Summary
该协议使用巴恩斯迷宫测量空间学习和记忆。一种新的遇险损伤范式被用来评估小鼠的运动活动和亲社会行为。
Abstract
巴恩斯迷宫是一个可靠的测量空间学习和记忆, 不需要食物限制或暴露在极度紧张的刺激。巴恩斯迷宫还可以评估其他鼠标行为, 如逃离迷宫平台的一般动机和探索性行为。巴恩斯迷宫可以测量基因突变或环境变量是否会影响空间记忆的获取和保留, 并提供有关小鼠所采用的搜索策略的信息。在这里, 我们使用巴恩斯迷宫来检测一个单一的发育乙醇暴露事件后, 成年小鼠的记忆缺陷。新描述的遇险破坏范式将一只雄性老鼠暴露在被困在竞技场开放中心场的一个房间里的雌性老鼠面前。它为老鼠提供了一个机会, 以社会反应被困的女性和表现亲社会的行为。遇险损伤范式也可以用来考察鼠标在新领域的行为, 并测量运动活动。巴恩斯迷宫和破坏困境协议都需要最低限度的财政投资, 测试的大部分方面都可以用普通的实验室用品构建。这些灵活且可访问的工具也可用于检测开发过程中的行为变化。
Introduction
该协议的目的是测量使用巴恩斯迷宫的小鼠的空间学习和记忆, 以及使用遇险破坏模式的社会响应和运动。常用的啮齿类动物空间学习和记忆测试包括径向臂迷宫, 它测量老鼠在多勺子装置的一个手臂中找到隐藏食物的能力, 以及莫里斯水迷宫, 它将老鼠放在一个大的浴缸或水池里,评估找到一个隐藏的水下平台所需的时间。通常情况下, 这些范例的培训跨越多个试验, 并允许通过短期和长期记忆试验测量学习获取率和保留率。
尽管无线电臂迷宫和莫里斯水迷宫是测试啮齿类动物记忆的可靠方法, 但它们给一些研究人员带来了并发症。两个迷宫使用剥夺或强烈的厌恶刺激作为增强 1。放射状手臂迷宫使用食物剥夺, 以确保老鼠有适当的动力找到食物奖励。在莫里斯水迷宫中, 强制游泳引起的压力效应可能会改变小鼠2号的结果。
巴恩斯迷宫是一个替代的空间意识任务, 需要啮齿类动物学习一个洞的位置, 以逃避明亮, 开放迷宫表面3。然后, 弱厌恶刺激 (光或声音) 被用来增加小鼠逃离平台的可能性。巴恩斯迷宫不需要食物剥夺, 所以动物的准备量比放射状手臂迷宫少。它可以使用没有冲突的研究人员谁正在调查的行为或分子与饮食, 激素调节, 或下丘脑途径。
巴恩斯迷宫也有优势比莫里斯水迷宫。它的压力比莫里斯水迷宫小, 导致小鼠4的皮质酮水平较低。此外, 它的组装要简单得多, 在测试过程和存储过程中需要的专用空间也较少。
遇险损伤试验是一个简单的两部分实验, 可以评估运动活动, 然后亲社会行为。遇险损伤法的目的是评估雄性啮齿类动物对被困雌性啮齿类动物的探索行为和社会反应能力。评估社交能力 (以及偏好社会新颖性) 的常用方法是使用 crawley 的三室社交测试, 该测试评估老鼠在靠近或远离其他老鼠5时的自由选择。
类似于克劳利的三室社交测试, 遇险测试也衡量如何在另一只老鼠面前花费时间的自由选择, 但它也为社会功能的更深层次提供了测量: 1) 在遇险损伤试验中, 被困的雌性小鼠被控制在一个开放的领域的中心, 所以男性对一个开放的领域的潜在厌恶与他的运动, 以社会探索或调查一个痛苦的女性锥形。2) 遇险破坏模型还提供了一种方法来评估亲社会和同情行为, 以回应被困的老鼠, 这在小鼠中并不经常探索。
动物移情肯定是可观察和测量的, 虽然没有多少的范式存在于这一目的。例如, 在老鼠身上, 被困的笼子伴侣可以诱发一种亲社会的动力状态, 在这种状态下, 老鼠将努力释放被困的动物。事实上, 老鼠甚至会选择在打开一个装有巧克力零食的类似容器之前帮助被困的动物, 然后进入巧克力并与新释放的老鼠分享.
