Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

לכימות הצמח חלבון מסיס והתוכן לעיכול פחמימות, באמצעות תירס (זיה מייז) כמו שיוצרו

Published: August 6, 2018 doi: 10.3791/58164
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 2, 2, 1
1Department of Entomology, Texas A&M University, 2Department of Entomology, University of Minnesota, 3Department of Entomology, University of Kentucky

Summary

הפרוטוקולים המפורטים להלן מספקים מתודולוגיה ברור ונגיש למדידת חלבון מסיס ותוכן לעיכול פחמימות (שאינן מבניות) ברקמות הצמח. היכולת לכמת macronutrients צמח שני אלה יש השלכות משמעותיות לקידום השדות של פיזיולוגיה של הצמח, אקולוגיה תזונתי, אינטראקציות צמח-הרביוור ואקולוגיה מזון-web.

Abstract

נתונים היסודות משמשים להסיק איכות הצמח כמשאב עבור אוכלי עשב. עם זאת, את הנוכחות המתמדת של הפחמן של מולקולות, הנוכחות של צמחים המכילים חנקן הגנתית תרכובות, וריאציה תלויי מין מתאמים בין חנקן וצמח תכולת החלבון כל להגביל את הדיוק של מסקנות אלה. בנוסף, המחקר התמקד צמח ו/או פיזיולוגיה הרביוור דורשים רמת הדיוק לא מושגת באמצעות מוכללת מתאמים. השיטות המובאות כאן מציעים החוקרים פרוטוקול ברור ומהיר למדידת ישירות חלבונים מסיסים צמח ופחמימות לעיכול, macronutrients צמח שני קשור קשר הדוק ביותר בביצועים פיזיולוגיים בעלי חיים. הפרוטוקולים לשלב מבחני ערכי צבע מוחלטים טוב מאופיין בצעדים עיכול צמחים ספציפיים ממוטבת כדי לספק תוצאות לשחזור ומדויק. שלנו ניתוחים של תירס מתוק שונה רקמות להראות שיש אלה מבחני הרגישות כדי לזהות את הוריאציה הצמח חלבון מסיס ותוכן לעיכול פחמימות מעבר סולמות המרחבי מרובים. אלה כוללים את ההבדלים בין-צמח על פני גדל אזורים ו מינים או סוגים שונים, כמו גם בתוך מפעל-הבדלים בסוג הרקמה והבדלים אפילו לפי מיקום בתוך רקמת אותו. שילוב של חלבון מסיס ותוכן לעיכול פחמימות עם נתונים אלמנטלים יש גם פוטנציאל לספק הזדמנויות חדשות בביולוגיה צמח להתחבר תזונה מינרלים צמח צמחים תהליכים פיזיולוגיים. ניתוחים אלה גם לעזור ליצור את חלבון מסיס והנתונים לעיכול פחמימות צריך ללמוד אקולוגיה תזונתי, אינטראקציות צמח-herbivore ו מזון-web דינמיקה, אשר בתורו יהיה לשפר פיזיולוגיה ומחקר אקולוגי.

Introduction

צמח ביומסה צורות היסוד של כמעט כל במארג המזון הארצי. צמחים לרכוש רכיבים תזונתיים מן הקרקע באמצעות מערכות השורשים שלהם, לנצל את אור השמש ברקמות בריסוס שלהם לסנתז מולקולות. בפרט, פחמן וחנקן משמשים כדי ליצור פחמימות, חלבונים (המורכב של חומצות אמינו), וכן שומנים הדרושות כדי לבנות מפעל ביומסה (יצוין כי בתוך הצמח פיזיולוגיה שהמונח "חומר מזין" מתייחס לעתים קרובות רכיבי הקרקע, כגון N, P, K, ו- S, עם זאת, לאורך כל המאמר מונח זה מתייחסים מולקולות, כגון חלבונים, פחמימות ושומנים). כאשר אוכלי עשב צורכים חומר צמחי, macronutrients הכיל ברקמות הצמח מחולקים שלהם החלקים המרכיבים אותה הינם ואז נהגת לשגע את התהליכים הפיזיולוגיים של הצרכן. בדרך זו, צמח macronutrients יש השפעה חזקה על הצרכן פיזיולוגיה יחד עם השלכות חשובות על סדר גבוהה יותר אינטראקציות אקולוגית, יחסי מזון-web.

