Summary
Hier presenteren we een protocol om te isoleren fucoxanthin chlorofyl a/c bindende proteïnen (FCP) van diatomeeën en in liposomen met natuurlijke lipide composities aan het bestuderen van excitatie energieoverdracht op ion samenstelling veranderingen te integreren.
Abstract
De fotosynthetische prestaties van planten, algen en diatomeeën afhankelijk sterk van de snelle en efficiënte regulering van de lichte oogsten en energie overdracht processen in het membraan van de thylakoïde van chloroplasten. Het licht oogsten antenne van diatomeeën, de zogenaamde fucoxanthin chlorofyl a/c bindende proteïnen (FCP), zijn vereist voor de absorptie van licht en efficiënte overdracht naar de fotosynthetische reactie centra alsmede voor foto-bescherming tegen buitensporige licht. Het schakelen tussen deze twee functies is een langdurige kwestie van onderzoek. Veel van deze studies zijn uitgevoerd met FCP in wasmiddel micellen. Voor studies van de interactie, zijn de detergentia verwijderd, die leidde tot een aspecifieke samenvoeging van FCP complexen. In deze aanpak is het moeilijk te discrimineren tussen artefacten en fysiologisch relevante gegevens. Vandaar, meer waardevolle informatie over FCP en andere membraan gebonden licht complexen oogst kan worden verkregen door het bestuderen van eiwit-eiwitinteractie, energie-overdracht en andere spectroscopische functies als ze zijn ingesloten in de omgeving van hun oorspronkelijke lipide. Het belangrijkste voordeel is dat liposomen hebben een gedefinieerde grootte en een gedefinieerde lipide/eiwitverhouding waarmee de mate van FCP clustering wordt gecontroleerd. Verder, veranderingen in de pH en ion samenstelling die regelen van licht oogsten in vivo kunnen gemakkelijk worden gesimuleerd. In vergelijking met het membraan van thylakoïde zijn de liposomen homogener en minder complex is, waardoor gemakkelijker te verkrijgen en te begrijpen van spectroscopische gegevens. Het protocol wordt de procedure beschreven van FCP isolatie en zuivering, liposomen voorbereiding en opneming van FCP in liposomen met natuurlijke lipide samenstelling. Het gevolg is van een typische toepassing zijn gegeven en besproken.
Introduction
Fotosynthetische organismen zoals diatomeeën moeten omgaan met veranderende lichtomstandigheden en reageren met verfijnde acclimatisering mechanismen die fotosynthetische hoogrenderende ondersteunen en beschermen tegen foto-oxidatieve schade veroorzaakt door het overmatige licht. Een grote licht-beschermende proces in fotosynthetische eukaryoten is de hoge energie blussen (qE) van geabsorbeerde licht dat zich als de belangrijkste bijdrage aan de niet-fotochemische blussen (NPQ) onder lichte stress voorwaarden1,2 voordoet ,3. De lichte oogsten antenne complexen (LHC) zijn betrokken bij de regulering van excitatie energie overdracht trajecten. In antwoord op hoge licht geïnduceerde lage pH in de chloroplast lumen, de antenne systeem schakelopties van het licht oogsten van status naar status het blussen. Deze dissipatief energietoestand beschermt photosystems (PS) en andere complexen in het membraan van thylakoïde foto-oxidatie. In fotosynthetische eukaryoten, wordt de qE meestal veroorzaakt door twee factoren1,-2,3. Een factor is het gespecialiseerde licht oogsten eiwit dat op de lage pH reageert. De publieke omroepen proteïne induceert de qE in hogere planten4. LhcSRs5, gemoduleerd door publieke omroepen activiteit, veroorzaken de qE in groene algen6. Diatomeeën bezitten Lhcx-achtige eiwitten die structuur verwant zijn aan de LHCSRs7,,8,,9,10.
De tweede factor van qE is de Xantofyl-cyclus waar carotenoïden van de antenne door de-epoxidatie omgezet in de vorm van een foto-beschermende en teruggekeerd door epoxidatie. In planten en groene algen, wordt Violaxanthine geconverteerd naar zeaxanthine. In diatomeeën, wordt diadinoxanthin geconverteerd naar diatoxanthin, die vervolgens met de omvang van NPQ11 correleert. Het licht van de Diatomee oogsten antenne bezit enkele eigenaardigheden, hoewel het evolutionaire gerelateerde te planten en algen LHCs. De overgang van licht aan foto-bescherming is enorm snel en de capaciteit van NPQ is hoger in vergelijking met planten12. Dit zou een reden waarom diatomeeën zijn ijzersterk in verschillende ecologische niches op een manier die zij verantwoordelijk voor 45% van de oceanische netto primaire productie13 zijn. Diatomee lichte oogsten systemen zijn dus een interessant object voor fotosynthese onderzoek.
Diatomeeën, zoals de centric soorten Cyclotella meneghiniana, intrinsieke licht thylakoïde oogsten systemen vernoemd naar de pigmenten die ze bezitten bind - fucoxanthin, chlorofyl (chl) a en c, vandaar FCP. Light oogsten van eiwitten, zoals FCPs, zijn ingebed in de thylakoïde membraan systeem dat bestaat uit verschillende lagen van het membraan. Diatomeeën vormen bands van drie thylakoiden. Dit complex situatie maakt het moeilijk om ze te bestuderen op moleculair niveau in het membraan van thylakoïde. Bovendien, vele componenten dragen bij aan de verordening van licht oogsten (zie hierboven). Daarom waren de complexen in vele benaderingen, geïsoleerd van het membraan met behulp van milde wasmiddelen, bijvoorbeeld n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside (β-DDM), die solubilize van het membraan, maar de FCP-complexen intact te houden. Vele spectroscopische studies werden uitgevoerd met behulp van ontbindend FCP te onderzoeken intramoleculaire energie overdracht14,15,16,17. Deze voormalige aanpak was echter beperkt omdat de regulering van energie-overdracht excitonic interactie met andere antenne complexen of photosystems moet. Vandaar worden dit soort studies niet uitgevoerd met ontbindend complexen omdat de interactie tussen complexen verloren is.
Een belangrijk kenmerk in antenne verordening is de "moleculaire verdringing" van de antenne en photosystems in de thylakoïde membraan18. Voorheen, een eenvoudige benadering werd uitgevoerd om te simuleren van dit effect in vitro. Het wasmiddel werd verwijderd, wat leidt tot willekeurige aggregatie van antenne complexen. Hoewel sommige redelijke gegevens werd verkregen door deze aanpak17,19, de wasmiddel verwijdering weerspiegelt niet de situatie in vivo en kent een aantal beperkingen omdat het complexen zijn niet in hun reguliere tertiaire interactie structuur.
