Summary
음이온 교환 수 지 기반 방법, 바이러스의 충돌-기반 bioaerosol 샘플링 시연 액체에 적응 합니다. 다운스트림 분자 탐지와 결합 하면 메서드 bioaerosols에서 바이러스의 손쉬운 및 민감한 감지.
Abstract
이 프로토콜에서는 바이러스에 대 한 사용자 지정된 bioaerosol 샘플링 방법을 보여 줍니다. 이 시스템에서는, 음이온 교환 수 지에서 bioaerosols 부정 청구 바이러스의 효능 농도 액체 치는 행위 기반 공기 샘플링 디바이스와 결합 이다. 따라서, 수 지 bioaerosol 샘플링 워크플로에 추가 농도 단계 역할을 합니다. 바이러스 성 입자의 핵 산 추출 다음 결과 샘플 분자 분석에 대 한 적합 한 음이온 교환 수 지에서 직접 수행 됩니다. 또한,이 프로토콜 사용자 bioaerosol 챔버 다양 한 환경 조건과 환경 변수 온도, 습도, 등의 지속적인 모니터링에 대 한 허용 아래 바이러스 라덴 bioaerosols 생성할 수 설명 바람 속도, 고 졸 대량 농도입니다. 이 프로토콜을 사용 하 여의 주요 장점은 수정 되지 않은 기존의 액체 임 핀 저를 직접 비교를 통해 평가 바이러스 탐지의 감도 증가입니다. 다른 장점은 집중 다양 한 부정 청구 바이러스, 음이온 교환 수 지 (샘플 당 ~$0.14), 및 사용의 용이성의 저렴 한 비용을 포함 합니다. 단점 수 지 흡착 바이러스 성 입자의 infectivity 평가이 프로토콜의 무 능력을 포함 하 고 액체 샘플링 버퍼의 최적화에 대 한 필요는 임 핀 저 내에서 사용 하는 잠재적으로.
Introduction
이 방법의 목적은 bioaerosols에서 부정 청구 바이러스의 분자 탐지를 촉진 하기 위하여 매우 중요 한 bioaerosol 샘플링 플랫폼을 제공. 미생물, 바이러스 성 입자를 포함 하 여 장시간 시간1bioaerosols에서 살아남을 수 있습니다. Bioaerosols 비교적 긴 거리를 여행 하 고 생존 및 infectivity, 산업 영향 받은 개인에서 6 킬로미터의 거리에 있는 타워에서 Legionnaires' 질병의 발발에 의해 입증으로 유지 수 및 18 사망자2결과. 간접 전송 bioaerosols 중재 하는 인 간에 게 바이러스의 여러 설정에서 발생할 수 있으며 학교와 레스토랑3,4노로바이러스 감염에 대 한 입증 되었습니다. 바이러스의 bioaerosol 전송의 생산 시설5, 바이러스의 운동에 주요 요인으로 간주 되 고이 전송 경로와 마찬가지로, 돼지 및 가금류 농장에서와 같은 농업 설정에서 발생할 수 있습니다. 6 , 7 , 8 , 9.
시위는 H5 독감 바이러스는 살아있는 동물에서 bioaerosols에서 발견 된 중국에서 시장 에서처럼 바이러스 라덴 bioaerosols의 효과적인 샘플링 신속한 진단 및 확산 방지를 위한 대비에 개선을 위한 수 고는 미국10,11. 현재 bioaerosol 샘플링 기술을 다른 입자 캡처 원칙의 숫자를 포함 하 고 impingers, 사이 클론, impactors, 및 필터12에 광범위 하 게 분류 될 수 있다. 그것은 철저 하 게 모든 장점을 커버 하이 프로토콜의 범위와 bioaerosols;에서 바이러스의 샘플링에 대 한 이러한 플랫폼의 단점 그러나, 그것은 바이러스 및 살 균 소13의 컬렉션에 대 한 이러한 샘플링 장치의 대다수는 최적화 되지 진술 될 수 있다. 또한, 바이러스 성 입자의 infectivity은 종종 부정적인 영향을, 액체 impingers 바이러스 infectivity 샘플링 장치 고체 impactors 또는 필터14보다 더 효과적으로 유지 하는 것으로 간주와 함께. 그러나, 하나의 액체 충돌의 단점은 대상 희석 효과, 바이러스는 비교적 많은 양의 (일반적으로 ≥20 mL) 액체 수집 용기에 수집 때문에 발생 합니다. 또 다른 중요 한 단점은 집중 입자를 액체 impingers의 차선의 효율성 포함 < 0.5 µ M 크기15. 그러나, 이러한 장치의 캡처 효율 immobilization 바이러스 성 핵 산 바이러스 infectivity16,17의 보존을 향상 시킬 수 있습니다으로 고체 행렬에 동원 정지에 의해 개선할 수 있습니다.
