Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at isolere fucoxanthin klorofyl a/c bindende proteiner (FCP) fra kiselalger og indarbejde dem i Liposomer med naturlige lipid kompositioner at studere excitation energioverførsel ved ion sammensætning ændringer.
Abstract
Planter, alger og kiselalger fotosyntetiske ydeevne afhænger stærkt af hurtig og effektiv regulering af de lette høst og energi overførsel processer i tylakoid membran af grønkorn. Lyset høst antenne af kiselalger, de såkaldte fucoxanthin klorofyl a/c-bindende proteiner (FCP), er nødvendige for let absorption og effektiv overførsel til den fotosyntetiske reaktion Centre såvel som for foto-beskyttelse mod overdreven lys. Skifte mellem disse to funktioner er en mangeårig spørgsmål om forskning. Mange af disse undersøgelser har været udført med FCP i vaske-og rengøringsmidler micelles. For interaktion undersøgelser, er vaske-og rengøringsmidler blevet fjernet, hvilket førte til en uspecifik sammenlægning af FCP komplekser. I denne tilgang er det svært at skelne mellem kulturgenstande og fysiologisk relevante data. Dermed kan mere værdifulde oplysninger om FCP og andre membran bundet lys høst komplekser fås ved at undersøge protein-protein interaktioner, energioverførsel og andre spektroskopiske egenskaber, hvis de er indlejret i deres native lipid miljø. Den største fordel er, at Liposomer har en defineret størrelse, og definerede lipid/protein forholdet som omfanget af FCP klynger styres. Yderligere, kan ændringer i pH og ion-sammensætning, der regulerer lys høst i vivo nemt simuleres. I forhold til tylakoid membran er Liposomer mere homogen og mindre komplekse, hvilket gør det lettere at opnå og forstå spektroskopiske data. Protokollen beskriver proceduren med FCP isolation og rensning, Liposom forberedelse og indarbejdelse af FCP i Liposomer med naturlige lipid sammensætning. Resultater fra en typisk anvendelse er givet og drøftet.
Introduction
Fotosyntetiske organismer såsom kiselalger skal håndtere skiftende lysforhold og reagere med sofistikerede acclimation mekanismer, at opretholde høje fotosyntetiske effektivitet og beskytte fra foto-oxidative skader forårsaget af overdreven lyset. En større lys-beskyttende proces i fotosyntetiske eukaryoter er høj energi quenching (qE) af absorberet lyset, der forekommer som det vigtigste bidrag til den ikke-fotokemisk quenching (NPQ) under lys stress betingelser1,2 ,3. De lette høst antenne komplekser (LHC) er involveret i reguleringen af excitation energi overførsel veje. Som reaktion på høje lys induceret lav pH i grønkornets lumen, antenne system skifter fra lyset høst tilstand til tilstanden quenching. Denne energi dissipative tilstand beskytter bannersystem (PS) og andre komplekser i tylakoid membran fra foto-oxidation. I fotosyntetiske eukaryoter, er qE normalt forårsaget af to faktorer1,2,3. En faktor er den specialiserede lys høst protein, der reagerer på den lave pH. PsbS protein inducerer qE i højere planter4. LhcSRs5, moduleret af PsbS aktivitet, fremkalde qE i grønalger6. Kiselalger besidder Lhcx-lignende proteiner, som strukturelt relateret til LHCSRs7,8,9,10.
Den anden faktor af qE er den xanthophyll cyklus hvor carotenoider antennen er omdannet til en foto-beskyttende form af de-epoxidation og vendt af epoxidation. I planter og grønalger konverteres violaxanthin til zeaxanthin. I kiselalger, er diadinoxanthin konverteret til diatoxanthin, som derefter korrelerer med omfanget af NPQ11. Diatom lys høst antenne besidder nogle særheder, selv om det er evolutionær relateret til plante og alge LHCs. Skiftet fra lys høst til foto-beskyttelse er enormt hurtigt og NPQ kapacitet er højere sammenlignet med planter12. Dette kan være en af grundene til hvorfor kiselalger er meget vellykket i forskellige økologiske nicher på en måde, som de er ansvarlige for op til 45% af det oceaniske netto primærproduktion13. Diatom lys høst systemer er derfor et interessant objekt af fotosyntese forskning.
Kiselalger, ligesom de centriske arter Cyclotella meneghiniana, besidder tylakoid iboende lys høst systemer opkaldt efter pigmenter de binde - fucoxanthin, klorofyl (chl) a og c, dermed FCP. lys høst proteiner, såsom FCPs, er indlejret i tylakoid membran system bestående af flere membran lag. Kiselalger danner bands af tre tylakoiderne. Dette kompleks situation gør det vanskeligt at studere dem på det molekylære niveau i tylakoid membran. Desuden, bidrager mange komponenter til reguleringen af lys høst (se ovenfor). Derfor, i mange tilgange, komplekser blev isoleret fra membranen bruge milde rengøringsmidler, som n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside (β-Bettinas), som solubilize membranen men holde FCP komplekser intakt. Mange spektroskopiske undersøgelser blev udført ved hjælp af solubilized FCP for at undersøge intramolekylære energi overførsel14,15,16,17. Denne tidligere tilgang var imidlertid begrænset, da forordningen af energioverførsel behov for excitonic interaktion med andre antenne komplekser eller bannersystem. Derfor, disse former for undersøgelser kan ikke foretages med solubilized komplekser fordi samspillet mellem komplekser er tabt.
En vigtig funktion i antenne forordning er "Molekylær fortrængning" af antenne og bannersystem i tylakoid membran18. Tidligere, en enkel tilgang blev udført for at simulere denne effekt in vitro-. Vaskemidlet blev fjernet, hvilket fører til tilfældige sammenlægning af antenne komplekser. Selv om nogle rimelig data er opnået ved denne tilgang17,19, vaskemiddel fjernelse afspejler ikke situationen i vivo og har nogle begrænsninger, da komplekser ikke interagere i deres regelmæssige tertiær struktur.
Brug af Liposomer overvinder flere af de tidligere begrænsninger. Den tertiære struktur er stadig fuldt intakt. Liposom membran giver en kvasi indfødte miljø for antenne komplekser. Membranen adskiller indersiden af Liposom fra omgivelserne. Med disse midler giver Liposomer to reaktion rum for undersøgelser af ion og pH stigninger såvel som for transport processer. Yderligere, kan parametrene af ordningen for eksperimentel styres lettere for studier i tylakoid membran. Liposomer var allerede vist sig at være et udmærket redskab til at studere fotosyntetiske komplekser. En stor fokus i fortiden var på anlægget LHC hvor effekten af ændret lipid sammensætning blev testet på LHC II20. I andre tilgange, protein-protein interaktion mellem forskellige LHC II var undersøgte21. Også, nogle undersøgelser i grønalger blev udført at beskriver spontan klyngedannelse mellem LHC22. I betragtning af betydningen af kiselalger for vandøkosystemer, forholdsvis få undersøgelser blev udført med antenne komplekser af kiselalger. To studier undersøgt antenne komplekser af den centreret Cyclotella meneghiniana, hvor klynger af FCP antenne23 og lydhørhed af FCP til elektrokemiske gradienter24 blev vist. Liposomer er således et fremragende værktøj til at studere diatom antenner og deres interaktion og forordning i næsten oprindelige betingelser. Liposomer er alsidige siden mange betingelser som lipid sammensætning, Liposom størrelse, protein tæthed og den omkringliggende vandige fase kan kontrolleres. Metoden kræver desuden lavt beløb af prøver. Den eksperimentelle system er robust og meget reproducerbare. Opdelingen i Liposomer giver mulighed for at studere pH og ion forløb, som er vigtige faktorer i reguleringen af antenne komplekser.