Het gebruik van liposomen overwint verscheidene van de vroegere beperkingen. De tertiaire structuur is nog volledig intact. Het liposoom membraan biedt een quasi-eigen omgeving voor de antenne-complexen. Het membraan scheidt de binnenkant van de liposomen van de buitenomgeving. Langs deze weg bieden liposomen twee reactie compartimenten voor studies van ion en pH verlopen ook wat transportprocessen. Verder kunnen de parameters van het experimentele systeem gemakkelijker worden beheerd voor studies in het membraan van thylakoïde. Liposomen bleken al te zijn een uitstekend hulpmiddel om te studeren fotosynthetische complexen. Een belangrijk aandachtspunt in het verleden was op de plant waar het effect van de gewijzigde lipide samenstelling is getest op LHC II20LHC. In andere benaderingen waren de eiwit-eiwit interactie tussen verschillende LHC II onderzochte21. Ook werden sommige studies in groene algen uitgevoerd die beschrijven spontane clustering tussen LHC22. Gezien het belang van diatomeeën voor aquatische ecosystemen, relatief weinig studies werden uitgevoerd met antenne complexen van diatomeeën. Twee studies onderzocht de complexen van de antenne van de centric Cyclotella meneghiniana, waar de clustering van de FCP antenne23 en reactievermogen van FCP elektrochemische verlopen24 werden getoond. Dus, liposomen zijn een uitstekend hulpmiddel om te studeren Diatomee antennes en hun interactie en de verordening in bijna oorspronkelijke omstandigheden. De liposomen zijn veelzijdig sinds vele aandoeningen zoals lipide samenstelling, grootte van de liposomen, eiwit dichtheid en de omliggende waterfase kan worden gecontroleerd. De methode vereist bovendien lage bedragen van monsters. Het experimentele systeem is robuust en zeer reproduceerbaar. De opdeling van liposomen zorgt voor het bestuderen van pH en ion hellingen, die zijn belangrijke factoren in de regulering van de antenne complexen.
Hier beschrijven we de isolatie van FCP antenne complexen van C. meneghiniana en hun opneming in liposomen met natuurlijke thylakoïde lipide samenstelling. Ook wij voorbeeldige gegevens leveren voor de spectroscopische karakterisering van ontbindend FCP en vergelijk deze met FCP in liposomen. De methode geeft een overzicht van kennis en gestandaardiseerde protocollen verkregen van de verbeteringen van de Gundermann en Büchel 201223, Natali et al. 201622en Ahmad en Dietzel 201724.
Figuur 1: schematische weergave van de werkstroom. (1) verwijst naar alinea 1 die beschrijft celgroei, verstoring en thylakoïde isolatie met FCP scheiding aanleiding sacharose dichtheid verlopen; C. m. -Cyclotella meneghiniana cellen. (2) voorbereiding van natuurlijke thylakoïde lipide mengsel (MGDG, DGDG en SQDG) als beschreven in lid 2 en oprichting van lipide-wasmiddel micellen met octylglycoside (OG). Een gedefinieerde lipide-micel grootte wordt bereikt door met behulp van membranen met een diameter van gedefinieerde porie extrusie. FCP en lipide-micellen zijn herenigd op een vooraf gedefinieerde lipide: eiwitverhouding en de detergentia OG en β-DDM zijn verwijderd via gecontroleerde dialyse FCP proteoliposomes vormen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Fotosynthetische complexen zoals FCPs zijn zeer gevoelig voor licht en warmte. Werkt altijd op ijs en onder een erg schemerig licht.
1. isolatie van FCP uit cellen
-
Thylakoïde isolatie van C. meneghiniana cellen
- C. meneghiniana in vijf flessen van 500 mL die elk gevuld met 300 mL ASP-medium23,25 en 50 miljoen cellen groeien. Sluit de kolven met een stop van katoen en toestaan dat de cellen om te groeien naar de exponentiële groeifase voor ongeveer een week in een roteerapparaat bij 120 omw / m met een 16 h lichte en de donkere fase 8 h bij 40 µmol photons/(m²s) witte licht en een temperatuur tussen 15-18 ° C. Controleer of het nummer van de cel tussen 1,5-2 miljoen cellen/mL met een cel teller kamer is.
- Centrifugeer de cellen bij 4000 x g in een precooled rotor met 500 mL centrifuge flesjes (4 ° C) gedurende 15 min. in een high-speed centrifuge. Resuspendeer de cel pellets in 12 mL buffer homogenisering (HB, tabel 1) door pipetteren.
- Spoel de suspensie tot een enkele 50 mL plastic koker. Opslaan van de monsters bij-80 ° C, of gaat u verder met stap 1.1.3.
- Vooraf cool de kraal molen en apparatuur. Vul het bekerglas van de 50 mL van de kraal molen tot 75% met een glazen kraal mengsel en voeg de celsuspensie. Gebruik voor de verstoring van de cel, 7 x 45 s pulsen op volle snelheid met 30 s van koeling tussen elke puls. Neem 20 µL van verstoorde cellen voor kwaliteitscontroles in stap 1.1.6.
- Filteren de verstoorde cellen over een glazen trechter met filter en wassen de HB gieten over de glasparels totdat ze worden duidelijk weergegeven. Zwembad de wash-fractie met het filtraat. Houd het eindvolume lager dan 150 mL.
- Centrifugeer het monster gedurende 15 minuten op 140 x g drie 50 mL plastic buizen met pellet van het puin van de cel. Zorgvuldig het supernatant overbrengen in 20 mL polycarbonaat ultracentrifugatie flesjes en gooi de pellet.
- Vul de flesjes met HB equilibreer het gewicht en centrifugeer in een geschikte rotor voor 1 h bij 300.000 x g en 4 ° C tot de thylakoïde membranen pellet.
- Gebruik de centrifugeertijd om te controleren van het aandeel van de cellen verstoord door microscopie bij 400 X vergroting met het 20 µL monster genomen in 1.1.3. Berekenen van de verhouding tussen chloroplast gratis en chloroplast met frustules (silica shells).
Opmerking: Diatomee celwanden zijn gemaakt van silica, die als zeer buigingsinrichting stof in de microscoop zichtbaar is. Chloroplasten die zich voordoen als groene stippen moeten hadden zijn vrijgegeven uit de cellen als de cel verstoring gewerkt. - Resuspendeer de pellet membraan met als weinig wassen buffer mogelijk (0.5-1 mL) met behulp van een kleine schilder borstel. Vul de polycarbonaat ultracentrifugatie flesjes met buffer (tabel 1) wassen, equilibreer hun gewicht en Centrifugeer gedurende 20 min op 200.000 x g - en 4 ° C.
- Resuspendeer de gewassen membranen met een schilder borstel. Wassen buffer alleen toevoegen als nodig om te houden van de thylakoïde concentratie zo hoog mogelijk. Het zwembad van alle thylakoiden in één monster flesje (15 mL).
- Vooraf Verdun de monsters met behulp van 10 µL van het monster met 90 µL van 100% aceton. Centrifugeer het bij 12.000 x g gedurende 5 min naar pellet neergeslagen eiwitten. Neem 10 µL van het predilution en meng het met 990 µL van 90% aceton.
- Meet de extinctie (ABS) van chlorofyl a en c op 664 nm en 630 nm in 90% aceton. Aftrekken van de ABS-750nm van beide waarden. Bepalen van de inhoud van de totale chlorofyl met behulp van de volgende formule:24
1)
2)
- Meet de extinctie (ABS) van chlorofyl a en c op 664 nm en 630 nm in 90% aceton. Aftrekken van de ABS-750nm van beide waarden. Bepalen van de inhoud van de totale chlorofyl met behulp van de volgende formule:24
- Aliquot ze in gedeelten van 0.5 mg van totale chlorofyl in een 1,5 mL reactie buizen, bevriezen ze in vloeibare stikstof en bewaar ze bij-80 ° C tot verder gebruik.