ברחבי ממלכת החי, חלבון מסיס ופחמימות לעיכול הם macronutrients קשור קשר הדוק ביותר הישרדות, רבייה וביצועים1. יתר על כן, הרוב המכריע של בעלי חיים פעיל לווסת את צריכת אלה macronutrients שני להכיר את הדרישות הפיזיולוגיות1,2. זה נכון במיוחד עבור אוכלי חרקים המאתרות את ריכוזי סוכר וחומצות אמינו ברקמות הצמח, אשר בתורו מנחה את התנהגות האכילה. כתוצאה מכך, הצמח חלבון מסיס, תוכן לעיכול פחמימות מילא תפקיד חזק באבולוציה של אינטראקציות צמח-חרקים.

בעוד נתונים על הצמח חלבון מסיס ותוכן לעיכול פחמימות הם נדירים יחסית (אך ראה6,7,8,9,10,11), אין שנגדו נתונים זמינים על הצמח תוכן אלמנטלים (פחמן, חנקן, זרחן). במידה רבה זה כי אלמנטים לשחק תפקיד ראשי מפעל הזנה מינרלית3,4,5. אלמנטים נמדדים, מתאמים שימשו כדי לנחש את כמות חלבונים מסיסים, לעיכול פחמימות, אבל חישובים מדויקים לעיתים קשה להשיג. למשל, זה בלתי אפשרי להשתמש פחמן כמחוון של הצמח לעיכול פחמימות תוכן כי פחמן נמצא ubiquitously כל תרכובות אורגניות. מערכת יחסים חזקה קיים בין היסודות חנקן ותוכן חלבון מסיס צמח, פקטורים של המרה חנקן-כדי-חלבון כללית מנוצלים לעיתים קרובות. עם זאת, יש ראיות חזקות כי המרות חנקן-כדי-חלבון הם מאוד ספציפית12,13,14,15, שהופך את השימוש להפרעת המרה סביר אתה לא חייב. מסיבה זו, פקטורים של המרה חנקן-כדי-חלבון לעתים קרובות חוסר דיוק, במיוחד במידה הנדרשת ללימודי תזונה על אוכלי עשב. כמו כן, הנוכחות של allelochemicals צמח המכיל N, כגון אלקלואידים, glucosinolates לעיתים קרובות רעילים אוכלי עשב, יכול וחיסול המרות אלה.

כאן, אנו מציעים שני מבחני כימי למדידת ריכוז חלבונים מסיסים ופחמימות לעיכול ברקמות הצמח. מבחני אלה מוצגים בנפרד, אבל הוא הציע כי הם לשמש במקביל כדי לנתח את הדגימות באותו צמח על מנת להשיג ניתוח מקיף יותר של macronutrients הצמח. שניהם מעסיקים מתודולוגיות דומה, המורכב צעד החילוץ, ואחריו כימות דרך ספיגת. צמח מדגם הכנה גם הוא זהה עבור פרוטוקולים, ולכן קל לפעול בשני ניתוחים במשולב. השירות של מבחני אלה אינה נובעת החידוש שלהם, כפי שהם מסתמכים על בוגרים, (ברדפורד, ג'ונס, דובואה) מבחני ערכי צבע מוחלטים ומבוססת16,17,18, אבל כאן. ארגנו כמובן, easy-to-בצע פרוטוקול שמשלב שיטות אלה יותר מעורפלים מיצוי צמחים ספציפיים טכניקות17,19 על מנת להפוך את היישום של מבחני אלה נגיש יותר לאלה בתחומים הרלוונטיים-צמח.

עבור שני מבחני, צמח macronutrients קודם מחולצים פיזית על ידי הקפאה, lyophilizing, שחיקה של חומר צמחי. עבור וזמינותו חלבון מסיס, בהמשך החילוץ כימי נעשה17,19 דרך כמה סיבובים של vortexing וחימום דגימות תמיסת NaOH. וזמינותו ברדפורד ידועים, ניצול Coomassie G-250 כחול מבריק, משמש לאחר מכן לכמת חלבונים מסיסים ו polypeptides בין 3,000-5,000 Daltons16,17. Assay הזה יש מגוון זיהוי בין 1-20 חלבונים הכולל µg לכל microplate טוב או < µg 25/mL, אך האם לא מדד חינם חומצות אמינו. השלב החילוץ של וזמינותו לעיכול פחמימות מבוססת על שיטת חומצה שתדללו סמית. et al. 20 ומאפשר ניתוקה של סוכרים מסיסים, עמילן, ו fructosan – אבל מבנית לא פחמימות. שיטה כימות חומצה גופרתית-פנול נלקח דובואה. et al. 18 מודד כל מונו-, oligo-, סוכרים (וכן מתיל נגזרים). זה וזמינותו היא היכולת לכמת סוכרים מסוימים, אבל כאן אנחנו משתמשים בו כמחוון של תוכן הכולל לעיכול פחמימות (ראה סמית. et al. 20 לניתוח מפורט יותר). יחד, אלה מבחני למדוד את macronutrients שני ו"לעזור חריפה לשתול eco-פיזיולוגיה וביצועי הרביוור, ומספקת נתונים חשובים על איכות המשאב בבסיס במארג המזון הארצי. הצגת פרוטוקולים אלה מקדמת את הדור של הצמח חומר מזין נתונים (datasets) על מנת לקבל הבנה מעמיקה יותר של פיזיולוגיה של הצמח, אקולוגיה תזונתי הרביוור אינטראקציות צמח-הרביוור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. לשתול איסוף ועיבוד

