Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Isolera och införliva ljus-skörd antenner från kiselalger Cyclotella Meneghiniana i liposomer med tylakoida lipider

Published: August 28, 2018 doi: 10.3791/58017
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute for Molecular Biosciences, Goethe University

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att isolera fucoxanthin klorofyll a/c-bindande proteiner (FCP) från kiselalger och införliva dem i liposomer med naturliga lipid kompositioner att studera excitation energiöverföring på ion sammansättning ändras.

Abstract

Fotosyntetiska prestanda av växter, alger och kiselalger beror starkt på snabb och effektiv reglering av ljuset skörd och energi överföring processer i tylakoida membranet i kloroplaster. Ljuset skörd antenn av kiselalger, de så kallade fucoxanthin klorofyll a/c-bindande proteinerna (FCP), krävs för ljusabsorption och effektiv överföring till fotosyntetiska reaktionen centrerar liksom när det gäller foto-skydd mot alltför stora ljus. Växla mellan dessa två funktioner handlar mångåriga forskning. Många av dessa studier har genomförts med FCP i tvättmedel miceller. För interaktionsstudier har tvätt tagits bort, vilket ledde till en ospecifik aggregering av FCP komplex. I detta synsätt är det svårt att diskriminera mellan artefakter och fysiologiskt relevanta data. Därför kan mer värdefull information om FCP och andra membran bunden ljus skörd komplex erhållas genom att studera protein-protein interaktioner, energiöverföring och andra spektroskopiska funktioner om de är inbäddade i deras infödda lipid miljö. Den största fördelen är att liposomer har en definierad storlek och en definierad lipid/proteinkvot som omfattningen av FCP klustring är kontrollerad. Ytterligare, förändringar i pH och ion sammansättning som reglerar ljus avverkning i vivo simuleras enkelt. I jämförelse med det tylakoida membranet är liposomer mer homogen och mindre komplex, vilket gör det lättare att få och förstå spektroskopiska data. Protokollet beskrivs förfarandet FCP isolering och rening, Liposom förberedelse och införlivande av FCP i liposomer med naturliga lipid sammansättning. Resultat från en typisk tillämpning ges och diskuterade.

Introduction

Fotosyntetiska organismer såsom kiselalger måste klara av ständigt föränderliga ljusförhållanden och svara med sofistikerade acklimatisering mekanismer som upprätthålla hög fotosyntetiska effektivitet och skydda från foto-oxidativ skada som orsakas av överdriven ljuset. En större tända-skyddande process i photosynthetic eukaryota organismer är hög energi släcka (qE) absorberas ljus som uppstår som den främsta bidragen till den icke-fotokemiska släcka (NPQ) under lätta stress villkor1,2 ,3. De lätta skörda antenn komplex (LHC) är involverade i regleringen av magnetiseringen energi överföring vägar. Svar på höga ljus inducerad lågt pH i kloroplast lumen, växlarna antenn system från ljuset skörd staten att släcka staten. Denna energi dissipativa staten skyddar fotosystem (PS) och andra komplex i tylakoida membran från photo-oxidation. I photosynthetic eukaryota organismer framkallas qE oftast av två faktorer1,2,3. En faktor är specialiserade ljuset skörd protein som svarar på den lågt pH. Proteinet PsbS inducerar qE i högre växter4. LhcSRs5, moduleras av PsbS aktivitet, framkalla qE i grönalger6. Kiselalger äger Lhcx-liknande proteiner som strukturellt besläktade LHCSRs7,8,9,10.

Den andra faktorn qE är xanthofyll cykeln där karotenoider av antennen konverteras till en foto-skyddande form av de-epoxidering och återgått av epoxidering. I växter och gröna alger konverteras violaxanthin till zeaxantin. I kiselalger omvandlas diadinoxanthin till diatoxanthin, som sedan korrelerar med omfattningen av NPQ11. Kiselalger ljuset skörd antenn besitter vissa egenheter även om det är evolutionärt relaterade till växter och alger LHCs. Övergången från ljus skörd till foto-skydd är oerhört snabb och NPQ kapacitet är högre jämfört med växter12. Detta kan vara en orsak varför kiselalger är mycket framgångsrika i olika ekologiska nischer på ett sätt som de är ansvariga för upp till 45% av den oceaniska netto primärproduktion13. Kiselalger ljus skörd system är därför ett intressant objekt av photosynthesis forskning.

Kiselalger, liknar centrerad arten Cyclotella meneghiniana, äger tylakoida inneboende ljus skörd system uppkallad efter pigment de binda - fucoxanthin, klorofyll (chl) a och c, därav FCP. ljus skörd proteiner, såsom FCPs, är inbäddad i tylakoida membran systemet bestående av flera membran lager. Kiselalger bilda band av tre thylakoids. Detta komplex situationen gör det svårt att studera dem på molekylär nivå i tylakoida membran. Dessutom bidrar många komponenter till regleringen av ljus skörd (se ovan). Därför i många metoder isolerades komplexen från membranet använder mild rengöringsmedel, till exempel n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside (β-DDM), som solubilize membranet men hålla FCP komplexen intakt. Många spektroskopiska studier utfördes med solubilized FCP för att undersöka intramolekylära energi överföring14,15,16,17. Detta före detta tillvägagångssätt var dock begränsad eftersom regleringen av energiöverföringen behöver excitonic interaktion med andra antenn komplex eller fotosystem. Därför, dessa typer av studier inte kan utföras med solubilized komplex eftersom interaktionen mellan komplex går förlorad.

Ett viktigt inslag i antenn förordning är ”molekylär trängsel” antenn och fotosystem i tylakoida membran18. Tidigare, en enkel strategi genomfördes för att simulera effekten in vitro-. Tvättmedlet togs bort, vilket leder till slumpmässiga aggregering av antenn komplex. Även om vissa rimliga uppgifter erhölls genom detta tillvägagångssätt17,19, tvättmedel avlägsnande återspeglar inte den situation i vivo och har vissa begränsningar eftersom komplexen inte interagerar i sin regelbundna tertiär struktur.