小鼠的移情措施通常涉及疼痛的产生;事实上, 观察其他老鼠疼痛的老鼠自己对疼痛更敏感.约束应激是啮齿类动物特有的现象, 并与休克相结合, 以检查应激反应, 作为衡量小鼠9,10 的移情的一种尺度。
有一些伦理方面的考虑与诱发疼痛或休克, 因此需要压力诱导的替代品。我们开发了危难破坏范式, 作为在没有疼痛或休克治疗的情况下衡量同情行为的一种尺度。在我们的遇险筑鼠协议中被困的老鼠在仅仅几分钟后就显示出明显的痛苦迹象, 因为它们无法在小容器内掉头, 但它们没有受到伤害, 同时也为其他老鼠提供了应对痛苦的机会。
为了开始遇险的评估, 一只雄性老鼠被放置在一个大型的小说竞技场, 里面有一个空的小中央圆筒。探索行为记录了几分钟, 包括竞技场有多少部分被划过, 在中央空地上花费了多少时间。这种方法提供了一种快速而简单的方法来排除运动缺陷, 因为它是学习情况下的一个潜在的混合体, 需要协调运动才能成功完成。它还提供了一个基本的衡量, 以衡量对开放中心场的厌恶程度。这两种措施都可能影响巴恩斯迷宫的性能。
在最初的探索之后, 雄性被移出竞技场, 一只雌性老鼠被放置在一个封闭的、透明的中央小圆筒中 (类似于用来收集老鼠血液的圆筒)。然后, 将原来的雄性老鼠重新引入竞技场, 再次对探索行为进行评分。遇险破坏模式评估老鼠是否对基于行为模式变化的社会交往感兴趣, 当被困女性在场时 (根据在中心广场花费的时间和挖掘次数来评分), 以及鼠标对被困女性表现出亲社会行为 (根据圆筒调查的数量和与被困女性的接触事件得分)。遇险损伤试验可用于测量社会新奇的倾向 (类似于克劳利的三室社交性测试), 这取决于研究人员是否捕获了熟悉的或新颖的老鼠。
巴恩斯迷宫和遇险破坏实验结合在一起, 可以在没有极大压力的刺激下准确评估老鼠的学习能力和社会反应能力。与所有行为检测一样, 这些实验应该对动物体验非常敏感, 最大限度地减少动物所经历的不适。
与大多数迷宫一样, 运动活动的差异可能会影响巴恩斯迷宫的性能, 因此研究人员也应该评估运动活动, 特别是当使用巴恩斯迷宫评估小鼠学习的突变可能会损害运动 (如在亨廷顿病小鼠模型中发现的, 或者那些接触毒素的人, 可能会诱发多动症或延缓运动, 如乙醇)。此外, 迷宫和室内表面应彻底清洁, 并在每种动物之间更换床上用品, 以避免气味提示糖果。
重要的是, 所有材料都可以在现场制造, 只需最低限度的财务投资, 这些检测的物理足迹很小, 这意味着这些实验几乎可以在任何环境中复制, 从而具有极大的灵活性。这种无障碍环境使良好的科学能够在资源有限的较小机构或在缺乏大量支持的情况下需要迅速收集试点数据的情况下进行。
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Protocol
这里描述的所有方法都得到了汉普顿-悉尼学院或兰道夫-麦孔学院动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 的批准 (以前在那里进行过一些工作)。
1. 老鼠的基本住房
- 将老鼠放在塑料笼子里, 有坚固的底部和侧面, 还有一层柔软的床上用品和筑巢材料, 如碎纸材料。使用由碎玉米芯或木屑组成的床上用品, 并确保床上用品定期更换, 以确保卫生。
- 提供食物和水.塑料笼子的顶部有一个食物漏斗。从食物料斗中配发配制的小鼠食品颗粒, 并提供饮水机。确保保持架顶部配有空气过滤器, 以保护小鼠免受外界污染物的污染。
- 在住房设施中遵循12小时的光暗循环, 保持小鼠的自然生理节律。在一天中的同一时间进行行为测试, 最好是在动物的黑暗周期内, 比如晚上。
注: 应注意区分外壳中的小鼠。有各种方法可以区分小鼠, 如耳拳、耳标和尾巴标记。
2. 巴恩斯迷宫测试: 建筑
- 获取直径为120厘米的圆形木板。
- 在圆形周围切割20个圆形孔 (直径4.5 厘米)。将每个孔放置在距离迷宫边缘2.5 厘米和距离相邻孔13厘米的地方。
- 平滑表面并将其涂成光滑的白色 (建议使用明亮的颜色)。