  1. לאסוף ולעבד דגימות צמח
    1. לאחר איסוף דגימות צמח, הקפאה דגימות בטבילת לשתול חומר לתוך חנקן נוזלי עם מלקחיים ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס. אם הדגימות צמחים שנאספו גדולים מדי הקפאה, במהירות מגניב הדגימות באמצעות קרח יבש, העברה כדי מקפיא-80 ° C בהקדם האפשרי. התוכן חומר מזין של חומר צמחי באפשרותך לשנות לאחר רקמות מופרדים מן הצמח, לכן חשוב להקפיא דגימות צמח בהקדם האפשרי לאחר אוסף.
      התראה: חנקן נוזלי יכול לגרום כווית קור חמורה במגע עם העור. נא ודא תחבורה חנקן נוזלי במיכליות שאושרו וללבוש עיקרון השוויון הפוליטי נכונה במהלך הטיפול שלה, כולל הקפאה-כפפות, גוגל העין, מגן הפנים, סינר, חלוק מעבדה.
    2. Lyophilize חומר צמחי באמצעות מייבש ההקפאה כדי להבטיח כי הרקמות סמויה פעיל בזמן הסרת מים. יבש עד המסה של המדגם מייצבת כדי להבטיח כל המים הוסר.
    3. פעם דוגמאות יבשים, טחינה לאבקה בסדר באמצעות חיתוך או מיל. לאחסן דגימות בארון desiccating עד הניתוח.