Användning av liposomer övervinner flera av de tidigare begränsningarna. Tertiär struktur är fortfarande helt intakt. Liposom membranet ger en kvasi infödda miljö för antenn komplexen. Membranet separerar insidan av Liposom från den yttre miljön. Av dessa medel ger liposomer två reaktion fack för studier av ion och pH lutningar samt när det gäller processer. Ytterligare, parametrarna för experimentell systemet kan kontrolleras lättare för studier i tylakoida membran. Liposomer har redan visat sig vara ett utmärkt verktyg att studera fotosyntetiska komplex. Ett stort fokus i förflutnan var på anläggning LHC där effekten av förändrade lipid sammansättning testades på LHC II20. I andra metoder, protein-protein interaktioner mellan olika LHC II var undersökta21. Också, vissa studier i grönalger genomfördes som beskriver spontana klustring mellan LHC22. Som beaktar betydelsen av kiselalger för akvatiska ekosystem, relativt få studier utfördes med antenn komplex av kiselalger. Två studier undersökt antenn komplexen av den centrerad Cyclotella meneghiniana, var den klustring av FCP antenn23 och lyhördhet av FCP till elektrokemiska övertoningar24 visades. Liposomer är alltså ett utmärkt verktyg att studera kiselalger antenner och deras interaktion och förordning i nästan inhemska förhållanden. Liposomer är mångsidig eftersom många förhållanden såsom lipid sammansättning, Liposom storlek, protein densitet och kringliggande vattenfasen kan styras. Metoden kräver dessutom låga mängder prover. Det experimentella systemet är robusta och mycket reproducerbara. Uppdelning i liposomer möjliggör studera pH och ion övertoningar, vilka är viktiga faktorer i regleringen av antenn komplex.

Här beskriver vi isolera FCP antenn komplex från C. meneghiniana och deras införlivande i liposomer med naturliga tylakoida lipid sammansättning. Också, vi tillhandahåller exemplariskt data för spektroskopisk karakterisering av solubilized FCP och jämföra dem med FCP i liposomer. Metoden sammanfattar kunskap och standardiserade protokoll erhålls från förbättringar av Gundermann och Büchel 201223, Natali et al. 201622och Ahmad och Dietzel 201724.

Figure 1
Figur 1: Schematisk bild av arbetsflödet. (1) refererar till punkt 1 och som beskriver celltillväxt, störningar och tylakoida isolering med följande FCP separation på sackaros täthetlutningar; C. m. -Cyclotella meneghiniana celler. (2) beredning av naturliga tylakoida lipid blandning (MGDG, DGDG och SQDG) beskrivs i punkt 2 och skapandet av lipid-tvättmedel miceller med octylglycoside (OG). En definierad lipid-micelle storlek uppnås genom extrudering med membran av definierade pordiameter. FCP och lipid-miceller är enhetlig på en fördefinierad lipid: förhållandet mellan protein och tvätt OG och β-DDM är borttagna via kontrollerade dialys bildar FCP proteoliposomes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Obs: Fotosyntetiska komplex såsom FCPs är mycket sårbara för ljus och värme. Arbeta alltid på isen och under ett mycket svagt ljus.

1. isolering av FCP från celler

  1. Tylakoida isolering från C. meneghiniana celler
    1. C. meneghiniana i fem 500 mL kolvar var fyllda med 300 mL ASP-medium23,25 och 50 miljoner celler att växa. Anslut kolvarna med en propp av bomull och låta cellerna att växa till exponentiella tillväxtfasen för ungefär en vecka på en shaker på 120 rpm med en 16 h ljus och 8 h mörk fas vid 40 µmol photons/(m²s) vitt ljus och en temperatur mellan 15-18 ° C. Kontrollera att cellen är mellan 1,5-2 miljoner celler/mL med en cell counter kammare.
    2. Centrifugera cellerna vid 4000 x g i en förhandskyld rotor med 500 mL centrifug flaskor (4 ° C) i 15 min i en höghastighets centrifug. Återsuspendering cell pellets i 12 mL homogenisering buffert (HB, tabell 1) av pipettering.
      1. Överför till en enda 50 mL plaströr. Lagra proverna vid-80 ° C eller gå vidare till steg 1.1.3.
    3. Pre cool den pärla kvarn och utrustning. Fyller 50 mL bägaren pärla kvarnen till 75% med en glas pärla blandningen och tillsätt cellsuspension. För cell störningar, använda 7 x 45 s pulser i full fart med 30 s av kyla mellan varje puls. Ta 20 µL av störd celler för kvalitetskontroller i steg 1.1.6.
    4. Filtrera störd cellerna över en glastratt filter och tvätta genom att hälla HB över glaspärlor tills de verkar klara. Pool tvätta andelen med filtratet. Hålla den slutliga volymen lägre än 150 mL.
    5. Centrifugera provet för 15 min vid 140 x g använder tre 50 mL plaströr till pellet cell skräp. Försiktigt överför supernatanten till 20 mL injektionsflaskor av polykarbonat ultracentrifugering och kassera pelleten.
      1. Fyll skålarna med HB, temperera vikt och Centrifugera i en lämplig rotor för 1 h på 300 000 x g och 4 ° C till pellet tylakoida membran.
    6. Använd centrifugeringstiden för att kontrollera andelen störd celler genom mikroskopi 400 X förstoring med det 20 µL prov i 1.1.3. Beräkna förhållandet mellan kloroplast gratis och kloroplast som innehåller frustules (kiseldioxid skal).
      Obs: Kiselalger cellväggar är gjorda av kisel, vilket syns som mycket diffracting ämne i mikroskopet. Kloroplaster som inträffar som gröna prickar bör har släppts från cellerna om cell störningar arbetat.
    7. Re centrifugerade membran med som lite tvätt buffert som möjligt (0,5-1 mL) med en liten målarens pensel. Fyll polykarbonat ultracentrifugering injektionsflaskorna med tvätt buffert (tabell 1), temperera sin vikt och Centrifugera i 20 min på 200 000 x g och 4 ° C.
      1. Återsuspendering tvättade membran med en målarens pensel. Lägga till tvätt buffert om behövs för att hålla tylakoida koncentrationen så hög som möjligt. Samla alla thylakoids i ett prov injektionsflaska (15 mL).
    8. Pre Späd prover med 10 µL av provet med 90 µL av 100% aceton. Centrifugera det 12 000 x g för 5 min till pellet utfällda proteinet. Ta 10 µL av förspädningen och blanda det med 990 µL av 90% aceton.
      1. Mät absorbansen (ABS) av klorofyll a och c på 664 nm och 630 nm i 90% aceton. Subtrahera den ABS750nm från båda värdena. Bestäm totala klorofyll innehållet med hjälp av följande formel:24
        1)Equation 1
        2)Equation 2
    9. Alikvotens thylakoids i delar av 0,5 mg totala klorofyll i en 1,5 mL reaktionsrören, frysa dem i flytande kväve och lagra dem vid-80 ° C tills vidare användning.
  2. Separation och koncentration av FCP komplex
    1. Förbereda en gradient sackaroslösning och fyll ultracentrifugen rören tills toppen minus lastning volymen (300 – 500 µL). Frysa rören vid-20 ° C tills de är helt frysta. Låt rören Tina vid + 4 ° C, som tar 3-4 h för en 17 mL tub.
      1. Upprepa frysning-tining cykeln två gånger för att förfina övertoningen för bättre upplösning.
    2. Använda de produktproverna i 1.1.9 motsvarande 0,5 mg klorofyll och justera med buffert B1 (tabell 1) till en slutlig volym av 2 mL. För lösbarhet, lägga till n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside (b-DDM) till en slutkoncentration av 20 mM.
      1. Vänd röret 3 gånger och placera den på is i 20 min med mild skakar för att undvika skum. Centrifugera i 5 min, på 12 000 x g i en nedkylda bordsskiva centrifug vid + 4 ° C.
    3. Ladda supernatanten på övertoningen. Fyll inte mer än 125 µg av totala klorofyll per övertoning om 17 mL injektionsflaskor används. Centrifugera i 22 h 100 000 x g och + 4 ° C.
      1. Återställa de önskad brun FCP fraktionerna från övertoningen med en spruta (figur 2A). Ta en 5 µL alikvotens och späd med 995 µL av B1a.
    4. Mät absorbansen (ABS) spektrumet mellan 370-750 nm i en UV-VIS-spektrofotometer. Använda semi micro optiskt glas kyvetter.
      1. Öppna programvaran spectra manager, gå till spektrum-läge och spela in en originalplan från 370 till 750 nm följt av testmätningar. Använd följande inställningar: scanningshastighet, 200 nm/min; data pitch, 0,5 nm. svar, medium.
    5. Mäta volymen av återvunna provet med en mikropipett. Tvätta de FCP komplex genom att lägga till två gånger den återvunna volymen med B1 buffert (tabell 1). Koncentrera sig i ett membran anrikningsverk med en 30 kDa cutoff på 1 000 x g och + 4 ° C till en ABS672nm på minst 20.
      Obs: B-DDM koncentrationen kan stiga på grund av micelle anrikning i provet facket. Detta kan leda till ytterligare lösbarhet av FCP komplex! Undvika alltför lösbarhet genom att lägga till tvättmedel gratis buffert B1 om ytterligare tvättar steg krävs för att ta bort kvarvarande sackaros.
    6. Ta en 20 µL alikvotens för kontrollerna. Chock frysa proverna i flytande kväve och lagra dem vid-80 ° C.

