onde ratos funcionará para libertar o animal. Na verdade, ratos irão escolher para ajudar o animal, mesmo antes de abrir um recipiente similar contendo um lanche chocolate, então acessar o chocolate e compartilhá-lo com o rato recém libertos6.
Medidas de empatia em camundongos normalmente envolvem a inflição de dor; com efeito, ratos que assistem outros ratos na dor são mais sensíveis à dor se7,8. Stress de contenção é um fenômeno caracterizado em roedores e tem sido associada a choque para examinar as respostas de estresse, como uma medida de empatia em camundongos9,10.
Existem considerações éticas associadas com dor induzida ou choque, assim alternativas indutoras de stress são necessários. Nós desenvolvemos o paradigma de donzela em perigo, como uma medida do comportamento empático na ausência de dor ou tratamento de choque. Os ratos presos em nosso protocolo de donzela em apuros mostram sinais aparentes de angústia após apenas alguns momentos, eles são incapazes de virar dentro do pequeno recipiente, mas eles estão ilesos, proporcionando uma oportunidade para os outros ratos responder a sua aflição.
Para começar a avaliação de donzela em apuros, um rato masculino é colocado em uma grande arena de romance que contém um pequeno cilindro central vazio. Comportamentos exploratórios são registrados por vários minutos, incluindo quantas seções da arena são ultrapassadas e quanto tempo é gasto na área central aberta. Este método fornece uma maneira rápida e fácil para descartar déficits locomotoras como uma potencial confundente em uma situação de aprendizagem que requer movimento coordenado para a conclusão bem sucedida. Ele também fornece uma medida básica de quanto aversão ao campo aberto do centro está presente. Ambas as medidas poderiam influenciar o desempenho de labirinto de Barnes.
Após a exploração inicial, o macho é retirado da arena e um mouse feminino é colocado em um cilindro claro central fechado, pequeno (similar ao usado para coletar sangue de ratos). Então, o rato masculino original é reintroduzido na arena, e comportamento exploratório é marcou novamente. O paradigma de donzela em apuros avalia se um mouse está interessado em uma interação social com base nas alterações em padrões de comportamento, quando uma mulher presa está presente (marcados pelo tempo gasto na praça central e o número de episódios de escavação) e se o rato apresenta comportamento pró-social em direção a fêmea presa (marcado pela quantidade de investigações de cilindro e eventos contatos com a fêmea presa). O ensaio de donzela em perigo pode ser usado para medir uma propensão para a novidade social (semelhante ao teste de sociabilidade da três-câmara do Crawley) dependendo se pesquisadores capturar um rato familiar ou romance.
Juntos, o labirinto de Barnes e experimentos de donzela em apuros permitem a avaliação exata do mouse capacidades de aprendizagem e capacidade de resposta social na ausência de estímulos extremamente estressantes. Como com todos os ensaios comportamentais, estas experiências devem ser executadas com grande sensibilidade em relação a experiência animal, minimizando o desconforto experimentado pelo animal.
Como a maioria dos labirintos, diferenças na atividade locomotora podem influenciar o desempenho no labirinto Barnes, então pesquisadores também devem avaliar a atividade locomotora, especialmente quando se utiliza o labirinto Barnes para avaliar aprendizagem em camundongos com mutações que podem afectar o movimento (tais como aqueles encontrados em modelos do rato a doença de Huntington, ou aqueles expostos a substâncias tóxicas que podem provocar hiperatividade ou retardar o movimento, como o etanol). Além disso, labirinto e câmara de superfícies devem ser cuidadosamente limpos e cama mudada entre cada animal para evitar a sugestão de perfume confunde.
Importante, todos os materiais podem ser fabricados no local com o mínimo de investimento financeiro e a pequena pegada física destes ensaios significa que estas experiências podem ser replicadas em praticamente qualquer ambiente, permitindo uma grande flexibilidade. Este tipo de acessibilidade permite boa ciência a ser realizada em instituições menores, com recursos limitados, ou em situações onde piloto dados precisam ser coletados rapidamente na ausência de um apoio substancial.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC) de Hampden-Sydney College ou Randolph-Macon College (onde alguns trabalho anteriormente foi realizado).
1. básica habitação dos ratos
- Os ratos em gaiolas de plástico com fundo sólido e os lados e uma camada de roupa de cama macia e aninhamento de material como papel retalhamento da casa. Use o fundamento que é composto de espigas de milho ralado ou aparas de madeira e certifique-se de que o fundamento é alterado regularmente para saneamento.
- Fornecer acesso a comida e água ad libitum. O topo da gaiola plástica abriga um funil de alimentação. Dispense as pelotas de alimento corretamente formulado rato do funil comida e fornecer um dispensador de água. Certifique-se de que o topo da gaiola possui um filtro de ar para proteger ratos de contaminantes externos.
- Manter o ritmo circadiano natural dos ratos, seguindo um ciclo claro-escuro de 12 horas na instalação de habitação. Conduta comportamental testes ao mesmo tempo do dia, idealmente durante o ciclo escuro do animal, tais como durante a noite.
Nota: Tenha cuidado para distinguir os ratos na carcaça. Vários métodos para ratos distintivos estão disponíveis, como orelha socos, marcas auriculares e marcas de cauda.
2. teste de labirinto Barnes: construção
- Obter uma placa de madeira circular que é de 120 cm de diâmetro.
- Corte 20 orifícios circulares (4,5 cm de diâmetro) ao redor do perímetro do círculo. Posição de cada furo para ser 2,5 cm da borda do labirinto e 13 cm além de furos vizinhos.