-
Scheiding en concentratie van FCP complexen
- Een kleurovergang sacharoseoplossing bereiden en vul de ultracentrifuge buizen tot de bovenkant minus het laadvolume (300 – 500 µL). Bevriezen de buizen bij-20 ° C totdat ze volledig zijn geblokkeerd. Toestaan dat de buizen te ontdooien bij + 4 ° C, waarin 3-4 h voor een tube 17 mL.
- Herhaal de vries-dooi cyclus tweemaal om de kleurovergang voor betere resolutie te verfijnen.
- Gebruik van de monsters in 1.1.9 overeenkomt met 0,5 mg van chlorofyl en aanpassen met buffer B1 (tabel 1) tot een eindvolume van 2 mL. Voor solubilisatie, voeg toe n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside (b-DDM) aan een eindconcentratie van 20 mM.
- Omkeren van de buis 3 keer en plaats deze op het ijs gedurende 20 minuten met zacht schudden Voorkom schuim. Centrifugeer gedurende 5 min, 12.000 x g in een centrifuge vooraf gekoelde tafelblad bij + 4 ° C.
- Het laden van het supernatant op de helling. Laad niet meer dan 125 µg totale chlorofyl per verloop als 17 mL flacons worden gebruikt. Centrifugeer gedurende 22 h op 100.000 x g en + 4 ° C.
- Herstellen van de gewenste bruin FCP breuken van het verloop met behulp van een injectiespuit (figuur 2A). Neem een 5 µL aliquoot en Verdun het met 995 µL van B1a.
- Meet de extinctie (ABS) spectrum tussen 370-750 nm in een UV-VIS-spectrofotometer. Het gebruik van semi-micro optisch glas cuvettes.
- Open de spectra manager-software, ga naar spectrum modus en opnemen van een basislijn van 370 tot 750 nm gevolgd door monster metingen. Gebruik de volgende instellingen: scansnelheid, 200 nm/min; gegevens worp, 0,5 nm; reactie, middellange.
- Het meten van de hoeveelheid van het herstelde monster met een micropipet. Wassen van de complexen FCP door toevoeging van tweemaal de herstelde volume met B1 buffer (tabel 1). Concentreren in een membraan-concentrator met een 30 kDa cutoff op 1.000 x g en + 4 ° C tot een ABS-672nm van ten minste 20.
Opmerking: De b-DDM concentratie zou kunnen stijgen als gevolg van micel verrijking in het compartiment van de steekproef. Dit kan leiden tot verdere solubilisatie van de FCP-complexen! Vermijd overmatige solubilisatie door toevoeging van wasmiddel gratis buffer B1 als verder wassen stappen nodig zijn om te verwijderen van de resterende sacharose. - Neem een 20 µL aliquoot voor de besturingselementen. Schok het bevriezen van de monsters in vloeibare stikstof en bewaar ze bij-80 ° C.
- Een kleurovergang sacharoseoplossing bereiden en vul de ultracentrifuge buizen tot de bovenkant minus het laadvolume (300 – 500 µL). Bevriezen de buizen bij-20 ° C totdat ze volledig zijn geblokkeerd. Toestaan dat de buizen te ontdooien bij + 4 ° C, waarin 3-4 h voor een tube 17 mL.
Figuur 2: zuivering van FCP, spectroscopische besturingselementen en zuiverheid check. (A) typische uitstraling van een sacharose dichtheid verloop na overnachting centrifugeren. Alle bruine banden bevatten het zwembad van de FCP bestaande FCPa en FCPb. pigm. - niet-afhankelijke pigmenten, PS - photosystems (B) extinctie spectra van FCP vóór (blauwe lijn) en na (oranje-onderbroken lijn) concentratie centrifugaal filter-apparaten gebruiken met 30 kDa cutoff . Carotenoïden zijn bijzonder gevoelig voor verlies van de FCP, die in lagere absorptie in de regio tussen 500-550 nm resulteren zou. Grafieken worden genormaliseerd naar het chlorofyl Qy maximaal bij ~ 670 nm. (C) chlorofyl a emissie spectra met excitatie van chl c (465 nm) voor het testen van de functionele excitatie energie-overdracht. Als de energie van chl c chl overbrengen een wordt belemmerd, een extra fluorescentie band aan ~ 640 nm (chl c) ontstaat. Grafieken zijn genormaliseerd naar de maximale emissie. (D) excitatie spectra opgenomen in 675 nm (chl een maximale fluorescentie) voor het testen van de energieoverdracht naar chl een van alle pigmenten absorberende tussen 370 nm en 600 nm. Als de energie aan chl overdragen een is minder efficiënt, de opbrengst van de fluorescentie zou afnemen, met name tussen 465 en 550 nm. De grafieken zijn genormaliseerd tot de maximum ongeveer 440 nm. De spectra in (B), (C) en (D) zijn bijna identiek zijn als de concentratie goed werkte. (E) controleren op de zuiverheid van de geïsoleerde FCP met behulp van een Tris-tricine gel28. FCPa en FCPb hebben subeenheden tussen 18-19 kDa. Alle zichtbare zilver gebeitste eiwitten groter dan 20 kDa zijn contaminanten. Tijl. -Ze Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
-
Spectroscopische en gel gebaseerde besturingselementen
- Record de extinctie tussen 370-750 nm 5 µL van FCP in 995 µL van B1a na stap 1.2.5. Vergelijk het met het spectrum verkregen in stap 1.2.4. Gebruik dezelfde instrumenten en instellingen zoals beschreven in stap 1.2.4.
- Gegevens als *.csv exporteren en importeren van de gegevens in een werkblad. Normaliseren van beide spectra tot het maximum van chl een in de Qy band van circa 672 nm zoals afgebeeld in figuur 2B.
- Berekening van de verdunningsfactor van de monsters uit stap 1.2.4 en 1.3.1 door het verdelen van de gemeten ABS672nm door de gewenste ABS672nm van 0,03. Verdun de monsters dienovereenkomstig met B1a en deze overbrengen naar speciaal glas fluorescentie cuvettes.
- Record chl een fluorescentie emissiespectrum met een spectrofluorometer te onthullen intact lichtenergie overbrengen van chl c chl een (figuur 2C).
- De spectrometer software gebruiken en ga naar de spectrum meting modus met de volgende instellingen: mode, emissie; gleuf breedte excitatie en emissie, 3 nm; gevoeligheid, middellange; Scansnelheid, 100 nm/min; gegevens worp, 0,5 nm; excitatie golflengte, 465 nm; emissie, 600-800 nm. Het uitvoeren van autozero en maatregel.
- Record excitatie spectra met de hetzelfde monster en apparatuur te onthullen intact energie overbrengen van alle pigmenten chl een (figuur 2D). Instellingen wijzigen in: mode, excitatie; emissie golflengte, 675 nm; excitatie, 370-600 nm. De spectra opnemen.
- Met een spectrum rhodamine in hetzelfde bereik voor de spectrale eigenschappen van de lamp- cfcorrigeren. instructies in de gebruikershandleiding.
- Mix FCP monsters overeenkomt met 1 µg chl een met 10 µL van SDS-laden buffer. Incubeer gedurende 10 min bij 25 ° C. Centrifugeer gedurende 5 minuten op 12000 x g in een centrifuge tafelblad.
- Het laden van het supernatant op een Tris-tricine gel28. Scheiden gedurende 2 uur op 150 V en zilver-vlek het na scheiding40.
Opmerking: De FCP subeenheden scheiden in twee prominente eiwit banden tussen 18-19 kDa, die een bestanddeel zijn van de FCPa en FCPb29 (2E figuur).