Figure 2
Figur 2: rening av FCP, spektroskopiska kontroller och renhetskontroll. (A) typiska utseende av en sackaros täthetlutning efter övernattning centrifugering. Alla bruna band innehåller FCP poolen bestående av FCPa och FCPb. pigm. - obundna pigment, PS - fotosystem (B) absorbans spektra av FCP innan (blå linje) och efter (orange-streckad linje) koncentration använda centrifugal filter enheter med 30 kDa cutoff . Karotenoider är särskilt benägna att förlust från den FCP, vilket skulle resultera i lägre absorbansen i regionen mellan 500-550 nm. Grafer är normaliserad till klorofyll Qy maximum vid ~ 670 nm. (C) klorofyll a utsläpp spectra med excitation av chl c (465 nm) för att testa funktionell excitation energiöverföringen. Om energi överföring av chl c till chl en hämmas, ett ytterligare fluorescens-band på ~ 640 nm (chl c) skulle inträffa. Grafer är normaliserad till maximala utsläpp. (D) Excitation spectra inspelad på 675 nm (chl en maximal fluorescens) för att testa energiöverföringen till chl en från alla pigment absorberande mellan 370 nm och 600 nm. Om energin överför till chl en är mindre effektiva, fluorescens avkastningen skulle minska särskilt mellan 465 och 550 nm. Diagrammen är normaliserade maximalt cirka 440 nm. Spektra (b), (C) och D är nästan identiska om koncentrationen fungerade bra. (E) kontrollera renheten av den isolerade FCP använder en Tris-tricine gel28. FCPa och FCPb har subenheter mellan 18-19 kDa. Alla synliga silver-färgade proteiner större än 20 kDa är föroreningar. Thyl. -Thylakoids vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

  1. Spektroskopiska och gel-baserade kontroller
    1. Spela in absorbansen mellan 370-750 nm 5 µL FCP i 995 µL B1a efter steg 1.2.5. Jämföra det med ett spektrum som erhölls i steg 1.2.4. Använd samma instrumentering och inställningar som beskrivs i steg 1.2.4.
      1. Exportera data som *.csv och importera data till ett kalkylblad. Normalisera båda spectra till maximat av chl en i Qy bandet av cirka 672 nm som avbildas i figur 2B.
    2. Beräkna utspädningsfaktorn för proverna från steg 1.2.4 och 1.3.1 genom att dividera de uppmätta ABS672nm av den önskade ABS-672nm på 0,03. Späd ut proverna med detta med B1a och överföra dem till specialglas fluorescens kyvetter.
    3. Spela in chl en fluorescens emissionsspektrum med en spectrofluorometer att avslöja intakt ljus energiöverföring från chl c till chl en (figur 2 c).
      1. Använda programvaran spektrometer och gå till spektrum mätning läge med följande inställningar: läge, utsläpp; skåra bredd excitation och utsläpp, 3 nm. känslighet, medium; scanningshastighet, 100 nm/min; data pitch, 0,5 nm. magnetiseringen våglängd: 465 nm. utsläpp, 600-800 nm. Utföra autozero och åtgärd.
    4. Spela in excitation spectra med samma prov och utrustning att avslöja intakt energiöverföring från alla pigment till chl en (figur 2D). Ändra inställningarna till: läge, magnetisering; utsläpp våglängd, 675 nm. excitation, 370-600 nm. Spela in spektra.
      1. Korrigera med ett rodamin spektrum i samma intervall för spektrala egenskaper av lampan – cf. instruktionerna i bruksanvisningen.
    5. Blanda FCP prover som motsvarar 1 µg av chl en med 10 µL av SDS-lastning buffert. Inkubera i 10 minuter vid 25 ° C. Centrifugera i 5 min vid 12000 x g i en bordsskiva centrifug.
      1. Ladda supernatanten på en Tris-tricine gel28. Separera det för 2 h 150 V och silver-fläcken det efter separation40.
        Obs: FCP subunitsna separera i två framstående protein band mellan 18-19 kDa, som är beståndsdelar i FCPa och FCPb29 (figur 2E).

