Summary
Hier beschrijven we een protocol voor te bereiden en handhaven van hypofyse en primaire celculturen van medaka (Oryzias latipes). De geoptimaliseerde voorwaarden in dit protocol rekening belangrijke parameters zoals temperatuur, osmolaliteit en pH door het nabootsen van de fysiologische omstandigheden van de vis, waardoor fysiologisch meer zinvolle resultaten.
Abstract
Primaire celculturen is een krachtig hulpmiddel gebruikt door wetenschappers bij het bestuderen van cellulaire eigenschappen en mechanismen van geïsoleerde cellen in een gecontroleerde omgeving. Ondanks de enorme verschillen in de Fysiologie tussen zoogdieren en vissen, zijn de protocollen van de cultuur van de primaire cel van vis vaak gebaseerd op zoogdieren kweekomstandigheden, vaak met slechts kleine wijzigingen. De ecologische verschillen van invloed zijn op niet alleen de lichaamstemperatuur, maar ook het bloedserum parameters zoals osmolaliteit, pH en buffercapaciteit van de pH. Als cel cultuurmedia en soortgelijke werkoplossingen zijn bedoeld om na te bootsen de kenmerken van de extracellulaire vloeistof en/of bloedserum waarnaar een cel aangepast wordt, is het van cruciaal belang dat deze parameters zijn aangepast specifiek aan het betrokken dier.
Het huidige protocol beschrijft geoptimaliseerde primaire kweekomstandigheden voor medaka (Oryzias latipes). Het protocol biedt gedetailleerde stappen over hoe te isoleren en handhaven van gezonde losgekoppeld hypofyse cellen voor meer dan een week en bestaat uit de volgende stappen: 1. de aanpassing van de osmolaliteit de waarden gevonden in medaka bloedplasma, 2. de aanpassing van de incubatietemperatuur tot normale medaka temperatuur (hier in de aquarium faciliteit), en 3. de aanpassing van de pH en bicarbonaat buffer waarden vergelijkbaar met andere vissoorten leven bij soortgelijke temperaturen. De resultaten gepresenteerd met behulp van het protocol beschreven fysiologisch zinvolle resultaten voor medaka bevorderen en als een naslagwerk kunnen worden gebruikt door wetenschappers maken van primaire celculturen van andere diersoorten bij niet-zoogdieren.
Introduction
Cultuur van de cel is één van de belangrijkste instrumenten in moleculair biologisch onderzoek, biedt een uitstekende modelsysteem voor het beantwoorden van verschillende biologische vragen variërend van normale cellulaire fysiologie tot drug screening en carcinogenese1gebruikt. Primaire cellen, rechtstreeks van het dierlijk weefsel met behulp van enzymatische en/of mechanische methoden, geïsoleerd worden vaak beschouwd als een meer biologisch relevant dan cellijnen als de biologische reactie dichter bij de in vivo situatie worden kan. Protocollen voor het voorbereiden van primaire celculturen moeten worden geoptimaliseerd voor elk soort en cel type van belang om te bootsen de kenmerken waarnaar een cel aangepast is en fysiologisch zinvolle resultaten te verkrijgen.
Talrijke protocollen beschrijven kweekomstandigheden voor zoogdiercellen systemen, terwijl soortgelijke protocollen beschrijven van primaire kweekomstandigheden voor vis cellen eerder schaars in vergelijking zijn. Cellen zijn gevoelig voor snelle veranderingen in de temperatuur, pH en de osmolaliteit, en zijn vooral kwetsbaar tijdens de procedure dissociatie. Commerciële zoutoplossingen en Kweekmedia gebruikt voor zoogdieren celculturen zijn niet optimaal voor teleost vis, met name wat betreft de pH buffer systemen en de osmolaliteit. Het is daarom belangrijk om te meten en aanpassen van de oplossingen voor fysiologisch relevante niveaus van deze parameters in de soorten van belang.
Primaire hypofyse culturen zijn gemaakt van verschillende vissoorten van de teleost, met inbegrip van de karper (Cyprinus carpio)2,3, gras carp (Ctenopharyngodon idella)4, goudvis (Carassius auratus )5, regenboogforel (Oncorhynchus mykiss)6, Europese aal (Anguilla anguilla)7, tilapia (Labeo fimbriatus)8, zebravissen (Danio rerio)9, en Kabeljauw (Gadus morhua)10. Afgezien van het aanpassen van de incubatietemperatuur tot de soorten van belang, hebben verscheidene van deze protocollen de cellen bij zoogdieren-achtige omstandigheden die voor de soorten van belang, met een pH van 7,2 tot 7,5 in een bevochtigde sfeer suboptimaal zijn kunnen geïncubeerd. met 3-5% CO2. Bovendien is het onduidelijk of de osmolaliteit van oplossingen gebruikt voor het voorbereiden van verscheidene van deze primaire celculturen werden aangepast en stabiel tussen verschillende oplossingen.
Het huidige protocol is gebaseerd op eerdere werk met primaire culturen van kabeljauw10 en omvat aanpassingen van incubatietemperatuur, osmolaliteit, pH en pH buffer systemen, met inbegrip van de gedeeltelijke druk van kooldioxide (pCO2), om te de Fysiologie van medaka (O. latipes). Medaka is een zoetwatervis van kleine (3-4 cm), inheems in Oost-Azië. Deze dagen, wordt het gebruikt als een soort model in veel onderzoekslaboratoria over de hele wereld, want het is relatief eenvoudig te kweken en zeer resistent tegen veel voorkomende vis ziekten11. Er zijn verschillende voordelen van het gebruik van medaka als een model, met inbegrip van een temperatuur tolerantie van 4 – 40 ° C11, een korte generatietijd, transparante embryo's, een seks-bepalen gene12, en een gesequenceerd genoom13, evenals veel andere beschikbare genetische hulpbronnen.