2. Assay חלבון מסיס

  1. הכנת הדוגמא
    1. שוקלים לצאת שכפל דגימות של כל הרקמות, כ 20 מ ג כל אחד, לתוך 1.5 mL microcentrifuge פוליסטירן צינורות וצינורות תווית. אלה דוגמאות בהמשך יכונו כדוגמאות לא ידוע. לתעד את המסה המדויקת של כל דגימה, כמו מידע זה יידרש לחשב % חלבון מסיס בכל מדגם לא ידוע. השתמש microcentrifuge צינורות נעילה בשלמותם, העפעפיים ללא נעילת עשוי להיפתח במהלך השלב חימום עוקבות, וכתוצאה מכך איבוד של מדגם פתרון.
  2. Solubilize ובידוד חלבונים מדגם לא ידוע
    1. השימוש של מיקרו-pipettor, להוסיף 500 µL של 0.1 M NaOH כל שפופרת. סגירת העפעפיים בחוזקה, sonicate במשך 30 דקות. מחממים מים חמים אמבטיה 90 ° C.
      התראה: נתרן הידרוקסידי בסיס חזק, יכול לגרום לכוויות במגע עם העור. למרות 0.1 M NaOH מייצגת ריכוז נמוך, ללבוש כפפות מגן כדי למנוע גירוי בעור.
    2. מקום צינורות מתלה באמבט מים חמים במשך 15 דקות.
    3. צנטריפוגה צינורות ב 15,000 x g במשך 10 דקות. Pipette supernatant הנוזלי לתוך צינורות microcentrifuge שכותרתו החדש, באמצעות טיפ פיפטה חדש עבור כל דגימה. להוסיף 300 µL של 0.1 M NaOH הצינור המכיל את צניפה ואת צנטריפוגה שוב ב g 15,000 x במשך 10 דקות. שוב, לאסוף את הנוזל supernatant, ולשלב אותו עם שאר הנוזלים supernatant באותה דגימת זרע. זהו פוטנציאל נקודת עצירה, דוגמאות שניתן לאחסן ב 4 ° C בלילה במידת הצורך.
  3. לזרז פרוטאינים צמחיים
    1. לנטרל את ה-pH של התמיסה supernatant על-ידי הוספת µL 11 של 5.8 M HCl. אישור pH של ~ 7 בטבילת נייר לקמוס לתוך כל אחד מהפתרונות הדגימה.
      התראה: חומצה הידרוכלורית הוא חומצה מאכלת חזקים שיכולים לגרום לכוויות במגע עם העור (העור יישום או באינהלציה). בבקשה ללבוש כפפות כדי למנוע גירוי בעור בעת טיפול HCl.
    2. להוסיף 90 µL של 100% חומצת חומץ טריכלור (TCA) כל שפופרת, דגירה צינורות על קרח במשך 30 דקות. המשקעים של חלבונים יהפוך את הפתרון מ ברור אטום. אם זה לא התרחשה לאחר 30 דקות, להכניס למקרר הצינורות למשך שעה. זהו פוטנציאל נקודת עצירה, דוגמאות שניתן לאחסן ב 4 ° C בלילה במידת הצורך.
      התראה: חומצת חומץ טריכלור הוא מאכל. בבקשה ללבוש כפפות בעת טיפול כדי למנוע מגע עם העור ולמנוע אינהלציה.
    3. צנטריפוגה דגימות ב g x 13,000 ל-10 דקות ב 4 º C. הסר בזהירות TCA supernatant על ידי suctioning אותו החוצה באמצעות קו ואקום המצורפת טיפ micropipette זכוכית (יכול לשמש את הטיפ אותו מדגמים). נא לא להפריע בגדר חלבונים על ידי הימנעות שאיבה כבד ושמירה על המרחק המתאים בין עצה פיפטה בגדר.
    4. רחץ צניפה במהירות עם 100 µL של אצטון-20 ° C. שלב זה מסיר כל TCA שנותרו בגדר, אשר עלולים להפריע וזמינותו ברדפורד הבאים; עם זאת, אצטון יתחיל להתמוסס בגדר חלבון אם נשאר בקשר הרבה זמן, אז אצטון אמור להתווסף ואז במהירות מופק בגדר בתוך 5 שניות.
    5. לאפשר אצטון מתמוססות על ידי הנחת צינורות fume הוד או המקרר. . ואז, לפזר בגדר חלבונים על-ידי הוספת 1 מ"ל של 0.1 M NaOH כל שפופרת. מלא המסת בגדר עשויים לדרוש כמה סבבים של חימום מים חמים לאמבטיה, vortexing ו- sonicating.
      הערה: ככל הצינורות לשבת בשכונה fume או מקרר, ממילא כדורי, קשה יותר. הם יהיה מחדש solubilize. הוא הציע להתייבש בגדר במשך 30 דקות ולאחר מכן בדיקת נוכחות של אצטון כל 10-15 דקות עד שזה נקה אצטון התאדו (לא מעשן אצטון הם לזיהוי).
  4. לערבב פתרונות סטנדרטיים, לדלל פתרונות לדוגמה לא ידוע, לכמת את תכולת החלבון הכולל דוגמאות לא ידוע באמצעות וזמינותו ברדפורד.