- Het laden van het supernatant op een Tris-tricine gel28. Scheiden gedurende 2 uur op 150 V en zilver-vlek het na scheiding40.
- Record de extinctie tussen 370-750 nm 5 µL van FCP in 995 µL van B1a na stap 1.2.5. Vergelijk het met het spectrum verkregen in stap 1.2.4. Gebruik dezelfde instrumenten en instellingen zoals beschreven in stap 1.2.4.
2. voorbereiding van de liposomen en opneming van FCP
-
Voorbereiding van de lipide mengsel en lipide wasmiddel micellen
Opmerking: lipiden zijn gevoelig voor warme temperaturen, gecombineerd met oxidatieve voorwaarden. Proberen te houden van de lipiden, gekoeld en onder een N2 sfeer.- Het berekenen van de verhoudingen van de lipide gewenste thylakoïde voor C. meneghiniana volgens Vieler et al. 200730. Verwijzen naar het voorbeeld gegeven in Supplemental tabel 1. Bereiden de lipide stamoplossingen aanbevolen door de fabrikant in een oplosmiddel bewijs container.
- Pipetteer van de gewenste hoeveelheid lipiden in een 2 mL reactiebuis en verdampen de chloroform met behulp van een zachte stikstof stroom en proberen om de lipiden verspreid over het hele gebied van de buis-base. Laat de N2 stroom totdat alle oplosmiddel verdampt is.
- Solubilize van het lipide-mengsel in 29 µL van n-octyl β-D-glucopyranoside oplossing (OG) bij 4 ° C gedurende 4 h. Incubate het lipide-mengsel gedurende 10 minuten staan bij 30 ° C. Incubeer de lipiden in een ultrasoonapparaat bad voor 3 x 3 min bij 25 ° C onderbroken door 30 s op ijs.
- 221 µL van tricine buffer en 250 µL van 4 x dialyse buffer toevoegen.
- Gebruik een extruder met 0.1 µm polycarbonaat membranen voor een gedefinieerde liposoom diameter van 50-70 nm. Het monteren van de extruder met de ondersteuning van het membraan en filter. Luchtbellen voorkomen en draai de vergadering grondig.
- Vul een spuit met 4 x dialyse buffer en vooraf natte de extruder totdat er geen luchtbellen kunnen worden gezien in de tweede injectiespuit.
- Het lipide-wasmiddel-micellen van toepassing op de extruder en druk weer op de oplossing van een spuit naar de andere en terug. Herhaal deze stap 5 keer totdat de oplossing homogene verschijnt.
Opmerking: Deze oplossing kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor meerdere dagen. Niet invriezen!
-
Opneming van FCP complexen en verwijdering van detergentia en aggregaten
Opmerking: In dit voorbeeld gebruiken we een lipide/chl een verhouding van 12:1, hetgeen overeenkomt met een lipide/eiwitverhouding van ongeveer 100:1.- Toevoegen van FCP gelijk is aan 20 µg chl een in een totaal volume van 500 µL van B1a buffer 250 μL van de geëxtrudeerde lipide-micellen en 250 µL van 4 x dialyse buffer. Incubeer de monsters voor 3 x 3 min bij 25 ° C in een thermomixer van 1500-3000 toeren per minuut onderbroken door een 30 s pauze op ijs.
- Snijd het deksel van vier 1,5 mL reactiebuis net onder de top geven een ring, die nog steeds op de deksel past. 1,5 x 1,5 cm stukken van dialyse membraan voor te bereiden en was ze in 20 mL voor 1 x dialyse buffer
- Vul 250 µL van het monster tot elke deksel. Zorgvuldig, leg het membraan op de deksel zodat het compartiment is geheel met het monster gevuld en geen luchtbellen ontstaan. Draai de reactie buis-ring op de vergadering om een gesloten compartiment.
- Dialyze de monsters in 50 mL 1 x dialyse buffer's nachts (12-16 h) op ijs op een tumbling shaker. De gebruikte dialyse buffer vervangen door verse en voeg 7 mg adsorberende kralen te verwijderen van de resterende wasmiddelen voor ten minste 6 uur.
- Vervang de dialyse buffer weer en dialyze voor een andere 12 h. de liposomen herstellen door het membraan van de dialyse met een tip van 200 µL micropipet piercing en gecombineerd alle liposomen uit de deksel van de buis reactie.
- Optionele stap: als hoge zuiverheid (> 95%) nodig is. Bereiden een discontinue dichtheid verloop in 17 mL ultracentrifugatie flesjes met stappen met 6%, 10%, 15% en 20% sacharose epichloorhydrine copolymeer in dialyse buffer. Laad de liposomen op bovenkant en ultracentrifuge bij 100.000 x g gedurende 4 uur in een swingende emmer rotor.
- Herstellen van de bovenste bruin band met een spuit, Verdun de monster 1:5 met DP en gaat u verder met de volgende stap.
- Centrifugeer de liposomen FCP in ten minste 2 mL 1 x dialyse buffer gedurende 1,5 uur op 100.000 x g- en 4 ° C. De liposomen herstellen door te draaien aan de centrifugebuis onder een hoek van 45°. Laat de liposomen om te gaan voor 1 min (figuur 3A).
- De liposomen FCP in een eindvolume van 25-50 µL. dat niet wordt verstoord de neerslag terug te vorderen.
-
Besturingselementen 1: absorptie, Fluorescentiespectroscopie
- Een hoeveelheid 3 µL van de FCP-liposomen toevoegen aan een eindvolume van 1 mL 1 x dialyse buffer en Centrifugeer gedurende 5 min op 12.000 x g.
- Noteer de extinctie tussen 370 en 750 nm van FCP-liposomen met dezelfde apparatuur zoals beschreven in 1.2.4. Normaliseren van het spectrum tot de hoogste in de regioy Q van chl een (670-680 nm) en te vergelijken met de genormaliseerde spectrum van ontbindend FCP (Figuur 3 c).
- Bereiden van FCP-liposomen in 1 mL DP met een extinctie (ABS) = 0,03 met betrekking tot het maximum tussen 670-680 nm. Aanpassen van de ontbindend FCP in wasmiddel uit stap 1.2.6 aan de dezelfde ABS verdunnen met B1a.
- Record extinctie spectra van beide monsters als beschreven in 1.2.4. Record chl een fluorescentie emissiespectrum van beide monsters als beschreven in 1.3.3.
Opmerking: De opbrengst van de fluorescentie is afgenomen in de steekproef van FCP-liposoom (figuur 3D en cf. discussie.)
- Een hoeveelheid 3 µL van de FCP-liposomen toevoegen aan een eindvolume van 1 mL 1 x dialyse buffer en Centrifugeer gedurende 5 min op 12.000 x g.