De primaire kweekomstandigheden in dit protocol worden geoptimaliseerd zodat deze overeenkomen met de temperatuur van 26 ° C die medakas worden bewaard in de vis-faciliteit. Verder is de osmolaliteit wordt teruggebracht van 320 mOsm/kg van kabeljauw leeft in zout water tot 290 mOsm/kg voor medaka leven in zoet water en is in overeenstemming met de normale osmolaliteit van medaka plasma14. In vergelijking is de typische osmolaliteit van zoogdieren plasma in het bereik van 275-295 mOsm15. Vissen leven in een verscheidenheid van temperaturen en hebben kieuwen die in direct contact met water, waardoor de pH en buffer capaciteit van het bloed en het extracellulaire vloeistof in vis afwijken bij zoogdieren. Zoogdieren voedingsbodems bestaan meestal uit buffer-systemen die leiden tot een pH van ongeveer 7.4 wanneer de media zijn geëquilibreerd aan een standaard sfeer van 5% CO2 in bevochtigde lucht bij 37 ° C. De pH is afhankelijk van temperatuur en de waarde voor de verhoging van de neutrale pH (in water) met een dalende temperatuur-16. Typisch teleost vis plasma pH varieert van 7,7 7,917. De optimalisering van dit protocol opgenomen een reductie van pH 7.85 voor kabeljauw bij 12 ° C tot pH 7,75 voor medaka gehouden bij 26 ° C door het verhogen van de CO-2 van 0,5% tot 1% beperkt.
Daarnaast is de buffercapaciteit van bicarbonaat heel anders in vissen en zoogdieren. CO2 gemakkelijk worden verzonden via de kieuwen in vis en de pCO2 in water is slechts een klein deel van de pCO2 in de Long-18. De temperatuur of de pCO2 wijzigt, de pH en de buffer van het medium. Noch de pCO2 aanbevolen voor het broeden van zoogdiercellen als de pH dus optimaal voor vis cellen, en daarom moet de voedingsbodems worden geoptimaliseerd met buffer systemen met fysiologisch relevante waarden voor vis en de bepaalde soorten van belang. Dit protocol beschrijft hoe te bereiden van primaire celculturen van medaka pituitaries en omvatten aanpassingen van de incubatie temperatuur, osmolaliteit, pH en pH buffersysteem, naast andere belangrijke parameters te overwegen bij de voorbereiding van de oplaadbare batterij bij niet-zoogdieren soorten culturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dierproeven uitgevoerd in deze studie werden goedgekeurd door de Noorse Universiteit van levenswetenschappen, volgende richtlijnen voor de zorg en het welzijn van dieren voor onderzoek.
1. bereiding van de oplossingen
- Kalibreren van de osmometer en pH meter instrumenten volgens de instructies van de fabrikant om de juiste metingen.
-
Bereiden van 500 mL van Ca2 +- en Mg2 +-gratis Dulbecco van fosfaat gebufferde zoutoplossing (dPBS), 7,75 (stap 1.2.1) pH en de osmolaliteit 290 mOsm/kg (stap 1.2.2) voordat een steriele filtratie (stap 1.2.3) aan te passen.
- Breng de pH op 7,75 met een gekalibreerde pH-meter door het zorgvuldig toevoegen druppels van een 1 M NaOH-oplossing terwijl zorgvuldig roeren de oplossing.
- De osmolaliteit van de oplossing met behulp van een geijkte osmometer meten en berekenen van de hoeveelheid mannitol moest verhogen de osmolaliteit 290 mOsm/kg. Voeg de vereiste hoeveelheid mannitol en meet vervolgens de osmolaliteit van de oplossing weer te waarborgen van de correcte afstelling ervan in.
Opmerking: De hoeveelheid mannitol nodig hangt de osmolaliteit gemeten, die meestal tussen verschillende batches instellen varieert. Één molecule van mannitol is gelijk aan 1 osmotische deeltje. - Steriel-filter de oplossing van de dPBS met behulp van een 0,2 µm filter.
Opmerking: De oplossing kan bij 4 ° C gedurende ten minste 3 maanden worden bewaard.
- Bereiden van 500 mL Leibovitz (L-15)-kweekmedium zonder L-glutamine en bicarbonaat, en aan te vullen met 10 mM NaHCO3 (step 1.3.1), 4.5 mM glucose (stap 1.3.2), en 2 mM verkrijgbare glutamine (stap 1.3.3). Aanpassen van de oplossing tot 290 mOsm/kg (stap 1.3.4), steriele-filter het (stap 1.3.5), en voeg 2,5 mL van de oplossing van een penicilline-streptomycine (stap 1.3.6).
Opmerking: De oplossing kan bij 4 ° C gedurende ten minste 4 weken worden bewaard.- Toevoegen van 420 mg NaHCO3 per 500 mL gestolde voedingsbodem om tot een oplossing van 10 mM.
- Toevoegen van 405 mg van glucose per 500 mL gestolde voedingsbodem om tot een oplossing van 4.5 mM.
- Voeg 5 mL 100 x voorraad van een oplossing van glutamine in 500 mL gestolde voedingsbodem om tot een oplossing van 2 mM. Roer tot alle opgeloste stoffen zijn opgelost.