    1. להכין נוגדן שור פתרונות סטנדרטיים G (IgG) על פי ריכוז המפורטים בטבלה 1 (lyophilized או פתרון מניות IgG ניתן לערבב עם מים יונים כדי להשיג בכל ריכוז). חנות סטנדרטים ב 4 º C. בצלחת 96-ובכן, להוסיף µL 160 של כל IgG סטנדרטי פתרון החל triplicate במיקום A1 של צלחת טוב (0 µg/µL ב A1, A2, A3 מיקום, 0.0125 µg/µL ב B1, B2, B3 עמדות, וכו ').
    2. להכין בתמיסה מדוללת של NaOH על-ידי הוספת µL 50 של 0.1 M NaOH µL 950 של מים מזוקקים. כפקד שלילי ריק, להוסיף 60 µL של פתרון זה הצלחת היטב שהפקידים (G1, G2, עמדות G3).
    3. להכין דילולים דגימות לא ידוע על-ידי הוספת µL 50 של כל פתרון מדגם µL 950 של מים מזוקקים בצינור microcentrifuge של 1.5 mL החדש. לאחר מכן, להוסיף 60 µL של כל מדגם מדולל לצלחת, ובכן כן, החל ממיקום H1. צלחת 96-ובכן צריך לאפשר לניתוח של 6 תקנים ריקים 1, 25 דוגמאות לא ידוע מתי לקרוא דולר. כל צלחת טוב ניתח צריך להכיל דוגמאות סטנדרטי, ריק משלו IgG.
    4. להוסיף 100 µL של מים מזוקקים כל בארות דגימות ריק ולא מוכרים. עכשיו כל אחד טוב צריך להכיל בסך 160 µL. באמצעות פיפטה של רב ערוצית (8 ערוצים), להוסיף 40 µL לחלבון G-250 כחול מבריק Coomassie לצבוע כל טוב בעמודה הראשונה של צלחת היטב. לערבב את הצבע עם הדגימות על ידי צולל מספר פעמים. חזור על כל עמודות אחרות, החלפת פיפטה טיפים כדי למנוע זיהום.
      התראה: Coomassie G-250 כחול מבריק הוא מגרה ו מגע עם העור, העיניים, או להימנע הריאות. בבקשה ללבוש כפפות כדי למנוע מגע עם העור. אם מתרחשת מגע עם העור, מוצר זה יהיה כתם.
    5. שימוש במחט פופ בועות נוכח הבארות, כפי שהם עלולים להפריע הקריאה ספקטרופוטומטרים microplate. לנקות את המחט כדי למנוע תקשורת בין בארות. תן את microplate דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    6. שימוש ספקטרופוטומטרים microplate, להקליט את הערכים ספיגת עבור כל טוב-595 nm.
    7. להקליט את ספיגת הממוצע בשביל הבארות ריק שלוש, לחסר ערך זה מכל אחת הקריאות מדגם רגיל ולא מוכרים. לאחר מכן, להקליט את ספיגת הממוצע עבור כל דגימה רגיל ולא מוכרים.
      הערה: כדי לחשב את כמות החלבונים נוכח כל דגימה לא ידוע באמצעות עקומת רגיל, זה הכי קל לנסיגה של ספיגת הממוצע של כל תקן נגד מיקרו-גרם של חלבון נוכח כל תקן, אבל אחד באפשרותך להתוות את ריכוז חלבון (ממוצע g/µL) של כל תקן אם רצוי. החישובים הבאים, לעומת זאת, מתייחסים עיקול רגיל המבוסס על מיקרו-גרם, לא ריכוזי (µg/µL).
    8. להתוות את ספיגת הממוצע של כל תקן כנגד הסכום הכולל של חלבון נוכח כל תקן טוב (טבלה 1). מתאים קו רגרסיה ליניארית על נתונים אלה ולהשתמש המשוואה לחישוב כמות חלבון (µg) בכל מדגם לא ידוע בהתבסס על ספיגת הממוצע (איור 1 א').
      הערה: מקדם המתאם (ערךr ) של הקו צריך להיות גדול מ- 0.98 ולא שגרתי ליד 0.99. הרגרסיה רגיל יהיה ספציפית כל צלחת, ומכאן הבארות מדגם לא ידוע על כל צלחת יש לנתח בנפרד.
    9. לאחר כמות החלבון הממוצעת מחושבת במשך כל דגימה לא ידוע, להשתמש במשוואה הבאה כדי לחשב את הסכום הכולל של חלבון (µg) בכל מדגם המקורי:
      Mp = (((Wp/60) x 1000) / 50) * 1000
      Mp = µg של חלבון במדגם המקורי
      Wp = µg של חלבון במדגם לא ידוע היטב
      1. לאחר מכן, השתמש במשוואה הבאה כדי לקבוע את אחוז חלבון בכל מדגם:
        Pp = (/M (Mp/1000)i) * 100
        Pp = % חלבון מדגם
        ז. אני = מסה הראשונית של המדגם (מ ג)
        הערה: במקרים מסוימים, הדגימה עלולה לעלות על הסף ספיגת העליון. אם כך, דוגמת פתרונות עשויים לדרוש עוד דילול בשלב 2.4.3.
        דילולים נוספים חייב אז להיות אחראים בחישובים הבאים. כמה מותגים קורא microplate מספקים גם תוכנות מחשב זה יחשב באופן אוטומטי את ריכוז חלבון בממוצע כל דגימה לא ידוע בהתבסס על הנתונים עיקול רגיל.