Her beskriver vi isolering af FCP antenne komplekser fra C. meneghiniana og deres inkorporering i Liposomer med naturlige tylakoid lipid sammensætning. Også, vi leverer eksemplarisk data for spektroskopiske karakterisering af solubilized FCP og sammenligne dem med FCP i Liposomer. Metoden opsummerer viden og standardiserede protokoller fremstillet af forbedringer af Gundermann og Büchel 201223, Natali et al. 201622og Ahmad og Dietzel 201724.
Figur 1: skematisk gengivelse af arbejdsprocessen. (1) henviser til punkt 1, som beskriver cellevækst, forstyrrelser og tylakoid isolation med følgende FCP adskillelse på saccharose tæthed gradienter; C. m. -Cyclotella meneghiniana celler. (2) udarbejdelse af naturlige tylakoid lipid blanding (MGDG, DGDG og SQDG) er beskrevet i stk. 2 og oprettelsen af lipid-vaskemiddel micelles med octylglycoside (OG). En defineret lipid-micelle størrelse opnås ved ekstrudering ved hjælp af membraner af defineret porestørrelse. FCP og lipid-micelles er samlet på en foruddefineret lipid: forhold mellem protein og vaske-og rengøringsmidler OG og β-Bettinas er fjernet via kontrollerede dialyse danner FCP proteoliposomes. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Fotosyntetiserende komplekser såsom FCPs er yderst sårbare over for lys og varme. Altid arbejde på isen og under en meget svagt lys.
1. isolering af FCP fra celler
-
Tylakoid isolation fra C. meneghiniana celler
- Vokse C. meneghiniana i fem 500 mL målekolber hver fyldt med 300 mL af ASP-medium23,25 og 50 millioner celler. Tilslut kolber med en prop, bomuld og tillade celler til at vokse til den eksponentielle vækstfase for ca en uge på en shaker på 120 rpm med en 16 h lys og 8 h mørke fase på 40 µmol photons/(m²s) hvide lys og en temperatur mellem 15-18 ° C. Kontroller, at celle nummer er mellem 1,5-2 millioner celler/mL med en celle counter kammer.
- Der centrifugeres celler på 4.000 x g i en forkølede rotor med 500 mL centrifugeres hætteglas (4 ° C) i 15 min. i en højhastigheds centrifuge. Genopslæmmes celle pellets i 12 mL af homogenisering buffer (HB, tabel 1) af pipettering.
- Overføre suspension til en enkelt 50 mL plastikrør. Gemme prøver på-80 ° C eller gå videre til trin 1.1.3.
- Pre cool perle mill og udstyr. Fylde 50 mL bægerglas perle møllen til 75% med et glas perle blanding og tilføje cellesuspension. For afbrydelse af celle, bruge 7 x 45 s pulser i fuld fart med 30 s af køling mellem hver puls. Tage 20 µL af forstyrret celler for kvalitetskontrol i trin 1.1.6.
- Filtrere de forstyrrede celler over et glas filter tragt og vask ved at hælde HB over glasperler, indtil de vises tydeligt. Pool vask brøkdel med filtratet. Holde den endelige mængden lavere end 150 mL.
- Der centrifugeres prøve for 15 min på 140 x g ved hjælp af tre 50 mL plastik rør til pellet celle debris. Omhyggeligt overføre supernatanten til 20 mL polycarbonat ultracentrifugering hætteglas og kassér pelleten.
- Fyld hætteglassene med HB, reagensglasset vægten og centrifugeres i et egnet rotor for 1 h på 300.000 x g og 4 ° C og pellet tylakoid membraner.
- Bruge centrifugeringstiden for at kontrollere andelen af forstyrret celler ved mikroskopi på 400 X forstørrelse med 20 µL prøven taget i 1.1.3. Beregn forholdet mellem grønkorn gratis og grønkorn indeholdende frustules (silica skaller).
Bemærk: Diatom cellevægge er lavet af kvarts, der kan ses som meget diffracting stof i mikroskopet. Kloroplaster forekommende som grønne prikker bør er blevet frigivet fra celler hvis den celle forstyrrelser arbejdede. - Genopslæmmes membran pellet med som lille vask buffer som muligt (0,5-1 mL) ved hjælp af en lille maler penslen. Fyld polycarbonat ultracentrifugering hætteglas med vask buffer (tabel 1), reagensglasset deres vægt og centrifugeres i 20 min. på 200.000 x g og 4 ° C.
- Genopslæmmes vasket membraner med en maler penslen. Tilføje vask buffer, kun hvis det er nødvendigt at holde tylakoid koncentrationen så høj som muligt. Samle alle Tylakoider i én prøve hætteglas (15 mL).
- Pre Fortynd prøver ved hjælp af 10 µL af prøven med 90 µL af 100% acetone. Der centrifugeres ved 12.000 x g for 5 min at sammenpresse bundfaldne proteiner. Tag 10 µL af predilution og bland det med 990 µL af 90% acetone.
- Absorbansen (ABS) af klorofyl a og c på 664 nm og 630 nm i 90% acetone. Subtrahere ABS750nm fra begge værdier. Bestemme den samlede klorofyl indhold ved hjælp af følgende formel:24
1)
2)
- Absorbansen (ABS) af klorofyl a og c på 664 nm og 630 nm i 90% acetone. Subtrahere ABS750nm fra begge værdier. Bestemme den samlede klorofyl indhold ved hjælp af følgende formel:24
- Alikvot Tylakoider i dele af 0,5 mg af samlede klorofyl i en 1,5 mL reaktion rør, fryse dem i flydende nitrogen og gemme dem på-80 ° C indtil videre anvendelse.
-
Adskillelse og koncentration af FCP komplekser
- Forberede en gradient rørsukkeropløsning og fylde ultracentrifuge rør indtil toppen minus lastning volumen (300-500 µL). Fryse rør ved-20 ° C, indtil de er helt frosset. Tillad rør til at tø ved + 4 ° C, som tager 3-4 h for en 17 mL tube.
- Gentag fryse-tø cyklus to gange for at forfine gradient for bedre opløsning.