- Pas de oplossing tot 290 mOsm/kg met mannitol met behulp van een osmometer (zoals uitgevoerd in stap 1.2.2).
- Het uitvoeren van een steriele filtratie van het medium van de L-15 met behulp van een 0,2 µm filter.
- Toevoegen aan de steriele filtratie, 2,5 mL van de oplossing van een penicilline-streptomycine, overeenkomend met 50 U/mL penicilline en 50 µg/mL streptomycine.
- 50 mL van een oplossing van de trypsine met 1 mg/mL (0,1%) trypsine type DIE II-S in de gewijzigde dPBS opgelost (bereid in stap 1.2) voor te bereiden. Maak van hoeveelheden van 2 mL in steriel plastic buizen en sla deze op-20 ° C tot gebruik.
Opmerking: Hoeveelheden van 2 mL kunnen worden achtergelaten bij-20 ° C gedurende ten minste 3 maanden. - 50 mL van een trypsine remmer oplossing met behulp van 1 mg/mL (0,1%) trypsine remmer type I-S voor te bereiden, en vullen met 2 µg/mL DNase ik opgelost in de gewijzigde dPBS (bereid in stap 1.2). Maak van hoeveelheden van 2 mL in steriel plastic buizen en sla deze op-20 ° C tot gebruik.
Opmerking: Hoeveelheden van 2 mL kunnen worden achtergelaten bij-20 ° C gedurende ten minste 3 maanden.
2. voorbereiding van de apparatuur
- Bereiden glas pipetten door brand polijsten de tip voor de cel dissociatie. Tips met 2 verschillende groottecategorieën maken (een middelgrote opening van 0,6-0,8 µm en een kleine opening van 0,4-0,6 µm) door te spelen met de tijd en de afstand van de vlam terwijl het tegelijk draaien van de pipet. Plaats het glas pipettes in een schone glazen container en de autoclaaf (met behulp van de solide modus bij 105 ° C voor 45 min).
- Bereiden een polystyreen doos met ijs.
- Een plastic buis met 1,5 mL gemodificeerde dPBS (bereid in stap 1.2) om de pituitaries te dragen tijdens de dissectie en houdt het op ijs bereiden.
- Bereiden van een tube van 15 mL met 10 mL gemodificeerde dPBS (bereid in stap 1.2) en bewaar deze op ijs totdat de cel dissociatie.
- Vers bereiden of ontdooien aliquots trypsine en trypsine remmer oplossingen (bereid in stap 1.4 en 1.5) en houden hen op ijs tot gebruik.
- Stel het waterbad tot 26 ° C voordat de dissectie zodat het water tot de gewenste temperatuur voordat de chemische dissociatie van het pituitaries.
- Reinig alle dissectie tools met 70% ethanol vóór, tijdens en na gebruik, met inbegrip van fijne pincet voor de dissectie en fijne naalden en een wax plaat kunt spelden van de vis. Gebruik schone handschoenen (wijzigen en vaak schoon) gedurende de gehele procedure om een potentiële verontreiniging van de cellen te voorkomen.
3. de hypofyse dissectie en cel dissociatie
- Euthanaseren de vis door het onder te dompelen in ijs slush (0 ° C). Laat de vis in de slush ijs gedurende ten minste 1 min. om een onomkeerbare hypothermic schok.
Opmerking: Immobilisatie en evenwicht zal verloren gaan na een paar seconden. Controleer of de vis wordt volledig ondergedompeld in het ijswater en ligt niet op de top van het ijs, zoals de laatste tot verstikking leiden zal en potentiële huid in plaats van een snelle en humane hypothermic schok verbrandt. - Snel overbrengen van de vis in een net naar een wax plaat onder de Microscoop dissectie en vernietigen van de wervelkolom door een punch naald door de nek.
- Het hoofd van de vis aan de wax plaat met fijne naalden, door het invoegen van een naald in de voorkant (via de mond) en één aan elke kant van het hoofd (achter de hersenen) om te stabiliseren van het hoofd voor de dissectie pin.
- Bekijk de vis onder de Microscoop dissectie en zachtjes Schraap de weegschaal aan de bovenkant van het hoofd met fijne pincet met een gehoekte tip.
- Zorgvuldig invoegen de gehoekte tip van de fijne verlostang onder de huid van de kant van het hoofd en verwijder het dak schedel door de verlostang langzaam te bewegen in de richting van de mond, terwijl een stevige grip om de verlostang bijvoeging van het dak van de schedel.
- Afgesneden het ruggenmerg volledig pincet met een gehoekte tip.
Opmerking: De tijd is een belangrijke factor, dus werk efficiënt en nauwkeurig te beperken van de tijd bracht van de dissectie van de pituitaries totdat de cellen zijn verguld in de schotel. Na wat oefening, hypofyse dissectie moet nemen ongeveer 2-3 min per vis, waarvan slechts ongeveer 10 s nodig zijn om te kiezen van de hypofyse, wanneer de hersenen reeds is blootgesteld. - Zorgvuldig flip-over de hersenen naar de mond bloot van de hypofyse en het met een schone Tang met een rechte tip ontleden. De hypofyse overbrengen in een plastic buis met 1,5 mL bewerkt dPBS (voor details zie stap 2.3) geplaatst op ijs. Controleer het uiteinde van de verlostang onder de Microscoop om ervoor te zorgen dat de hypofyse is succesvol toegevoegd aan de buis en niets is meer op de verlostang.