3. לעיכול פחמימות Assay

  1. הכנת הדוגמא
    1. שוקלים לצאת שכפל דגימות של כל הרקמות, כ 20 מ"ג כל, לתוך זכוכית צינורות 15 מ"ל עם כמוסות מצופה גומי בורג (100 מ מ אורך). דוגמאות אלה לאחר מכן יכונו כדוגמאות לא ידוע. תווית צינורות עם סמן עמיד למים או עם תוויות קלטת העפעפיים ולהקליט המסה המדויקת של כל דגימה, כמו מידע זה יידרש לחשב הפחמימות % בכל מדגם לא ידוע.
  2. לחלץ לעיכול פחמימות כל דגימה לא ידוע.
    1. להוסיף 1 מ"ל של 0.1 M H2כדי4 כל שפופרת, מזרקי אל צינורות בחוזקה. מניחים באמבט מים רותחים למשך שעה.
      התראה: חומצה גופרתית היא מאכל מאוד. בבקשה ללבוש כפפות, עין גוגל וסינר בעת טיפול H2אז4 לבצע שלב זה בשכונה fume.
    2. להתקרר צינורות באמבט מים פושרים. יוצקים תוכן צינור לתוך mL 1.5 שכותרתו צינורות microcentrifuge (שלא יהיה מודאג אם חלק הצמח נשאר גשמי צינורות זכוכית).
    3. צנטריפוגה צינורות ב 15,000 x g במשך 10 דקות. הסר את הנוזל supernatant עם מיקרו-pipettor, המקום לתוך צינורות microcentrifuge mL 1.5 שכותרתו החדש. צינורות יכול להיות בקירור ללילה בשלב זה. אם ממשיכים עם assay, עיין שלב 3.3.2.
  3. לערבב פתרונות סטנדרטיים, לכמת תוכן הכולל לעיכול פחמימות דגימות לא ידוע.
    1. להכין D(+) גלוקוז פתרונות סטנדרטיים עם ריכוז המפורטים בטבלה מס ' 2. להכין 6 מבחנות זכוכית עם 400 µL של כל פתרון רגיל.
    2. פיפטה 15 µL של כל דגימה לא ידוע לתוך מבחנה משלו, להוסיף µL 385 של מים מזוקקים לכל אחד עבור הנפח הכולל של 400 µL בתוך כל מבחנה. בשכונה fume, להוסיף 400 µL של 5% פנול כל מבחנה מדגם רגיל ולא מוכרים ולאחר מכן במהירות פיפטה 2 מ"ל של H מרוכז2אז4 לתוך כל שפופרת. לא לגעת, בתוכן מבחנה עם קצה פיפטה, פשוט להוסיף אל פני השטח פתרון (פיפטה ממסר פועלת באופן הטוב ביותר בשביל זה).
    3. תן צינורות תקופת דגירה של 10 דקות, ולאחר מכן בקפידה מערבולת הצינורות לערבב תוכן. תקופת דגירה של נוספים 30 דקות.
      התראה: פנול חומצה גופרתית המגרים קורוזיבית בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. כדי להגן מפני חשיפה העור, העיניים, אינהלציה, יש לבצע שלב זה בשכונה fume כימי באמצעות PPE נכונה, הכוללת: להתמודד עם משקפי מגן או עין, כפפות גומי, מעבדה סינר, מגפיים. ערבוב פנול עם חומצה גופרתית גם תוצאות תגובה אקסותרמית, אשר יביא את החצוצרות שלה הופך להיות חם.
    4. פיפטה µL 800 מדגם מהצינור כל לתוך כל אחד 3 פוליסטירן mL 1.5 מיקרו למחצה וואקום (3 טכני משכפל עבור דגימה). הגדר את ספקטרופוטומטרים לקרוא 490 nm. כיילו כדי cuvette ריקים המכיל מים מזוקקים, לפני קריאת תקנים או דגימות לא ידוע, לסירוגין לאורך כל מדגם קריאות. לרוץ cuvette בכל דרך ספקטרופוטומטרים ולהקליט את ספיגת. ממוצע על פני טכני משכפל עבור כל דגימה לא ידוע.