2. beredning av liposomer och införlivande av FCP

  1. Förberedelse av lipid blandningen och lipid tvättmedel miceller
    Obs:     lipider är mottagliga för varma temperaturer kombinerat med oxidativ villkor. Försök att hålla lipider kylda och under en N2 atmosfär.
    1. Beräkna önskad tylakoida lipid kvoterna för C. meneghiniana enligt Vieler et al. 200730. Se exemplet i Supplemental tabell 1. Förbereda lipid stamlösningar som rekommenderas av tillverkaren i en lösningsmedel bevis behållare.
    2. Tillsätt önskad mängd lipider i en 2 mL reaktionsröret och avdunsta i kloroform som använder en skonsam kväveflödet och försöker sprida lipider över hela området av tube bas. Låt N2 flödet tills all vätska är avdunstat.
    3. Solubilize lipid blandningen i 29 µL av n-octyl β-D-glukopyranosid lösning (OG) vid 4 ° C i 4 h. Inkubera lipid blandningen i 10 min vid 30 ° C. Inkubera i lipider i badkar någon sonikator för 3 x 3 min vid 25 ° C avbryts av 30 s på is.
      1. Lägg till 221 µL tricine buffert och 250 µL av 4 x dialys buffert.
    4. Använda en extruder med 0.1 µm polykarbonat membran för en definierad Liposom diameter 50-70 nm. Montera extrudern med membran och filter stöd. Undvika luftbubblor och dra åt församlingen grundligt.
    5. Fyller en spruta med 4 x dialys buffert och pre våt extrudern tills inga bubblor kan ses i andra sprutan.
    6. Gälla extrudern lipid-tvättmedel-micellerna och tryck på lösningen från en spruta till den andra fram och tillbaka. Upprepa detta steg 5 gånger tills lösningen visas homogen.
      Obs: Denna lösning kan förvaras vid 4 ° C i flera dagar. Inte frys!
  2. Införlivandet av FCP komplex och borttagning av rengöringsmedel och aggregat
    Obs: I detta exempel använder vi en lipid/chl förhållandet 12:1, vilket motsvarar en lipid/proteinkvot av ungefär 100: 1.
    1. Lägg till FCP lika 20 µg chl en i en total volym av 500 µL B1a buffert till 250 μL av extruderad lipid-micellerna och 250 µL av 4 x dialys buffert. Inkubera proverna för 3 x 3 min vid 25 ° C i en thermomixer på 1.500-3.000 rpm avbryts av en 30 s paus på is.
    2. Skär locket av fyra 1,5 mL reaktionsröret strax under toppen ger en ring som fortfarande passar på locket. Förbereda 1,5 x 1,5 cm bitar av dialys membran och tvätta dem i 20 mL 1 x dialys buffert
    3. Fyll 250 µL av varje lock provet. Lägg försiktigt, membranet på locket så att facket är helt fyllt med provet och inga luftbubblor uppstår. Dra åt reaktion tube ringen på församlingen för att få ett stängt fack.
    4. Dialyze proverna i 50 mL 1 x dialys buffert över natten (12-16 h) på is på en tumlande shaker. Ersätta används dialys bufferten med färska och lägga till 7 mg adsorbent pärlor att ta bort de återstående rengöringsmedel för minst 6 h.
    5. Ersätta dialys bufferten igen och dialyze för en annan 12 h. återställa liposomer av piercing dialys membranet med en 200 µL mikropipett spets och aspirera alla liposomer från reaktion tube locket.
    6. Valfritt steg: om hög renhet (> 95%) behövs. Förbereda en diskontinuerlig täthetlutning i 17 mL ultracentrifugering injektionsflaskor med steg som innehåller 6%, 10%, 15% och 20% sackaros epiklorhydrin sampolymer i dialys buffert. Ladda liposomer på toppen och ultracentrifugen vid 100 000 x g i 4 h i en svängande hink rotor.
      1. Återställa det övre brun bandet med en spruta, späd den prov 1:5 med DP och fortsätta till nästa steg.
    7. Centrifugera FCP liposomer i minst 2 mL 1 x dialys buffert för 1,5 h 100 000 x g och 4 ° C. Återställa liposomer genom att vrida centrifugröret i 45° vinkel. Tillåta liposomer att flytta ner för 1 min (figur 3A).
    8. Recover FCP liposomer i en slutlig volym av 25-50 µL. undvika att störa fällningen.
  3. Kontroller 1: absorbans, fluorescens-spektroskopi
    1. Lägga till en 3 µL alikvot av FCP-liposomer i en 1 mL slutlig volym av 1 x dialys buffert och Centrifugera under 5 minuter vid 12 000 x g.
      1. Spela in absorbansen mellan 370 och 750 nm FCP-liposomer med samma utrustning som beskrivs i 1.2.4. Normalisera spektrumet till högst i regionen Qy i chl en (670-680 nm) och jämför det normaliserade spectrumen av solubilized FCP (figur 3 c).
    2. Förbereda FCP-liposomer i 1 mL av DP med en absorbans (ABS) = 0,03 med avseende på maximalt mellan 670-680 nm. Justera den solubilized FCP i tvättmedel från steg 1.2.6 till samma ABS att späda med B1a.
    3. Spela in absorbansen spektra av båda proven som beskrivs i 1.2.4. Spela in chl en fluorescens emissionsspektrum av både prover enligt 1.3.3.
      Obs: Fluorescens avkastningen minskas i FCP-Liposom provet (figur 3D och jfr diskussion.)

Figure 3
Figur 3: isolering av FCP proteoliposomes följt av spektroskopiska kontroller och confocal imaging. (A) återvinning av FCP liposomer efter centrifugering. Slå centrifugering röret till 45° och vänta ca 1 min - liposomer kommer flytta medan FCP aggregat som inte införlivas i liposomer stick till rörväggen. (B) jämförelse av absorbansen spektra av solubilized FCP i tvättmedel (blå) och FCP i liposomer (orange) (C) samma spektra som i (B) normaliserad till chl maximalt i den röda regionen (~ 670 nm - Qy peak); solubilized FCP i tvättmedel (blå) och FCP i liposomer (orange). Potentiellt, kunde det synas en pigment förlust främst av karotenoider i regionen 500-550 nm. Klustring av FCP i liposomer kan leda till en toppbreddning och en viss förskjutning av chl maximalt (~ 670 nm) till röda. (D) utsläpp spectra solubilized FCP i tvättmedel och FCP i Liposom. Klustring av FCP i Liposom förbättrar energetiska interaktioner av FCP komplex som sänker fluorescens avkastningen (orange kurvan) och skiftar de utsläpp maxima något till röda. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollet beskrivs isolering av totala FCP fraktionen från Cyclotella meneghiniana och införlivande i liposomer med infödda lipid sammansättning. Tylakoida isolering är mycket reproducerbara, men tylakoida avkastningen kan ändra. Resultatet är godtagbart om mer än 50% av alla pigment återvinns i steg 1.1.4. Mer än 80% är optimal.