Opmerking: Ontleden zoveel pituitaries als nodig, afhankelijk van het aantal cultuur gerechten die gaan gelijktijdig worden voorbereid. Als een vuistregel, ten minste 10 pituitaries uit volwassen vis per schotel te hebben van een juiste dichtheid van cellen (die afhangt van de stroomafwaartse toepassing) te berekenen. - Spin naar beneden de pituitaries in een tafelblad centrifuge voor 1-2 s bij kamertemperatuur. Verwijder de dPBS met behulp van een precisiepipet glas voorzichtig en verzorgen om te voorkomen dat het verwijderen van een pituitaries.
- Voeg 1 mL van de oplossing van de trypsine (bereid in stap 1.4) voor het wassen van de pituitaries, draai ze naar beneden in een tafelblad centrifuge voor 1-2 s en allermeest naar de vloeistof met behulp van een glazen pipet voor het toevoegen van een extra 1 mL trypsine oplossing verwijderen.
- Incubeer de buis in een waterbad bij 26 ° C gedurende 30 minuten, bij voorkeur met zacht schudden, of als alternatief, flick de buis een paar keer gedurende de incubatieperiode.
- Spin naar beneden de pituitaries in een tafelblad centrifuge voor 1-2 s bij kamertemperatuur en zorg ervoor dat alle pituitaries zijn gelegen aan de onderkant van de buis. Verwijderen van de meeste van de trypsine-oplossing met een glazen pipet en voeg 1 mL van de trypsine remmer oplossing (bereid in stap 1.5) inactivering van de trypsine en wassen van de pituitaries.
- Het verzamelen van de pituitaries aan de onderkant van de buis door het draaien van hen naar beneden in een tafelblad centrifuge voor 1-2 s bij kamertemperatuur. Verwijderen van de meeste van de vloeistof met een glazen pipet en voeg 1 mL van de trypsine remmer oplossing (bereid in stap 1.5). Plaats de buis op een waterbad bij 26 ° C gedurende 20 minuten, bij voorkeur met zacht schudden, of u kunt ook een paar keer gedurende de incubatieperiode voor inactivering van de trypsine flick de buis.
- Een 35 mm poly-d-lysine-coated cel cultuur schotel met een centrale glazen bodem door toevoeging van 2 mL van L-15 medium en dat Incubeer gedurende minstens 10 min bij 26 ° C en met 1% CO2 , zodat het de juiste temperatuur en pH bereiken kan voordat plating de cellen te laten bereiden.
Opmerking: Een kunststof cel cultuur schotel kan ook worden gebruikt. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van een schotel met een centrale glazen bodem is dat het gebied waar de cellen zijn verguld kleiner is en minder hypofyse cellen dus vereist per schotel zijn. Sommige downstream toepassingen wellicht ook een glazen bodem (dat wil zeggen, sommige beeldvormingstechnieken). - Stel de koeling centrifuge voor de 15 mL tubes op 4 ° C om deze te bereiken van de gewenste temperatuur voordat de mechanische dissociatie.
- Verzamel de pituitaries aan de onderkant van de buis door spinnen naar beneden de buis met de oplossing van de trypsine-remmers (uit stap 3.11) in een tafelblad centrifuge voor 1-2 s bij kamertemperatuur en zorg ervoor dat alle pituitaries zijn gelegen aan de onderkant van de buis alvorens zorgvuldig het verwijderen van de meeste van de trypsine remmer oplossing met behulp van een precisiepipet glas.
Opmerking: Voer alle volgende stappen van het protocol in een laminaire flow-bench (LAF) gecertificeerd voor cel werk om te voorkomen dat een besmetting van de cellen. - Voeg 1 mL ijskoud gemodificeerde dPBS (bereid in stap 2.4) tot de hypofyse weefsel stukken en zachtjes zuigen de stukjes weefsel op en neer (6-7 x) in een brand-gepolijste glazen pipet (bereid in stap 2.1).
Opmerking: Temperatuur is een essentieel aspect, dus houd alle oplossingen bij 4 ° C. Voer alle stappen op ijs indien mogelijk vanaf dit punt verder. - Draai naar beneden de weefsel stukken in een tafelblad centrifuge voor 1-2 s op kamertemperatuur en het bovenste deel van de dPBS met de gedissocieerde cellen (bijna 1 mL) zorgvuldig overbrengen in een nieuwe tube van 15 mL geplaatst op ijs. Vermijd verplaatsen de pipet naar de onderkant van de buis waar de stukjes weefsel zijn gebleven.
- Herhaal stap 3.16 – 3.17, distantiëren van de cellen in 1 mL ijskoud dPBS op een moment, totdat alle 10 mL van de dPBS wordt gebruikt. Start met het gebruik van een glazen pipet met een middelgrote opening en overschakelen op een glazen pipet met een kleinere opening eind (voor de laatste 3-4 mL van dPBS toegevoegd) van de dissociatie. Als er nog steeds zichtbare weefsel stukken aan het einde van de procedure dissociatie, verhogen de pipetteren tot ongeveer 10 x naar de 2 laatste stappen van de dPBS voor dissociatie, en ten slotte de resterende weefsel stukken achterlaten. Resuspendeer de cellen zachtjes en voorkomen dat er bubbels, omdat het leiden celbeschadiging tot kan wanneer de cellen aan het oppervlak van de belletjes hechten.
Opmerking: Dit is een kritieke stap van dit protocol en vereist een opleiding om een goed resultaat te bereiken. - Evenwicht van de buis in de centrifuge (vooraf gekoeld tot 4 ° C) en spin down de cellen bij 200 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Zorg ervoor dat ter gelegenheid van de kant van de buis waar de cel pellet zal zijn.