Figuur 3: isolatie van FCP proteoliposomes gevolgd door spectroscopische besturingselementen en confocal beeldvorming. (A) herstel van FCP liposomen na het centrifugeren. Schakel de centrifugeren buis tot 45° en wacht ongeveer 1 minuut - de liposomen zal omlaag terwijl de FCP aggregaten die niet zijn opgenomen in liposomen vasthouden aan de buiswand. (B) vergelijking van spectra van de extinctie van ontbindend FCP in wasmiddel (blauw) en FCP in liposomen (oranje) (C) de dezelfde spectra zoals in (B) genormaliseerd naar chl een maximum in het rode gebied (~ 670 nm - Qy piek); ontbindend FCP in wasmiddel (blauw) en FCP in liposomen (oranje). Potentieel, kan er een verlies van pigment voornamelijk uit carotenoïden zichtbaar in de 500-550 nm regio. De clustering van FCP in de liposomen kan leiden tot een verbreding van de piek en een lichte verschuiving van de chl maximaal (~ 670 nm) aan de rode. (D) de spectra van de emissie van ontbindend FCP in wasmiddel en FCP in liposomen. Clustering van FCP in de liposomen verbetert energetische interacties van FCP complexen die verlaagt de fluorescentie opbrengst (oranje curve) en de emissie-maxima iets verschuift naar het rood. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het protocol wordt beschreven voor de isolatie van de totale FCP-Fractie van Cyclotella meneghiniana en opneming in liposomen met inheemse lipide samenstelling. Het isolement thylakoïde is zeer reproduceerbaar, maar de opbrengst thylakoïde kan veranderen. Het resultaat is aanvaardbaar als meer dan 50% van alle pigmenten worden teruggevorderd in stap 1.1.4. Meer dan 80% is optimaal.
De solubilisatie van de thylakoiden is een cruciale stap. Goed ontbindend membranen zijn verkregen als het supernatans dat na stap 1.2.2 het merendeel van de pigmenten bevat. De scheiding van FCP van photosystems is goed als een duidelijke bruin (FCP) en een groene (PS) band te onderscheiden (figuur 2A zijn). Een prominente gelige noemer op de bovenkant van het verloop is een indicatie voor pigment verlies als gevolg van overmatige solubilisatie. Pigment verlies optreedt bij elke voorbereiding. Het is tot op zekere hoogte aanvaardbaar zolang de functionaliteit van de energie overbrengen in chl een is niet beïnvloed (figuur 2C, 2D). Ook, FCP verrijking stap (1.2.4) kan induceren verder solubilisatie en pigment verlies als gevolg van gelijktijdige wasmiddel verrijking. Verschillen in de genormaliseerde extinctie spectra zijn een indicatie voor pigment verlies (figuur 2B), die vaak voorkomt in de spectrale regio tussen 500-550 nm waar carotenoïden absorberen. Het verlies van pigment is aanvaardbaar als de complexen nog steeds functioneel zijn. Dit betekent dat er geen grote verschillen in emissie spectra en excitatie spectra (figuur 2C, 2D voorkomen). Voor de emissie-spectra, chl c is bij voorkeur enthousiast op 465 nm en transfers alle de excitatie energie chl a, die uitzendt op ~ 675 nm. Als de chl c tot chl een energieoverdracht verstoord wordt, chl c stoot op ~ 640 nm. De energie overbrengen in de excitatie-spectra, chl een wordt gecontroleerd door het veranderen van de golflengte van de excitatie van 370-600 nm. In het spectraal bereik van 370-440 nm vooral chl een is enthousiast. Excitatie ongeveer 465 nm gunsten chl c. In de reeks > 500 nm carotenoïden, voornamelijk fucoxanthins, zijn enthousiast. De energie-overdracht is beïnvloed, als chl c en carotenoïden minder aan chl een fluorescentie bijdragen. Vandaar, vermindert de fluorescentie-opbrengst in deze spectrale regio's met betrekking tot chl een excitatie tussen 370-440 nm.
De gewenste zuiverheid van het monster is afhankelijk van het beoogde doel van de studie. Bijvoorbeeld, is het essentieel om te scheiden van photosystems van FCP voor spectroscopische metingen, terwijl niet-gepigmenteerde eiwitten minder met de metingen interfereren. Hier, een zuiverheid van 95% voldoende hoog is (figuur 2E). Voor massaspectrometrische methoden uitsluitend, moeten FCP subeenheden zichtbaar zijn op een zilveren-gekleurde gel.
Controle op de kwaliteit van het liposoom preparaat is moeilijk te controleren en kan alleen gezien worden aan het einde van het protocol (2.2.5, figuur 3A). De FCP-complexen worden vernietigd als hun kleur van bruin verandert tot olijfgroen. Een goed resultaat is als een fractie bruin liposoom verzameld. Het percentage van de liposomen herstelde vs. geaggregeerde pellet optimaal is > 70%. De opneming van FCP in de liposomen kan weer leiden tot minder pigment verlies. Een vergelijking van genormaliseerde extinctie spectra vóór en na de opname wordt gezien als pigmenten (figuur 3B, 3 C) gingen verloren. Sommige toppen van de extinctie van FCP-liposomen bredere weergegeven en de opname in de rode spectrale regio (~ 670 nm - de zogenaamde Qy band) van chl een machtig worden iets rood-verschuiven. Dit gebeurt als gevolg van clustering van FCP in de liposomen. De chl een opbrengst van de fluorescentie die voortvloeien uit FCP in liposomen grotendeels is ten gevolge van de excitonic interactie in FCP beperkt clusters (figuur 3D, cf. discussie).
Een typisch experiment met liposomen maakt gebruik van de de liposomen twee reactie compartimenten gescheiden door een lipide dubbelgelaagde waarmee pH of elektrochemische verlopen. In een voorbeeld, de impact van een kalium-ion verloop op FCP fluorescentie opbrengst werd getest (figuur 4A). De opbrengst van de fluorescentie werd gemeten in aanwezigheid van standaard buffer. De fluorescentie daalt met 30% als KCl is toegevoegd. Het K+ verloop werd uitgebracht door de kalium specifieke ionophore valinomycin, waarbij de FCP-fluorescentie in het eerste niveau (figuur 4B) wordt hersteld. Deze veranderingen in fluorescentie bevestigen de hypothese dat FCP complexen op kalium-ion concentratie verlopen24 in vivo reageren.
Figuur 4: typisch experiment met FCP liposomen weergegeven: de verandering van FCP fluorescentie in reactie op een elektrochemische gradiënt geïnduceerd door KCl. (A) Experimentele regeling: 1. FCP chl fluorescentie in dialyse buffer. 2. toevoeging van 20 mM KCl inducerende een elektrochemische gradiënt. 3. versoepeling van het verloop van de valinomycin selectieve ionophore K+ (4 µM). (B) Drop van FCP fluorescentie (675 nm) in reactie op een K+ verloop (blauw) en restauratie van de opbrengst fluorescentie dezelfde als voorheen (oranje) door ontspanning van het verloop (grijs). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| buffers / mengsels | samenstelling | |
| cel groei & | Kunstmatig zeewater volgens | 86 mM NaCl |
| thylakoïde voorbereiding | Provasoli, 1957 (ASP)25 | 21 mM KCl |
| 4 mM Tris | ||
| 8.1 mM MgSO4 | ||
| 11.8 mM NaNO3 | ||
| 0.58 mM K3HPO4 | ||
| 0.16 mM H3BO3 | ||
| 2 mM silica | ||
| pH 7.7 (H2zo4) | ||
| autoclaaf | ||
| steriele toevoegen: 2,72 mM CaCl2 | ||
| steriele toevoegen: 0.012 mM FeCl3 | ||
| steriele toevoegen: 0.092 mM EDTA | ||
| steriele toevoegen: 0,02 mM MnCl2 | ||
| steriele toevoegen: 0,002 mM ZnCl2 | ||
| steriele toevoegen: 50 pM CoCl2 | ||
| steriele toevoegen: 25 pM nb2MoO4 | ||
| steriele toevoegen: 22 pM 5 CuCl2 | ||
| homogenisering buffer | 10 mM MES | |
| 2 mM KCl | ||
| 5 mM EDTA | ||
| 1 M sorbitol | ||
| pH 6,5 (KOH) | ||
| wassen buffer | 10 mM MES | |
| 2 mM KCl | ||
| 5 mM EDTA | ||
| pH 6,5 (KOH) | ||
| glas kralen mix | 75% 1 mm kralen | |
| 25% 0.4 mm kralen | ||
| aceton | 90% (v/v) met H2O | |
| vloeibare stikstof | ||
| FCP zuivering | n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | 10% (m/v) in H2O |
| buffer B1 | 25 mM Tris | |
| 2 mM KCl | ||
| pH 7.4 (HCl) | ||
| buffer B1a = B1 + b-DDM | 0,03% (m/v) definitieve | |
| kleurovergang sacharoseoplossing | 19% sucrose (g/v) in B1a | |
| liposoom voorbereiding | lipiden Zie aanvullende tabel 1 | |
| N2 gas | ||
| n-octyl β-D-glucopyranoside (OG) | 10% (m/v) in B1a | |
| tricine buffer | 20 mM pH 7.5 | |
| 4 x dialyse buffer (DB) | 80 mM tricine pH7.5 | |
| 20 mM MgCl2 | ||
| 0,04% (m/v) NaN3 |
Tabel 1: Lijst van buffers, stamoplossingen en mengsels voor FCP voorbereiding en opneming in liposomen.