우리는 이전 음이온 교환 수 지 캡처 및 F-RNA 살 균 소, A 형 간염 바이러스, 인간 아 데 노비 루스, 고로18,19 포함 하 여 액체 매트릭스에서 바이러스의 농도 대 한 효과적인 도구입니다 증명 하고있다 ,20. 제조 업체에 의해 정의 된 대로이 작품에서 음이온 교환 수 지는 기능성된 4 급 아민 그룹 중재 하십시오 매력 및 액체 매체21 에서 음이온의 캡처 macroreticular 폴리스 티 렌 강한 기본 음이온 교환 수 지 . 따라서, 음이온 교환 수 지 그물 네거티브 표면 요금, 많은 장 바이러스, 인플루엔자 바이러스 및 다른 바이러스 관련 공공 및 동물 건강을 포함 하 여 바이러스를 캡처 예정 이다.
현재 프로토콜 액체 임 핀 저를 음이온 교환 수 지의 추가 포함 한다. 이 시스템에서 수 지 임 핀 저 액체에서 바이러스 성 입자에 대 한 보조 농도 단계 역할을 합니다. 핵 산 분자 분석에 대 한 집중된 샘플을 제공 하는 작은 볼륨에서 직접 eluted 수 다음. 따라서,이 방법의 주요 장점은 주로 샘플 볼륨 감소를 통해 바이러스 검출 감도에 개선 이다. 또한, 때문에 부정적인 충전 바이러스의 고유의 일반적인 캡처, 방법은 가능성이 많은 관심의 바이러스의 탐지를 위해 적용 가능한. 여기, 메서드는 백신 긴장의 유형 A와 B 형 인플루엔자 바이러스와 FRNA coliphage MS2 (MS2)에 대 한 보여 줍니다. 이러한 바이러스 그 후 앞에서 설명한22로 표준 qRT-PCR 분석 실험을 사용 하 여 검색 됩니다. 끝점 사용자 때문에이 메서드를 수행에 문제가 발생할 것을 기대 하지 해야 수정 현재 기존 장비 bioaerosol 샘플링 및 분석의 기존 흐름에 주요 중단을 구성 하지 않습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bioaerosol 챔버의 설치 ( 그림 2참조)
-
사전에 0.01 M 버퍼링 인산 염 분, pH 7.5 (PBS)의 20 mL와 함께 액체 impingers 로드 합니다.
- 음이온 교환 수 지의 0.5 g을 추가 하 고 컨트롤 역할을 수행 하는 다른 액체 임 핀 저와 액체 impingers 중의 PBS 내 일시 중단.
- 챔버 내부에 bioaerosol는 분무기를 직면 하는 어로 졸 후미와 클램프 스탠드를 사용 하 여 병렬로 위치 액체 impingers.
참고: 추가 정보에 대 한 그림 2 를 참조 하십시오. - 공동 직접 읽기 졸 모니터를 bioaerosol의 대량 농도 (mg/m3)을 측정 하 여 액체 impingers 가까이 찾습니다.
- 추가적인 직접 읽기 계측 (실내 공기 질 모니터 및 열 풍속 계) 배치, 온도 등의 환경 변수를 모니터링 하는 액체 impingers 근처 상대 습도 바람 속도, 챔버 내에 bioaerosol.
- 에 어로 졸의 혼합을 촉진 하기 위하여 bioaerosol 챔버의 모서리에 축 팬 들을 실행 합니다.
참고: 축 팬 고정 속도로 실행 하 고는 조정 가능 하다.