- Verwijder voorzichtig de buis van de centrifuge en zachtjes de bovendrijvende substantie met een glazen pipet overbrengen naar een lege 15 mL plastic buis direct na het centrifugeren. Zorg ervoor dat allermeest naar de bovendrijvende vloeistof verwijderen maar verzorgen om te voorkomen dat verliezen de kleine (vaak onzichtbare) cel-pellet.
- Zorgvuldig resuspendeer de pellet cel in 50-100 µL cultuurmedium van de L-15.
Opmerking: Bij deze stap kan de cellen tellen en/of uitvoeren van een test van de levensvatbaarheid (zoals een cel tellen in het bijzijn van trypan blauw met behulp van een hemocytometer), maar pas op dat deel van de celsuspensie gebruik voor dit doel zal lager het rendement. Vermijd het gebruik van een grote schorsing volume, zoals het zal verhogen het risico van cellen verspreiden buiten het centrum van de schotel. - Zorgvuldig druppelen de gedissocieerde cellen in het midden van de cel cultuur schotel met 2 mL van het medium van de L-15 (bereid in stap 3.13). De cellen om te zinken naar de bodem van de schotel voor ongeveer 5 min voordat hij ze naar de incubator, om te voorkomen dat de cellen verspreiden buiten de gezonken deel van de glazen bodem toestaan.
- Incubeer de schotel op 26 ° C en 1% CO2 om alle cellen te zinken grondig en hechten aan de onderkant van de schotel.
- Na 30 min, kijken naar de cellen in de Microscoop om ervoor te zorgen dat ze hebt aangesloten op de schotel van cultuur.
- Incubeer de cellen bij 26 ° C en 1% CO2blijven.
- Zorgvuldig wijzigen van de meeste (maar niet alle) het medium om 3-4 dagen.
Opmerking: Vermijd het wijzigen van het medium vaker, als het kan het verstoren van de cellen en laten losmaken van de glazen bodem. De cellen gebruiken voor de experimenten binnen een week na het zaaien van hen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol beschrijving van de voorbereiding van een cultuur van de primaire cel van medaka pituitaries en gezonde cellen die kunnen worden gehandhaafd in een cultuur voor ten minste een week. Het protocol is gebaseerd op fysiologische relevante waarden voor medaka14 en bovendien aan de hypofyse weefsel in volwassen vis, met behulp van een pH van 7,75 en een osmolaliteit van 290 mOsm/kg gedurende de gehele procedure van het weefsel oogsten tot de vergulde is geoptimaliseerd cellen in cultuur (Figuur 1 en Figuur 2).
Representatieve resultaten uit experimenten op primaire celculturen geproduceerd door dit protocol worden weergegeven in Figuur 3, Figuur 4en Figuur 5. Voor de resultaten die hier gepresenteerd, een transgene medaka lijn, waar luteinizing hormoon (Lh)-gonadotrope cellen express de groen fluorescente proteïne (GFP), benutte19was. Figuur 3 toont een representatieve veld in de schotel van een cultuur van de primaire cel vanaf dag 0 op dag 7 na het zaaien, met inbegrip van beide beelden helder-veld en fluorescent microscopie, tonen de Lh-gonadotrope GFP-uiten-cellen. Met behulp van rond de 10 volwassen medaka pituitaries per schotel meestal resulteert in een dichtheid van ongeveer 5 x 10,4 -1 x 105 cellen per schotel na het zaaien. De levensvatbaarheid van de hypofyse cellen in cultuur is berekend op basis van het totale aantal cellen in de cultuur GFP-uiten op dag 1, 3 en 7 na beplating, in vergelijking met dag 0 (Figuur 4). De grafiek wordt weergegeven in Figuur 4 geeft aan dat het aantal stervende cellen bijna constant in de tijd, met meer dan 95% van de cellen leven na 1 dag, terwijl meer dan 90% na 3 dagen nog in leven is. Hoewel er een kleine daling in de levensvatbaarheid van de cellen met de tijd, zijn de meeste cellen (ongeveer 75%) nog in leven na een week in cultuur. Elektrofysiologische opnames van GFP-uiten Lh-gonadotrope cellen (uitgevoerd zoals beschreven in Strandabø, et al.) 20 blijkt dat de cellen kunnen brand actie potentials spontaan na 4 dagen in cultuur (figuur 5A). Verder, bij stimulatie van het gonadotropin - releasing hormoon, een eerste voorbijgaande hyperpolarisatie van de celmembraan wordt gevolgd door een dramatische toename van de vuren frequentie die daarmee gepaard gaande met een depolarisatie en verhoogde duur van de actie potentieel (figuur 5B).