      הערה: במקרים מסוימים, דגימות עשוי לעלות על הסף ספיגת העליון. אם כך, צריך להיות מדולל דגימות בשלב 3.2.3. דילולים חייב גם להיות אחראים בחישובים הבאים.
    5. לחשב את ספיגת הממוצע עבור כל התקן.
      הערה: כדי לחשב את כמות הפחמימות לעיכול הכולל נוכח כל דגימה לא ידוע באמצעות עקומת רגיל, זה הכי קל לנסיגה של ספיגת הממוצע של כל תקן נגד מיקרוגרם של גלוקוז D (+) נוכח כל תקן, אבל אפשר גם להתוות את ריכוז הגלוקוז D (+) (µg/µL) של כל תקן אם רצוי. החישובים הבאים, לעומת זאת, מתייחסים עיקול רגיל המבוסס על מיקרו-גרם, לא ריכוזי (µg/µL).
    6. לחשב עקומת סטנדרטי ידי את ספיגת הממוצע כנגד הסכום הכולל של גלוקוז D (+) (µg) כל פתרון רגיל. מתאים קו רגרסיה ליניארית על נתונים אלה, ולאחר מכן השתמש במשוואה הבאה כדי לחשב את הסכום הכולל של פחמימות (µg) בכל מדגם לא ידוע:
      Mc = (((x – b)/m)/(15)) * 1000
      Mc = µg של פחמימות מדגם
      סימןx = ספיגת הממוצע של המדגם לא ידוע
      b = חיתוך-y (קו הרגרסיה סטנדרטיים)
      m = שיפוע (קו הרגרסיה סטנדרטיים)
      מקדם המתאם של הקו צריך להיות גדול יותר 0.98 ולא שגרתי ליד 0.99. לאחר מכן, השתמש במשוואה הבאה כדי לקבוע את אחוז פחמימות בכל מדגם:
      Pc = ((Mc/1000) / (Mi)) * 100
      Pc = % פחמימות
      ז. אני = מסה הראשונית של המדגם (מ ג)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להראות את התועלת של שיטות אלה, ניתחנו את חלבון מסיס והתוכן לעיכול פחמימות של ארבעה שדה אחר ורקמות פשטידת כי לשמש ברורים משאבים תזונתיים פוטנציאליים עבור אוכלי חרקים. אספנו קלחי תירס משלושה אזורים חקלאיים בארצות הברית (מינסוטה, צפון קרוליינה, טקסס), הכוללת חמישה זנים שונים של תירס מתוק (קרי, אחרים) ומגוון אחת של שדה תירס כמו outgroup. טבלה 3 מציג סיכום של הדגימות תירס, איפה הם היו שנאספו. כל הזנים שנאספו בזמן הפירעון, אך עקב הבדלים התפתחותיים בין הזנים, הם לא היו כל מה שנאסף באותו יום לאחר השתילה. עיבדנו את האוזניים לרקמות שונות על-ידי הפרדת במהירות את מקליפות (עלים ששונה להקיף קלח), בדי משי (מבריק סיבי בין קליפה גרעינים) באוזן לפני אחסון לכל רקמות ב-80 מעלות צלזיוס כפי המצוין השיטות. כל רקמה היה אז הקפוא. ברגע מיובש, נפרדנו גרגירים מן הבסיס קצה האוזן על ידי גילוח את הגרעינים מהחלק העליון שליש (tip) והתחתון שליש (בסיס) קלח. בשלב הבא, לכל רקמות היו הקרקע לאבקה בסדר גמור. אנחנו מכן נותחו קליפה, משי, עצה הקרנל ואת הבסיס הליבה דגימות רקמה עבור חלבונים מסיסים ותוכן לעיכול פחמימות לפי ההליכים המתוארים לעיל השיטות. לאור אילוצים על כמות רקמת זמין, ניתחנו את סך דוגמאות צמחים 217 חלבונים מסיסים וגם לעיכול פחמימות תוכן.