2. 모델 Bioaerosolization 실험 ( 그림 3참조)
- 시리얼, 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에서 원하는 농도 MS2 살 균 소 및 인플루엔자 백신의 10 희석을 수행 합니다.
참고: 여기, 103.5 : FFU/mL는 종류 A와 B 독감 바이러스 백신 긴장의와 10 메서드를 보여 주기 위해5 PFU/mL MS2 살 균 소의 활용 됩니다. Titers는 inocula에 대 한 결정, 살 균 소는 대장균 HS (pFamp) R에에서 전파 되며 앞에서 설명한20으로 열거. 상용 백신 포함 알려진된 양의 4 라이브 감쇠 독감 바이러스 변종, 두 입력 인플루엔자 바이러스와 형광 초점 단위 또는: FFU 표현 두 B 형 인플루엔자 바이러스. - 100 mL PBS의에서 바이러스 성 입자의 원하는 농도의 정지를 만들어서 6 제트기 충돌 분무기의 유리 용기 내에서 inocula를 준비 하 고 사용자 지정 bioaerosol 챔버 내 설치.
- 계측 변수 챔버 내에 bioaerosol, 온도, % 상대 습도, 이산화탄소 농도 등을 측정 하 고 바람 속도 (축 팬을 사용 하 여 생성)을 시작 합니다. 직접 읽기 졸 모니터를 사용 하 여 챔버 내에 bioaerosol 질량 농도 추적 하 고 시간과 실험 사이 일관성을 확립.
- Bioaerosol 챔버를 밀봉 하 고 공기 HEPA 필터와 10 분 동안 제거.
- 6.9 kPa에서 분무기에 필터링 된, 건조 공기를 제공 합니다.
- 각 bioaerosol 챔버 시험 (nebulizer)를 통해 바이러스 bioaerosols의 대상 농도 생성 합니다. 이 데모 5 mg/m3 의 농도와 bioaerosols 생성 됩니다.
- 에 어로 졸의 대상 질량 농도 도달 하면 일단 nebulization을 중지 합니다.
- 사용 하 여 기본 흐름 표준 각 샘플링 이벤트 전 / 후 볼륨 샘플링에 일관성을 보장 하는 행위 교정 12.5 L/분의 유량을 조정 되었습니다 각 액체 임 핀 저에 대 한 공기 샘플링 펌프를 작동 합니다. 공급 희석 HEPA 필터 라인 부근에 분무기를 사용 하 여 공기와 챔버에 일정 한 압력을 유지.
- 적극적으로 샘플 당 500 L의 샘플링 볼륨을 달성 하기 위해 40 분의 기간에 대 한 bioaerosol 챔버 분위기를 샘플 합니다.
참고: 동시에 두 개의 펌프와 12.5 L/분 40 분에 대 한 샘플링은 bioaerosol의 1000 L의 샘플링에 대 한 허용 됩니다. 따라서, 실험의 완료에 예상 된다 bioaerosol 약 실에 있는 공기의 대부분을 샘플링 하 고 HEPA 필터 시스템을 통해 환경으로 출시 되었습니다. 이 입자 농도 감소에 의해 입증 됩니다. 후 실험 표면 10% 가구 표 백제와 70% 에탄올으로 소독 된다. 표시기;이 데모에 사용 됩니다. 그러나, 알려진 병원 성 유기 체는이 시스템에 사용 됩니다, 추가 biosafety 조치 수 있습니다 구현 필요에 따라.
3. 핵 산 추출 및 qRT-PCR 검출
-
음이온 교환 수 지에서 직접 하 고, 액체 impingers 내에서 사용 하는 액체에서 비교 목적을 위해 핵 산을 분리. 이 예제에서는 RNA 격리 절차 설명 하지만 비슷한 프로토콜 DNA 바이러스를 위해 사용 될 수 있습니다.
- 음이온 교환 수 지에서 핵 산 격리입니다.
- 살 균 50 mL 원뿔 튜브에 음이온 교환 수 지를 포함 하는 액체의 액체 임 핀 저의 모두를 전송.
- 정착, 수 지 고 천천히 음이온 교환 수 지에서 액체 샘플을 가만히 따르다. 1 mL 피 펫 팁을 사용 하 여 음이온 교환 수 지에서 남은 액체의 모든을 제거.