- As superfícies lisas e pintá-las de branco brilhante (recomenda-se uma cor brilhante).
- Designar-se um lado do Conselho labirinto para inserção de um pequeno copo de ganchos aproximadamente 2-3 cm de cada uma das 20 furos e coloque dois ganchos para cada buraco (um de cada lado de cada furo).
- Use discos de raso preto (plástico) para cobrir buracos no lado do labirinto com ganchos. Utilize ganchos para prender elásticos grossos para segurar os discos para o fundo do labirinto.
- Monte com segurança o labirinto de Barnes 120 cm acima do chão e longe de outros objetos da mesma forma altos como mesas ou cadeiras. Uma caixa ou fezes podem ser usado para oferecer suporte no meio do labirinto.
- Coloca grandes cartazes brancos com uma forma em cada parede (triângulo, círculo e Cruz) como pistas extralabirinto em 3 lados do labirinto. Manter os cartazes nas paredes ao redor do labirinto para cada julgamento.
- Último lado do labirinto, configure uma cortina preta sólida para esconder os observadores para que os dados podem ser gravados com precisão sem os pesquisadores sendo visível aos ratos no labirinto.
- Suspenda uma câmera de vídeo sobre a arena com uma visão global da superfície inteira do labirinto.
- Limpe todas as superfícies do labirinto (discos pretos e caixa de destino incluído) com água então uma solução de etanol a 70% antes e após cada julgamento de mouse.
- Coloque uma fonte luminosa 100 W 25 cm sobre o centro do labirinto (ligar/desligar no início/final de julgamento) e certifique-se de ter os discos e ganchos fique voltada para o chão.
Nota: Todas as outras luzes aéreas na sala devem ser desligadas durante o teste. Recomenda-se a adição de um fabricante de ruído ultra-sônico pendurado ao lado de 100 W de iluminação. Transformá-lo de ligar/desligar para o início/término de cada julgamento.
3. teste de labirinto Barnes: procedimento
Nota: Certifique-se que todos os componentes do labirinto são limpos com água e 70% de solução de etanol, antes e após cada julgamento, permitindo tempo para secar completamente antes de testar os currículos. Assegure-se de limpeza pronto de suprimentos, bem como temporizadores para os ensaios.
- Todos os ratos em grupos da casa enquanto estiver usando um método de identificação fiável. Manter os ratos fora da sala de testes, quando eles não estiverem executando ativamente no labirinto. Isso é para garantir que não estão sujeitos ao ultra-som para fazer barulho prematuramente.
- Lidar com ratos suavemente a apanhar e mantendo-os da base da cauda, com as patas, continuava a mão.
- Para o treinamento, têm os ratos executar no labirinto uma vez diariamente por dia durante 7 dias em uma fila para avaliar a aprendizagem/aquisição.
Nota: Um único julgamento a longo prazo pode ser feito em uma data posterior para avaliar/retenção da memória. O protocolo atual treinou ratos adolescentes começando no dia pós-natal 32 e um julgamento longo prazo foi realizado em adultos com 4 meses de idade. - Aleatoriamente, atribua cada rato para um buraco de destino para usar durante todo o período de testes. Os furos podem ser rotulados 1-20 no fundo do labirinto ou do lado de fora do perímetro do labirinto, onde eles não são visíveis com o rato no labirinto.
- Substitua o disco atribuído buraco com uma caixa preta pequena (23 x 11 cm). Firmemente, anexá-lo ao labirinto de Barnes usando elásticos ligados aos ganchos mais próximos.
Nota: A caixa de destino é superficial suficiente para que o mouse pode descer facilmente nele ou contém uma etapa para garantir que o rato não tem que pular nele. - Coloque o mouse sobre o centro do labirinto debaixo de um copo se aclimate por 30 segundos até o início do teste. Começa a gravação de vídeo.
- Ligue o luz e ultra-sônica para fazer barulho. Levante a taça de através de um mecanismo de sequência de caracteres para evitar a polarização da posição inicial do animal. Iniciar um timer e sente-se atrás da cortina para observar.
- Depois que o mouse entra no buraco de alvo, tapar o orifício com o mesmo copo opaco usado no início do julgamento ou um fichário e desligar o ultra-som para fazer barulho. Se o mouse não tiver inserido o alvo decorridos 5 minutos, encurralar o mouse no orifício do alvo.
- Certifique-se que o mouse entra no buraco. Quando o mouse está dentro da caixa de destino, tapar o buraco e desligue o fazer barulho. Permitir que o mouse permanecer na caixa destino durante 1 minuto sem ser perturbado.
- Embora o buraco de destino permanecerá constante para cada rato durante todo o período de treinamento, execute os ratos em uma ordem aleatória cada dia para garantir que eles não estão seguindo qualquer sugestões/perfumes deixado pelo mouse anterior.
4. Barnes labirinto de testes: Análise de dados
- Durante os julgamentos de labirinto de Barnes, gravar o seguinte dados cronometrado: total de tempo gasto no labirinto, na hora de encontrar o alvo e na hora de entrar buraco alvo se o alvo for inserido.
- Acompanhar o movimento global do mouse para determinar o número de erros (número de furos incorretos exploradas) antes e depois que o alvo é encontrado. Também gravar a distância entre o furo do alvo para o primeiro buraco explorado (a distância é medida em número de buracos embora), juntamente com qualquer notável comportamento de aliciamento.