Lösbarhet av thylakoids är ett viktigt steg. Väl solubilized membran erhålls om supernatanten efter steg 1.2.2 innehåller de flesta av pigment. Separation av FCP från fotosystem är bra om en tydlig brun (FCP) och en grön (PS)-band är distinguishable (figur 2A). En framstående gulaktig bråkdel på toppen av toningen är en indikation för pigment förlust på grund av överdriven lösbarhet. Pigment förlust uppstår i varje beredning. Det är acceptabelt att en viss grad så länge funktionen av energi överföra till chl en är inte påverkas (figur 2 c, 2D). Dessutom kan FCP anrikning steg (1.2.4) framkalla ytterligare lösbarhet och pigment förlust på grund av samtidig tvättmedel anrikning. Skillnaderna i den normaliserade absorbans spectra är en indikation för pigment förlust (figur 2B), som ofta förekommer i den spektrala-regionen mellan 500-550 nm där karotenoider absorbera. Pigment förlust är acceptabelt om komplexen är fortfarande funktionella. Detta betyder att inga större skillnader uppstå utsläpp spectra och excitation spectra (figur 2 c, 2D). För utsläpp spektra, chl c exciteras företrädesvis på 465 nm och överföringar alla excitation energi till chl a, som avger på ~ 675 nm. Om den chl c till chl en energiöverföring är störd, chl c avger på ~ 640 nm. I excitation spektra, överföra energin till chl en övervakas genom att ändra magnetiseringen våglängd från 370-600 nm. I spektralområdet från 370-440 nm främst chl en är upphetsad. Excitation runt 465 nm gynnar chl c. I de intervall > 500 nm karotenoider, främst fucoxanthins, exciteras. Energiöverföring påverkas, om chl c och karotenoider bidrar mindre till chl en fluorescens. Därmed minskar fluorescens avkastningen i dessa spektral-regioner med avseende på chl en magnetisering mellan 370-440 nm.

Önskad renhet av provet beror på syftet med studien. Det är exempelvis viktigt att separera fotosystem från FCP för spektroskopiska mätningar medan icke-pigmenterade proteiner stör mindre med mätningarna. Här en renhetsgrad av 95% är tillräckligt höga (figur 2E). För massa spektrometriska metoder uteslutande, ska FCP subenheter vara synliga på en silver-färgade gel.

Kvalitetskontroll av de Liposom förberedelsen är svårt att övervaka och kan endast ses i slutet av protokollet (2.2.5, figur 3A). FCP komplexen förstörs om deras färg övergår från brunt till olivgrön. Ett bra resultat är om en brun Liposom bråkdel samlas. Procentandelen av liposomer återvunna vs. aggregerade pellets är optimalt > 70%. Införlivandet av FCP i liposomer igen leda till mindre pigment förlust. En jämförelse av normaliserade absorbansen spectra före och efter inkorporeringen ses om pigment försvann (figur 3B, 3 C). Några absorbansen toppar FCP-liposomer visas bredare och upptaget i den röda spektrala-regionen (~ 670 nm - det så kallade Qy bandet) av chl en kan vara lite röd-skiftat. Detta uppstår på grund av klustring av FCP i Liposom. Chl en fluorescens avkastning som härrör från FCP i liposomer minskas till stor del på grund av excitonic interaktion i FCP kluster (figur 3D, cf. diskussion).

En typisk experiment med liposomer utnyttjar den Liposom två reaktion fack åtskilda av en lipid lipidens som möjliggör pH eller elektrokemisk övertoningar. I ett exempel testades effekterna av kalium ion toning på FCP fluorescens avkastning (figur 4A). Fluorescens avkastningen mättes i närvaro av standard buffert. Fluorescensen sjunker med 30% om KCl lades till. Toningen som K+ släpptes av den kalium specifika jonofor valinomycin, som återställer FCP fluorescensen till den ursprungliga nivån (figur 4B). Dessa förändringar i fluorescens bekräfta hypotesen att FCP komplex svarar på kalium ion koncentration övertoningar24 i vivo.

Figure 4
Figur 4: typisk experiment med FCP liposomer visar förändringen av FCP fluorescens som svar på en elektrokemisk gradient induceras av KCl. (A) Experimentella system: 1. FCP chl fluorescens i dialys buffert. 2. tillägg av 20 mM KCl förmå en elektrokemisk gradient. 3. lättnader i övertoningen genom att K+ selektiv jonofor valinomycin (4 µM). (B) släpp av FCP fluorescens (675 nm) som svar på en K+ lutning (blå) och restaurering av samma fluorescens avkastningen som tidigare (orange) av avkoppling på toningen (grå). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

buffertar / blandningar sammansättning
cell tillväxt & Konstgjorda havsvatten enligt 86 mM NaCl
tylakoida beredning Provasoli, 1957 (ASP)25 21 mM KCl
4 mM Tris
8,1 mM MgSO4
11,8 mM NaNO3
0,58 mM K3HPO4
0,16 mM H3BO3
2 mM kiseldioxid
pH 7,7 (H2så4)
autoklav
Lägg till sterila: 2,72 mM CaCl2
Lägg till sterila: 0,012 mM FeCl3
Lägg till sterila: 0.092 mM EDTA
Lägg till sterila: 0.02 mM MnCl2
Lägg till sterila: 0,002 mM ZnCl2
Lägg till sterila: 50 pM CoCl2
Lägg till sterila: 25 pM Na2MoO4
Lägg till sterila: 22.5 pM CuCl2
homogenisering buffert 10 mM MES
2 mM KCl
5 mM EDTA
1 M sorbitol
pH 6,5 (KOH)
tvätt buffert 10 mM MES
2 mM KCl
5 mM EDTA
pH 6,5 (KOH)
glas pärla blandning 75% 1 mm pärlor
25% 0,4 mm pärlor
aceton 90% (v/v) med H2O
flytande kväve
FCP rening n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside 10% (w/v) i H2O
buffert B1 25 mM Tris
2 mM KCl
pH 7,4 (HCl)
buffra B1a = B1 + b-DDM 0,03% (w/v) final
gradient sackaroslösning 19% sackaros (w/v) i B1a
Liposom förberedelse lipider Se kompletterande tabell 1
N2 gas
n-octyl β-D-glukopyranosid (OG) 10% (w/v) i B1a
tricine buffert 20 mM pH 7,5
4 x dialys buffert (DB) 80 mM tricine pH7.5
20 mM MgCl2
0.04% (w/v) NaN3

Tabell 1: Lista över buffertar, lager lösningar och blandningar för FCP förberedelser och införlivande i liposomer.