- 바이러스 성 RNA 격리 키트에서 포함 하는 음이온 교환 수 지에 직접 캐리어 RNA 바이러스 성 세포의 용 해 버퍼의 560 µ L을 추가 하 고 정기적으로 혼합과 실 온에서 10 분 동안 품 어.
- 1 mL 피 펫 팁을 사용 하는 바이러스 성 전송 lysate (바이러스 성 세포의 용 해 버퍼) 살 균 1.5 ml 원뿔 튜브와 RNA 계속 바이러스 성 RNA 격리를 사용 하 여 격리 키트 ( 재료의 표참조) 제조업체의 지침에 따라 제외 하 고 그 RNA는 eluted 차입 버퍼의 60 µ L의 전체 볼륨에.
- 핵 산 격리 액체 impingers에서.
- 살 균 1.5 mL 원뿔 튜브에 액체 샘플의 140 µ L 플라스틱 고 RNA 격리 차입 버퍼의 60 µ L의 전체 볼륨에 RNA를 방출 하는 것 제외 하 고 제조업체의 지침에 따라 바이러스 성 RNA 격리 키트를 사용 하 여 수행 합니다.
참고: 140 µ L은 단일 단계 준비에서 여기 고용 특정 바이러스 성 RNA 격리 키트와 함께 처리할 수 있는 최대 샘플 볼륨입니다.
- 살 균 1.5 mL 원뿔 튜브에 액체 샘플의 140 µ L 플라스틱 고 RNA 격리 차입 버퍼의 60 µ L의 전체 볼륨에 RNA를 방출 하는 것 제외 하 고 제조업체의 지침에 따라 바이러스 성 RNA 격리 키트를 사용 하 여 수행 합니다.
- 음이온 교환 수 지에서 핵 산 격리입니다.
- 앞에서 설명한23,24MS2 및 인플루엔자 A와 B 바이러스의 검출을 위한 qRT-PCR을 수행 합니다. 이 데모에서는 핵 산 있다의 5 µ L qRT-PCR에 사용 됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
그림 1 에서 bioaerosols 액체 기반의 impingers 수 지의 포함을 통해 바이러스의 차지 기반 캡처의 뒤에 원리를 보여 줍니다. 그림 2 는 사용자 bioaerosol 챔버의 설치. 그림 3 에서는 aerosolization 실험 및 측정 품질 관리를 보장 하기 위해 설정에 관련 된 단계를 설명 합니다. 그림 4 는 qRT-PCR bioaerosols에서 캡처한 부정 청구 바이러스의 검출을 위한 증폭 곡선. 표 1 뇌관 및 프로브 qRT-PCR이이 연구에 사용 된 예제에서는 바이러스에 대 한 사용을 보여 줍니다.
사용자 지정 bioaerosol 챔버에 모델로 인플루엔자 백신에 포함 된 MS2 및 인플루엔자 바이러스를 사용 하 여 액체 impingers 수정 약 3 x 9 배 향상 특정에 따라 바이러스 탐지에서를 허용 하는 음이온 교환 수 지 바이러스, 직접 치는 행위 액체22의 테스트에 비해. 대표 qRT-PCR 증폭 곡선 (그림 4) 에서처럼 직접 치는 행위 액체의 테스트에 비해 음이온 교환 수 지 사용 때 인플루엔자 바이러스 3.26까지 달성 될 수 있는 형식의 검색 빨리 주기. QRT-PCR 효율 100%, 한 Ct의 대상 집중에서 2-fold 증가에 해당 하는 고려,이 차이 검출에서 9.58 배 향상.