Aanvullende tabel 1: voorbeeld voor lipide en chl een berekening van de verhouding. Een lipide/chl een verhouding van 12 wordt gebruikt in het voorbeeld in Figuur 1 en Figuur 3gegeven. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FCP liposomen met natuurlijke lipide samenstelling verstrekt een handige, eenvoudige en reproduceerbare hulpmiddel om te onderzoeken van spectroscopische eigenschappen in vitro. Het lipide-milieu in FCP liposomen lijkt op de situatie binnen de thylakoïde membraan, die aanleiding geven tot experimentele resultaten die zich dichter bij het natuurlijke omstandigheden.
Er zijn verschillende voordelen van het gebruik van C. meneghiniana als een modelsysteem voor FCP antenne. Het relatief snel groeit en is krachtiger in vergelijking met andere Diatomee model soorten, bijvoorbeeld Thalassiosira pseudonana. In de molen van de parel, die voor een hoog rendement van intact thylakoïde complexen zorgt breken de cellen relatief eenvoudig. Het belangrijke punt voor C. meneghiniana is de rijkdom van biochemische en spectroscopische gegevens die zijn verkregen in het laatste jaar16,17,23,27,29,31 ,32,33,34. Het enige nadeel is dat een geannoteerde genoom nog niet beschikbaar is maar genetische manipulaties mogelijk35 zijn.
De FCPs waren bereid uit culturen gegroeid in optimale omstandigheden. Vandaar, de opbrengst, de subeenheid samenstelling en de pigmentatie van FCP complexen kunnen veranderen als zij worden bereid met stress voorwaarden, bijvoorbeeld hoge licht27 of nutriënten beperking. De verstoring van de cel in de kraal molen (1.1.3) is van cruciaal belang voor de opbrengst van de FCP en na elke wijziging van groei aandoening moet worden gecontroleerd door een microscoop. De plastiden moeten hadden zijn vrijgegeven uit de cellen zodat de lege frustules (silica shells) zijn heersende. De volgende kritieke stap is thylakoïde solubilisatie. De efficiëntie van membraan solubilisatie interfereert met de hoeveelheid opslag lipiden die onder bepaalde voorwaarden stress36 accumuleren. Daarom moet de hoeveelheid wasmiddel vóór verwerking verkregen onder stress omstandigheden om te voorkomen dat overmatig solubilisatie monsters worden aangepast. Dit probleem wordt weergegeven als verhoogde chl c fluorescentie emissie bij ~ 640 nm. Verder, de energieoverdracht van carotenoïden (500-550 nm) naar chl een wordt verminderd. Dit kan worden gezien in de excitatie-spectrum (figuur 2C, 2D). Bepaalde benaderingen kunnen zinvol zijn om te scheiden van de FCPa van FCPb antenne complexen door ionenwisseling chromatografie27.
De overdracht van FCP in liposomen is de volgende kritieke stap. Het spuitrendement en het liposoom homogeniteit INTACTHEID is afhankelijk van diverse parameters. De lipide-micel-voorbereiding en extrusie biedt homogeen formaat liposoom precursoren. In dit voorbeeld (2.1.3-2.1.4), een polycarbonaat membraan van 100 nm poriegrootte werd gebruikt om de grootte van een proteo-liposoom van ~ 50 nm. Het bedrag van FCP toegevoegd aan de lipide-wasmiddel micellen definieert het eiwit: lipide verhouding in de liposomen. Vandaar, een bepaald aantal FCP per liposoom wordt verkregen. In een soortgelijke aanpak geclusterd plant en groene algen LHC complexen spontaan. Dit feit werd geopenbaard door de time-resolved fluorescentie en single-molecuul spectroscopie22 en een basis geluid voorziet in verdere experimenten.
De gecontroleerde dialyse is ook cruciaal voor de opneming van FCP in de liposomen. Hoewel de opneming van de hydrofobe FCP complex energiek favoriet is, kan de kinetiek van invoeging concurreren met de kinetiek van aggregatie. Dit feit wordt meer prominente de meer hydrofobe en hoe groter de complexen zijn. In dit voorbeeld is de kleinere FCPa trimeer sneller dan de grotere FCPb nonamer ingesloten. Juiste FCP-integratie vereist dat de lipide micellen goed gemengd met ontbindend FCP complexen voor wasmiddel verwijdering via dialyse zijn. Hier, kan het mengen tijd in 2.2.1 worden gevarieerd. Het is niet aanbevolen om de mengen temperatuur stijgen, omdat dit tot FCP desintegratie leiden kan. Verder is de "snelheid" van wasmiddel verwijdering is belangrijk en kan worden aangepast door het bedrag van de absorberend (2.2.4). Het uiteindelijke formaat van de liposomen kan variëren. Dynamische lichtverstrooiing en analytische ultracentrifugatie elektronenmicroscopie zijn geschikte methoden om te bepalen van de liposomen grootte bereik37,38. Voor dit protocol met natuurlijke thylakoïde lipide samenstelling en lipide micel extrusie verwachten wij de bovengenoemde diameter van 50-80 nm en een bol bijna zoals vorm geopenbaard door cryo-elektronenmicroscopie. Deze resultaten werden bekomen met de zeer dezelfde methode integratie van groene algen LHC22. Liposomen van dergelijke kleine diameter hebben een sterke oppervlakte kromming van ~ 10° per 5 nm die kan buigen grotere complexen van de antenne en hen dwingen om te monomerize. Deze situatie bootst de natuurlijke kromming in grana marges van algen en planten van22. Vergeleken met grana marges, lijkt het grootste deel van de thylakoïde nogal plat. Daarom, als grotere complexen zoals photosystems zullen worden bestudeerd is het aanbevolen om liposomen met een grotere diameter te gebruiken. Een andere vraag die rijst is: wat is de schrijfrichting van de complexen? In het geval van de FCPa concluderen we metingen in reactie op lage pH24 dat de oriëntatie ongeveer 50% rechts out en 50% binnenstebuiten is. In de toekomst methodes dienen te dwingen de complexen in één richting. In andere studies met de bacteriorhodopsin efflux pomp, zijn bijna alle eiwitten spontaan georiënteerd in de dezelfde manier (rechterkant uit)39.