- Bruge de prøver i 1.1.9 svarende til 0,5 mg af klorofyl og justere med buffer B1 (tabel 1) til en endelige mængden af 2 mL. Oploesning, tilføje n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside (b-Bettinas) til en slutkoncentration på 20 mM.
- Vend røret 3 gange og placere den på is i 20 min. med blid ryste for at undgå skum. Der centrifugeres i 5 min på 12.000 x g i en pre afkølede bordplade centrifugeres ved + 4 ° C.
- Indlæse supernatanten på farveforløbet. Læg ikke mere end 125 µg af samlede klorofyl pr. forløb, hvis 17 mL hætteglas er brugt. Der centrifugeres i 22 h på 100.000 x g og + 4 ° C.
- Gendanne de ønskede brune FCP fraktioner fra forløb ved hjælp af en sprøjte (figur 2A). Tage en 5 µL alikvot og fortynd det med 995 µL af B1a.
- Måling af absorbans (ABS)-spektrum mellem 370-750 nm i en UV-VIS-Spektrofotometer. Bruge semi-mikro optisk glas kuvetter.
- Åbn spectra manager software, gå til spektrum tilstand og optage en baseline fra 370 til 750 nm efterfulgt af stikprøve målinger. Brug følgende indstillinger: Skan hastighed, 200 nm/min. data pitch, 0,5 nm; svar, medium.
- Måle volumen af den gendannede prøve med en mikropipette. Vask FCP komplekser ved at tilføje to gange den gendannede volumen med B1 buffer (tabel 1). Koncentrere sig i en membran koncentrator med en 30 kDa cutoff på 1.000 x g og + 4 ° C til en ABS672nm på mindst 20.
Bemærk: B-Bettinas koncentrationen kan stige på grund af micelle berigelse i stikprøven rum. Dette kunne føre til yderligere oploesning af FCP komplekser! Undgå overdreven oploesning ved at tilføje vaskemiddel gratis buffer B1 hvis yderligere vask trin er nødvendige for at fjerne resterende saccharose. - Tag en 20 µL alikvot for kontrolelementerne. Chok fryse prøverne i flydende nitrogen og opbevar dem ved-80 ° C.
- Forberede en gradient rørsukkeropløsning og fylde ultracentrifuge rør indtil toppen minus lastning volumen (300-500 µL). Fryse rør ved-20 ° C, indtil de er helt frosset. Tillad rør til at tø ved + 4 ° C, som tager 3-4 h for en 17 mL tube.
Figur 2: rensning af FCP, spektroskopiske kontroller og renhed check. (A) typiske udseende af en saccharose tæthed farveforløb efter natten centrifugering. Alle brune bands indeholder FCP pool bestående af FCPa og FCPb. pigm. - ubundet pigmenter, PS - bannersystem (B) absorbans spektre af FCP før (blå linje) og efter (orange stiplede linje) koncentration ved hjælp af centrifugal filter enheder med 30 kDa cutoff . Især, er carotenoider tilbøjelige til tab fra FCP, hvilket ville resultere i lavere absorbans i området mellem 500-550 nm. Grafer er normaliseret til klorofyl Qy maksimum ved ~ 670 nm. (C) klorofyl a emission spektre med excitation af chl c (465 nm) til at teste funktionelle excitation energioverførsel. Hvis energien overførsel af chl c til chl en hæmmes, en yderligere fluorescens band på ~ 640 nm (chl c) ville forekomme. Grafer er normaliseret til maksimal emission. (D) Excitation spektre registreres på 675 nm (chl en maksimal fluorescens) til at teste energioverførsel til chl en fra alle pigmenter absorberende mellem 370 nm og 600 nm. Hvis energien overføres til chl en er mindre effektive, fluorescens udbyttet ville falde især mellem 465 og 550 nm. Graferne er normaliseret til maksimum omkring 440 nm. Spektre (b), (C) og (D) er næsten identiske, hvis koncentrationen fungerede godt. (E) Kontroller for renhed af den isolerede FCP ved hjælp af en Tris-tricine gel28. FCPa og FCPb er underenheder mellem 18-19 kDa. Alle synlige sølv-farvede proteiner større end 20 kDa er forurenende stoffer. Thyl. -Tylakoiderne venligst klik her for at se en større version af dette tal.
-
Spektroskopiske og gel-baserede kontrol
- Optage absorbans mellem 370-750 nm af 5 µL af FCP i 995 µL af B1a efter trin 1.2.5. Sammenlign det med spektret opnået i trin 1.2.4. Bruge de samme indstillinger som beskrevet i trin 1.2.4 og instrumentation.
- Eksportere data som *.csv og importere dataene til et regneark. Normalisere begge spectra til maksimum af chl en i Qy band af omkring 672 nm som afbilledet i figur 2B.
- Beregne fortyndingsfaktoren prøver fra trin 1.2.4 og 1.3.1 ved at dividere den målte ABS672nm af den ønskede ABS672nm af 0,03. Fortynde prøverne i overensstemmelse hermed med B1a og overføre dem til specialglas fluorescens kuvetter.
- Optage chl et fluorescens emission spektrum med en spectrofluorometer til at afsløre intakt lys energioverførsel fra chl c til chl en (figur 2 c).
- Bruge spektrometer software og gå til tilstanden spektrum måling med følgende indstillinger: tilstand, emissioner; snitte bredde excitations- og, 3 nm; følsomhed, mellemstor; scanning hastighed, 100 nm/min. data pitch, 0,5 nm; excitation bølgelængde, 465 nm; emission, 600-800 nm. Udføre autozero og foranstaltning.
- Optage excitation spektre med samme prøve- og udstyr til at afsløre intakt energioverførsel fra alle pigmenter til chl en (figur 2D). Ændre indstillinger til: tilstand, magnetisering; emission bølgelængde, 675 nm; excitation, 370-600 nm. Optage spektre.
- Rette med en rodamin spektrum i samme interval for spektrale egenskaber af lampe- cf. instruktionerne i brugervejledningen.
- Mix FCP prøver svarende til 1 µg af chl en med 10 µL af SDS-loading bufferen. Der inkuberes i 10 min. ved 25 ° C. Der centrifugeres i 5 min på 12000 x g i en bordplade centrifuge.
- Indlæse supernatanten på et Tris-tricine gel28. Adskille det i 2 timer ved 150 V og sølv-pletten det efter separation40.
Bemærk: FCP underenheder separat i to fremtrædende protein bånd mellem 18-19 kDa, der er bestanddele af FCPa og FCPb29 (figur 2E).
- Indlæse supernatanten på et Tris-tricine gel28. Adskille det i 2 timer ved 150 V og sølv-pletten det efter separation40.
- Optage absorbans mellem 370-750 nm af 5 µL af FCP i 995 µL af B1a efter trin 1.2.5. Sammenlign det med spektret opnået i trin 1.2.4. Bruge de samme indstillinger som beskrevet i trin 1.2.4 og instrumentation.