그림 1: 음이온 교환 수 지와 결합 된 액체 충돌. 각각의 수정 된 bioaerosol 샘플링 장치 그것의 디자인에는 음이온 교환 수 지를 통합합니다. 각 수 지 비드 다공성 표면, 음이온 교환 표면 영역을 증가 하는 특성으로 0.5 ~ 1.0 m m 영역 이다. 기능 4 급 암모늄 그룹 허용 액체 매체에서 이온의 캡처 캡처 MS2 coliphages 및 인플루엔자 바이러스, 모형 유기 체 (한 꼬리으로이 프로토콜에 사용 되는 포함 하 여 그물 네거티브 표면 유료 바이러스의 중재 살 균 소 그려집니다 캡처된 바이러스에 대 한 예로 여기). 핵 산 격리 다음 적합 가장 분자 탐지 전략 (qRT-PCR 여기 고용) 샘플 (를 사용 하 여 상용 키트), 수 지에서 직접 수행 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 사용자 정의 bioaerosol 챔버 구조. A: 6-제트 분무기 6.9 kPa;의 생성에서 필터링 하 고 건조 공기 공급 B: 축 팬 유니폼 bioaaerosol 혼합; 촉진을 C:에 어로 졸 모니터를 식별 상대 bioaerosol 농도; D: 액체 임 핀 저 수 지; E: 액체 임 핀 저 없이 수 지; F: 열 풍속 계 측정 풍속; G: 공기 품질 모니터 온도, 이산화탄소, 및 % 상대 습도;를 포함 하 여 다른 환경 변수를 측정 하 H: 액티브 샘플링 펌프 12.5 L/분; 보정 나: 공기 밀폐 챔버 내에 bioaerosol; 샘플링 장비를 두기를 위한 장갑 포트 J: 관찰 창입니다. 이 수치는 게시자22허가 이전 작품에서 다시 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: bioaerosolization 실험의 워크플로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 음이온 교환 수 지 향상 bioaerosols 바이러스 부정 청구의 qRT-PCR 기반 탐지. 이 예제에서 형식 A 독감 바이러스 103.5 : FFU/mL inoculum 농도에서 했다 aerosolized 사용자 지정 bioaerosol 챔버로 bioaerosol 대량 농도 5 mg/m3를 도달할 때까지. 액체 impingers 수 지 않고는 bioaerosol의 각 샘플 (500l)을 동시에 약혼 했다. 바이러스 성 RNA 음이온 교환 수 지 또는 임 핀 저 액체에서 고 qRT-PCR에 의해 분석. 실험 3 중에 반복 되었다. 수 지 샘플에서 얻은 핵 산 임 핀 저 액체 샘플 30.02 (3.26의 ΔCt)의 평균 Ct에서 발견 된 반면 26.76의 평균 Ct에서 발견 했다. 코네티컷에서이 차이 음이온 교환 수 지를 사용 하 여 검출에서 9.58 배 향상. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 바이러스 | 뇌관 이름 | 뇌관 순서 | 참조 | |
| MS2 | GI Fwd | 5'-ATCCATTTTGGTAACGCCG-3' | 23 | |
| GI 프로브 | 5'-(6-FAM)-TAGGCATCTACGGGGACGA-(BBQ)-3' | |||
| GI 레 브 | 5'-TGCAATCTCACTGGGACATAT-3' | |||
| IAC Fwd (46F) | 5'-GACATCGATATGGGTGCCG-3' | |||
| IAC 프로브 | 5'-(Cy5)-CACATTCACCAGGGAGACGCATGAGA-(바베 큐)-3 ' | |||
| IAC 레 브 (186R) | 5'-CGAGACGATGCAGCCATTC-3' | |||
| 형 A 독감 바이러스 | CDC 범용 인플루엔자 A 바이러스 앞으로 뇌관 | 5'-GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C-3' | 24 | |
| CDC 범용 인플루엔자 바이러스 반전 뇌관 | 5'-AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA-3' | |||
| CDC 범용 인플루엔자 A 바이러스 프로브 | 5'-(FAM)-TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG-(BHQ1)-3 ' | |||
| B 형 인플루엔자 바이러스 | CDC 범용 인플루엔자 B 바이러스 앞으로 뇌관 | 5'-TCCTCAACTCACTCTTCGAGCG-3' | 24 | |