Er is de vraag wat de fluorescentie wijziging induceert wanneer K+ is toegevoegd aan de liposomen. Meerdere antwoorden zijn denkbaar. Als de K+ -concentratie alleen verantwoordelijk is, dat het experiment in Figuur 4 zou resulteren in een verdere daling van de fluorescentie als valinomycin wordt toegevoegd na KCl. In een recente studie verleend we steun voor het begrip dat de helling van de concentratie K+ verantwoordelijk voor de verandering van de fluorescentie van de FCPa24 is. Verschillende andere factoren kunnen de fluorescentie opbrengst ook beïnvloeden. Dit zou osmotische of oppervlakte lading dynamics effecten24.
Kortom, is het voordeel van de onderzoeken van lichte oogsten antenne complexen zoals FCP in liposomen dat het biedt een functioneel systeem dicht bij de in vivo voorwaarden. Maar het aantal onderdelen is nog klein, die vermindert de complexiteit in de experimentele resultaten. Het zorgt voor simulaties van lichte stress voorwaarden en inductie van foto-beschermende mechanismen. Verder kan de rol van bepaalde lipide-soorten op de functie van FCP complexen worden bestudeerd. Het potentieel van deze methode neemt toe met het recent gemaakt vordert in cryo-elektronenmicroscopie, enkel molecuul spectroscopie en andere tijd opgelost spectroscopische methoden. Hierdoor kunnen onderzoekers te verbeteren van de studies van energie-overdracht in licht oogsten van systemen. In combinatie met deze technieken, kan de kennis over FCP in de ontbindend en geaggregeerde staat aangevuld worden met gegevens over de bijdrage van het lipide milieu FCP functie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Rana Adeel Ahmad voor bijstand in FCP zuivering. Prof. Claudia Büchel is erkend voor nuttige discussies en het lezen van het manuscript. Dit werk werd gesteund door de Duitse Research Foundation naar LD (DI1956-1/1) en de Humboldt foundation voor een Feodor-Lynen fellowship aan LD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 500 ml centrifuge vials | |||
| high speed centrifuge | Heraeus | ||
| Bead Mill VI 2 | Edmund-Bühler (edmund-buehler.de) | newer version: Vibrogen-Zellmühle Vl 6 | |
| Silibeads S 400 µm | Sigmund-Lindner.com | 5223-7 | |
| Silibeads S 1,-1,3 mm | Sigmund-Lindner.com | 4504 | |
| VitraPOR filter funnel - por1 | ROBU GmbH | 21121 | |
| polycarbonate ultracentrifuagtion vials (30 mL) for T-865 | Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de) | 314348 | |
| Ultracentrifuge Discovery 90SE | Sorvall | n.a. | |
| rotor T 865 | ThermoFisher Scientific (thermofisher.com) | 51411 | |
| Neubauer Cell Counter Chamber (improved) | Carl Roth Laborbedarf (Carlroth.com) | T729.1 | |
| Zeiss Mikroskop Primostar (7) | Optik-Pro (optik-pro.de) | 51428 | |
| optical glass cuvettes (6040-OG) | Hellma Analytics (hellma-analytics.com) | "6040-10-10" | |
| V-630 UV-VIS Spectrophotometer (incl. software) | Jasco (jasco.de) | V-630 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | ANATRACE (anatrace.com) | D310LA | |
| Ultra-Clear tubes 17 ml for AH629 | Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de) | 344061 | |
| rotor AH629-17-mL | ThermoFisher Scientific (thermofisher.com) | 54285 | |
| Membrane concentrator_Centriprep 30 kDa cutoff | Millipore (merckmillipore.com) | 4307 | |
| Biometra Minigel-Twin | Analytik Jena AG (analytik-jena.de) | 846-010-100 | |
| Silver Stain Plus Kit | Bio-Rad (bio-rad.com) | 1610449 | |
| libre office spread sheet | The document foundation | https://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/ | |
| special glass cuvettes for fluorescence (101-0S) | Hellma Analytics (hellma-analytics.com) | 101-10-20 | |
| Spectrofluorometer FP-6500 (incl. Software) | Jasco (jasco.de) | FP-6500 | |
| SDS-loading buffer Roti-Load | ROTH (carlroth.com) | K929.1 | |
| n-octyl β-D-glucopyranoside | ANATRACE (anatrace.com) | O311 | |
| Monogalactosyl Diaclyglycerol (MGDG) | Larodan AB (larodan.com) | 59-1300 | make stock solution in chloroform |
| Digalactosyl Diacylglycerol (DGDG) | Larodan AB (larodan.com) | 59-1310 | make stock solution in chloroform |
| Sulphoquinovosyl Diacylglycerol (SQDG) | Larodan AB (larodan.com) | 59-1230 | make stock solution in chloroform |
| L-alpha-Phosphatidylglycerol (PG) | Larodan AB (larodan.com) | 37-0150 | make stock solution in chloroform |
| L-α-Phosphatidylcholine | Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com) | P3782 SIGMA | make stock solution in chloroform |
| sonicator bath S-50TH | Sonicor (getmedonline.com | SONICOR-S-50TH | |
| mini-Extruder | Avanti Polar Lipids (Avanti.com) | 610000 | |
| Nuleopore polycarbonate membrane | Avanti Polar Lipids (Avanti.com) | 610005 | |
| dialysis membrane Visking 14 kDa cutoff | ROTH (carlroth.com) | 0653.1 | boil in destilled water before use |
| Biobeads SM2 Adsorbent | Biorad (Bio-rad.com) | 152-3920 | |
| sucrose epichlorhydrin copolymer - Ficoll 400 | Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com) | F4375 | |
| Polycarbonate ultracentrifuagtion vials (2.7 mL) for TFT 80.4 | Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de) | 252150 | |
| rotor TFT 80.4 | Millipore (merckmillipore.com) | 54356 | |
| material listed in order of appearance | For specific safety instructions please refer to material safety sheets and repective manuals. Standard lab material and substances are not listed. |
References
- Eberhard, S., Finazzi, G., Wollman, F. A. The Dynamics of Photosynthesis. Annual Review of Genetics. 42, 463-515 (2008).
- Li, Z. R., Wakao, S., Fischer, B. B., Niyogi, K. K. Sensing and Responding to Excess Light. Annual Review of Plant Biology. 60, 239-260 (2009).
- Niyogi, K. K., Truong, T. B. Evolution of flexible non-photochemical quenching mechanisms that regulate light harvesting in oxygenic photosynthesis. Current Opinion in Plant Biology. 16 (3), 307-314 (2013).
- Li, X. -P., et al. A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting. Nature. 403 (6768), 391-395 (2000).
- Peers, G., et al. An ancient light-harvesting protein is critical for the regulation of algal photosynthesis. Nature. 462 (7272), 518-521 (2009).
- Correa-Galvis, V., et al. Photosystem II Subunit PsbS Is Involved in the Induction of LHCSR Protein-dependent Energy Dissipation in Chlamydomonas reinhardtii. The Journal of biological chemistry. 291 (33), 17478-17487 (2016).
- Bailleul, B., et al. An atypical member of the light-harvesting complex stress-related protein family modulates diatom responses to light. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18214-18219 (2010).
- Taddei, L., et al. Multisignal control of expression of the LHCX protein family in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum. Journal of experimental botany. 67 (13), 3939-3951 (2016).
- Lepetit, B., et al. The diatom Phaeodactylum tricornutum adjusts nonphotochemical fluorescence quenching capacity in response to dynamic light via fine-tuned Lhcx and xanthophyll cycle pigment synthesis. New Phytologist. 214 (1), 205-218 (2017).
- Büchel, C. Evolution and function of light harvesting proteins. Journal of Plant Physiology. 172, 62-75 (2015).
- Lavaud, J., Rousseau, B., van Gorkom, H. J., Etienne, A. -L. Influence of the Diadinoxanthin Pool Size on Photoprotection in the Marine Planktonic Diatom Phaeodactylum tricornutum. Plant Physiology. 129 (3), 1398-1406 (2002).
- Ruban, A., et al. The super-excess energy dissipation in diatom algae: comparative analysis with higher plants. Photosynthesis Research. 82 (2), 165-175 (2004).
- Mann, D. G. The species concept in diatoms. Phycologia. 38 (6), 437-495 (1999).
- Papagiannakis, E., van Stokkum, I. H. M., Fey, H., Büchel, C., van Grondelle, R. Spectroscopic Characterization of the Excitation Energy Transfer in the Fucoxanthin-Chlorophyll Protein of Diatoms. Photosynthesis Research. 86 (1-2), 241-250 (2005).
- Premvardhan, L., Robert, B., Beer, A., Büchel, C. Pigment organization in fucoxanthin chlorophyll a/c2 proteins (FCP) based on resonance Raman spectroscgopy and sequence analysis. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1797 (9), 1647-1656 (2010).
- Gildenhoff, N., Herz, J., Gundermann, K., Büchel, C., Wachtveitl, J. The excitation energy transfer in the trimeric fucoxanthin-chlorophyll protein from Cyclotella meneghiniana analyzed by polarized transient absorption spectroscopy. Chemical Physics. 373 (1), 104-109 (2010).
- Ramanan, C., et al. Exploring the mechanism(s) of energy dissipation in the light harvesting complex of the photosynthetic algae Cyclotella meneghiniana. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1837 (9), 1507-1513 (2014).
- Haferkamp, S., Kirchhoff, H. Significance of molecular crowding in grana membranes of higher plants for light harvesting by photosystem II. Photosynthesis Research. 95 (2-3), 129-134 (2008).
- Wahadoszamen, M., et al. Stark fluorescence spectroscopy reveals two emitting sites in the dissipative state of FCP antennas. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1837 (1), 193-200 (2014).
- Zhou, F., et al. Effect of monogalactosyldiacylglycerol on the interaction between photosystem II core complex and its antenna complexes in liposomes of thylakoid lipids. Photosynthesis Research. 99 (3), 185-193 (2009).
- Moya, I., Silvestri, M., Vallon, O., Cinque, G., Bassi, R. Time-resolved fluorescence analysis of the photosystem II antenna proteins in detergent micelles and liposomes. Biochemistry. 40 (42), 12552-12561 (2001).
- Natali, A., et al. Light-harvesting Complexes (LHCs) Cluster Spontaneously in Membrane Environment Leading to Shortening of Their Excited State Lifetimes. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16730-16739 (2016).
- Gundermann, K., Büchel, C. Factors determining the fluorescence yield of fucoxanthin-chlorophyll complexes (FCP) involved in non-photochemical quenching in diatoms. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1817 (7), 1044-1052 (2012).
- Ahmad, R. A., Dietzel, L. Relaxation of cellular K+ gradients by valinomycin induces diatoxanthin accumulation in Cyclotella meneghiniana cells and alters FCPa fluorescence yield in vitro. Physiologia Plantarum. , 171-180 (2017).
- Provasoli, L., McLaughlin, J. J. A., Droop, M. R. The development of artificial media for marine algae. Archiv für Mikrobiologie. 25 (4), 392-428 (1957).
- Jeffrey, S., Humphrey, G. New spectrophotometry equations for determining chlorophyll a, chlorophyll b, chlorophyll c-1 and chlorophyll c-2 in higher plants, algae and natural phytoplankton. Biochemie und Physiologie der Pflanzen. 167, 191-194 (1975).
- Beer, A., Gundermann, K., Beckmann, J., Büchel, C. Subunit Composition and Pigmentation of Fucoxanthin−Chlorophyll Proteins in Diatoms: Evidence for a Subunit Involved in Diadinoxanthin and Diatoxanthin Binding. Biochemistry. 45 (43), 13046-13053 (2006).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Analytical Biochemistry. 166 (2), 368-379 (1987).
- Büchel, C. Fucoxanthin-Chlorophyll Proteins in Diatoms: 18 and 19 kDa Subunits Assemble into Different Oligomeric States. Biochemistry. 42 (44), 13027-13034 (2003).
- Vieler, A., Wilhelm, C., Goss, R., Süß, R., Schiller, J. The lipid composition of the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii and the diatom Cyclotella meneghiniana investigated by MALDI-TOF MS and TLC. Chemistry and Physics of Lipids. 150 (2), 143-155 (2007).
- Gundermann, K., Büchel, C. The fluorescence yield of the trimeric fucoxanthin-chlorophyll-protein FCPa in the diatom Cyclotella meneghiniana is dependent on the amount of bound diatoxanthin. Photosynthesis Research. 95 (2-3), 229-235 (2008).
- Miloslavina, Y., et al. Ultrafast fluorescence study on the location and mechanism of non-photochemical quenching in diatoms. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1787 (10), 1189-1197 (2009).
- Grouneva, I., Jakob, T., Wilhelm, C., Goss, R. The regulation of xanthophyll cycle activity and of non-photochemical fluorescence quenching by two alternative electron flows in the diatoms Phaeodactylum tricornutum and Cyclotella meneghiniana. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1787 (7), 929-938 (2009).
- Chukhutsina, V. U., Büchel, C., van Amerongen, H. Disentangling two non-photochemical quenching processes in Cyclotella meneghiniana by spectrally-resolved picosecond fluorescence at 77 K. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1837 (6), 899-907 (2014).
- Ghazaryan, A., Akhtar, P., Garab, G., Lambrev, P. H., Büchel, C. Involvement of the Lhcx protein Fcp6 of the diatom Cyclotella meneghiniana in the macro-organisation and structural flexibility of thylakoid membranes. Biochimica Et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1857 (9), 1373-1379 (2016).
- Darley, W. M. Biochemical composition. The biology of diatoms. 13, 198-223 (1977).
- Milsman, M. H. W., Schwendner, R. A., Weder, H. G. Preparation of large single bilayer liposomes by a fast and controlled dialysis. Biochimica Et Biophysica Acta. 512 (1), 147-155 (1978).
- Zumbuehl, O., Weder, H. G. Liposomes of controllable size in the range of 40 to 180 nm by defined dialysis of lipid-detergent-mixed micelles. Biochimica Et Biophysica Acta. 640 (1), 252-262 (1981).
- Verchere, A., Broutin, I., Picard, M. Photo-induced proton gradients for the in vitro investigation of bacterial efflux pumps. Scientific Reports. 2 (306), (2012).
- Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).