2. forberedelse af Liposomer og indarbejdelse af FCP
-
Forberedelse af lipid blanding og lipid vaskemiddel micelles
Bemærk: lipider er modtagelige for varme temperaturer kombineret med oxidative betingelser. Prøv at holde lipider, kølet og under en N2 atmosfære.- Beregne de ønskede tylakoid lipid nøgletal for C. meneghiniana ifølge Vieler et al. 200730. Henvise til eksemplet i supplerende tabel 1. Forberede lipid stamopløsninger anbefales af fabrikanten i et opløsningsmiddel bevis beholder.
- Tilsæt den ønskede mængde af lipider i et 2 mL reaktion rør og fordampe chloroform ved hjælp af en blid kvælstof flow og forsøge at sprede lipider over hele området med tube base. Lad N2 flow, indtil alle opløsningsmidlet er fordampet.
- Solubilize lipid blandingen i 29 µL af n-octyl β-D-glucopyranoside løsning (OG) ved 4 ° C i 4 h. Incubate lipid blandingen i 10 min ved 30 ° C. Inkuber lipider i en sonikator bad i 3 x 3 min. ved 25 ° C afbrudt af 30 s på is.
- Tilføje 221 µL af tricine buffer og 250 µL af 4 x dialyse buffer.
- Bruge en ekstruder med 0,1 µm polycarbonat membraner til en defineret Liposom diameter på 50-70 nm. Samle ekstruder med membran og filter støtte. Undgå luftbobler og stramme forsamlingen grundigt.
- Fyld en sprøjte med 4 x dialyse buffer og pre våd ekstruder, indtil ingen bobler kan ses i den anden sprøjte.
- Gælde ekstruder lipid-vaskemiddel-micelles og tryk på løsning fra en sprøjte til den anden frem og tilbage. Gentag dette trin 5 gange, indtil løsningen vises homogen.
Bemærk: Denne opløsning kan opbevares ved 4 ° C i flere dage. Ikke Frys!
-
Indarbejdelse af FCP komplekser og fjernelse af vaske-og rengøringsmidler og aggregater
Bemærk: I dette eksempel bruger vi et lipid/chl forholdet 12:1, der svarer til et lipid/protein-forhold på ca 100: 1.- Tilføje FCP svarende til 20 µg af chl et i en samlet maengde paa 500 µL af B1a buffer til 250 μL af de ekstruderet lipid-micelles og 250 µL af 4 x dialyse buffer. Inkuber prøverne til 3 x 3 min. ved 25 ° C i en thermomixer på 1.500-3.000 rpm afbrudt af en 30 s pause på is.
- Skære låget af fire 1,5 mL reaktion tube lige under toppen giver en ring, som stadig passer på låget. Forberede 1,5 cm x 1,5 cm stykker af dialyse membran og vaske dem i 20 mL af 1 x dialyse buffer
- Fylde 250 µL af prøven til hver låg. Omhyggeligt, lå membranen på låget, så at rummet er helt fyldt med prøven og ingen luftbobler opstå. Stramme reaktion tube ring på forsamlingen for at have et lukket rum.
- Dialyze prøver i 50 mL af 1 x dialyse buffer natten over (12-16 h) på isen på en tumbling shaker. Udskift brugte dialyse buffer med frisk og tilføje 7 mg af adsorbent perler til at fjerne de resterende rengøringsmidler til mindst 6 h.
- Erstatte dialyse buffer igen og dialyze for en anden 12 h. genoprette Liposomer ved piercing dialyse membran med en 200 µL mikropipette spids og Opsug alle Liposomer fra reaktion tube låg.
- Valgfrit trin: Hvis høj renhed (> 95%) er nødvendig. Forberede et diskontinuert tæthed farveforløb i 17 mL ultracentrifugering hætteglas med trin der indeholder 6%, 10%, 15% og 20% saccharose epichlorhydrin copolymer i dialyse buffer. Indlæse Liposomer på toppen og ultracentrifuge på 100.000 x g for 4 h i en swingende spand rotor.
- Genoprette den øverste brun band med en sprøjte, Fortynd prøven 1:5 med DP og gå videre til næste trin.
- Centrifugeres FCP Liposomer i mindst 2 mL 1 x dialyse buffer for 1,5 h på 100.000 x g og 4 ° C. Genskab Liposomer ved at dreje centrifugeglasset i en vinkel på 45°. Tillad Liposomer til at flytte for 1 min (figur 3A).
- Genoprette FCP Liposomer i en endelige mængden af 25-50 µL. undgå at forstyrre bundfaldet.
-
Kontrol 1: absorbans, fluorescens spektroskopi
- Tilføje en 3 µL alikvot af FCP-Liposomer til en 1 mL endelige mængden af 1 x dialyse buffer, og der centrifugeres i 5 min på 12.000 x g.
- Optage absorbans mellem 370 og 750 nm i FCP-Liposomer med det samme udstyr, som beskrevet i 1.2.4. Normalisere spektrum til maksimum i regionen Qy i chl en (670-680 nm) og sammenligne det med den normaliserede spektrum af solubilized FCP (figur 3 c).
- Forberede FCP-Liposomer i 1 mL af DP med en absorbans (ABS) = 0,03 med hensyn til maksimalt mellem 670-680 nm. Justere den solubilized FCP i vaskemiddel fra trin 1.2.6 til samme ABS fortynding med B1a.
- Optage absorbans spektre af begge prøver som beskrevet i 1.2.4. Optage chl et fluorescens emission spektrum af begge prøver som beskrevet i 1.3.3.
Bemærk: Fluorescens udbytte er faldet i FCP-Liposom prøve (figur 3D og jf. diskussionen.)
- Tilføje en 3 µL alikvot af FCP-Liposomer til en 1 mL endelige mængden af 1 x dialyse buffer, og der centrifugeres i 5 min på 12.000 x g.
Figur 3: isolering af FCP proteoliposomes efterfulgt af spektroskopiske kontrol og konfokal billeddannelse. (A) inddrivelse af FCP Liposomer efter centrifugering. Centrifugering tube til 45° og vent ca. 1 min. - Liposomer vil flytte paa FCP aggregater som ikke er indarbejdet i Liposomer stick til rørvæggen. (B) sammenligning af absorbans spektre af solubilized FCP i vaskemiddel (blå) og FCP i Liposomer (orange) (C) de samme spektre som i (B) normaliseret til chl højst i den røde region (~ 670 nm - Qy peak); solubilized FCP i vaskemiddel (blå) og FCP i Liposomer (orange). Potentielt, kunne der ses en pigment tab hovedsagligt af carotenoider i regionen 500-550 nm. Klynger af FCP i Liposomer kan føre en topforbredning og en lille forskydning af chl højst (~ 670 nm) til røde. (D) Emission spektre af solubilized FCP i opvaskemiddel og FCP i Liposom. Klynger af FCP i Liposom forbedrer energetiske vekselvirkninger mellem FCP komplekser, som sænker fluorescens udbytte (orange kurve) og skifter emission maxima lidt til røde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen beskriver isolering af samlede FCP fraktion fra Cyclotella meneghiniana og indarbejdelse i Liposomer med indfødte lipid sammensætning. Isolation tylakoid er yderst reproducerbare, men tylakoid udbytte kan ændre. Resultatet er acceptabelt, hvis mere end 50% af alle pigmenter er inddrevet i trin 1.1.4. Mere end 80% er optimal.