| CDC 범용 인플루엔자 B 바이러스 역 뇌관 | 5'-CGGTGCTCTTGACCAAATTGG-3' | |||
| CDC 범용 인플루엔자 B 바이러스 프로브 | 5'-(조)-CCAATTCGAGCAGCTGAAACTGCGGTG-(BHQ1)-3 ' | |||
표 1: 프라이 머 및이 연구에 사용 된 프로브. 모든 프라이 머 및 프로브 프리드먼 외. 201123 , Selvaraju & Selvarangan 201024에서 했다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 프로토콜에서 bioaerosols 수정된 액체 impingers를 사용 하 여 민감한 바이러스 캡처 하는 방법을 설명 합니다. 방법은 탐지 및 정량화 bioaerosols에 바이러스 부하의 최적화 되어 있습니다. 여기 설명 하는 특정 수정 일반적인 액체 임 핀 저 안에 포함 된 액체에 음이온 교환 수 지의 추가 포함 한다. 이 메서드는 원심 분리, 여과, 강 수 기반 방법 등 다른 샘플 처리 기술 이러한 이점을 제공 하지 않는 반면 다운스트림 샘플 처리에 그것의 단순에 대 한 개발 되었다. 핵 산의 추출 대량 elutions에 대 한 필요성 및 궁극적으로 효과적인 샘플에서 감소를 통해 방법의 향상 된 탐지 감도에 기여 하는 여러 샘플 준비 단계를 만듦으로써 수 지에서 직접 수행 볼륨입니다. 또한, 그것은 보였다 그 immobilization 바이러스 성 입자의 고체에 표면 바이러스 핵 산의 증가 한 안정성 또는 바이러스 infectivity17,25의 보존에 기여할 수 있다. 동원 정지 reaerosolization16인해 손실을 감소 시켜 증가 캡처 효율성에 더 기여할 수 있습니다. 메서드를 사용 하면 다운스트림 분자 분석 (qRT-PCR 여기 시연) 쉽게 결합 될 수 있습니다. 음이온 교환 수 지 필드 추출 고 공기 샘플링 장비 샘플링 영역에 모니터링 전용 유지 수 참조 실험실 분석을 위해 제공 될 수 있습니다. 절차의 뒤에 원리는 그물 네거티브 표면 충전을 수행 하는 바이러스의 일반적인 캡처 관련 된, 방법은 인간의 건강 및 수의학에 중요성의 여러 병원 성 바이러스의 검출 의무가 있을 예정 이다. Michen와 Graule26의 검토, 공공 및 동물 건강에 중요 한 바이러스의 많은 rotaviruses와 감염의 특정 계통 등 몇 가지 알려진된 예외와 그물 네거티브 표면 요금 있다.
이 프로토콜에 직접 감지;의 감도에 환경 조건의 영향 평가 하지 않습니다. 그러나 공기 샘플링 필드 설정에서 실시 하는 경우, 그것은 생각할 수 있는 상대 습도 및 온도 같은 변수12에 어 샘플러 여러 종류에 걸쳐 수집 효율성을 제한할 수 있습니다. 따라서, 챔버 내에 bioaerosol 조건은 필요에 따라 매개 변수를 이러한 환경에 맞게 수정할 수 있습니다. 음이온 교환 수 지 방법은 다양 한 물리 화학적 특성, 미 립 자 물질, 박테리아, 그리고 다른 환경에서 그 방해를 나타내는 물 샘플에서 여러 바이러스를 효과적으로 집중 표시 되었습니다. 오염 물질 최소18될 예정 이다. 또한, 컬렉션 버퍼 컬렉션 버퍼 최적화 바이러스 안정성27의 향상 된 보존 될 수 있는 몇 가지 경우 그것은 특정 바이러스에 대 한 최적화를 요구할 수 있습니다. 제시 방법의 주요 불리는 사실 이다 그것은 바이러스 성 infectivity 확인할 수 없습니다. 이 프로토콜의 또 다른 단점은 nebulization의 잠재적으로 부정적인 영향을 평가 하 고 공기 건조, 전단, 및 일반적인 흡착 bioaerosol 챔버 표면22를 포함 하 여 바이러스 성 안정성에 샘플링 하는 무 능력.
수정 된 bioaerosol 샘플링 장치 여러 설정에서 병원, 학교, 농업 작업 및 다른 장소를 포함 하 여 필드 기반 샘플링 의무가 될 수 있습니다. 수정한 기존 공기 샘플링 장비에, 때문에 예상 된다 수정된 장치 쉽게 채택할 수 있는 것이 현재 바이러스 bioaerosols 샘플링 연산자로. 프로토콜은 사실을 나타내도록 비 싸여 및 포함 된 바이러스의 예 방법 개발에 대 한 유용한 목표는, MS2 및 인플루엔자 바이러스를 사용 하 여 사용자 bioaerosol 챔버에 여기 증명 MS2로 인식 되는 대리 장 바이러스의 일반적으로 impingers22,,2627,,2829의 평가에서 고용.
미래의 작업 샘플링 조건 (즉, 공기 샘플링 속도, 컬렉션 버퍼)의 최적화 및 테스트 프로토콜에 추가 관련 바이러스의 포함을 포함 한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 농업 건강과 안전 (5U54OH008085)에 대 한 CDC/NIOSH 높은 평야 Intermountain 센터와 콜로라도 생명 과학 발견 평가 그랜트 프로그램 (14BGF-16)에서 자금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Escherichia coli bacteriophage MS2 (ATCC 15597-B1) | American Type Culture Collection | ATCC 15597-B1 | |
| FluMist Quadrivalent | AstraZeneca | Contact manufacturer | Viral constitutents of this vaccine are subject to change on an annual basis |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
| Primers and probes | Integrated DNA Technologies | NA | |
| 0.2 µM sterile filter | NA | NA | |
| 1 L pyrex bottles or equivalent | NA | NA | |
| 1 mL pipet tips | NA | NA | |
| 1 mL pipettor | NA | NA | |
| 50 mL serological pipet | NA | NA | |
| PCR tubes | NA | NA | |
| Pipet-aid or equivalent | NA | NA | |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| QuantiTect Probe RT-PCR Kit | Qiagen | 204443 | |
| Amberlite IRA-900 chloride form | Sigma-Aldrich | 216585-500G | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Water (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Eppendorf DNA LoBind Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher | 13-698-791 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 14-432-22 | |
| Falcon Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 05-538-62 | |
| SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit w/ROX | ThermoFisher | 11745100 | |
| SKC Biosampler 20 mL, 3-piece glass set | SKC Inc. | 225-9593 | |
| Vac-u-Go sample pumps | SKC Inc. | 228-9695 | |
| Collison nebulizer (6-jet) | BGI Inc. | NA | |
| HEPA capsule | PALL | 12144 | |
| Q-TRAK indoor air quality monitor 8554 | TSI Inc. | NA | |
| Alnor velometer thermal anemometer AVM440-A | TSI Inc. | NA | |
| SidePak AM510 personal aerosol monitor | TSI Inc. | NA | |
| Bioaerosol chamber | NA | NA |
References
- Pirtle, E. C., Beran, G. W. Virus survival in the environment. Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics). 10 (3), 733-748 (1991).
- Nguyen, T. M., et al. A community-wide outbreak of legionnaires disease linked to industrial cooling towers--how far can contaminated aerosols spread? The Journal of Infectious Diseases. 193 (1), 102-111 (2006).
- Marks, P. J., et al. Evidence for airborne transmission of Norwalk-like virus (NLV) in a hotel restaurant. Epidemiology and Infection. 124 (3), 481-487 (2000).
- Marks, P. J., et al. A school outbreak of Norwalk-like virus: Evidence for airborne transmission. Epidemiology and Infection. 131 (1), 727-736 (2003).
- Corzo, C. A., Culhane, M., Dee, S., Morrison, R. B., Torremorell, M. Airborne detection and quantification of swine influenza a virus in air samples collected inside, outside and downwind from swine barns. PLoS One. 8 (8), e71444 (2013).
- Anderson, B. D., et al. Bioaerosol sampling in modern agriculture: A novel approach for emerging pathogen surveillance. The Journal of Infectious Diseases. 214 (4), 537-545 (2016).
- Hietala, S. K., Hullinger, P. J., Crossley, B. M., Kinde, H., Ardans, A. A. Environmental air sampling to detect exotic Newcastle disease virus in two California commercial poultry flocks. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 17 (2), 198-200 (2005).
- Jonges, M., et al. Wind-mediated spread of low-pathogenic avian influenza virus into the environment during outbreaks at commercial poultry farms. PLoS One. 10 (5), e0125401 (2015).
- Otake, S., Dee, S. A., Jacobson, L., Torremorell, M., Pijoan, C. Evaluation of aerosol transmission of porcine reproductive and respiratory syndrome virus under controlled field conditions. The Veterinary Record. 150 (26), 804-808 (2002).