- Acompanhar os movimentos de cada animal em um pedaço de papel com um diagrama do labirinto durante cada julgamento e usá-lo para analisar estratégias de pesquisa, bem como determinar o número de buracos que foram exploradas no quadrante oposto o alvo. Use a análise de vídeo para confirmar os caminhos.
5. donzela em apuros teste: construir a câmara de contenção
- Corte um cilindro claro para um comprimento igual a ¾ do comprimento do mouse feminino da base da cauda à ponta do nariz. Certifique-se de que as dimensões do cilindro são tais que o rato colocado dentro não pode virar.
Nota: Nós cortamos o fim do cone de um tubo cónico de 50 mL até fazer um tubo longo de 4cm para ratos de 1 mês de idade e um de 8 cm de comprimento do tubo para ratos de 4 meses de idade. - Cap ambas as extremidades do cilindro, tal que o Caps pode ser removido e recolocado. 3-4 buracos, cerca de 0,5 cm cada, em cada cap. Certifique-se de que os buracos são grandes o suficiente para permitir que nariz-tocando entre ratos e respiração12.
Nota: Como alternativa, um dispositivo de contenção do mouse durante a coleta de sangue pode ser usado.
6. donzela em apuros teste: preparando a Arena
- Certifique-se de que a arena é uma caixa quadrada plástica em topless opaca de 38 x 38 cm, com paredes de 19 cm. Preenchê-lo uniformemente com fundamento de milho a uma altura de aproximadamente 2,5 cm.
Nota: O fundamento de espiga de milho faz eventos de escavação mais fácil de detectar. - Suspenda uma câmera de vídeo sobre a arena, para que a totalidade da arena está em exibição.
7. donzela em apuros teste: medida de comportamento exploratório
- Coloque a câmara de estresse fechado e vazio para o centro da arena.
- Comece a gravar com a câmera suspensa.
- Selecione um rato masculino. Se os ratos são marcados para identificação, observe a identidade deste macho; Se não, marque este mouse para que ele pode ser distinguido depois de voltar para a gaiola.
- Coloque delicadamente o rato macho debaixo de um copo no canto inferior esquerdo na arena. Após 30 segundos, retire o copo através de um mecanismo de cadeia de caracteres.
- Permitir que o mouse para explorar durante 10 minutos, tendo o cuidado de ficar fora do seu campo de visão durante a gravação. No final da 10 min, retire o mouse da arena e devolvê-lo para uma gaiola de exploração para os próximos 5 min12.
- Parar a gravação e salvar o arquivo de vídeo com um identificador apropriado.
8. donzela em apuros teste: medida de capacidade de resposta Social
- Use a mesma configuração de arena e gravação, como a medida do comportamento exploratório.
- Selecione um rato fêmea. Se os ratos são marcados para identificação, observe a identidade desta fêmea; Se não, marque este mouse para que ele pode ser distinguido depois é retornado para a gaiola.
Nota: Um littermate, companheiro de gaiola ou rato romance pode ser usado, dependendo da pergunta de pesquisa. Se vários ensaios estão sendo realizados, manter o tipo de relacionamento em todos os ensaios. - Segure o mouse feminino suavemente a base da cauda, ou por retenção de pescoço, se necessário e abaixá-lo para a câmara de contenção. Feche a extremidade aberta por trás dele e certifique-se de que é incapaz de girar ao redor.
Nota: Considere usar luvas resistentes a mordida, como o mouse feminino serão resistente ao entrar na câmara de contenção. - Comece a gravar com a câmera suspensa.
- Coloque a câmara de contenção com o mouse feminino aprisionado dentro no centro da arena de empatia e permitir que a fêmea se aclimate por 10 min. Tome cuidado para manter-se fora campo de visão a fêmea.
- Após o rato fêmea foi na câmara de contenção por 5 min, posicione o mouse masculino marcado volta para a arena de empatia, usando o mesmo processo como antes. Permitir que o rato masculino um adicional 5 min explorar a arena, mais uma vez tendo o cuidado de manter-se fora do campo de visão dos ratos.
- Parar a gravação e salvar o arquivo de vídeo com um identificador apropriado.
- No final da 5 min, remover ambos os ratos da arena e colocá-los em suas gaiolas. Substituir o fundamento de milho e higienizar tanto a arena e a câmara de estresse com 70% de etanol12.
9. donzela em apuros teste: análise de dados
- Software de rastreamento pode ser usado, mas o vídeo também pode ser analisado manualmente. Uma vez que o arquivo de vídeo é visível no computador, sobrepor uma folha transparente sobre a tela e contorne a Praça da arena usando um marcador. Divida o quadrado arena em nove compartimentos iguais.
- Revise os dados de vídeo para o primeiro 5 min da medida inicial exploratória. Registrar o número de compartimentos cruzados (comportamento exploratório/atividade locomotora), o tempo gasto no centro do quadrado da arena (aversão ao campo aberto), número de cavar e episódios de aliciamento e número de vezes que o mouse tocou a contenção de centro vazio Câmara.
Nota: Pontuação não é feito para o segundo 5 min de exploração inicial de 10 minutos do macho, nem para a 10 min a fêmea é preso na câmara central, na ausência do macho. - Revise os dados de vídeo para a 5 min da medida responsividade social imediatamente depois que o macho é reintroduzido na arena com a fêmea presa. Gravar os mesmos dados quanto a medida inicial e exploratória, mas Adicionalmente, registrar o número de vezes que o rato masculino tocou narizes com o rato fêmea preso.