Figuur 1: overzicht van de hypofyse primaire cel cultuur techniek. Pituitaries zijn ontleed met een fijne Tang en overgedragen aan een plastic buis met gewijzigde dPBS op ijs (stap 1 van het protocol) tot de enzymatische vertering van de pituitaries met trypsine bij 26 ° C (stap 2), gevolgd door een inactivering met een trypsine-remmer bij 26 ° C (niet afgebeeld). De mechanische dissociatie van het enzymatisch verteerd pituitaries met een glazen pipet is zorgvuldig uitgevoerd in dPBS op ijs (stap 3), gevolgd door een centrifugeren bij 4 ° C (stap 4). Tot slot, de cel pellet wordt ontbonden in cultuurmedium en de cellen verguld uit in een cel cultuur schotel (stap 5). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Details van de hypofyse dissectie van medaka. (A) het hoofd van een geïmmobiliseerdet medaka (dorsale weergave) is vastgemaakt aan een wax plaat, en de bovenkant van het dak van de schedel wordt verwijderd met een fijne Tang bloot van de bovenkant van de hersenen. (B) het ruggenmerg is verbroken, en de hersenen omgedraaid naar de voorkant van het hoofd zodanig dat de hypofyse wordt blootgesteld. (C) de hypofyse wordt verzameld met een schoon, fijne Tang. Pijlpunt wijst naar de hypofyse in deelvenster B en C. Schaal bar = 1.000 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Medaka hypofyse primaire celculturen. Deze panelen tonen confocal resolutieafbeeldingen van een representatieve medaka hypofyse primaire celculturen op dag 0, dag 3 en dag 7 na het zaaien. Het bovenste deelvenster toont de heldere-veld microscopie beelden van een representatieve veld in de schotel, het middelste deelvenster toont fluorescent microscopie beelden van het hetzelfde gezichtsveld GFP-uiten Lh-gonadotrope cellen weer te geven, en het lagere paneel is een overlay van de twee. Schaal bar = 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: levensvatbaarheid van medaka hypofyse cellen in cultuur. Deze figuur toont de levensvatbaarheid van de hypofyse primaire celculturen gemeten op dag 0, 1, 3 en 7 na het zaaien. De nummers worden berekend met behulp van de open-source software CellProfiler V2 en zijn gebaseerd op het totale aantal GFP-uiten Lh-gonadotrope cellen per schotel op de verschillende tijdstippen, ten opzichte van tijd 0. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: elektrofysiologische opnames van hypofyse cellen. Deze panelen Toon elektrofysiologische opnames uit een cel Lh-gonadotrope GFP-uitdrukken in een cultuur van de primaire cel uitgevoerd op dag 4 na zaaien, tonen (A) een representatieve spoor van spontane actie-potentiëlen, gevolgd door (B) een stimulatie met de gonadotropin - releasing hormoon Gnrh1 voor 10 s. De Gnrh1 stimulatie induceert een tweefase antwoord met een hyperpolarisatie van de celmembraan, gevolgd door een depolarisatie en verhoogde duur van de actie potentieel (gemeten op 50% piek) van 8.9 ± 3.0 ms voordat de stimulatie tot 29.2 ± 9.9 ms na de stimulatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro cel cultuur systemen bieden krachtige hulpmiddelen voor onderzoekers een overvloed aan verschillende biologische vragen beantwoorden als gebruikt in de juiste manier1. Het is belangrijk te onthouden dat gedissocieerde cellen die verloren hun verbindingen met de naburige cellen hebben verschillende functionele eigenschappen verkregen wellicht dan ze oorspronkelijk had in vivo. Om te voorkomen dat gevaar voor verkeerde uitleg van de resultaten uit in vitro experimenten, is het belangrijk dat de aanpassing van de primaire cel cultuur procedure met de soorten en cel type van belang. Zelfs de meest gematigde aanpassingen van standaard cultuur procedures en oplossingen gebruikt zijn vaak voldoende om diep wijzigen de voorwaarden van de cultuur van een bepaald celtype.
Dit protocol beschrijft geoptimaliseerde voorwaarden voor te bereiden en primaire celculturen van volwassen medaka pituitaries, die kunnen worden bereikt door het aanpassen van de parameters zoals de temperatuur, osmolaliteit, pH en pCO2 van de oplossingen worden gebruikt, te handhaven overeen met de fysiologische omstandigheden van deze soort. De pH is temperatuur afhankelijk en moet daarom ook worden aangepast tussen verschillende soorten teleost vis woont bij verschillende temperaturen17. De osmolaliteit van alle oplossingen gebruikt tijdens cel dissociatie en kweken moet ook worden aangepast ter verbetering van de conditie van de cellen. Vooral als er een discrepantie in de osmolaliteit tussen verschillende oplossingen gebruikt tijdens de isolatie-procedure, kan het hebben verwoestende effecten op de kwaliteit van de cultuur, wat leidt tot een verminderde levensvatbaarheid (de auteurs eigen niet-gepubliceerde resultaten). Hyperosmotic oplossingen zal leiden tot de cellen om te krimpen (en vice versa), daarmee bemoeien met de membraan integriteit en membraan eiwit functie21. Een belangrijk punt in dit verband is dat parameters zoals osmolaliteit en pH meestal niet zijn gemeten noch stabiel tussen verschillende batches van commerciële buffers en Kweekmedia gebruikt in zoogdieren cultuuromstandigheden. Verschillen in osmolaliteit en pH tussen verschillende oplossingen gebruikt tijdens de isolatie-procedure moeten te allen tijde te worden vermeden.
Het slagingspercentage van dit protocol wordt verbeterd door opleiding, dus naar verwachting onderzoekers nodig enige tijd kennismaken met de verschillende stappen van de techniek. Bijvoorbeeld, is de tijd van de dissectie van de pituitaries totdat de cellen zijn verguld in de schotel omgekeerd gerelateerd aan cell gezondheid. De mechanische dissociatie van het pituitaries met behulp van een precisiepipet glas is een bijzonder belangrijke stap van het protocol en het vereist wat opleiding om een goed resultaat te bereiken. De dissociatie procedure kunt introduceren osmotische en mechanische stress, dat is schadelijk voor de cellen. De toevoeging van kleine hoeveelheden van gemodificeerde dPBS in herhaalde stappen voor de mechanische dissociatie zorgt voor een zachtere dissociatie procedure waar al gedissocieerde cellen worden overgedragen aan een nieuwe buis en links onaangeroerd, terwijl de onderzoeker blijft distantiëren extra cellen van het weefsel in een nieuw volume van dPBS.