Kompletterande Tabell1: exempel för lipid- och chl en baserat beräkning. En lipid/chl förhållandet 12 används i exemplet i figur 1 och figur 3. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

FCP liposomer med naturliga lipid sammansättning ger en praktisk, enkel och reproducerbara verktyg för att undersöka spektroskopiska boenden in vitro-. Lipid miljön i FCP liposomer liknar situationen inom tylakoida membranet, vilket ger upphov till experimentella resultat som är närmare naturliga förhållanden.

I området i närheten finns det flera fördelar med att använda C. meneghiniana som modellsystem för FCP antenn. Den växer relativt fort och är mer robust i jämförelse med andra kiselalger modell arter, exempelvis Thalassiosira pseudonana. Cellerna bryta relativt lätt i pärla mill, vilket möjliggör en hög avkastning av intakt tylakoida komplex. Den stora punkten för C. meneghiniana är rikedomen av biokemiska och spektroskopiska data som erhållits i sista år16,17,23,27,29,31 ,32,33,34. Den enda nackdelen är att en kommenterad arvsmassa inte är tillgänglig ännu även om genetiska manipulationer är möjligt35.

FCPs var beredda från kulturer odlas under optimala förhållanden. Därmed kan avkastningen, subenhet sammansättning och pigmentering av FCP komplex ändras om de är beredda från stress villkor, t.ex. hög ljus27 eller näringsämnen begränsning. Cell störningar i pärla kvarnen (1.1.3) är avgörande för FCP avkastning och bör övervakas efter varje förändring av tillväxt villkorar av ett mikroskop. Plastids bör har släppts från cellerna så att tomma frustules (kiseldioxid skal) är rådande. Nästa viktiga steg är tylakoida lösbarhet. Effektiviteten i membran lösbarhet stör mängden lagring lipider som ansamlas under vissa stress villkor36. Därför bör mängden rengöringsmedel justeras före bearbetning erhållits under stress förhållanden att undvika överdriven lösbarhet. Problemet visas som ökad chl c fluorescens utsläpp på ~ 640 nm. Vidare energiöverföring från karotenoider (500-550 nm) till chl en reduceras. Detta kan ses i excitation spektrum (figur 2 c, 2D). Vissa metoder kan vara användbart att separera FCPa från FCPb antenn komplex genom jonbyte kromatografi27.

Överföring av FCP i liposomer är nästa viktiga steg. Spruttryck, Liposom homogenitet och orördhet beror på flera parametrar. Lipid-micelle-förberedelse och extrudering ger likartad storlek Liposom prekursorer. I detta exempel (2.1.3-2.1.4), polykarbonat membran av 100 nm porstorlek användes för att få en proteo-Liposom storlek ~ 50 nm. Mängden FCP tillsätts lipid-tvättmedel micellerna definierar proteinet: lipid förhållandet i Liposom. Därmed erhålls ett definierat antal FCP per Liposom. I ett liknande tillvägagångssätt växt och gröna alger LHC komplex klustrade spontant. Detta faktum uppenbarades av tid-löst fluorescens och singel-molekyl spektroskopi22 och ger ett ljud som bas för ytterligare experiment.

Den kontrollerade dialysen är också avgörande för införlivandet av FCP i liposomer. Även om införlivandet av den hydrofoba FCP komplexa gynnas energetically, kan kineticsen av införande konkurrera med kinetiken för aggregering. Detta faktum blir mer framträdande den mer hydrofoba och den större komplexen är. I det här exemplet är den mindre FCPa trimer inbäddad snabbare än den större FCPb nonamer. Ordentlig FCP införlivande kräver att lipid micellerna är väl blandade med solubilized FCP komplex innan tvättmedel borttagning via dialys. Här, kan den blandande tiden i 2.2.1 varieras. Det rekommenderas inte att stiga blandande temperaturen eftersom detta kan leda till FCP sönderfall. Dessutom ”hastighet” tvättmedel borttagning är viktigt och kan justeras av mängden adsorbenten (2.2.4). Den slutliga storleken av liposomer kan variera. Dynamiska ljusspridning, analytisk ultracentrifugering och elektronmikroskopi är lämpliga metoder för att bestämma de Liposom storlek utbud37,38. För detta protokoll med naturliga tylakoida lipid sammansättning och lipid micelle extrudering, förväntar vi oss ovannämnda diameter 50-80 nm och ett nästan sfäriskt liknande form avslöjades av cryo-elektronmikroskopi. Dessa resultat har erhållits med samma metod med gröna alger LHC22. Liposomer av sådan liten diameter har en stark yta krökning ~ 10 ° per 5 nm som kan böja större antenn komplex och tvinga dem att monomerize. Denna situation härmar den naturliga krökningen i grana marginaler av alger och växter22. Jämfört med grana marginaler, verkar större delen av tylakoida ganska platt. Därför, om större komplex såsom fotosystem skall studeras är det rekommenderat att använda liposomer av större diameter. En annan fråga som uppkommer är: Vad är orientering av komplex? Vid FCPa, vi dra slutsatsen från mätningar i svar till lågt pH24 att orienteringen är ca 50% höger ut och 50% inifrån och ut. I framtiden krävs metoder för att tvinga komplexen i en riktning. I andra studier med bacteriorhodopsin efflux pumpen, är nästan alla proteiner spontant orienterade på samma sätt (höger ut)39.

Det är frågan om vad inducerar fluorescens ändringen när K+ läggs till liposomer. Flera svar är tänkbara. Om K+ koncentrationen ensam är ansvarig, experimentet i figur 4 skulle leda till ytterligare minskning av fluorescens om valinomycin läggs efter KCl. I en färsk studie gav vi stöd för uppfattningen att K+ koncentrationsgradient är ansvarig för fluorescens ändringen av FCPa24. Flera andra faktorer kan påverka fluorescensen avkastningen också. Dessa kan vara osmotisk eller ytan avgift dynamics effekter24.