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Representative Results
O labirinto de Barnes
Para ilustrar como o labirinto de Barnes pode ser usado, investigamos se uma única exposição precoce de etanol causou uma diferença na aprendizagem ao longo do desenvolvimento do mouse. Camundongos C57Bl6/J também foram injetados com uma solução de etanol de 2,5 g/kg (n = 8) ou com solução salina (n = 6) duas vezes, duas horas de diferença, no 6º dia pós-natal. Estamos treinados os animais no labirinto Barnes durante a adolescência (P30) e, em seguida, realizou um julgamento longo prazo único na idade adulta (4 meses). Os dados coletados podem ser divididos em várias categorias principais: 1) exatidão por taxa de tempo e erro e entrada 2) destino 3) mapeamento do caminho de exploração.
Precisão pela taxa de tempo e de erro:
Medições de tempo abrangem vários aspectos importantes: A latência para alcançar o primeiro buraco (o tempo que leva para o mouse investigar qualquer primeiro buraco depois de iniciar o julgamento) irá ilustrar se o mouse está aprendendo o que é suposto ir encontrar a fuga (de buraco Figura 1A). A latência para descobrir o buraco de alvo (marcado por uma diminuição inicial do nariz através do plano do buraco alvo) é capaz de encontrar o buraco correto (figura 1B). Com cada sessão, deve diminuir o tempo para executar a sessão de treinamento, indicando que os animais estão aprendendo o labirinto.
O número de investigações de buraco errado (denominados erros) o mouse executa antes de localizar o orifício correto (Figura 1) indica se o animal é capaz de ir relativamente direto para o buraco de escapar do destino. O número total de vezes que um rato explora um furo incorreto ao longo do julgamento dá uma medida rudimentar da atividade locomotora e comportamento exploratório. (Figura 1). Todos os ratos foram treinados com sucesso no labirinto Barnes durante um período de teste de 7 dias durante a adolescência (representado aqui por sessões diárias em dias pós-natal 32-39), indicada por uma diminuição na taxa de erro e o tempo para encontrar o buraco alvo. Não houve diferença estatística na aprendizagem entre os etanol e o controle de animais ao longo do período de formação.
Taxa de entrada de destino:
A latência para realmente entrar no buraco do alvo é comumente usada como os critérios para a conclusão bem sucedida do labirinto, mas provavelmente não dá tanta informação quanto a outros aspectos do teste. Entrada no alvo também pode ser marcada como um 0 ou 1. Se o mouse entra o alvo antes de decorridos o 5 min, o teste é considerado bem-sucedido, mas se o mouse não inserir o destino, um fichário ou livro deve ser usado para encurralar o animal para o destino assim que ela sofresse a segurança da câmara abaixo. Sobre os primeiros dias de treinamento, deve presumir-se que as taxas baixas da entrada do alvo e animais que levam os 5 minutos sobre o labirinto. Nos dias subsequentes, o teste deve ter menos tempo.
Fazer vários erros depois de encontrar o alvo indica baixa motivação para introduzir a caixa de destino e pode também detectar anormal conforto com uma situação que é tipicamente contrário aos ratos (plataforma elevada, campo aberto, luz brilhante, ruído ultra-sônico). Uma grande diferença entre erros cometidos antes de encontrar o alvo e o número total de explorações buraco durante um julgamento indica pobre motivação para entrar na câmara de fuga do alvo (Figura 2A). Se ratos não estão entrando no buraco de escapar do destino após a descoberta, ruídos ou luzes brilhantes podem ser adicionados à situação de teste como estímulos nocivos levemente.
Em nossa experiência, um emissor de ruído ultra-sônico foi adicionado acima do labirinto no teste dia 5 apresentar motivação extra para entrar o alvo. Antes da introdução do ruído ultra-sônico, sem ratos tratados salinos já havia entrado o alvo, mas entradas cravado após a introdução do ruído. Significativamente mais ratos (solução salina e etanol combinada) entraram o alvo em 6 de julgamento em relação ao julgamento 4 (t-test, p = 0.0014) (Figura 2B).
Mapeamento de caminho:
Mapear o caminho do mouse pode ajudar a avaliar a retenção de informações e estratégias, bem como de aprendizagem. A distância entre o primeiro buraco explorado e o orifício de destino é um bom indicador da memória para o local de destino, como este faixas onde o rato vai primeiro e quanto tempo eles são para o alvo (Figura 3A). Espero que esta medida variar extensamente no início do treinamento, mas o primeiro buraco que visitou deve aproximar-se o alvo como os ratos aprendem o local de destino.
Embora sem diferença estatística na aprendizagem foi encontrada entre os etanol e o controle de animais ao longo do período de formação, quando esses ratos foram re-executados como adultos usando um único julgamento a longo prazo (em 4 meses), os animais de etanol-injetado tinham dificuldade para lembrando que onde se localizava o buraco do alvo (Figura 3B)12. Esta diferença na retenção da memória não foi encontrada no labirinto de Barnes inicial de treinamento, isso usando o labirinto novamente em um momento posterior nos permitiu buscar diferenças sutis em memória/aprendizagem, tais como aqueles encontrados com um evento de intoxicação por etanol do desenvolvimento único. Um diagrama representativo de superfície labirinto permite que os pesquisadores mapear o caminho que o rato levou o Barnes, incluindo o número de erros e um registro do primeiro buraco visitou (Figura 3).
Tempo gasto no quadrante oposto corresponde a quantidade de tempo que um rato explora uma seção do labirinto sobre os outros, especificamente o um oposto do alvo. É possível que um pesquisador obter e calcular todas as outras medidas, como o mouse está em execução no labirinto, mas esta medida requer a análise em um momento posterior. Um rato que está aprendendo deve diminuir o tempo gasto explorar furos no quadrante oposto. No julgamento de adulto a longo prazo, o etanol tratou ratos exploraram significativamente mais buracos no quadrante oposto do alvo, indicando uma falha para lembrar a correta localização espacial geral (p = 0,03) (Figura 4A).
É importante interromper este medições de mapeamento em erros cometidos antes e depois de realmente encontrar o alvo. O número de erros antes de encontrar o alvo pode revelar se a aprendizagem está ocorrendo, mas também pode nos dizer sobre a estratégia de pesquisa do rato. Em vez de visitar aleatoriamente buracos, o mouse pode adoptar uma estratégia para encontrar rapidamente o alvo. Durante o julgamento a longo prazo, todos os animais tratados com etanol usado uma busca sequencial de buraco-de-buraco de forma em forma de anel até que o buraco foi encontrado, Considerando que significativamente menos soro tratado ratos empregada esta técnica (p = 0,004) (Figura 4B e 4D). Alternativamente, os ratos podem direcionar uma direção geral do labirinto (Figura 4), que indica que está ocorrendo a aprendizagem espacial e o animal é provavelmente a utilizar sinais externos de cabeça para as proximidades do buraco alvo.
Donzela em apuros
A arena de donzela em apuros foi construída e utilizada para testar o comportamento exploratório e social de camundongos C57Bl6/J em ambos 1m (n = 15) e 4M (n = 12) de idade. Uma arena de empatia foi utilizada onde o rato macho colocado em um canto (Figura 5A). Comportamento exploratório de mouse é quantificado como o número de quadrados cruzados em 5min na arena de romance. Nossos resultados mostram que os ratos mais velhos (4 meses) atravessam praças mais do que os ratos mais jovens (1 mês) (p < 0,0001) (Figura 5B).
Em seguida, a fêmea presa foi colocada em um cilindro no meio da arena (Figura 5A). Uma vez que a fêmea é preso na câmara, comportamento exploratório novamente pode ser quantificado como o número de quadrados cruzados. A presença da fêmea presa impacta o comportamento exploratório masculino. Independentemente da idade, camundongos machos exploram menor na presença de uma mulher presa. Machos juvenis exploraram a arena menos (medida pelo número de quadrados cruzados na presença de uma mulher presa de rato do que quando sozinho (em 1 mês: t-teste, p = 0,001; dizer macho sozinho 46 ± 4,34 praças vs com 26,13 feminino ± 3,42 quadrados). Esta diferença também foi apreciada em adultos (em 4 meses: t-teste, p < 0.000001; dizer macho sozinho 151.5 ± 5,31 praças vs com 103,08 feminino ± 0.3.59 quadrados) (Figura 5B).
Além disso, também deve ser avaliada a quantidade de tempo que um rato passou na praça central, ao longo de um período de 5 minutos. Tempo gasto na Praça do centro deve ser comparado a presença e ausência da fêmea como medida de interesse social. Nossos resultados mostram que os machos passam mais tempo na praça central na presença da fêmea presa. Machos juvenis passaram mais tempo a explorar o centro da arena na presença de uma mulher presa de rato do que quando sozinho (em 1 mês: p = 0,05; dizer masculino s 13,14 ± 2.79 sozinho vs com feminino 33.42 ± 9.32 s). Esta diferença também foi vista em adultos (em 4 meses: p = 0,001; dizer macho sozinho 14,80 ± 1.89 s vs com 52.87 feminino ± 8,9 s) (Figura 5).
Além disso, os pesquisadores também devem quantificar o número de eventos de escavação na arena, o que poderia ser uma medida de ansiedade ou comportamento pró-social em direção a fêmea presa. Esta medida foi significativamente diferente na presença da fêmea para ratos de 1 mês (1 M), mas não ratos de 4 meses (4 M). Machos juvenis passaram mais tempo cavando durante seu tempo na arena na presença de uma mulher presa de rato do que quando sozinho (em 1 mês: p = 0,027; dizer masculino sozinho 0,4 ± 0,27 vezes vs com feminino 3.2 ± 1,09 vezes). Esta diferença não foi vista em adultos (em 4 meses: p = 0,65; quer dizer macho sozinho 1,33 ± 0,54 vezes vs. com feminino 1 ± 0,49 vezes) (Figura 5).
O número de vezes que um homem toca a câmara de contenção que contém a fêmea presa e o número de vezes que os animais tocaram narizes através dos orifícios de ar é medidas de comportamento pró-social. Em nossos resultados, camundongos machos tocaram o tubo contendo a fêmea presa significativamente mais frequentemente como adultos (4 meses) do que como juvenis (1 mês) (p = 0.00001; média ± 1 mês 4,73 vezes 0.95 vs. 4 meses 15.92 ± 1,64 vezes) (Figura 5E). Machos adultos também iniciados mais presos eventos contatos femininos. Camundongos machos tocaram narizes com a fêmea presa através dos orifícios de ar significativamente mais frequentemente como adultos (4 meses) do que como juvenis (1 mês) (p = 0,002; média 1 mês 3.93 ± 1 vezes vs ± 4 meses 8.67 vezes.94). (Figura 5F).
Aparelho de ultra-som foi usado para escutar vocalizações ultra-sônicas acima de 20 kHz por ratos fêmeas, e foi usado também para escutar vocalizações ultra-sônicas por camundongos machos presos em um paradigma de reversão "Bacharel em apuros". Não há vocalizações foram detectadas em qualquer situação, o que é esperada, desde que a pesquisa anterior não encontrado nenhum rato vocalizações ultra-sônicas durante estímulos aversive exposição (tais como a contenção física ou choque eléctrico)11.
Figura 1 : Representante de precisão de labirinto Barnes resulta pela taxa de tempo e erro. Ratos também foram injetados com uma solução de etanol de 2,5 g/kg ou com soro fisiológico duas vezes 2 horas de diferença no 6º dia pós-natal. Estamos treinados os animais de uma vez por dia durante 7 dias, durante a adolescência e, em seguida, realizou um julgamento longo prazo único em idade adulta11. (A) a latência para alcançar a primeira revela buraco (o tempo que leva para o mouse investigar qualquer primeiro buraco depois de iniciar o julgamento) se o mouse está aprendendo a encontrar o orifício de fuga. (B) a latência para descobrir o buraco de alvo (marcado por uma diminuição inicial de nariz em todo o plano do buraco alvo) é capaz de encontrar o buraco correto. (C) o número de buraco errado investigações (denominados erros) o mouse faz antes de localizar o orifício correto indica se o animal é capaz de ir relativamente direto para o buraco de escapar do destino. (D) o total de número de vezes que um rato explora um furo incorreto ao longo do julgamento dá uma medida rudimentar da atividade locomotora e comportamento exploratório. Barras de erro representam SEM11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Conclusão do labirinto de Barnes sucesso. A latência para realmente entrar no buraco do alvo é comumente usada como os critérios para a conclusão bem sucedida do labirinto, mas os animais não podem entrar no buraco alvo após a descoberta. (A), A grande diferença entre erros cometidos antes de encontrar o alvo e o número total de explorações buraco durante um julgamento indica pobre motivação para entrar na câmara de escapar do destino. Em nossa experiência, um ruído ultra-sônico foi adicionado no julgamento 5 para induzir os ratos para entrar o alvo. (B) significativamente mais ratos (solução salina e etanol combinada) entraram o alvo em 6 de julgamento em relação ao julgamento 4 (t-test, p = 0.0014). Nenhum rato de etanol continuou explorando depois de encontrar o alvo de dia 7. Barras de erro representam SEM. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Motivação de labirinto Barnes. Mapear caminhos de rato pode fornecer informações sobre a motivação. (A), a distância entre o primeiro buraco explorado e o orifício de destino é um bom indicador da memória para o local de destino, como este faixas de medida onde o mouse é o primeiro e o quão longe eles estão longe do alvo. (B) embora sem diferença estatística na aprendizagem foi encontrada entre os etanol e o controle de animais ao longo do período de formação, quando esses ratos foram re-executados como adultos usando um único julgamento a longo prazo (em 4 meses), os animais de etanol-injetado tinha dificuldade para lembrar onde se localizava o buraco do alvo. (C) A diagrama representativo da superfície labirinto permite que os pesquisadores mapear o caminho que o rato levou o Barnes, incluindo o número de erros e um registro do primeiro buraco visitou. Este mouse foi direto para o alvo em 16 segundos, mas nunca entrou ao longo de 5 minutos e explorado 41 buracos depois. Esse comportamento indica baixa motivação para entrar o alvo. Barras de erro representam SEM. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Estratégia de busca de labirinto Barnes. Mapear caminhos de rato pode descobrir estratégias de busca e fornecer informações sobre a estratégia de aprendizagem. (A) no julgamento de adulto a longo prazo, o etanol tratou ratos exploraram significativamente mais buracos no quadrante oposto do alvo, indicando uma falha para lembrar a correta localização espacial geral (* p = 0,03). (B) durante o julgamento a longo prazo, todos os animais tratados com etanol usado uma busca sequencial de buraco-de-buraco de forma em forma de anel até que o buraco foi encontrado, Considerando que significativamente menos do soro tratado ratos empregada esta técnica (* * p = 0,004) (B D). Julgamento dia 6 resultados são retratados por uma solução salina (C) tratada mouse e mouse de etanol Tratado (D). Ratos podem direcionar uma direção geral do labirinto (C), que indica que está ocorrendo a aprendizagem espacial e o animal é provavelmente a utilizar sinais externos de cabeça para as proximidades do buraco alvo. Normalmente, o golo de quadrante é muito melhores para ratos usando esta estratégia. (D), o buraco-de-buraco sequencial pesquisa é uma estratégia de anel, onde o rato vai para qualquer borda do labirinto e parece em cada buraco para encontrar o alvo. Golo de quadrante é pobres com grande variação quando ratos usam a estratégia de anel. Barras de erro representam SEM. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Donzela em apuros. (A), a donzela em apuros arena é dividida em 9 quadrados. O rato macho é colocado em um canto e comportamento masculino é observado. O mouse feminino, preso em um contêiner de cilindro, é colocado na praça central da arena. (B) comportamento exploratório dentro da arena aumenta entre adolescência (1 mês = 1 M) e a idade adulta (4 meses = 4 M). Ratos em gerais, masculinos exploraram menos na presença de uma mulher presa. Em adição, ratos juvenis explorados menos de ratos adultos na presença da fêmea preso. (C) capacidade de resposta Social também pode ser medida pelo tempo que um rato passa na praça central onde realiza-se o rato encurralado. Jovens e adultos machos passaram mais tempo na praça central na presença da fêmea presa. Os machos juvenis (D) gastou mais tempo cavando durante seu tempo na arena na presença de uma mulher presa de rato do que quando sós. Camundongos machos (E) tocaram o tubo contendo a fêmea presa significativamente mais frequentemente como adultos do que como juvenis. (F) machos adultos também iniciados mais presos eventos contatos femininos do que os juvenis. Barras de erro representam SEM (* * * p < 0,0001, * * p 0,001, * p 0.05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O labirinto de Barnes e os experimentos de donzela em perigo são formas relativamente fácil, rápidas e baratas para avaliar aprendizagem espacial, atividade locomotora e comportamento pró-social em camundongos. Outras vantagens incluem a ausência de estressores ostensivos, dor ou restrição alimentar para o animal. Como a maioria dos paradigmas de aprendizagem/memória, uma desvantagem do labirinto Barnes é o número de ensaios requeridos pelos animais saber onde se encontra o buraco de alvo e entrar.
Coleta de dados:
Dados devem ser consistentemente se reuniram ao observar actividades e comportamentos em ambos os paradigmas do rato. Para o labirinto de Barnes, isso inclui o primeiro buraco é atingido, o número de erros/errado buracos que explora, o tempo em que atinge o buraco de alvo e o tempo em que ele entra no buraco do destino o tempo de gravação. Além disso, os investigadores devem mapear o caminho de cada rato no labirinto. Dados podem ser controlados usando um mapa de papel do labirinto Barnes ao mesmo tempo que o rato está executando o labirinto, e os números de sincronismo e o furo podem ser confirmados usando imagens de vídeo. Quando o acompanhamento do animal, pode ser útil alterar cores de caneta uma vez a cada minuto para manter o controle de explorações de buraco potencialmente sobrepostos. Sistemas de rastreamento assistida por computador estão disponíveis para garantir a precisão e confiabilidade, tais como idTracker, Ctrax ou tracktor, e alguns são livres ou open source.
Para o ensaio de donzela em apuros, dados gravados devem incluir quantos quadrados entra o macho, o tempo que leva para o sexo masculino para alcançar a fêmea, quanto tempo o macho passa na praça central, quando a fêmea presa está presente em comparação com apenas o cilindro vazio , quantos eventos contatos lá são com o cilindro, o número de vezes que os narizes de animais tocados através da câmara, e quantas vezes escavação eventos ocorreram no geral e no centro da Praça.
Constantes em testes comportamentais:
Como com todos os testes comportamentais, é fundamental que as condições sejam mantidas constantes entre e dentro de testes em animais para garantir que as variáveis ambientais não confundir os resultados do estudo. Estímulos visuais, auditivos ou olfativos no ambiente experimental podem causar mudanças de comportamento nos ratos, destinados a serem ou não13. Como tal, deve-se ter cuidado para proteger os ratos da distração de estímulos externos de14. Tanto a arena usada para o cenário de donzela em perigo e o labirinto de Barnes deve ser limpos após cada julgamento com água e higienizado com álcool 70% para garantir que nenhum indicador persistente dos ratos anteriores influencia um julgamento posterior. Além disso, roupas de cama deverão ser trocadas após cada ensaio de donzela em perigo. Coleta de dados deve sempre ser gravada em vídeo para permitir que os experimentadores rever os dados e garantir a análise precisa. Isso pode ser um desafio para o pesquisador permaneça oculto atrás de uma cortina ou não fora de vista, recolhendo os dados, mas isso é importante manter um ambiente de constante, sem distracções para os ratos.
Concepção de paradigma de labirinto de Barnes e modificações:
Existem vários paradigmas publicadas em uso para o labirinto de Barnes. Protocolos de treinamento de labirinto Barnes normalmente variam de 7-15 dias, mas o protocolo pode ser encurtado. Às vezes truncar o número de sessões de treinamento para tornar o aprendizado mais difícil a tarefa pode isolar as diferenças que os protocolos mais falta15. Ele pode ser usado com apenas uma sobrecarga de luz (como no estudo original de Barnes), ou outros elementos podem ser adicionados (por exemplo, uma luz mais brilhante, um ventilador ou um ruído), a fim de fazer com que os ratos mais motivado para entrar a fuga câmara3,16. Se você observar o pobre motivação para introduzir a caixa de destino durante um estudo-piloto, a adição destes elementos deve ser considerada durante o treinamento real.
Entrada no orifício do alvo correto ocorrerá provavelmente menos rapidamente, sem esses elementos, mas os investigadores devem estar cientes de que estas adições podem ser indutoras de stress estímulos. A presença ou ausência de estímulos contrário pode ser manipulada para avaliar a motivação para entrar no buraco do alvo. Nosso estudo mostrou que etanol pré-natal teve um efeito sobre a probabilidade de que um rato entraria o orifício de fuga durante o período de treinamento, quando utilizou-se somente a luz brilhante, e este fenômeno foi distinto aprendendo onde se localizava o buraco do alvo.