Dit protocol is geoptimaliseerd voor volwassen medaka hypofyse cellen. Verschillende soorten, weefsels, of zelfs verschillende levensfasen van het dier binnen de dezelfde weefsel vereisen optimalisaties van de cultuuromstandigheden. Bijvoorbeeld, kunnen cellen afkomstig van onvolwassen dieren kwetsbaarder en dus gevoeliger naar apoptosis en cel dood, en dus de noodzaak om het protocol, met name naar een zachtere dissociatie-procedure kunnen vergen. De mechanische dissociatie met behulp van een precisiepipet glas is een zeer belangrijke stap van de procedure, zoals een te voorzichtig mechanische dissociatie tot een lagere winst, leiden zal terwijl een te ruw apoptosis en/of cel dood veroorzaken. Als verschillende enzymen komen in aanmerking voor dissociatie, is het mogelijk dat het gebruik van een tijd en enzym-concentratie van verschillende spijsvertering noodzakelijk. Medaka pituitaries zijn zeer klein en relatief gemakkelijk te distantiëren met behulp van het protocol beschreven. Optimalisaties voor andere soorten kunnen echter het gebruik van een mesh filter na de dissociatie te verwijderen van puin. Het succes van dit protocol ook hangt grotendeels af van het uitvoeren van de stappen onder steriele omstandigheden om te voorkomen dat de cellen besmetten.
Het aantal cellen te zaad per schotel hangt af van het aantal pituitaries aan het begin, evenals het succes van de procedure dissociatie. Er zijn ongeveer 15.000 cellen in de hypofyse van een intact volwassen medaka. Echter cellen gaan verloren tijdens de dissociatie en dit dient te worden verwerkt bij de berekening van het aantal pituitaries die nodig zijn voor een experiment. Meestal met behulp van ten minste 10 pituitaries per schotel zal resulteren in een dichtheid van rond 50.000-100.000 cellen per schotel. Bij deze dichtheid vormt aggregatie geen in een significante hoeveelheid, zelfs na 7 dagen in de cultuur. Merkbaar, aggregatie lijkt dichtheid afhankelijk, zoals de dichtere de cellen worden overgeënt, hoe meer ze lijken te aggregaat. Bepaalde procedures kunnen verlangen een dichtere cultuur en, de optimale seeding dichtheid moet worden derhalve afhankelijk van de stroomafwaartse toepassing. Dit is een belangrijk punt in overweging te nemen bij het plannen van het aantal pituitaries te gebruiken per schotel.
Meest voorkomende downstream toepassingen gebruiken primaire celculturen binnen de eerste paar dagen na het zaaien. De resultaten die hier gepresenteerd van de levensvatbaarheid van de cellen aan de elektrofysiologische opnamen, blijkt dat het mogelijk is te verkrijgen van goede resultaten van primaire celculturen opgesteld in overeenstemming met het beschreven protocol voor maximaal 1 week na het zaaien. Niettemin, culturen kunnen langer worden bewaard, en gezonde cellen nog na meer dan 2 weken in cultuur (de auteurs eigen niet-gepubliceerde resultaten) aanwezig zijn. De geoptimaliseerde voorwaarden gepresenteerd in dit protocol vergemakkelijkt fysiologisch zinvolle resultaten en kan nuttig zijn voor andere wetenschappers voorbereiding van primaire celculturen uit cellen die bij niet-zoogdieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te verklaren.
Acknowledgments
Dit project werd gefinancierd door de Noorse Universiteit van levenswetenschappen en de Raad onderzoek van Noorwegen, subsidie aantal 243811 en 244461 (aquacultuur programma). We zijn dankbaar Lourdes Carreon Tan aan de Noorse Universiteit van levenswetenschappen voor het behoud van de vis-faciliteit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (dPBS), without calcium chloride and magnesium chloride | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | D8537 | Adjust solution to pH 7.75 with 1M NaOH and 290 mOsm with mannitol. |
| L-15 medium (Leibovitz), witout L-glutamine | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | L5520 | Supplement 500 ml culture medium with 10 mM NaHCO3, 4.5 mM glucose, 2 mM Glutamax. Adjust solution to 290 mOsm with mannitol and filter solution through a 0.2 µm PES sterile filter, before adding 2.5 mL Penicillin-Streptomycin solution (see below for details). |
| NaOH | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | S5881 | Add drops of 1 M solution to increase pH of dPBS and culture medium to 7.75. |
| NaHCO3 | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | S5761 | 10 mM NaHCO3 equals 420 mg per 500 mL culture medium. |
| D-mannitol | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | 63565 | Use to increase osmolality of dPBS and culture medium. Calculate correct amount needed to reach an osmolality of 290 mOsm. |
| D-glucose | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | G5400 | 4.5 mM D-glucose equals 405 mg per 500 mL culture medium. |
| GlutaMAX Supplement | Gibco (Life Technologies, Paisley, UK) | 35050-061 | Alternative to L-glutamine, with increased stability. 2 mM Glutamax equals 5 ml of 100x stock in 500 mL culture medium. |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | P0781 | Stock solution 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL. Use 2.5 mL of stock solution in 500 mL L-15 medium (equivalent of 50 U/mL Penicillin and 50 µg/mL Streptomycin). |
| Trypsin type II-S | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | T7409 | Prepare 1 mg/mL in dPBS solution. |