Fördelen med att undersöka ljus skörd antenn komplex såsom FCP i liposomer är sammanfattningsvis att det ger ett funktionellt system nära i vivo förhållanden. Men antalet komponenter är fortfarande små, vilket minskar komplexiteten i experimentella resultat. Det möjliggör simuleringar av lätta stress villkor och induktion av foto-skyddande mekanismer. Vidare, vissa lipid arter på funktionen av FCP komplex roll kan studeras. Potentialen i denna metod ökar med de nyligen gjorda fortskrider i cryo-elektronmikroskopi, enda molekyl spektroskopi och andra gången löst spektroskopiska metoder. Detta kommer göra det möjligt för forskare att förbättra studier av energiöverföring i ljus skörd system. Kombinerat med dessa tekniker, kan kunskap om FCP i statligt solubilized och aggregerade kompletteras med data om bidraget av lipid miljön till FCP funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Rana Adeel Ahmad för bistånd i FCP rening. Prof. Claudia Büchel är erkänt för bra diskussioner och läsa manuskriptet. Detta arbete fick stöd av den tyska forskningsfondens till LD (DI1956-1/1) och Humboldt foundation för ett Feodor Lynen stipendium till LD.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
500 ml centrifuge vials
high speed centrifuge Heraeus
Bead Mill VI 2 Edmund-Bühler (edmund-buehler.de) newer version: Vibrogen-Zellmühle Vl 6
Silibeads S 400 µm Sigmund-Lindner.com 5223-7
Silibeads S 1,-1,3 mm Sigmund-Lindner.com 4504
VitraPOR filter funnel - por1 ROBU GmbH 21121
polycarbonate ultracentrifuagtion vials (30 mL) for T-865 Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de) 314348
Ultracentrifuge Discovery 90SE Sorvall n.a.
rotor T 865 ThermoFisher Scientific (thermofisher.com) 51411
Neubauer Cell Counter Chamber (improved) Carl Roth Laborbedarf (Carlroth.com) T729.1
Zeiss Mikroskop Primostar (7) Optik-Pro (optik-pro.de) 51428
optical glass cuvettes (6040-OG) Hellma Analytics (hellma-analytics.com) "6040-10-10"
V-630 UV-VIS Spectrophotometer (incl. software) Jasco (jasco.de) V-630
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside ANATRACE (anatrace.com) D310LA
Ultra-Clear tubes 17 ml for AH629 Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de) 344061
rotor AH629-17-mL ThermoFisher Scientific (thermofisher.com) 54285
Membrane concentrator_Centriprep 30 kDa cutoff Millipore (merckmillipore.com) 4307
Biometra Minigel-Twin Analytik Jena AG (analytik-jena.de) 846-010-100
Silver Stain Plus Kit Bio-Rad (bio-rad.com) 1610449
libre office spread sheet The document foundation https://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/
special glass cuvettes for fluorescence (101-0S) Hellma Analytics (hellma-analytics.com) 101-10-20
Spectrofluorometer FP-6500 (incl. Software) Jasco (jasco.de) FP-6500
SDS-loading buffer Roti-Load ROTH (carlroth.com) K929.1
n-octyl β-D-glucopyranoside ANATRACE (anatrace.com) O311
Monogalactosyl Diaclyglycerol (MGDG) Larodan AB (larodan.com) 59-1300 make stock solution in chloroform
Digalactosyl Diacylglycerol (DGDG) Larodan AB (larodan.com) 59-1310 make stock solution in chloroform
Sulphoquinovosyl Diacylglycerol (SQDG) Larodan AB (larodan.com) 59-1230 make stock solution in chloroform
L-alpha-Phosphatidylglycerol (PG) Larodan AB (larodan.com) 37-0150 make stock solution in chloroform
L-α-Phosphatidylcholine Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com) P3782 SIGMA make stock solution in chloroform
sonicator bath S-50TH Sonicor (getmedonline.com SONICOR-S-50TH
mini-Extruder Avanti Polar Lipids (Avanti.com) 610000
Nuleopore polycarbonate membrane Avanti Polar Lipids (Avanti.com) 610005
dialysis membrane Visking 14 kDa cutoff ROTH (carlroth.com) 0653.1 boil in destilled water before use
Biobeads SM2 Adsorbent Biorad (Bio-rad.com) 152-3920
sucrose epichlorhydrin copolymer - Ficoll 400 Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com) F4375
Polycarbonate ultracentrifuagtion vials (2.7 mL) for TFT 80.4 Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de) 252150
rotor TFT 80.4 Millipore (merckmillipore.com) 54356
material listed in order of appearance For specific safety instructions please refer to material safety sheets and repective manuals.
Standard lab material and substances are not listed.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eberhard, S., Finazzi, G., Wollman, F. A. The Dynamics of Photosynthesis. Annual Review of Genetics. 42, 463-515 (2008).
  2. Li, Z. R., Wakao, S., Fischer, B. B., Niyogi, K. K. Sensing and Responding to Excess Light. Annual Review of Plant Biology. 60, 239-260 (2009).
  3. Niyogi, K. K., Truong, T. B. Evolution of flexible non-photochemical quenching mechanisms that regulate light harvesting in oxygenic photosynthesis. Current Opinion in Plant Biology. 16 (3), 307-314 (2013).
  4. Li, X. -P., et al. A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting. Nature. 403 (6768), 391-395 (2000).
  5. Peers, G., et al. An ancient light-harvesting protein is critical for the regulation of algal photosynthesis. Nature. 462 (7272), 518-521 (2009).
  6. Correa-Galvis, V., et al. Photosystem II Subunit PsbS Is Involved in the Induction of LHCSR Protein-dependent Energy Dissipation in Chlamydomonas reinhardtii. The Journal of biological chemistry. 291 (33), 17478-17487 (2016).
  7. Bailleul, B., et al. An atypical member of the light-harvesting complex stress-related protein family modulates diatom responses to light. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18214-18219 (2010).
  8. Taddei, L., et al. Multisignal control of expression of the LHCX protein family in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum. Journal of experimental botany. 67 (13), 3939-3951 (2016).
  9. Lepetit, B., et al. The diatom Phaeodactylum tricornutum adjusts nonphotochemical fluorescence quenching capacity in response to dynamic light via fine-tuned Lhcx and xanthophyll cycle pigment synthesis. New Phytologist. 214 (1), 205-218 (2017).
  10. Büchel, C. Evolution and function of light harvesting proteins. Journal of Plant Physiology. 172, 62-75 (2015).
  11. Lavaud, J., Rousseau, B., van Gorkom, H. J., Etienne, A. -L. Influence of the Diadinoxanthin Pool Size on Photoprotection in the Marine Planktonic Diatom Phaeodactylum tricornutum. Plant Physiology. 129 (3), 1398-1406 (2002).
  12. Ruban, A., et al. The super-excess energy dissipation in diatom algae: comparative analysis with higher plants. Photosynthesis Research. 82 (2), 165-175 (2004).
  13. Mann, D. G. The species concept in diatoms. Phycologia. 38 (6), 437-495 (1999).