Oploesning af tylakoiderne er et kritisk skridt. Godt solubilized membraner opnås hvis supernatanten efter trin 1.2.2 indeholder de fleste af pigmenter. Adskillelse af FCP bannersystem er godt, hvis en tydelig brun (FCP) og en grøn (PS) band er identificerbar (figur 2A). En fremtrædende gullig brøkdel på toppen af gradient er en indikation for pigment tab på grund af overdreven oploesning. Pigment tab opstår i hvert præparat. Det er acceptabelt at en vis grad, så længe funktionaliteten af energien overføres til chl en er ikke påvirket (figur 2 c, 2D). Også, FCP berigelse trin (1.2.4) kan fremkalde yderligere oploesning og pigment tab på grund af ledsagende vaskemiddel berigelse. Forskelle i de normaliserede absorbans spektre er en indikation for pigment tab (figur 2B), som ofte opstår i den spektrale region mellem 500-550 nm hvor carotenoider absorbere. Pigment tab er acceptabel, hvis komplekser er stadig funktionel. Det betyder, at ingen større forskelle forekomme i emission spectra og excitation spektre (figur 2 c, 2D). For emission spektre, chl c er fortrinsvis ophidset på 465 nm og overførsler alle excitation energi til chl a, som udsender på ~ 675 nm. Hvis chl c til chl en energioverførsel er forstyrret, chl c udsender på ~ 640 nm. I excitation spektre, energien overføres til chl et overvåges ved at ændre excitation bølgelængde fra 370-600 nm. I den spektrale spænder fra 370-440 nm hovedsagelig chl en er spændt. Excitation omkring 465 nm favoriserer chl c. I sortiment > 500 nm carotenoider, hovedsageligt fucoxanthins, er glade. Energi transmission påvirkes, hvis chl c og carotenoider bidrager mindre til chl et fluorescens. Derfor, fluorescens udbytte falder i disse spektrale regioner i henseende til chl en excitation mellem 370-440 nm.
Den ønskede renhed af prøven afhænger af formålet med undersøgelsen. For eksempel, er det vigtigt at adskille bannersystem fra FCP til spektroskopiske målinger, mens ikke-pigmenterede proteiner griber mindre med målingerne. Her 95% renhed er tilstrækkelig høj (figur 2E). For massespektrometriske metoder udelukkende, bør FCP underenheder være synlige på en sølv-farvet gel.
Kvalitetskontrol af Liposom forberedelse er svært at overvåge og kan kun ses i slutningen af protokollen (2.2.5, figur 3A). FCP komplekser er ødelagt hvis deres farve fra brun til oliven grøn. Et godt resultat er, hvis en brun Liposom brøkdel er indsamlet. Procentdelen af Liposomer gendannede vs aggregerede pellet er optimalt > 70%. Indarbejdelse af FCP i Liposomer kan igen føre til mindre pigment tab. En sammenligning af normaliserede absorbans spectra før og efter iblandingen ses hvis pigmenter gik tabt (figur 3B, 3 C). Nogle absorbans toppene af FCP-Liposomer vises bredere og absorption i den røde spektrale region (~ 670 nm - den såkaldte Qy band) af chl en måske være lidt rød-forskudt. Dette sker på grund af klynger af FCP i Liposom. Chl et fluorescens udbytte skyldes FCP i Liposomer er i høj grad reduceret på grund af excitonic interaktion i FCP klynger (figur 3D, cf. diskussion).
En typisk eksperiment med Liposomer gør brug af den Liposom to reaktion rum adskilt af et lipid tolagede, der giver mulighed for pH eller elektrokemiske gradienter. I et eksempel er virkningen af en kalium ion gradient på FCP fluorescens udbytte blev testet (figur 4A). Fluorescens udbyttet blev målt i overværelse af standard buffer. Fluorescens dråber med 30% hvis KCl blev tilføjet. K+ gradient blev udgivet af kalium bestemt ionophor valinomycin, som genskaber FCP fluorescens til den indledende niveau (figur 4B). Disse ændringer i fluorescens bestyrker den hypotese, at FCP komplekser reagere på kalium ion koncentration gradienter24 in vivo.
Figur 4: typisk eksperiment med FCP Liposomer viser ændringen af FCP fluorescens i svar til en elektrokemisk gradient induceret af KCl. (A) Eksperimentelle ordningen: 1. FCP chl fluorescens i dialyse buffer. 2. tilsætning af 20 mM KCl inducere en elektrokemisk gradient. 3. afslapning på graduering af K+ selektive ionophor valinomycin (4 µM). (B) slip af FCP fluorescens (675 nm) som svar på et K+ gradient (blå) og restaurering af den samme fluorescens udbytte som før (orange) af afslapning af gradient (grå). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| buffere / blandinger | sammensætning | |
| celle vækst & | Kunstigt havvand i henhold til | 86 mM NaCl |
| tylakoid forberedelse | Provasoli, 1957 (ASP)25 | 21 mM KCl |
| 4 mM Tris | ||
| 8.1 mM MgSO4 | ||
| 11.8 mM NaNO3 | ||
| 0.58 mM K3HPO4 | ||
| 0.16 mM H3BO3 | ||
| 2 mM silica | ||
| pH 7,7 (H2så4) | ||
| autoklave | ||
| tilføje sterile: 2,72 mM CaCl2 | ||
| tilføje sterile: 0.012 mM FeCl3 | ||
| tilføje sterile: 0.092 mM EDTA | ||
| tilføje sterile: 0,02 mM frihedsbevægelse2 | ||
| tilføje sterile: 0.002 mM ZnCl2 | ||
| tilføje sterile: 50 pM CoCl2 | ||
| tilføje sterile: 25 pM Na2MoO4 | ||
| tilføje sterile: 22.5 pM CuCl2 | ||
| homogenisering buffer | 10 mM MES | |
| 2 mM KCl | ||
| 5 mM EDTA | ||
| 1 M sorbitol | ||
| pH 6,5 (KOH) | ||
| vask buffer | 10 mM MES | |
| 2 mM KCl | ||
| 5 mM EDTA | ||
| pH 6,5 (KOH) | ||
| glas perle blanding | 75% 1 mm perler | |
| 25% 0.4 mm perler | ||
| acetone | 90% (v/v) med H2O | |
| flydende kvælstof | ||
| FCP rensning | n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | 10% (w/v) i H2O |
| buffer B1 | 25 mM Tris | |
| 2 mM KCl | ||
| pH 7,4 (HCl) | ||
| buffer B1a = B1 + b-Bettinas | 0,03% (w/v) endelige | |
| gradient rørsukkeropløsning | 19% saccharose (w/v) i B1a | |
| Liposom forberedelse | lipider Se supplerende tabel 1 | |
| N2 gas | ||
| n-octyl β-D-glucopyranoside (OG) | 10% (w/v) i B1a | |
| tricine buffer | 20 mM pH 7,5 | |
| 4 x dialyse buffer (DB) | 80 mM tricine pH7.5 | |
| 20 mM MgCl2 | ||
| 0,04% (w/v) NaN3 |
Tabel 1: Liste over buffere, stamopløsninger og blandinger til FCP forberedelse og indarbejdelse i Liposomer.
Supplerende tabel 1: eksempel for lipid og chl en ratio beregning. Et lipid/chl forholdet mellem 12 bruges i eksemplet i figur 1 og figur 3. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FCP Liposomer med naturlige lipid sammensætning giver en nem, simpel og reproducerbar værktøj til at undersøge spektroskopiske egenskaber in vitro-. Lipid miljø i FCP Liposomer ligner situationen inden for tylakoid membran, giver anledning til eksperimentelle resultater, der er tættere på naturlige forhold.
Der er flere fordele ved at bruge C. meneghiniana som et modelsystem for FCP antenne. Det vokser forholdsvis hurtigt og er mere robust i forhold til andre diatom model arter, fx, Thalassiosira pseudonana. Cellerne bryde relativt let i perle-møllen, som giver mulighed for et højt udbytte af intakt tylakoid komplekser. Det vigtigste punkt for C. meneghiniana er væld af biokemiske og spektroskopiske data indhentet i de sidste år16,17,23,27,29,31 ,32,33,34. Den eneste ulempe er at en kommenteret genom ikke er tilgængelig endnu selv om genetiske manipulationer er muligt35.
FCPs blev udarbejdet fra kulturer dyrket under optimale betingelser. Derfor, udbytte, subunit sammensætning og pigmentering af FCP komplekser kan ændres hvis de er fremstillet af stressforhold, fx høj lys27 eller næringsstof begrænsning. Celle forstyrrelser i perle mill (1.1.3) er afgørende for FCP udbytte og bør overvåges efter hver ændring af vækst tilstand af et mikroskop. Plastids bør er blevet frigivet fra cellerne så at tomme frustules (silica skaller) fremherskende. Det næste vigtige skridt er tylakoid oploesning. Effektiviteten af membran oploesning interfererer med mængden af storage lipider, der ophobes under visse stress betingelser36. Mængden af vaskemiddel bør derfor, justeres inden forarbejdning prøver under stress betingelser at undgå overdreven oploesning. Problemet vises som øget chl c fluorescens emission på ~ 640 nm. Yderligere, energioverførsel fra carotenoider (500-550 nm) til chl en reduceres. Dette kan ses i excitation spektrum (figur 2 c, 2D). Visse fremgangsmåder kan være nyttigt at adskille FCPa fra FCPb antenne komplekser ved ionbytning kromatografi27.
Overførsel af FCP til Liposomer er det næste vigtige skridt. Overførsel effektivitet, Liposom homogenitet og handelsformer afhænge af flere parametre. Lipid-micelle-forberedelse og ekstrudering giver homogen måde mellemstore Liposom prækursorer. I dette eksempel (2.1.3-2.1.4), en polycarbonat membran af 100 nm porestørrelse blev brugt til at opnå en proteo-Liposom størrelse af ~ 50 nm. Mængden af FCP tilføjes lipid-vaskemiddel micelles definerer proteinet: lipid forholdet i Liposom. Dermed opnås et defineret antal FCP pr. Liposom. I en lignende tilgang plante og grønne alge LHC komplekser grupperet spontant. Dette faktum blev afsløret af tidsopløst fluorescens og enkelt-molekyle spektroskopi22 og giver en lyd base for yderligere eksperimenter.
Den kontrollerede dialyse er også afgørende for indarbejdelse af FCP ind i Liposomer. Selv om indarbejdelse af den hydrofobe FCP komplekse er energisk begunstiget, kunne kinetik af indsættelse konkurrere med kinetik af sammenlægning. Dette forhold bliver mere fremtrædende i flere hydrofobe og den større komplekser er. I dette eksempel er det mindre FCPa trimer integreret hurtigere end den større FCPb nonamer. Ordentlig FCP vedtægter kræver, at lipid micelles er godt blandet med solubilized FCP komplekser før vaskemiddel fjernelse via dialyse. Her, kan at blande tid i 2.2.1 varieres. Det anbefales ikke at stige blanding temperaturen, fordi det kan føre til FCP nedbrydning. Yderligere, "hastigheden" af vaskemiddel fjernelse er vigtigt og kan justeres med beløbet af adsorbent (2.2.4). Den endelige størrelse af Liposomer kan variere. Dynamisk lysspredning, analytisk ultracentrifugering og elektronmikroskopi er egnede metoder til at bestemme Liposom størrelse vifte37,38. For denne protokol med naturlige tylakoid lipid sammensætning og lipid micelle ekstrudering forventer vi den førnævnte diameter på 50-80 nm og en næsten kugle som figur afsløret af kryo-elektronmikroskopi. Disse resultater blev opnået med den samme metode indarbejde grønne alge LHC22. Liposomer af sådanne små diameter har en stærk overflade krumning af ~ 10° pr. 5 nm, som kan bøje større antenne komplekser og tvinge dem til at monomerize. Denne situation efterligner den naturlige krumning i grana margener af alger og planter22. Sammenlignet med grana margener, synes den største del af tylakoid temmelig flad. Derfor, hvis større komplekser såsom bannersystem skal undersøges det anbefales at bruge Liposomer med en større diameter. En anden spørgsmålet er: Hvad er orientering af komplekser? I tilfælde af FCPa konkludere vi fra målinger i svar til lav pH24 , orientering er omkring 50% højre side ud og 50% indefra og ud. I fremtiden, skal metoder tvinge komplekser i én retning. I andre undersøgelser med bakterierhodopsin efflux pumpe, er næsten alle proteiner spontant orienteret i den samme måde (højre out)39.
Der er spørgsmålet om hvad inducerer fluorescens ændringen, når K+ er føjet til Liposomer. Flere svar er tænkelige. Hvis K+ koncentration alene er ansvarlig, forsøget i figur 4 ville resultere i en yderligere nedsættelse af fluorescens, hvis valinomycin er tilføjet efter KCl. I en nylig undersøgelse ydede vi støtte til tanken om, at K+ koncentration gradient er ansvarlig for fluorescens ændring af FCPa24. Flere andre faktorer kan påvirke fluorescens udbyttet så godt. Disse kunne være osmotisk eller overflade afgift dynamics effekter24.
For at opsummere, er fordelen ved at undersøge lys høst antenne komplekser såsom FCP i Liposomer at det giver et funktionelt system tæt på i vivo betingelser. Men antallet af komponenter er stadig små, hvilket reducerer kompleksiteten i de eksperimentelle resultater. Det giver mulighed for simuleringer af lys stressforhold og induktion af foto-beskyttende mekanismer. Yderligere, rolle af visse lipid arter på funktionen af FCP komplekser kan studeres. Potentialet i denne metode øger med de seneste lavet skrider frem i kryo-elektronmikroskopi, enkelt molekyle spektroskopi og andre gang løst spektroskopiske metoder. Dette vil sætte forskerne i at forbedre undersøgelser af energioverførsel i lys høst systemer. Kombineret med disse teknikker, kan viden om FCP i tilstanden solubilized og aggregerede blive suppleret med data om bidrag af lipid miljø til FCP funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Rana Adeel Ahmad for bistand i FCP renseanlæg. Prof. Claudia Büchel er anerkendt for nyttige diskussioner og læsning af manuskript. Dette arbejde blev støttet af den tyske Forskningsfonds til LD (DI1956-1/1) og Humboldt grundlaget for en Feodor-Lynen stipendium til LD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 500 ml centrifuge vials | |||
| high speed centrifuge | Heraeus | ||
| Bead Mill VI 2 | Edmund-Bühler (edmund-buehler.de) | newer version: Vibrogen-Zellmühle Vl 6 | |
| Silibeads S 400 µm | Sigmund-Lindner.com | 5223-7 | |
| Silibeads S 1,-1,3 mm | Sigmund-Lindner.com | 4504 | |
| VitraPOR filter funnel - por1 | ROBU GmbH | 21121 | |
| polycarbonate ultracentrifuagtion vials (30 mL) for T-865 | Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de) | 314348 | |
| Ultracentrifuge Discovery 90SE | Sorvall | n.a. | |
| rotor T 865 | ThermoFisher Scientific (thermofisher.com) | 51411 | |
| Neubauer Cell Counter Chamber (improved) | Carl Roth Laborbedarf (Carlroth.com) | T729.1 | |
| Zeiss Mikroskop Primostar (7) | Optik-Pro (optik-pro.de) | 51428 | |
| optical glass cuvettes (6040-OG) | Hellma Analytics (hellma-analytics.com) | "6040-10-10" | |
| V-630 UV-VIS Spectrophotometer (incl. software) | Jasco (jasco.de) | V-630 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | ANATRACE (anatrace.com) | D310LA | |
| Ultra-Clear tubes 17 ml for AH629 | Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de) | 344061 | |
| rotor AH629-17-mL | ThermoFisher Scientific (thermofisher.com) | 54285 | |
| Membrane concentrator_Centriprep 30 kDa cutoff | Millipore (merckmillipore.com) | 4307 | |
| Biometra Minigel-Twin | Analytik Jena AG (analytik-jena.de) | 846-010-100 | |
| Silver Stain Plus Kit | Bio-Rad (bio-rad.com) | 1610449 | |
| libre office spread sheet | The document foundation | https://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/ | |
| special glass cuvettes for fluorescence (101-0S) | Hellma Analytics (hellma-analytics.com) | 101-10-20 | |
| Spectrofluorometer FP-6500 (incl. Software) | Jasco (jasco.de) | FP-6500 | |
| SDS-loading buffer Roti-Load | ROTH (carlroth.com) | K929.1 | |
| n-octyl β-D-glucopyranoside | ANATRACE (anatrace.com) | O311 | |
| Monogalactosyl Diaclyglycerol (MGDG) | Larodan AB (larodan.com) | 59-1300 | make stock solution in chloroform |
| Digalactosyl Diacylglycerol (DGDG) | Larodan AB (larodan.com) | 59-1310 | make stock solution in chloroform |
| Sulphoquinovosyl Diacylglycerol (SQDG) | Larodan AB (larodan.com) | 59-1230 | make stock solution in chloroform |
| L-alpha-Phosphatidylglycerol (PG) | Larodan AB (larodan.com) | 37-0150 | make stock solution in chloroform |
| L-α-Phosphatidylcholine | Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com) | P3782 SIGMA | make stock solution in chloroform |
| sonicator bath S-50TH | Sonicor (getmedonline.com | SONICOR-S-50TH | |
| mini-Extruder | Avanti Polar Lipids (Avanti.com) | 610000 | |
| Nuleopore polycarbonate membrane | Avanti Polar Lipids (Avanti.com) | 610005 | |
| dialysis membrane Visking 14 kDa cutoff | ROTH (carlroth.com) | 0653.1 | boil in destilled water before use |
| Biobeads SM2 Adsorbent | Biorad (Bio-rad.com) | 152-3920 | |
| sucrose epichlorhydrin copolymer - Ficoll 400 | Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com) | F4375 | |
| Polycarbonate ultracentrifuagtion vials (2.7 mL) for TFT 80.4 | Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de) | 252150 | |
| rotor TFT 80.4 | Millipore (merckmillipore.com) | 54356 | |
| material listed in order of appearance | For specific safety instructions please refer to material safety sheets and repective manuals. Standard lab material and substances are not listed. |
References
- Eberhard, S., Finazzi, G., Wollman, F. A. The Dynamics of Photosynthesis. Annual Review of Genetics. 42, 463-515 (2008).
- Li, Z. R., Wakao, S., Fischer, B. B., Niyogi, K. K. Sensing and Responding to Excess Light. Annual Review of Plant Biology. 60, 239-260 (2009).
- Niyogi, K. K., Truong, T. B. Evolution of flexible non-photochemical quenching mechanisms that regulate light harvesting in oxygenic photosynthesis. Current Opinion in Plant Biology. 16 (3), 307-314 (2013).
- Li, X. -P., et al. A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting. Nature. 403 (6768), 391-395 (2000).
- Peers, G., et al. An ancient light-harvesting protein is critical for the regulation of algal photosynthesis. Nature. 462 (7272), 518-521 (2009).
- Correa-Galvis, V., et al. Photosystem II Subunit PsbS Is Involved in the Induction of LHCSR Protein-dependent Energy Dissipation in Chlamydomonas reinhardtii. The Journal of biological chemistry. 291 (33), 17478-17487 (2016).
- Bailleul, B., et al. An atypical member of the light-harvesting complex stress-related protein family modulates diatom responses to light. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18214-18219 (2010).
- Taddei, L., et al. Multisignal control of expression of the LHCX protein family in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum. Journal of experimental botany. 67 (13), 3939-3951 (2016).
- Lepetit, B., et al. The diatom Phaeodactylum tricornutum adjusts nonphotochemical fluorescence quenching capacity in response to dynamic light via fine-tuned Lhcx and xanthophyll cycle pigment synthesis. New Phytologist. 214 (1), 205-218 (2017).