- 指定迷宫板的一侧插入大约2-3 厘米远的20个孔中的每一个小杯钩, 并为每个孔放置两个挂钩 (每个孔的两侧一个)。
- 使用浅黑色 (塑料) 盘, 用钩子覆盖迷宫一侧的孔。使用挂钩固定厚的橡皮筋, 以便将磁盘固定在迷宫的底部。
- 安全地将巴恩斯迷宫安装在离地面120厘米的地方, 远离其他类似的高物体, 如桌子或椅子。一个盒子或凳子可以用来支撑迷宫的中间。
- 将每面墙上一个形状的白色大海报作为迷宫3面的超迷宫提示放置。每次试验都要在迷宫周围的墙上贴上海报。
- 在迷宫的最后一侧, 设置一个坚实的黑色窗帘来隐藏观察者, 以便在迷宫上的老鼠看不到研究人员的情况下准确记录数据。
- 将摄像机挂在竞技场上, 对整个迷宫表面有鸟图。
- 在每次小鼠试验之前和之后, 用清水清洗迷宫的每一个表面 (包括黑色的圆盘和目标盒子), 然后用70% 的乙醇溶液。
- 将 100 w 光源放置在迷宫中心25厘米处 (在试验开始时关闭), 并确保磁盘和挂钩面向地面。
注: 在测试过程中, 应关闭室内所有其他头顶灯。建议在 100 w 光旁边添加一个超声波噪声制造商。在每次试验开始时将其关闭。
3. 巴恩斯迷宫测试: 程序
注: 确保在每次试验前后用清水和70% 乙醇溶液清洗所有迷宫组件, 以便在测试恢复之前有时间完全干燥。一定要准备好清洁用品以及试验的计时器。
- 在使用可靠的识别方法的同时, 将所有小鼠分组。当老鼠没有在迷宫上积极奔跑时, 把它们放在试验室外。这是为了确保他们没有受到超声波噪音器过早。
- 用手上的爪子轻轻地把老鼠从尾巴底部捡起来, 把它们拿去处理。
- 为了训练, 让老鼠每天在迷宫上连续运行一次, 连续 7天, 以评估学习/习得。
注: 一个单一的长期试验可以在以后的日期, 以评估内存/保留率。目前的协议训练青春期小鼠从产后32天开始, 并在4个月大的成年人中进行了长期试验。 - 将每个鼠标随机分配到一个目标孔, 以便在整个测试期间使用。这些孔可以标记为1-20 在迷宫的底部或外部的迷宫周长, 在迷宫中的鼠标看不到它们。
- 将分配的孔盘更换为一个小黑匣子 (23 x 11 厘米)。使用连接到最近的挂钩的橡皮筋将其牢固地连接到巴恩斯迷宫上。
注: 目标框足够浅, 以便鼠标可以轻松地下到它或包含一个步骤, 以确保鼠标不必跳入它。 - 将鼠标放在迷宫的中心杯下, 以适应 30秒, 直到测试开始。开始视频录制。
- 打开光和超声波噪音器。通过弦机制提起杯子, 以避免偏移动物的初始标题。启动计时器, 坐在窗帘后面观察。
- 鼠标进入目标孔后, 用试验开始时使用的相同不透明杯或粘合剂覆盖孔, 关闭超声波噪音器。如果鼠标在经过5分钟后仍未进入目标, 请将鼠标合并到目标孔中。
- 确保鼠标进入孔。当鼠标在目标箱内时, 盖孔并关闭噪音器。允许鼠标在目标框中保持1分钟不受干扰。
- 虽然在整个训练期间, 每个鼠标的目标孔将保持不变, 但每天按随机顺序运行鼠标, 以确保它们不遵循前一只鼠标留下的任何 cues/气味。
4. 巴恩斯迷宫测试: 数据分析
- 在巴恩斯迷宫试验期间, 记录以下定时数据: 在迷宫上花费的总时间、查找目标的时间以及输入目标孔的时间。
- 跟踪鼠标的整体移动, 以确定在找到目标之前和之后的错误数 (探索的不正确孔数)。还要记录从目标孔到探索的第一个孔的距离 (距离是用孔的数量来衡量的), 以及任何显著的梳理行为。
- 在每次试验中, 用迷宫的图表跟踪每只动物的运动, 并使用它来分析搜索策略, 以及确定在目标对面的象限中探索的孔的数量。使用视频分析来确认路径。
5. 遇险损伤测试: 建造约束室
- 将一个透明的圆筒切割成长度等于雌性老鼠从尾巴底部到鼻尖的长度。确保气缸的尺寸使放置在里面的鼠标无法转动。
注: 我们将50毫升锥形管的锥形端切割下来, 为1个月大的小鼠制作4厘米长的管, 为4个月大的小鼠制作一根8厘米长的管。 - 盖帽的两端, 以便可以拆除和重新连接其中一个盖帽。冲孔3-4 个孔, 每个盖帽约0.5 厘米。确保孔足够大, 以便小鼠和呼吸12之间的鼻子接触.
注: 或者, 也可以使用血液采集过程中的鼠标约束设备。
6. 遇险测试: 准备竞技场
- 确保竞技场是一个不透明的无级塑料方盒, 38 x 38 厘米, 墙壁19厘米。将其均匀地填充到约2.5 厘米的高度。
注: 玉米芯床上用品使挖掘事件更容易被检测到。 - 将摄像机悬停在竞技场上, 以便整个竞技场都能看到。
7. 遇险损伤测试: 探索行为测量
- 将封闭和空的应力室放置在竞技场的中心。
- 开始使用悬挂的相机进行录制。
- 选择一只雄性鼠标。如果老鼠被标记为识别, 请注意这个雄性的身份;如果没有, 请标记此鼠标, 以便在返回到保持架后可以对其进行区分。
- 轻轻地把雄性老鼠放在竞技场左下角的杯子下面。30秒后, 通过字符串机制取出杯子。
- 允许鼠标探索 10分钟, 注意在录制过程中远离视野。在10分钟结束时, 将鼠标移出竞技场, 并将其返回到接下来的 5分钟1 2分钟的保持笼子中。
- 停止录制并使用适当的标识符保存视频文件。
8. 遇险损害测试: 社会反应措施
- 使用与探索性行为度量相同的竞技场和录制设置。
- 选择女性鼠标。如果老鼠被标记为识别, 请注意这个雌性的身份;如果没有, 请标记此鼠标, 以便在将鼠标返回到保持架后对其进行区分。
注: 根据研究问题, 可以使用垃圾、笼状或新型鼠标。如果正在执行多个试验, 请在所有试验中保持关系的类型。 - 将雌性老鼠轻轻地抓住尾巴的底部, 或在必要时通过颈部约束, 并将其降低到约束室。关闭它背后的开放端, 并确保它无法掉头。
注意: 考虑戴抗咬手套, 因为雌性老鼠会抵抗进入约束室。 - 开始使用悬挂的相机进行录制。
- 将约束室与被困的雌性老鼠放在移情竞技场的中心, 让雌性进入中心10分钟。注意远离女性的视野。
- 雌性老鼠在约束室呆了5分钟后, 用与以前相同的过程将标记的雄性老鼠放回同理心竞技场。让雄性老鼠多5分钟探索竞技场, 再次注意远离老鼠的视野。
- 停止录制并使用适当的标识符保存视频文件。
- 5分钟结束后, 将两只老鼠从竞技场上取出, 放在笼子里。用70% 乙醇12取代玉米床上用品, 对竞技场和应力室进行消毒.
9. 遇险测试: 数据分析
- 可以使用跟踪软件, 但也可以手动分析视频。一旦视频文件在计算机上可见, 将透明的工作表覆盖在屏幕上, 并使用标记勾画竞技场的正方形。把竞技场方块分成九个相等的隔间。
- 查看初始探索性度量的前5分钟的视频数据。记录交叉的隔间数量 (运动活动行为)、在竞技场中心广场上花费的时间 (露天场地厌恶)、挖掘和梳理剧集的次数, 以及鼠标触摸空中心约束的次数室。
注: 在男性10分钟的初步探索中, 没有进行第二次5分钟的评分, 也没有为10分钟的时间进行评分, 女性在男性缺席的情况下被困在中央房间。 - 在男性与被困女性重新进入竞技场后, 立即查看5分钟的社会反应措施的视频数据。记录与初始探索测量相同的数据, 但另外还记录雄性鼠标用被困的雌性鼠标触摸鼻子的次数。
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Representative Results
巴恩斯迷宫
为了说明巴恩斯迷宫是如何使用的, 我们调查了早期一次乙醇暴露是否在小鼠发育过程中造成学习差异。c57bl6 j 小鼠在产后第6天注射 2.5 g/kg 乙醇溶液 (n = 8) 或两次盐水 (n = 6), 间隔两个小时。我们在青春期 (p30) 对这些动物进行了巴恩斯迷宫的训练, 然后在成年 (4个月) 进行了一次长期试验。我们收集的数据可分为几个主要类别: 1) 按时间和错误率的准确性, 2) 目标输入, (3) 映射勘探路径。
按时间和错误率的准确性:
时间测量包括几个重要方面: 到达第一个洞的延迟 (鼠标在开始试验后调查任何第一个洞所需的时间) 将说明鼠标是否正在学习它应该去寻找逃生孔 (图 1a)。找到目标孔的延迟 (通过在目标孔的平面上初始降低鼻子来评分) 能够找到正确的孔 (图 1b)。每次训练时, 运行训练课的时间都应该减少, 这表明动物正在学习迷宫。
鼠标在定位正确的孔之前执行的错误孔调查数 (称为错误)表明动物是否能够相对地直接进入目标逃生孔。老鼠在试验过程中探索一个不正确的洞的总次数, 给出了运动活动和探索行为的初步指标。(图 1d)。所有老鼠在青春期的7天测试期间都在巴恩斯迷宫上成功接受了训练 (以产后32-39 天的每日疗程为代表), 这表现在错误率和寻找目标洞的时间减少。在训练期间, 乙醇和控制动物之间的学习没有统计差异。
目标输入率:
实际进入目标孔的延迟通常被用作成功完成迷宫的标准, 但可能不会像测试的其他方面那样提供那么多的信息。进入目标也可以分为0或1。如果鼠标在5分钟过去之前进入目标, 测试被认为是成功的, 但如果老鼠没有进入目标, 则应使用活页夹或书籍将动物聚集在目标中, 使其体验下面的房间的安全。在第一个训练日, 应该会看到进入目标的比例很低, 动物在迷宫上需要整整5分钟。在随后的几天里, 测试所需的时间应该更少。
在找到目标后出现多个错误表明进入目标箱的动机较低, 也可能检测到异常舒适性, 这种情况通常是对小鼠的厌恶 (高架平台、强光、明场、超声波噪声)。在发现目标之前犯下的错误与试验期间的洞探索总数之间的很大差异表明进入目标逃生室的动机不佳 (图 2a)。如果老鼠在发现后没有进入目标逃生孔, 明亮的灯光或噪音可以作为轻微有害的刺激添加到测试情况中。
在我们的实验中, 在测试第5天在迷宫上方添加了一个超声波噪声发射器, 以引入进入目标的额外动机。在引入超声波噪音之前, 没有经过盐水处理的老鼠进入过目标, 但引入噪音后, 入口却激增。与试验 4 (t-测试, p = 0.0014) (图 2b) 相比, 6 试验中进入目标的小鼠 (盐水和乙醇加起来) 明显多于第6期。
路径映射:
绘制鼠标路径图还可以帮助评估信息保留和学习策略。第一个探索的孔和目标孔之间的距离是目标位置内存的一个很好的指示器, 因为这跟踪鼠标首先到达的位置以及它们与目标的距离 (图 3 a)。预计在训练开始时, 这一措施会有很大的不同, 但随着老鼠了解目标位置, 所访问的第一个洞应该会向目标移动得更近。
虽然在训练期间, 乙醇和控制动物在学习方面没有发现统计上的差异, 但当这些老鼠在接受单一的长期试验 (4个月) 时, 它们作为成年人重新奔跑时, 注射乙醇的动物的时间却比较困难记住目标孔所在的位置 (图 3b)12。这种记忆保留的差异在最初的巴恩斯迷宫训练中没有发现, 因此, 在以后的时间再次使用迷宫, 使我们能够在学习记忆中发现细微的差异, 例如在单一的发育乙醇中毒事件中发现的差异。巴恩斯迷宫表面的代表性图允许研究人员绘制鼠标所走的路径图, 包括错误数和访问的第一个孔的记录 (图 3c)。
在相反象限中花费的时间相当于鼠标探索迷宫的一部分而不是其他部分的时间, 特别是与目标相反的一段时间。当老鼠在运行迷宫时, 研究人员有可能获得并计算所有其他措施, 但这一措施需要在以后进行分析。正在学习的老鼠应该减少在相反象限中探索洞的时间。在长期成人试验中, 经过乙醇治疗的小鼠在目标的相反象限中探索了更多的孔, 这表明未能记住正确的一般空间位置 (p = 0.03) (图 4a)。
将此映射测量值拆分为实际查找目标之前和之后发生的错误是很重要的。找到目标前的错误数量可以揭示是否正在进行学习, 但也可以告诉我们鼠标的搜索策略。鼠标可以采取一种策略来快速找到目标, 而不是随机访问孔。在长期试验中, 所有接受乙醇处理的动物都以环状的方式使用连续的孔到孔搜索, 直到发现这个洞, 而在接受盐的情况下, 使用这种技术的老鼠明显较少 (p = 0.004) (图 4 b)。和4d)。或者, 老鼠可以瞄准迷宫的一般方向 (图 4c), 这表明空间学习正在发生, 动物很可能使用外部线索前往目标孔附近。
遇险损坏
构建了遇险损伤场, 并利用该竞技场对 c57bl6 j 小鼠在 1m (n = 15) 和 4m (n = 12) 中的探索性和社会行为进行了测试。利用同理心竞技场, 将雄性老鼠放置在角落 (图 5a)。在小说领域, 小鼠的探索性行为被量化为5分钟内交叉的方块数。我们的结果表明, 年龄较大的小鼠 (4个月) 交叉的方块比年轻的小鼠 (1个月) (p & lt; 0.0001) (图 5b)。
接下来, 被困的女性被放置在竞技场中央的一个圆筒中 (图 5a)。一旦女性被困在房间里, 探索行为可以再次量化为方块的数量交叉。被困女性的存在影响男性的探索行为。无论年龄大小, 雄性老鼠在被困雌性的情况下探索较少。少年男性探索竞技场的次数较少 (以在被困雌性老鼠面前交叉的方块数衡量, 而不是在单独时 (在 1个月: t-测试时, p = 0.001; 平均男性单独 46条, 4.34 方块与雌性26.13±3.42 方块)。这种差异在成人中也很明显 (4个月: t-测试, p & lt; 0.000001; 平均男性仅151.5±5.31 方块与女性103.08±0.3.59 方块) (图 5b)。
此外, 还应该评估一只老鼠在5分钟时间内在中间广场花费的时间。在中心广场度过的时间应该在女性存在和不存在的情况下进行比较, 以此来衡量社会利益。我们的研究结果显示, 在被困女性在场的情况下, 男性在中心广场花了更多的时间。少年男性花在被困雌性老鼠面前的时间比单独时更多 (1个月: p = 0.05; 平均男性 13.14±2.79 s 与雌性33.42 ±9.32 s)。成人也出现了这种差异 (4个月: p = 0.001; 平均男性仅14.80±1.89 秒与女性 52.87±8.9秒) (图 5c)。
此外, 研究人员还应该量化竞技场上挖掘事件的数量, 这可能是衡量对被困女性焦虑或亲社会行为的一个尺度。这一措施在女性 1个月 (1m) 小鼠的存在下存在, 而不是 4个月 (4m) 小鼠的存在, 差异显著。少年男性在竞技场上挖掘的时间比单独在被困的雌性老鼠面前多 (1个月: p = 0.027; 平均男性单独0.4±0.27 倍, 而女性 3.2±1.09次)。成人没有出现这种差异 (4个月: p = 0.65; 平均男性单独1.33±0.54 次, 而女性为 1±0.49次) (图 5d).
男性接触含有被困雌性的约束室的次数和动物通过气孔触摸鼻子的次数是亲社会行为的指标。在我们的研究结果中, 雄性小鼠成年时接触被困雌性的管 (4个月) 明显高于幼体 (1个月) (p = 0.00001; 平均 1个月4.73±0.95 次与 4个月1592±1.64 倍) (图 5e).成年男性也引发了更多被困的女性接触事件。雄性小鼠在成年时 (4个月) 明显地比幼体时期 (1个月) 更频繁地通过气孔触摸被困女性的鼻子 (1个月) (p = 0.002; 平均 1个月3.93 ± 1次, 4个月8.67±94次)。(图 5f)。
超声波记录设备被用于倾听雌性小鼠20千赫以上的超声波发声, 也被用来倾听被困雄性小鼠在 "遇险单身汉" 反转范式中的超声发声。这两种情况下都没有发现发声, 这是意料之中的, 因为以前的研究发现, 在厌恶刺激暴露 (如身体约束或电击)期间, 没有超声发声小鼠11。
图 1: 巴恩斯迷宫精度代表结果按时间和错误率.小鼠要么注射 2.5 ggskg 乙醇溶液, 要么在产后第6天相隔 2小时, 用盐水注射。我们在青春期每天训练一次动物, 为期 7天, 然后在成年期间进行一次长期试验11。(a) 到达第一个孔的延迟 (鼠标在开始试验后调查任何第一个洞所需的时间) 显示鼠标是否正在学习查找逃生孔。(b) 找到目标孔的延迟 (通过在目标孔的平面上最初降低鼻子来打分) 能够找到正确的孔。(c) 老鼠在定位正确的孔之前进行的错误孔调查的次数 (称为错误) 表明动物是否能够相对地直接进入目标逃生孔。(d) 老鼠在试验过程中探索不正确的洞的总次数, 对运动活动和探索行为进行了初步的衡量。错误条表示 sem11。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 成功完成巴恩斯迷宫.实际进入目标孔的延迟通常被用作成功完成迷宫的标准, 但动物发现后可能不会进入目标孔。(a) 在找到目标之前犯下的错误与试验期间的洞探索总数之间的很大差异表明进入目标逃生室的动机不佳。在我们的实验中, 在试验5上加入了超声波噪声, 以诱导小鼠进入目标。(b) 与试验 4 (t-试验, p = 0.0014) 相比, 6 试验中进入目标的小鼠 (盐水和乙醇加起来) 明显多于第6期。在第7天找到目标后, 没有乙醇小鼠继续探索。错误条表示 sem. 请点击此处查看此图的较大版本.
图 3: 巴恩斯迷宫的动机.映射鼠标路径可以提供有关激励的信息。(a) 第一个探索的孔与目标孔之间的距离是目标位置内存的一个很好的指示器, 因为此测量跟踪鼠标首先到达的位置以及它们离目标的距离有多远。(b) 虽然在训练期间, 乙醇和控制动物在学习方面没有发现统计上的差异, 但当这些老鼠在接受单一的长期试验 (4个月) 时, 作为成年人重新奔跑时, 乙醇注射的动物很难记住目标孔的位置(c) 巴恩斯迷宫表面的代表性图允许研究人员绘制鼠标所走的路径图, 包括错误次数和访问的第一个洞的记录。这只老鼠在 1 6秒内直接向目标走去, 但在5分钟内从未进入目标, 随后探索了 4 1个洞。此行为表示进入目标的动机较低。错误条表示 sem. 请点击此处查看此图的较大版本.
图 4: 巴恩斯迷宫搜索策略.映射鼠标路径可以发现搜索策略并提供有关学习策略的信息。(a) 在长期成人试验中, 经过乙醇处理的小鼠在目标的相反象限中探索了更多的洞, 这表明没有记住正确的一般空间位置 (* p = 0.03)。(b) 在长期试验期间, 所有经乙醇处理的动物都以环状的方式进行连续的孔到孔搜索, 直到发现这个洞, 而在接受盐水处理的老鼠中使用这种技术的明显较少 (* * p = 0.004) (b, d)。试验第6天结果为 (c) 盐水处理的小鼠和 (d) 乙醇处理的小鼠。老鼠可以瞄准迷宫 (c) 的一般方向, 这表明空间学习正在发生, 动物很可能使用外部线索前往目标孔附近。通常情况下, 对于使用此策略的小鼠来说, 象限分数要好得多。(d) 顺序孔到孔搜索是一种环策略, 鼠标进入迷宫的任何边缘, 并在每个孔中查找目标。当小鼠使用环策略时, 象限得分很差, 变化很大。错误条表示 sem. 请点击此处查看此图的较大版本.