  14. Papagiannakis, E., van Stokkum, I. H. M., Fey, H., Büchel, C., van Grondelle, R. Spectroscopic Characterization of the Excitation Energy Transfer in the Fucoxanthin-Chlorophyll Protein of Diatoms. Photosynthesis Research. 86 (1-2), 241-250 (2005).
  15. Premvardhan, L., Robert, B., Beer, A., Büchel, C. Pigment organization in fucoxanthin chlorophyll a/c2 proteins (FCP) based on resonance Raman spectroscgopy and sequence analysis. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1797 (9), 1647-1656 (2010).
  16. Gildenhoff, N., Herz, J., Gundermann, K., Büchel, C., Wachtveitl, J. The excitation energy transfer in the trimeric fucoxanthin-chlorophyll protein from Cyclotella meneghiniana analyzed by polarized transient absorption spectroscopy. Chemical Physics. 373 (1), 104-109 (2010).
  17. Ramanan, C., et al. Exploring the mechanism(s) of energy dissipation in the light harvesting complex of the photosynthetic algae Cyclotella meneghiniana. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1837 (9), 1507-1513 (2014).
  18. Haferkamp, S., Kirchhoff, H. Significance of molecular crowding in grana membranes of higher plants for light harvesting by photosystem II. Photosynthesis Research. 95 (2-3), 129-134 (2008).
  19. Wahadoszamen, M., et al. Stark fluorescence spectroscopy reveals two emitting sites in the dissipative state of FCP antennas. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1837 (1), 193-200 (2014).
  20. Zhou, F., et al. Effect of monogalactosyldiacylglycerol on the interaction between photosystem II core complex and its antenna complexes in liposomes of thylakoid lipids. Photosynthesis Research. 99 (3), 185-193 (2009).
  21. Moya, I., Silvestri, M., Vallon, O., Cinque, G., Bassi, R. Time-resolved fluorescence analysis of the photosystem II antenna proteins in detergent micelles and liposomes. Biochemistry. 40 (42), 12552-12561 (2001).
  22. Natali, A., et al. Light-harvesting Complexes (LHCs) Cluster Spontaneously in Membrane Environment Leading to Shortening of Their Excited State Lifetimes. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16730-16739 (2016).
  23. Gundermann, K., Büchel, C. Factors determining the fluorescence yield of fucoxanthin-chlorophyll complexes (FCP) involved in non-photochemical quenching in diatoms. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1817 (7), 1044-1052 (2012).
  24. Ahmad, R. A., Dietzel, L. Relaxation of cellular K+ gradients by valinomycin induces diatoxanthin accumulation in Cyclotella meneghiniana cells and alters FCPa fluorescence yield in vitro. Physiologia Plantarum. , 171-180 (2017).
  25. Provasoli, L., McLaughlin, J. J. A., Droop, M. R. The development of artificial media for marine algae. Archiv für Mikrobiologie. 25 (4), 392-428 (1957).
  26. Jeffrey, S., Humphrey, G. New spectrophotometry equations for determining chlorophyll a, chlorophyll b, chlorophyll c-1 and chlorophyll c-2 in higher plants, algae and natural phytoplankton. Biochemie und Physiologie der Pflanzen. 167, 191-194 (1975).
  27. Beer, A., Gundermann, K., Beckmann, J., Büchel, C. Subunit Composition and Pigmentation of Fucoxanthin−Chlorophyll Proteins in Diatoms: Evidence for a Subunit Involved in Diadinoxanthin and Diatoxanthin Binding. Biochemistry. 45 (43), 13046-13053 (2006).
  28. Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Analytical Biochemistry. 166 (2), 368-379 (1987).
  29. Büchel, C. Fucoxanthin-Chlorophyll Proteins in Diatoms: 18 and 19 kDa Subunits Assemble into Different Oligomeric States. Biochemistry. 42 (44), 13027-13034 (2003).
  30. Vieler, A., Wilhelm, C., Goss, R., Süß, R., Schiller, J. The lipid composition of the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii and the diatom Cyclotella meneghiniana investigated by MALDI-TOF MS and TLC. Chemistry and Physics of Lipids. 150 (2), 143-155 (2007).
  31. Gundermann, K., Büchel, C. The fluorescence yield of the trimeric fucoxanthin-chlorophyll-protein FCPa in the diatom Cyclotella meneghiniana is dependent on the amount of bound diatoxanthin. Photosynthesis Research. 95 (2-3), 229-235 (2008).
  32. Miloslavina, Y., et al. Ultrafast fluorescence study on the location and mechanism of non-photochemical quenching in diatoms. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1787 (10), 1189-1197 (2009).
  33. Grouneva, I., Jakob, T., Wilhelm, C., Goss, R. The regulation of xanthophyll cycle activity and of non-photochemical fluorescence quenching by two alternative electron flows in the diatoms Phaeodactylum tricornutum and Cyclotella meneghiniana. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1787 (7), 929-938 (2009).
  34. Chukhutsina, V. U., Büchel, C., van Amerongen, H. Disentangling two non-photochemical quenching processes in Cyclotella meneghiniana by spectrally-resolved picosecond fluorescence at 77 K. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1837 (6), 899-907 (2014).
  35. Ghazaryan, A., Akhtar, P., Garab, G., Lambrev, P. H., Büchel, C. Involvement of the Lhcx protein Fcp6 of the diatom Cyclotella meneghiniana in the macro-organisation and structural flexibility of thylakoid membranes. Biochimica Et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1857 (9), 1373-1379 (2016).
  36. Darley, W. M. Biochemical composition. The biology of diatoms. 13, 198-223 (1977).
  37. Milsman, M. H. W., Schwendner, R. A., Weder, H. G. Preparation of large single bilayer liposomes by a fast and controlled dialysis. Biochimica Et Biophysica Acta. 512 (1), 147-155 (1978).
  38. Zumbuehl, O., Weder, H. G. Liposomes of controllable size in the range of 40 to 180 nm by defined dialysis of lipid-detergent-mixed micelles. Biochimica Et Biophysica Acta. 640 (1), 252-262 (1981).
  39. Verchere, A., Broutin, I., Picard, M. Photo-induced proton gradients for the in vitro investigation of bacterial efflux pumps. Scientific Reports. 2 (306), (2012).
  40. Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).

Tags

Biokemi fråga 138 ljus skörd komplex Foto-skydd energiöverföring tylakoida membran komplex Protonlutning jonoforer klorofyll fluorescens
Isolera och införliva ljus-skörd antenner från kiselalger <em>Cyclotella Meneghiniana</em> i liposomer med tylakoida lipider
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pieper, K., Gundermann, K., Dietzel, … More

Pieper, K., Gundermann, K., Dietzel, L. Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids. J. Vis. Exp. (138), e58017, doi:10.3791/58017 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter