Summary
여기, 선물이 토양 요인 (예, 기판 종류 및 습기 콘텐츠)에 대 한 응답 Ectropis grisescens 의 성숙한 애벌레의 pupation 선호를 조사 하는 프로토콜 선택 생물 검정을 사용 하 여. 우리 또한 제시 pupation 동작에 영향을 주는 요소를 확인 하려면 아니오 선택 생물 검정의 프로토콜의 survivorship E. grisescens.
Abstract
많은 곤충 애벌레와 어른으로 땅 위에 사는 고 땅 아래 pupate로. 그들의 라이프 사이클의 지상 단계에 비해 관심을 덜 지급 되었습니다 어떻게 환경 요인 영향에 이러한 곤충 때 그들은 토양 내에서 pupate. 차 자 벌레, Ectropis grisescens 워렌 (나비목: Geometridae), 차 식물의 심각한 해충 이며 중국 남부에 있는 거 대 한 경제적 손실 발생 했습니다. 프로토콜 설명 여기 객관식 생물 검정을 통해 조사 하는 것을 목표로, 마지막 탈피 여부 성숙 E. grisescens 애벌레 수 콘텐츠처럼는 기판 유형 및 수 분, 토양 변수를 차별 하 고 아니오-선택을 통해 결정 생물 검정, 콘텐츠의 기판 유형 및 습기 pupation 행동에 미치는 영향 및의 출현 성공 E. grisescens. 결과의 E. grisescens pupation 생태의 이해를 향상 시킬 것 이다 및 E. grisescens 인구 억제 위해 토양 관리 전술에 대 한 통찰력을가지고 있습니다. 또한, 이러한 생물 검정 survivorship 토양 용 해충의 pupation 동작에 다양 한 요인의 영향을 공부 하 고 수정할 수 있습니다.
Introduction
곤충의 애벌레 및 성인 단계에 비해, 번데기 단계는 매우 빠르게 위험한 상황에서 벗어날 수 없다 pupae의 제한 된 모바일 능력으로 인해 취약 합니다. 곤충의 다양 한 그룹에서 사용 하는 일반적인 전략은 지상 아래 용 (예를 들면, 순서 Diptera에서에서1,2,3,4, 딱정벌레목5, Hymenoptera6, Thysanoptera7, 그리고 나비목8,,910,,1112) 지상 육 식 동물 및 환경 위험에서 그들을 보호 하기 위해. 그들의 많은 심각한 농업 및 임업 해충1,2,3,,45,6,7,8 ,,910,,1112. 토양 용 곤충의 성숙한 애벌레 일반적으로, 그들의 호스트를 두고 지상에가, 적절 한 사이트를 찾아, 흙으로 뚫으 용8,10번데기 챔버를 건설을 방황.
차 자 벌레, Ectropis grisescens 워렌 (나비목: Geometridae)의 가장 중요 한 defoliator 해충 중 동백 sinensis L.13식물 이다. 비록이 종이 1894 년에 처음으로 설명, 그것은 실수로 발견 되었습니다 Ectropis obliqua 프라 (나비목: Geometridae) 과거에 수십 년간14,15. 형태학, 생물학, 및 두 형제 종 사이의 지리적 분포 차이 일부 최근 연구14,,1516에 설명 했습니다. 예를 들어 장 외. E. grisescens 는에 비해 훨씬 넓은 분포 하는 반면 15 E. 오블리크 주로 중국의 3 개의 지방 (안후이, 강 소, 절 강)의 경계에서 발생 한 보고 E. 간접. 따라서, E. grisescens 으로 인 한 경제적 손실을 크게 간과 하 고, 그리고이 해충의 지식을 광범위 하 게 개정 하 고16,,1718,19 갱신 . 우리의 이전 연구 보여주었다 그 E. grisescens 토양 내에서 pupate을 선호 하지만 때 토양 (사용할 수 없음-pupation-기판 조건)11,12pupate도 수.
이 문서에서는 (1) 결정에 E. grisescens 의 pupation 기본 기판 종류 같은 요인 및 객관식 생물 검정를 사용 하 여 콘텐츠 분과 (2) 비 생물 적인 요인의 영향을 확인 하는 단계별 절차를 제공 합니다. pupation 동작 및에 아니오 선택 생물 검정을 사용 하 여 E. grisescens 의 출현 성공. 이러한 생물 검정의 모두 잘 통제 된 실험실 조건 하에서 지휘 된다. 또한, 이러한 생물 검정 pupation 행동에 다른 요인의 영향 및 다양 한 토양 용 곤충의 survivorship 적응 됩니다.
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Protocol
1. 수 분-선택 생물 검정 E. grisescens 의 Pupation 취향 결정
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E. grisescens 의 성숙 마지막 탈피 애벌레를 얻기
- 차 식물 (동백나무 sinensis L.)의 신선한 촬영 (길이 30-40 cm)를 잘라. 250 mL 삼각 플라스 크에 25-30 촬영을 삽입 합니다. 수돗물으로 플라스 크를 채우십시오. 플라스틱 분 지에 (와 함께 차 촬영) 플라스 크 3-4를 넣어 (상부: 51 cm 직경에서, 아래쪽: 직경에서 40cm, 높이: 16 cm).
- 각 분 지에 차 싹의 잎에 E. grisescens 의 실험실 식민지의 1000-2000 애벌레 (두 번째에서 다섯 번째 탈피)를 해제 합니다. 유지 하는 통제 된 실험실 조건에서 이러한 애벌레 [빛의 14 h photoperiod 뒤 어둠의 10 h (14시 10분 L:D), 60-90% 상대 습도 (RH), 그리고 24-28 ° C]. 신중 하 게 전송 신선한 잎에 애벌레 손으로 모든 1-2 d. 매일은 분 지의 바닥에서 배설물과 파편을 제거 합니다.
- 적극적으로 분 지의 바닥에 돌아다니는 차 새싹의 잎에서가 성숙한 마지막 탈피 애벌레를 선택 합니다. 충분 한 애벌레는 생물 검정에 사용할 수 있도록 적어도 240 성숙한 애벌레를 얻을.
참고:만 실험에 대 한 적극적으로 방황 애벌레를 선택 합니다. 이들은 pupate 준비 때문에 애벌레는 잎에 유지를 선택 하지 마십시오. 또한, 그들은 검색 하지 않습니다 적극적으로 적절 한 조건에 대 한 후 검정 경기장에 출시 되 고 있기 때문에 제한 된 모바일 활동 prepupae 선택 하지 마십시오.
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기판 준비
- 수집 및 기판의 4 종류를 식별 (예를 들어, 모래, 모래 옥 토 1, 모래 2, 명 개 및 갯벌 명 개) 비 중계 방법20를 사용 하 여. 토양과 건조 기 > 3 d, 80 ° C 오븐에서 모래 살 균 하십시오 그리고 그 후 완전히 건조 토양과 모래 50 ° C에서 기판 샘플의 건조 중량은 시간이 지남에 더 이상 변경 되지 않습니다 때까지 몇 주 동안.
- 지상 나무 pestles와 박격포 건조 한 토양. 3 ㎜ 체 통해 접지 토양 및 모래를 체로 치십시오 고 sealable 비닐 봉지에 그들을 저장 합니다.
- 계산 하는 각 기판의 다른 습기 내용 (모래, 모래 옥 토 1, 모래 명 개 2, 또는 갯벌 명 개)로2다음과 같습니다:
- 건조 한 토양 이나 5를 준비 하는 모래를 포함 하는 접착성 비닐 봉지에 증류수의 필요한 금액을 추가 %-20%-35%, 50%, 65% 및 80% 수 분 기판. 철저 하 게 믹스는 증류수와 토양 또는 모래.
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생물 분야 준비
- 폴 리 프로필 렌 용기를 동등 하 게 분할 (상부: 길이 20.0 c m x 13.5 c m 폭, 아래 측에에서: 17.0 c m 길이에 폭, 높이 10.0 cm x: 6.5 c m) 방수 폴 리 염화 비닐 (PVC) 시트 6 실로 (높이: 3.5 c m). PVC 시트를 수정 하 고 뜨거운 접착제를 사용 하 여 균열을 봉인.
참고: 완전히 물 침투를 방지 하기 위해 모든 균열을 봉인. - 각 테스트에 대 한 채우기 기판의 동일한 종류를 사용 하 여 다른 습기 내용으로 6 실 (5%-20%-35%-50%, 65% 및 80% 수 분) (그림 1a).
참고: 각 테스트에만 다른 습기 내용의 기판의 1 종류를 사용 합니다. 무작위로 6 습기 내용으로 기질을 포함 하는 챔버의 순서를 지정 합니다. - 4-6 조각을 (그림 1b) 폴 리 프로필 렌 용기 뚜껑의 안쪽 표면에 테이프의 작은 조각을 사용 하 여 신선한 찻 잎을 붙여 넣습니다.
- 폴 리 프로필 렌 용기를 동등 하 게 분할 (상부: 길이 20.0 c m x 13.5 c m 폭, 아래 측에에서: 17.0 c m 길이에 폭, 높이 10.0 cm x: 6.5 c m) 방수 폴 리 염화 비닐 (PVC) 시트 6 실로 (높이: 3.5 c m). PVC 시트를 수정 하 고 뜨거운 접착제를 사용 하 여 균열을 봉인.
그림 1: 선택 테스트에 대 한 검정 경기장의 예. (한) 방수 폴 리 염화 비닐 (PVC) 시트는 6 챔버로 폴 리 프로필 렌 용기를 동등 하 게 분할 하는 데 사용 됩니다. PVC 시트 뜨거운 접착제로 고정 되 고 어떤 균열 든 지 신중 하 게 밀봉 된다. 이 예제에서는 다른 습기 내용 (5%, 20%, 35%, 50%, 65% 및 80% 수 분)으로 모래 옥 토 2는 임의로 할당 된 순서에 있는 챔버를 채우는 데 사용 됩니다. (b) 신선한 차 잎 뚜껑의 안쪽에 붙여 있는 성숙 Ectropis grisescens 애벌레 발표 될 예정 이다. (c) PVC 시트 4 실로 4 종류의 가득 폴 리 프로필 렌 용기를 동등 하 게 분할 하는 데 사용 됩니다 기판 (모래, 모래 옥 토 1, 모래 2, 명 개 및 갯벌 명 개) 50% 수 분에. 이 그림에서 왕 외. 수정 되었습니다. 11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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생물 검정 설정 및 데이터 기록
- 30 성숙한 마지막 탈피 애벌레를 (단계 1.1.3에서에서 얻은) 폴 리 프로필 렌 컨테이너의 뚜껑에 붙여 신선한 찻 잎에 놓습니다. 조심 스럽게 뚜껑을 전복 하 고 폴 리 프로필 렌 용기를 단단히 커버.
- 각 반복 테스트 8 x. 14:10 (L:D) photoperiod와 26 ° C에서 환경 챔버 속에서 검정 경기장 유지
- 5 일에 각 약 실에 있는 토양의 표면에 pupae의 수를 계산 합니다. 또한, 생물 검정을 해체 하 고 기판 내 pupae의 수를 계산.
참고: 또는 기판 내에 라이브 pupae를 계산 합니다. 집게를 사용 하 여 번데기 후 복 부의 움직임을 관찰 하 여 번데기 생존 능력을 확인 합니다.
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데이터 분석
- 각 테스트에 대 한 각 복제의 각 챔버에 pupae의 비율을 계산 합니다. 백분율 데이터를 로그 비 고객 및 Malmgren21에서 제공 하는 메서드를 사용 하 여 전송.
- 번데기 (변환 된 데이터)는 단방향 분산 분석 (ANOVA)을 사용 하 여 각 실에서의 백분율을 비교 합니다. Α 의미 수준 설정 각 테스트에 대 한 0.05 =.
2. 기판 선택 생물 검정 E. grisescens Pupation 환경 설정을 확인 하려면
- 단계 1.1 성숙한 마지막 탈피 애벌레를 반복 하 고 다른 습기 내용으로 기판 준비 하 1.2 단계. 이 시간 20%, 50% 및 80% 습기 기판만 필요 합니다.
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생물 분야의 준비
- 1.3.1 단계, 똑같이 4 챔버 PVC 시트를 사용 하 여 폴 리 프로필 렌 용기를 나눌 비슷합니다. PVC 시트를 수정 하 고 뜨거운 접착제를 사용 하 여 균열을 봉인.
- 각 테스트에 대 한 4 종류의 약 실 채울 기판 (모래, 모래 옥 토 1, 모래 2, 명 개 및 갯벌 명 개)가 동일한 함량 (20%, 50% 또는 80% 수 분)와 임의로 할당 순서 (그림 1c). 1.3.3 뚜껑을 준비 단계를 반복 합니다.
- 1.4 생물 검정 설정 하 고 데이터를 기록 하 고 데이터를 분석 하는 1.5 단계를 단계를 반복 합니다.
3. 아니오 선택 생물 검정 토양 내 행동과 E. grisescens 의 출현 성공을 확인 하려면
- 단계 1.1 성숙한 마지막 탈피 애벌레를 반복 하 고 단계 3 습기 내용 (20%, 50% 및 80% 습도)에 4 기질 (모래, 모래 옥 토 1, 모래 2, 명 개 및 갯벌 명 개)을 준비 하는 1.2.
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생물 검정 설정
- 플라스틱 용기에 기판 추가 (상부: 지름에서 11.5 c m, 아래쪽: 직경에서 8.5 c m, 높이: 6.5 c m) 3 cm의 깊이에. 총에서 12 치료 (4 기판 종류와 3 습기 내용의 조합) 있을 것입니다 확인 합니다. 각 치료 7 반복 x.
- 각 생물 분야의 기판에 15 성숙한 마지막 탈피 애벌레를 릴리스 합니다. 단단히 뚜껑을 취재 하 여 컨테이너를 봉인. 14:10 (L:D) photoperiod와 26 ° C에서 환경 챔버 속에서 생물 검정을 유지
참고: 있을 것입니다 필요가 없습니다 선택 생물 검정에서 설명 했 듯이 뚜껑에 신선한 찻 잎을 붙여 넣습니다.
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데이터 기록 및 분석
- 3 일에 각 복제 기판의 표면에 어떤 죽은 애벌레와 번데기의 수를 계산 합니다. 다음과 같이 기판에 거머리 E. grisescens 개인의 비율을 계산.
- 기록 신흥 성인 수 더 이상 성인 15 등장 때까지 매일 디 계산 출현 성공을 다음과 같습니다:
- 가량 개인과 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 치료 중 출현 성공의 백분율을 비교 합니다. Α의 수준을 설정 = 0.05.
- 3 일에 각 복제 기판의 표면에 어떤 죽은 애벌레와 번데기의 수를 계산 합니다. 다음과 같이 기판에 거머리 E. grisescens 개인의 비율을 계산.
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Representative Results
수 분-선택 생물 검정 훨씬 더 많은 E. grisescens 개인에 pupated 또는 5%와 35% 습기 내 모래 80% 수 분 모래 (그림 2a)에 비해 보여주었다. 그러나, 훨씬 더 많은 개인 또는 토양 (모래 옥 토 1과 2와 갯벌 명 개)는 중간 함량 (그림 2b - 2d)를 했다 pupate 선호.
그림 2: 수 분-선택 생물 검정에서 결과. 이러한 패널 (는) 모래, (b)의 다른 습기 내용 (5%, 20%, 35%, 50%, 65% 및 80% 수 분)을 포함 하는 각 챔버에 라이브 pupae의 백분율을 표시 2, 또는 (d) 갯벌 명 개 모래 옥 토 1, (c) 모래 명 개. 데이터는 평균 ± SE로 표시 됩니다. 다른 문자 나타냅니다 중요 한 차이 (P < 0.05). 이 그림에서 왕 외. 수정 되었습니다. 11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
기질 선택 생물 검정 모래 E. grisescens 개인 20% 습기 조건 (그림 3a) 모래 옥 토 (1 및 2)에 비해 더 선호 크게 했다 보여주었다. Pupae 실 포함 하는 50% 함량 (그림 3b)에서 4 기판에서에서 발견의 비율에 큰 차이가 없었다. 훨씬 더 많은 개인에 또는에 보다 모래 내 또는 다른 기판 (그림 3c) 80% 수 분 조건 내에서 pupated.
그림 3: 기판 선택 생물 검정에서 결과. 모래, 모래 옥 토 1, 모래 옥 토 2, 포함 된 각 챔버에 라이브 pupae의 백분율을 표시 하는이 패널 또는 갯벌 명 개 (a)에 20%, (b)는 50%-, 또는 (c) 80% 함량. 데이터는 평균 ± SE로 표시 됩니다. 다른 문자 나타냅니다 중요 한 차이 (P < 0.05). 이 그림에서 왕 외. 수정 되었습니다. 11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
모래의 다른 습기 내용을 크게 미치지 않았다 가량된 개인의 비율 및 E. grisescens (그림 4a 및 4b)의 출현 성공. 상당히 적은 E. grisescens 용 (그림 4a)에 대 한 건조 (수 분 20%) 또는 습식 (80% 습도) 토양에 거머리. 또한, 크게 적은 성인 20% 습기에서 등장 모래 옥 토 2와 미사 보다 50% 또는 80%-습기 모래 옥 토 2와 갯벌 명 개 (그림 4b) pupated 했다 명 개.
그림 4: 아니오 선택 생물 검정에서 결과. 이러한 패널 표시 (a) 가량된 개인 및 (b) 다른 기판 종류에 대 한 응답에서 Ectropis grisescens 의 출현 성공의 비율 (모래, 모래 옥 토 1, 모래 2, 명 개 및 갯벌 명 개) 및 습기 내용 (20%, 50%와 80%)입니다. 데이터는 평균 ± SE로 표시 됩니다. 다른 문자 나타냅니다 중요 한 차이 (P < 0.05). 이 그림에서 왕 외. 수정 되었습니다. 11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
다른 토양 변수에 응답 pupation 환경 설정 몇 가지 해충6,9,,2223에 공부 되었습니다 했다. 예: Bactrocera tryoni (Froggatt)의 성숙한 애벌레의 기본을 공부 (Diptera: Tephritidae) 다른 토양 수 분 조건, 중 Hulthen 및 클라크22 가득 9 컨테이너를 포함 하는 3 x 3 라틴 스퀘어 디자인 설정 0%, 75% 또는 100% 필드 용량, 토양 및 25 성숙한 애벌레는 각 컨테이너의 표면에 발표 했다. Alyokhin 외. 23 나무 프레임, 36 센터 컨테이너 (건조 하거나 젖은) "체스판" 패턴 및 350-450 늦은 제 3 탈피 애벌레 Bactrocera dorsalis (Hendel)의 배열에서 100 용기 (흙으로 가득) 배치 (Diptera: Tephritidae) 36 컨테이너의 중심에 발표 했다. 이러한 연구는 그들의 대부분의 생물 검정 경기장22,23에 토양 내에서 회수 했다 때문에 B. tryoni 및 B. dorsalis 애벌레에 적합. 그러나,이 경기장은 포함 되지 않습니다. 그 결과, 강한 이동 수 용량을 가진 애벌레 방황 긴 거리와는 경기장에서 여행할 수 있습니다. 여기, 우리는 그들의 크기 및 모바일 능력에 토양 용 곤충의 기본을 공부 하는 간단한 방법을 제공 합니다. 이전 연구에 비해, 이러한 생물 검정은 설정 하기 쉽다. 또한, 토양 변수의 여러 수준 (예를 들어, > 4) 비교적 작은 경기장에서 공부 될 수 있다.
그것은 그 여기 설명 하는 선택 테스트에서 얻은 데이터 수 없습니다 직접 분석 백분율 데이터는 독립적 이므로 ANOVA를 사용 하 여 협조할 (각 챔버에 pupae의 비율의 합계가 항상 같음 1, 그리고, 그러므로,의 증가 1 약 실에 pupae의 비율 하면 비율의 감소 나머지 것 들에). 때문에 "효과적으로 어떤 구성 데이터에서 CSC (상수-합 제약 조건)를 제거 하 고 동시에 그들의 진정한 공분산 구조를 유지" 하는 간단한 프로시저 로그 비 변환 수행 하는 자,21. 현재 연구에서 E. grisescens pupae survivorship 높았다, 그리고 우리만 각 챔버에 라이브 pupae의 비율을 기록 했다. 그러나, 파인 processionary 엄, Thaumetopoea pityocampa (데니스 & Schiffermüller)와 같은 일부 토양 용 해충 (나비목: Thaumetopoeidae), 보통 용24중 높은 사망률을 전시. 이 경우, 그것은 라이브와 죽은 pupae를 적절 한 것입니다.
아니 선택 생물 검정 토양 pupation 해충의 출현 성공에 토양 변수의 영향을 조사 하기 위해 널리 사용 되었습니다. 기판 종류와 습기 내용에 가장 자주 공부 요인 연구2,3,,45,9,,1011 했다 , 12. 나는 기판에 E. grisescens pupate도 수 있습니다. 결과적으로, 우리는 가량된 개인의 비율을 기록 했다. 이 결과의 E. grisescenspupation 패턴을 이해할 수 있도록 중요 한 것입니다.
선택 및 아니오 선택 생물 검정 기본 설정 및 다양 한 토양 용 곤충의 성능에 다른 토양 요인 (예: 토양 밀도, 표면 압축, 유기 물, 등의 내용)의 영향을 조사 하기 위해 수정할 수 있습니다. 최근 작품에서 우리는 이러한 생물 검정 (1) 토양 화학 농약으로 치료 또는 biocontrol 대리인 격퇴 용 E. grisescens 여부를 공부 하 수정 (라이브 및 죽은 pupae 계산 했다), 그리고 (2)는 pupation에 이러한 치료의 효과 E. grisescens. 의 출현 성공과 행동 (예를 들어, 가량된 개인의 비율)
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 곤충 사육 및 실험 설정에 그들의 도움에 대 한 Yuzhen 원, Shiping Liang, Shengzhe 지 앤, 그리고 Yanjun 리 (임업 대학 및 조 경, 한국 중국 농업 대학) 감사 합니다. 이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (보조금 번호 31600516), 광 동 자연 과학 재단 (보조금 번호 2016A030310445), 그리고 과학 및 기술 계획 프로젝트의 광 동성 (보조금 번호 2015A020208010)에 의해 투자 되었다 .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triangular flask | Bomex Chemical (Shanghai) Co., LTD | 99 | 250 mL |
| Plastic basin | Chahua, Fuzhou, China | 100 | upper side: 51 cm in diameter; bottom side: 40 cm in diameter; height: 16 cm |
| Zip lock bags | Glad, Guangzhou, China | 126/133 | |
| Polypropylene containers | Youyou Plastic Factory, Taian, China | 139/155/160/161/190 | upper side: 20.0 cm [L] × 13.5 cm [W], bottom side: 17.0 cm [L] × 10.0 cm [W], height: 6.5 cm |
| Waterproof polyviny chloride sheet | Yidimei, Shanghai, China | 141 | |
| Tape | V-tech, Guangzhou, China | VT-710 | |
| Oven drier | Kexi, Shanghai, China | KXH-202-3A | |
| Environmental chamber | Life Apparatus, Ningbo, China | PSX-280H |
References
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