- Wu, Y., et al. Aerosolized avian influenza A (H5N6) virus isolated from a live poultry market, China. The Journal of Infection. 74 (1), 89-91 (2017).
- Choi, M. J., et al. Live animal markets in Minnesota: A potential source for emergence of novel influenza A viruses and interspecies transmission. Clinical Infectious Diseases. 61 (9), 1355-1362 (2015).
- Haig, C. W., Mackay, W. G., Walker, J. T., Williams, C. Bioaerosol sampling: Sampling mechanisms, bioefficiency and field studies. The Journal of Hospical Infection. 93 (3), 242-255 (2016).
- Anderson, B. D., Lednicky, J. A., Torremorell, M., Gray, G. C. The use of bioaerosol aampling for airborne virus surveillance in swine production facilities: A mini review. Frontiers in Veterinary Science. 4, 121 (2017).
- Verreault, D., Moineau, S., Duchaine, C. Methods for sampling of airborne viruses. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 413-444 (2008).
- Hogan, C. J. Jr Sampling methodologies and dosage assessment techniques for submicrometre and ultrafine virus aerosol particles. Journal of Applied Microbiology. 99 (6), 1422-1434 (2005).
- Yu, K. -P., Chen, Y. -P., Gong, J. -Y., Chen, Y. -C., Cheng, C. -C. Improving the collection efficiency of the liquid impinger for ultrafine particles and viral aerosols by applying granular bed filtration. Journal of Aerosol Science. 101, 133-143 (2016).
- Perez-Mendez, A., et al. Evaluation of a simple and cost effective filter paper-based shipping and storage medium for environmental sampling of F-RNA coliphages. J Virol Methods. 194 (1-2), 60-66 (2013).
- Chandler, J. C., et al. Field-based evaluation of a male-specific (F+) RNA coliphage concentration method. Journal of Virological Methods. 239, 9-16 (2017).
- Perez-Mendez, A., Chandler, J. C., Bisha, B., Goodridge, L. D. Concentration of enteric viruses from tap water using an anion exchange resin-based method. Journal of Virological Methods. 206, 95-98 (2014).
- Perez-Mendez, A., Chandler, J. C., Bisha, B., Goodridge, L. D. Evaluation of an anion exchange resin-based method for concentration of F-RNA coliphages (enteric virus indicators) from water samples. Journal of Virological Methods. 204, 109-115 (2014).
- Kammerer, J., Carle, R., Kammerer, D. R. Adsorption and ion exchange: Basic principles and their application in food processing. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59 (1), 22-42 (2011).
- Chandler, J. C., et al. A method for the improved detection of aerosolized influenza viruses and the male-specific (F+) RNA coliphage MS2. Journal of Virological Methods. 246, 38-41 (2017).
- Friedman, S. D., Cooper, E. M., Calci, K. R., Genthner, F. J. Design and assessment of a real time reverse transcription-PCR method to genotype single-stranded RNA male-specific coliphages (Family Leviviridae). Journal of Virological Methods. 173 (2), 196-202 (2011).
- Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. Evaluation of three influenza A and B real-time reverse transcription-PCR assays and a new 2009 H1N1 assay for detection of influenza viruses. Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 3870-3875 (2010).
- Cademartiri, R., et al. Immobilization of bacteriophages on modified silica particles. Biomaterials. 31 (7), 1904-1910 (2010).
- Michen, B., Graule, T.
- Turgeon, N., Toulouse, M. J., Martel, B., Moineau, S., Duchaine, C. Comparison of five bacteriophages as models for viral aerosol studies. Applied and Environmental Microbiology. 80 (14), 4242-4250 (2014).
- Vergara, G. G., et al. Evaluation of FRNA coliphages as indicators of human enteric viruses in a tropical urban freshwater catchment. Water Research. 79, 39-47 (2015).
- Tung-Thompson, G., Libera, D. A., Koch, K. L., de Los Reyes, F. L. 3rd, Jaykus, L. A. Aerosolization of a human norovirus surrogate, bacteriophage MS2, during simulated vomiting. PLoS One. 10 (8), e0134277 (2015).