- Büchel, C. Evolution and function of light harvesting proteins. Journal of Plant Physiology. 172, 62-75 (2015).
- Lavaud, J., Rousseau, B., van Gorkom, H. J., Etienne, A. -L. Influence of the Diadinoxanthin Pool Size on Photoprotection in the Marine Planktonic Diatom Phaeodactylum tricornutum. Plant Physiology. 129 (3), 1398-1406 (2002).
- Ruban, A., et al. The super-excess energy dissipation in diatom algae: comparative analysis with higher plants. Photosynthesis Research. 82 (2), 165-175 (2004).
- Mann, D. G. The species concept in diatoms. Phycologia. 38 (6), 437-495 (1999).
- Papagiannakis, E., van Stokkum, I. H. M., Fey, H., Büchel, C., van Grondelle, R. Spectroscopic Characterization of the Excitation Energy Transfer in the Fucoxanthin-Chlorophyll Protein of Diatoms. Photosynthesis Research. 86 (1-2), 241-250 (2005).
- Premvardhan, L., Robert, B., Beer, A., Büchel, C. Pigment organization in fucoxanthin chlorophyll a/c2 proteins (FCP) based on resonance Raman spectroscgopy and sequence analysis. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1797 (9), 1647-1656 (2010).
- Gildenhoff, N., Herz, J., Gundermann, K., Büchel, C., Wachtveitl, J. The excitation energy transfer in the trimeric fucoxanthin-chlorophyll protein from Cyclotella meneghiniana analyzed by polarized transient absorption spectroscopy. Chemical Physics. 373 (1), 104-109 (2010).
- Ramanan, C., et al. Exploring the mechanism(s) of energy dissipation in the light harvesting complex of the photosynthetic algae Cyclotella meneghiniana. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1837 (9), 1507-1513 (2014).
- Haferkamp, S., Kirchhoff, H. Significance of molecular crowding in grana membranes of higher plants for light harvesting by photosystem II. Photosynthesis Research. 95 (2-3), 129-134 (2008).
- Wahadoszamen, M., et al. Stark fluorescence spectroscopy reveals two emitting sites in the dissipative state of FCP antennas. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1837 (1), 193-200 (2014).
- Zhou, F., et al. Effect of monogalactosyldiacylglycerol on the interaction between photosystem II core complex and its antenna complexes in liposomes of thylakoid lipids. Photosynthesis Research. 99 (3), 185-193 (2009).
- Moya, I., Silvestri, M., Vallon, O., Cinque, G., Bassi, R. Time-resolved fluorescence analysis of the photosystem II antenna proteins in detergent micelles and liposomes. Biochemistry. 40 (42), 12552-12561 (2001).
- Natali, A., et al. Light-harvesting Complexes (LHCs) Cluster Spontaneously in Membrane Environment Leading to Shortening of Their Excited State Lifetimes. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16730-16739 (2016).
- Gundermann, K., Büchel, C. Factors determining the fluorescence yield of fucoxanthin-chlorophyll complexes (FCP) involved in non-photochemical quenching in diatoms. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1817 (7), 1044-1052 (2012).
- Ahmad, R. A., Dietzel, L. Relaxation of cellular K+ gradients by valinomycin induces diatoxanthin accumulation in Cyclotella meneghiniana cells and alters FCPa fluorescence yield in vitro. Physiologia Plantarum. , 171-180 (2017).
- Provasoli, L., McLaughlin, J. J. A., Droop, M. R. The development of artificial media for marine algae. Archiv für Mikrobiologie. 25 (4), 392-428 (1957).
- Jeffrey, S., Humphrey, G. New spectrophotometry equations for determining chlorophyll a, chlorophyll b, chlorophyll c-1 and chlorophyll c-2 in higher plants, algae and natural phytoplankton. Biochemie und Physiologie der Pflanzen. 167, 191-194 (1975).
- Beer, A., Gundermann, K., Beckmann, J., Büchel, C. Subunit Composition and Pigmentation of Fucoxanthin−Chlorophyll Proteins in Diatoms: Evidence for a Subunit Involved in Diadinoxanthin and Diatoxanthin Binding. Biochemistry. 45 (43), 13046-13053 (2006).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Analytical Biochemistry. 166 (2), 368-379 (1987).
- Büchel, C. Fucoxanthin-Chlorophyll Proteins in Diatoms: 18 and 19 kDa Subunits Assemble into Different Oligomeric States. Biochemistry. 42 (44), 13027-13034 (2003).
- Vieler, A., Wilhelm, C., Goss, R., Süß, R., Schiller, J. The lipid composition of the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii and the diatom Cyclotella meneghiniana investigated by MALDI-TOF MS and TLC. Chemistry and Physics of Lipids. 150 (2), 143-155 (2007).
- Gundermann, K., Büchel, C. The fluorescence yield of the trimeric fucoxanthin-chlorophyll-protein FCPa in the diatom Cyclotella meneghiniana is dependent on the amount of bound diatoxanthin. Photosynthesis Research. 95 (2-3), 229-235 (2008).
- Miloslavina, Y., et al. Ultrafast fluorescence study on the location and mechanism of non-photochemical quenching in diatoms. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1787 (10), 1189-1197 (2009).
- Grouneva, I., Jakob, T., Wilhelm, C., Goss, R. The regulation of xanthophyll cycle activity and of non-photochemical fluorescence quenching by two alternative electron flows in the diatoms Phaeodactylum tricornutum and Cyclotella meneghiniana. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1787 (7), 929-938 (2009).
- Chukhutsina, V. U., Büchel, C., van Amerongen, H. Disentangling two non-photochemical quenching processes in Cyclotella meneghiniana by spectrally-resolved picosecond fluorescence at 77 K. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1837 (6), 899-907 (2014).
- Ghazaryan, A., Akhtar, P., Garab, G., Lambrev, P. H., Büchel, C. Involvement of the Lhcx protein Fcp6 of the diatom Cyclotella meneghiniana in the macro-organisation and structural flexibility of thylakoid membranes. Biochimica Et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1857 (9), 1373-1379 (2016).
- Darley, W. M. Biochemical composition. The biology of diatoms. 13, 198-223 (1977).
- Milsman, M. H. W., Schwendner, R. A., Weder, H. G. Preparation of large single bilayer liposomes by a fast and controlled dialysis. Biochimica Et Biophysica Acta. 512 (1), 147-155 (1978).
- Zumbuehl, O., Weder, H. G. Liposomes of controllable size in the range of 40 to 180 nm by defined dialysis of lipid-detergent-mixed micelles. Biochimica Et Biophysica Acta. 640 (1), 252-262 (1981).
- Verchere, A., Broutin, I., Picard, M. Photo-induced proton gradients for the in vitro investigation of bacterial efflux pumps. Scientific Reports. 2 (306), (2012).
- Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).