| Trypsin inhibitor type I-S | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | T6522 | Prepare 1 mg/mL in dPBS solution, supplement with 2 µg/ml Dnase I (see details below). |
| Dnase I | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | D5025 | Use in trypsin inhibitor solution (see above). |
| 0.2 µm Polyethersulfone (PES) sterile filter system | Corning Inc. (Corning, NY) | 431097 | Use for sterile filtration of dPBS and L-15 medium after adjustments. |
| 35 mm cell culture dish with glass bottom, poly d-lysine coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-10-C | Can also be replaced by plastic dish, depending on downstream application. |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools (CA) | 11254-20 | Straight tip |
| Dumont #5/45 fine forceps | Fine Science Tools (CA) | 11253-25 | Angled 45° tip |
| Stereo microscope SZ61 | Olympus Corp. (Tokyo, Japan) | Use for dissection of pituitaries. | |
| Alegra X-22R Centrufuge | Beckman Coulter Inc. (Brea, CA) | With cooling option (similar to current model XR-30). | |
| Water bath | Techne (Staffordshire, UK) | Any water bath with the possibility of adjusting temperature will do. | |
| Pasteur glass pipettes | VWR (NY) | 612-1701 | Outer diameter 1.6 mm, fire polish and autoclave before use. |
| Galaxy MiniStar table centrifuge | VWR (NY) | 521-2844 | Any small table centrigue will do. |
| Fine needles/insect pins | Fine Science Tools (CA) | 26001-40 | Diameter 0.03 mm. Other fine needles can be used instead. |
| Wax plate | Custom made by adding melted paraffin wax in large petri dish. |
References
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2010).
- Ribeiro, L. P., Ahne, W. Fish cell culture: initiation of a line of pituitary cells from carp (Cyprinus carpio) to study the release of gonadotropin in vitro. In Vitro. 18 (5), 419-420 (1982).
- Ribeiro, L., Ahne, W., Lichtenberg, V. Primary culture of normal pituitary cells of carp (Cyprinus carpio) for the study of gonadotropin release. In Vitro. 19 (1), 41-45 (1983).
- Wong, A. O., Ng, S., Lee, E. K., Leung, R. C., Ho, W. K. Somatostatin inhibits (d-Arg6, Pro9-NEt) salmon gonadotropin-releasing hormone- and dopamine D1-stimulated growth hormone release from perifused pituitary cells of chinese grass carp, Ctenopharyngodon idellus. General and Comparative Endocrinology. 110 (1), 29-45 (1998).
- Chang, J. P., et al. Use of a pituitary cell dispersion method and primary culture system for the studies of gonadotropin-releasing hormone action in the goldfish, Carassius auratus. I. Initial morphological, static, and cell column perifusion studies. General and Comparative Endocrinology. 77 (2), 256-273 (1990).
- Weil, C., Hansen, P., Hyam, D. Use of pituitary cells in primary culture to study the secretion in rainbow-trout - Setting up and validating the system as assessed by its responsiveness to mammalian and salmon gonadotropin-releasing hormone. General and Comparative Endocrinology. 62 (2), 202-209 (1986).
- Montero, M., LeBelle, N., Vidal, B., Dufour, S. Primary cultures of dispersed pituitary cells from estradiol-pretreated female silver eels (Anguilla anguilla L): Immunocytochemical characterization of gonadotropic cells and stimulation of gonadotropin release. General and Comparative Endocrinology. 104 (1), 103-115 (1996).
- Xu, S. H., Cooke, I. M. Voltage-gated currents of tilapia prolactin cells. General and Comparative Endocrinology. 150 (2), 219-232 (2007).
- Lin, S. W., Ge, W. Differential regulation of gonadotropins (FSH and LH) and growth hormone (GH) by neuroendocrine, endocrine, and paracrine factors in the zebrafish-An in vitro approach. General and Comparative Endocrinology. 160 (2), 183-193 (2009).
- Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO2, and pH. General and Comparative Endocrinology. 178 (2), 206-215 (2012).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka - a model organism from the far East. Nature Reviews Genetics. 3, 53-64 (2002).
- Matsuda, M., et al. DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish. Nature. 417 (6888), 559-563 (2002).
- Kasahara, M., et al. The medaka draft genome and insights into vertebrate genome evolution. Nature. 447 (7145), 714-719 (2007).
- Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes. Zoological Letters. 2 (12), (2016).
- Waymouth, C. Osmolality of mammalian blood and of media for culture of mammalian cells. In Vitro. 6 (2), 109-127 (1970).
- Cameron, J. N. Acid-base homeostasis - past and present perspectives. Physiological Zoology. 62 (4), 845-865 (1989).
- Claiborne, J. B., Edwards, S. L., Morrison-Shetlar, A. I. Acid-base regulation in fishes: cellular and molecular mechanisms. Journal of Experimental Zoology. 293 (3), 302-319 (2002).
- Perry, S. F., Tufts, B. L. Fish respiration. , Academic Press. San Diego, CA. (1998).
- Hildahl, J., et al. Developmental tracing of luteinizing hormone β-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function. Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).
- Strandabø, R. A. U., et al. Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes). Molecular and Cellular Endocrinology. 372 (1-2), 128-139 (2013).
- Verbalis, J. G. Brain volume regulation in response to changes in osmolality. Neuroscience. 168 (4), 862-870 (2010).