图 5:在痛苦中.(a) 遇险竞技场分为9个广场。雄性老鼠被放置在一个角落, 男性的行为被观察到。被困在圆筒容器中的雌性老鼠被放置在竞技场的中央广场上。(b) 在青春期 (1个月 = 1m) 和成年 (4个月 = 4m) 之间, 竞技场内的探索行为增加。总体而言, 雄性老鼠在被困雌性的情况下探索较少。此外, 幼鼠在被困雌性的情况下探索的幼鼠少于成年小鼠。(c) 社会反应能力也可以通过鼠标在被困老鼠所在的中心广场上花费的时间来衡量。在被困女性在场的情况下, 少年和成年男性都在中心广场度过了更多的时间。(d) 少年男性在竞技场上, 在被困雌性老鼠在场的情况下挖掘的时间比单独在一起的时间多。(e) 雄性老鼠在成年时接触含有被困雌性的导管的频率明显高于成年时的频率。(f) 成年男性也比青少年引发更多被困的女性接触事件。误差条表示 sem (* * * p & lt; 0.0001, * * p 0.001, * p 0.05)。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
巴恩斯迷宫和遇险破坏实验是一种廉价、快速、相对简单的方法来评估小鼠的空间学习、运动活动和亲社会行为。其他优势包括动物没有明显的压力源、疼痛或食物限制。与大多数学习记忆范式一样, 巴恩斯迷宫的一个缺点是, 动物需要多少试验才能知道目标孔的位置并进入。
数据采集：
在观察鼠标在这两种范例中的活动和行为时, 应一致地收集数据。对于巴恩斯迷宫, 这包括记录到达第一个洞的时间、它所探索的错误孔的数量、它到达目标孔的时间以及它进入目标孔的时间。此外, 研究人员应绘制迷宫上每只老鼠的路径图。在鼠标运行迷宫的同时, 可以使用巴恩斯迷宫的纸质地图来跟踪数据, 并且可以使用视频画面确认时间和孔号。在跟踪动物时, 每分钟更换一次笔颜色, 以跟踪可能重叠的洞探索, 可能是有帮助的。计算机辅助跟踪系统可用于确保准确性和可靠性, 如 idtracker、ctrax 或跟踪器, 少数是免费或开源的。
对于遇险破坏分析, 记录的数据应包括男性进入多少方块、男性到达雌性所需的时间、当被困的雌性出现时, 男性在中心广场上停留的时间与只有空的圆柱体相比, 有多少接触事件与气缸, 多少动物接触鼻子通过室, 多少次挖掘事件发生在整体和中心广场。
行为测试中的常量:
与所有行为测试一样, 至关重要的是, 在动物试验之间和内部保持条件不变, 以确保环境变量不会混淆研究结果。在实验环境中的视觉、听觉或嗅觉刺激会导致小鼠的行为改变, 不管是否有意为 13。因此, 应注意保护小鼠免受干扰外部刺激的影响.用于遇险破坏方案的竞技场和巴恩斯迷宫都应在每次试验后用水清洗, 并用70% 乙醇进行消毒, 以确保以前的小鼠不会产生挥之不去的指标影响以后的试验。此外, 床上用品应更换后, 每次在遇险的检测。数据收集应始终记录在视频上, 以便实验者审查数据并确保准确分析。对于研究人员来说, 在收集数据时隐藏在窗帘后面或在其他看不见的地方可能是一个挑战, 但这对于保持小鼠持续的、无干扰的环境很重要。
巴恩斯迷宫范式设计和修改:
巴恩斯迷宫有多个已发布的范例。巴恩斯迷宫训练协议通常从7-15 不等, 但协议可以缩短。有时, 截断培训课程的数量以使学习任务更加困难, 可以隔离较长的协议错过15的差异。它只能与头顶上的光一起使用 (如最初的巴恩斯研究), 也可以添加其他元素 (如明亮的光、风扇或噪音), 以便使老鼠更有动力进入逃生室3,16。如果你在试点研究中观察到进入目标框的动机不佳, 在实际培训中应该考虑增加这些元素。
如果没有这些元素, 进入正确的目标孔的速度可能会降低, 但研究人员应该意识到, 这些添加可能是压力诱发的刺激。是否存在厌恶性刺激可以纵 , 以评估进入目标孔的动机。我们的研究表明, 产前乙醇对老鼠在只使用强光的训练期间进入逃生孔的可能性有影响, 这种现象与实际了解目标孔所在的情况不同。
正如我们协议第1-4 天所看到的, 老鼠进入洞的动力不是很大, 尽管它们似乎很容易找到洞。然而, 当第5天超声波噪音被放置在迷宫上方时, 巴恩斯大多数测量指标的得分都得到了提高, 包括老鼠在发现后进入目标室的可能性。噪音似乎大大减少了第6天和第7试验期间的外孔调查次数, 到第7天, 在找到目标后, 没有乙醇小鼠继续探索 (图 2 a)。虽然这可能是学习迷宫的自然结果, 但在引入超声波噪音后, 这些动物确实显得更加激动, 探索迷宫的可能性较小。为了让室内对老鼠来说仍然是一个有回报的情况, 研究人员还必须小心地关闭厌恶性的刺激 (覆盖孔, 关闭噪音), 并允许动物在室内保持不受干扰的分配量。取出动物前的恢复时间。
巴恩斯迷宫的设计会对学习和记忆评估产生影响。当前协议使用额外的迷宫提示。除了测试室的不对称外, 还在房间的墙壁上贴上了四个简单的黑色在白色背景上的海报 (正方形、三角形、圆形、十字) 作为视觉暗示。巴恩斯迷宫可以解决有或没有远端提示的测试室的墙壁或可以解决使用串行搜索策略。因此, 仅使用 "与目标的第一孔距离" 测量可能会忽略鼠标求解迷宫的方式上的相关差异, 并且可能无法区分空间能力和非空间能力17。应使用多种分析措施, 例如还应检查在相反的正方形中探索的孔的数量或目标之前的错误数。还可以分析搜索策略的模式。
不同的自交系的小鼠可以有不同的性能在巴恩斯迷宫, 可能是由于视觉敏锐度的差异。如果选择视力差的小鼠在巴恩斯迷宫中使用, 在迷宫边缘添加一堵小墙可能会增加大腿轴 (拥抱墙的行为), 并增加非视觉搜索策略的使用。在 dbay2j 和 DBA/2J 菌株中, 男性的学习成绩优于女性, 虽然目前的协议中只使用男性, 但在巴恩斯迷宫18上, c57/bl6 小鼠没有发现在记忆中显示性别差异。