Como pode ser visto nos dias 1-4 do nosso protocolo, os ratos não estavam muito motivados para entrar no buraco, embora pareciam encontrá-lo com bastante facilidade. No entanto, quando o ruído ultra-sônico foi colocado acima do labirinto no dia 5, pontuações melhoraram na maioria das medidas de Barnes, incluindo a probabilidade de que os ratos entraria a câmara de destino depois de encontrá-lo. O barulho apareceu para reduzir drasticamente o número de inquéritos externos buraco em julgamento dia 6 e 7, e por dia, 7 nenhum rato etanol continuou explorando depois de encontrar o alvo (Figura 2A). Embora seja possível, que isto é uma consequência natural da aprendizagem do labirinto, os animais aparecem mais agitado após a introdução do ruído ultra-sônico e menos propensos a explorar o labirinto. Em ordem para a câmara manter uma situação gratificante para os ratos, os pesquisadores também devem ter cuidadosos desligar os contrário estímulos (cobrir o buraco e desligar o ruído) e permitir que o animal permanecer imperturbável na câmara pelo montante distribuído de tempo de recuperação antes de retirar o animal.
O desenho do labirinto Barnes pode ter um impacto sobre a aprendizagem e a avaliação de memória. O protocolo atual usa pistas extralabirinto. A assimetria da sala de testes, além de cartazes de quatro formas de-sobrebranco-fundo preto simples (quadrado, triângulo, círculo, Cruz) foram montados nas paredes da sala como visuais. O labirinto de Barnes pode ser resolvido com ou sem as pistas distais nas paredes da sala de testes, ou pode ser resolvido usando uma estratégia de busca serial. Devido a isso, usar apenas uma medida de "primeiro buraco de distância do alvo" pode perder diferenças relevantes na forma que o rato resolve o labirinto e não pode diferenciar espacial de habilidades não-espaciais17. Várias medidas de análise devem ser usadas, como também examinar o número de buracos explorado na Praça oposta ou o número de erros antes do alvo. O padrão de estratégia de pesquisa também pode ser analisado.
Diferentes linhagens puras de ratos podem ter desempenho variável sobre o labirinto de Barnes, possivelmente devido a diferenças na acuidade visual. Se uma cepa de ratos com pobre acuidade visual é escolhida para ser usado no labirinto de Barnes, a adição de um pequeno muro ao redor da borda do labirinto pode aumentar thigmotaxis (parede-abraçando o comportamento) e aumentar o uso de uma estratégia de pesquisa não-visuais. Os machos tinham que aprender melhor desempenho do que as fêmeas em cepas DBA/2J e C3H/HeJ, e embora só machos foram usados no protocolo atual, camundongos C57/Bl6 não foram encontrados para exibir as diferenças de gênero na memória sobre o labirinto de Barnes18.
Concepção de paradigma de donzela em apuros e modificações:
Para o experimento de donzela em perigo, uma grande limitação é que é impossível para o mouse exploratório liberar o mouse feminino, ou "donzela", do tubo no centro da arena. Redesenhando a câmara para conter um mecanismo de libertação seria uma interessante modificação futura. Uma desvantagem a donzela em perigo é a ausência de estudos comparativos utilizando o paradigma, pois é uma nova avaliação para medir o comportamento pró-social.
A donzela em perigo poderia ser ainda mais modificada para avaliar a sociabilidade (definida como a inclinação para passar o tempo com outro rato), preferência por novidade social (a inclinação para investigar um rato romance em comparação com um rato familiar), acasalamento ou agressivo comportamentos (prendendo uma fêmea no cio ou um macho novo na câmara) e questões de biologia evolutiva, como o impacto do fundo genético compartilhado sobre tendências de comportamento altruísta (a resposta para um littermate preso em comparação com um preso não-littermate rato)19.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
No Hampden-Sydney College damos reconhecimento e apreço para Sean Walden, Zach Leitner, Hunter Lee e Anton Kheirani pelo seu envolvimento em testes de protocolos para o labirinto de Barnes e experimentos de donzela em perigo. Também gostaríamos de agradecer a James Foster em Randolph-Macon College para a construção do labirinto de Barnes e Randolph-Macon College departamento de biologia para fornecer espaço de teste.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Damsel-in-Distress | |||
| 50 mL conical tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | Any brand of 50 mL conical tube will work |
| Rubber bands | Sprano Brand | n/a | Size 62, used to keep caps held to plywood |
| hammer | Grainger | 6R252 | Any standard hammer will work |
| nail (size 8D) | Grainger | 4NFE3 | Similarly-sized nails should work just as well |
| opaque, topless plastic box | AcmePlastics | CUT-TO-SIZE-ACRYLIC-CAST-BLACK-SHEET-2025 | Opaque plastic, cut to size (30 cm L x 19 cm W x 3-6 cm H). Step may be added to ensure no more than a 3.5 cm entrance depth for the mouse. |
| video camera (smartphone) | N/A | N/A | Any camera-equipped smartphone will work |
| bite-resistant gloves | Kent Scientific | GLVDYN02 | Any brand offering appropriate protection |
| transparency sheet | Staples | 954145 | Any brand of clear plastic sheet will work, used for scoring |
| Barnes Maze | |||
| Petri Dishes | Corning | 353025 | Spray painted and used as covers for Barnes maze holes |
| Plywood (3/4 in.) | LP Building Products | 22487 | To construct Barnes maze |
| Spray Paint | Krylon | 1274937 | Used to paint petri dish caps black, white paint used to paint plywood |
| Cup Hooks (5/8 in.) | Ace Hardware | 5360615 | 2 used on either side of ventral hole surfaces; Rubber band wraps around hooks to hold cap flat |
| Poster Board | Creatology | n/a | Used at edges of maze as extra cues |
| Light Bulbs | Phillips | n/a | 100W light bulb, used to during the trials |
| Rubber bands | Sprano Brand | n/a | Size 62, used to keep caps held to plywood |
| Ultrasonic noisemaker | Victor mini PestChaser | M753SN | Used as aversive stimuli |
References
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