遇险模式设计和修改:
对于遇险伤害实验, 一个主要的限制是, 没有办法为探索性鼠标, 或 "少女", 从管在竞技场的中心。重新设计腔体以包含释放机制将是一个有趣的未来修改。困境中的一个缺点是缺乏使用范式的比较研究, 因为它是衡量亲社会行为的一种新的评估。
可以进一步修改遇险, 以评估社交能力 (定义为与另一只老鼠呆时间的倾向)、对社会新颖性的偏好 (与熟悉的老鼠相比研究一只新老鼠的倾向)、交配或好斗行为 (将女性困在雌鱼中或将新的雄性困在室内) 和进化生物学问题, 如共同遗传背景对利他行为倾向的影响 (与被困的非垃圾伴侣相比, 对被困垃圾的反应老鼠)19。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们在汉普顿-悉尼学院感谢肖恩·沃尔登、扎克·莱特纳、亨特·李和安东·凯里亚尼参与测试巴恩斯迷宫和遇险破坏实验的协议。我们还要感谢兰道夫-麦孔学院的詹姆斯·福斯特建造了巴恩斯迷宫, 并感谢兰道夫-麦孔学院生物系提供了测试空间。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Damsel-in-Distress | |||
| 50 mL conical tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | Any brand of 50 mL conical tube will work |
| Rubber bands | Sprano Brand | n/a | Size 62, used to keep caps held to plywood |
| hammer | Grainger | 6R252 | Any standard hammer will work |
| nail (size 8D) | Grainger | 4NFE3 | Similarly-sized nails should work just as well |
| opaque, topless plastic box | AcmePlastics | CUT-TO-SIZE-ACRYLIC-CAST-BLACK-SHEET-2025 | Opaque plastic, cut to size (30 cm L x 19 cm W x 3-6 cm H). Step may be added to ensure no more than a 3.5 cm entrance depth for the mouse. |
| video camera (smartphone) | N/A | N/A | Any camera-equipped smartphone will work |
| bite-resistant gloves | Kent Scientific | GLVDYN02 | Any brand offering appropriate protection |
| transparency sheet | Staples | 954145 | Any brand of clear plastic sheet will work, used for scoring |
| Barnes Maze | |||
| Petri Dishes | Corning | 353025 | Spray painted and used as covers for Barnes maze holes |
| Plywood (3/4 in.) | LP Building Products | 22487 | To construct Barnes maze |
| Spray Paint | Krylon | 1274937 | Used to paint petri dish caps black, white paint used to paint plywood |
| Cup Hooks (5/8 in.) | Ace Hardware | 5360615 | 2 used on either side of ventral hole surfaces; Rubber band wraps around hooks to hold cap flat |
| Poster Board | Creatology | n/a | Used at edges of maze as extra cues |
| Light Bulbs | Phillips | n/a | 100W light bulb, used to during the trials |
| Rubber bands | Sprano Brand | n/a | Size 62, used to keep caps held to plywood |
| Ultrasonic noisemaker | Victor mini PestChaser | M753SN | Used as aversive stimuli |
References
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