חלבון מסיס
הרצנו תשעה לוחות דגימה ספקטרופוטומטרים סך הכל, והיה באופן כללי, רגיל עקומות מקדמי מתאם גבוה (r), עם ערכי בין 0.985-1.00. איור 1 מציג את העקומה סטנדרטי שהושג עם הגבוה ביותר (א) ואת ערכי r (B) הנמוך שהפגינו ההשתנות שהבחנו מעבר צלחות. אנחנו מחושבים % חלבון מסיס עבור כל הדגימות באמצעות הדגימה הראשונית מסה (טבלה 4) ולאחר מכן נותחו הנתונים עבור הבדלים סטטיסטיים בתוכן חלבון מסיס בין אזורים, זנים וסוגים רקמות. הנתונים היו הדרגה טרנספורמציה לפגוש נורמליות הנחות בעת הצורך.

נצפו הבדלים משמעותיים חלבון מסיס תוכן בין אזורים (Welch ANOVA; F(2, 133.5) = 4.303, P = 0.015), כפי תוצאה, נתונים בכל אזור לאחר מכן נותחו בנפרד. מינסוטה דגימות הראה על אינטראקציה משמעותית בין מגוון, סוג הרקמה על תוכן חלבון מסיס (ANOVA דו-כיווני; F(3, 64) 16.51, P = < 0.001). רוב רקמות היה חלבון מסיס בדומה תוכן שני זנים, פרט הבסיס גרעינים, שבו מגוון תירס מתוק הכיל כמעט 7 פעמים הסכום בהשוואה המגוון שדה תירס. עבור מגוון שדה תירס (הפריבט/NK-3122A-EZ), קליפות, בדי משי היו דומים והיה את תכולת חלבון מסיס הנמוך לכל רקמות. גרעינים מהקצה של האוזן הייתה תכולת חלבון מסיס הגבוהה ביותר, גרעינים מבסיס של האוזן היו ביניים (איור 2 א). עבור מגוון תירס מתוק (Bicolor ההשגחה העליונה), לכל רקמות היו ברורים, עם קליפות, בדי משי המכיל את התוכן חלבון מסיס הנמוך ביותר, ואת הבסיס גרעינים הכילה ~2.5 פעמים יותר מאשר עצה גרעינים (איור 2b).

צפון קרוליינה דגימות הראה גם של אינטראקציה משמעותית בין מגוון, סוג הרקמה (ANOVA דו-כיווני; F(3, 77) = 3.33, P < 0.024). רוב רקמות הראו חלבון מסיס דומה תוכן על פני זנים, חוץ גרעינים עצה באורה של תוכן גבוהה יותר ללא - מגווןBt (מתוק G90 היברידי). Bt היו מגוון (Seedway Bt 1576) מקליפות הרקמה עם הנמוך ביותר מסיסים חלבון התוכן, ואחריו ודעתה עצה גרעינים, אשר היה עם תוכן דומה. גרעינים הבסיס היה תכולת חלבון מסיס הגבוהה ביותר אך לא היו סטטיסטית שונה מזו של עצה גרעינים (איור 2 c). במגוון הלא -Bt (מתוק G90 היברידי), לכל רקמות היו ברורים חוץ עצה, גרעינים הבסיס אשר היו דומים מבחינה סטטיסטית. מקליפות היה הנמוך ביותר מסיסים החלבון תוכן, ואחריו בדי משי, גרעינים עצה ובסיס אשר תכולת הגבוהה ביותר (איור דו-ממדי).

דוגמאות טקסס הראה הבדלים משמעותיים חלבון מסיס תוכן בין הזנים (ANOVA דו-כיווני; F(1, 76) = 12.91, P = 0.001) ורקמות (ANOVA דו-כיווני; F(3, 76) = 21.90, P < 0.001), אבל אין אינטראקציה משמעותית (ANOVA דו-כיווני; F(3, 76) = 0.436, P = 0.728). בסך הכל, המגוון bicolor (Sh2 SS2742 NAT III) הראה תוכן חלבון מסיס הממוצע נמוך יותר מאשר המגוון כסף המלכה (TRTD F1 (סו)). על פני שני זנים, מקליפות הייתה תכולת החלבון הנמוך של, ואחריו בדי משי, אז עצה, לבסס גרעינים, אשר שניהם היה דומה תכולה גבוהה (איור 2e-f).

לעיכול פחמימות
כי כל דוגמאות נותחו בעת ובעונה אחת, רצנו רק אחד עיקול רגיל. C איור 1 מראה כי מקדם המתאם היה גבוהה של 0.998. לנו לחשב את התוכן לעיכול פחמימות % עבור כל דוגמאות (טבלה 5) ולאחר מכן נותחו נתונים לגבי הבדלים סטטיסטיים בתוכן לעיכול פחמימות אזורים, זנים וסוגים רקמות. נתונים דרגה-השתנו בעת הצורך להכיר הנחות נורמליות.

היו אין הבדלים משמעותיים בין אזורים (ANOVA; F(2, 216) = 1.47, P = 0.231), אלא למען המשכיות עם הבדיקות חלבון שוב ניתחנו נתונים בכל אזור בנפרד. דוגמאות מינסוטה הראה אין הבדלים משמעותיים לעיכול פחמימות תוכן בין הזנים (ANOVA דו-כיווני; F(1, 64) = 0.00014, P = 0.990) או סוג הרקמה (ANOVA דו-כיווני; F(3, 64) = 0.818, P = 0.489). היה שם גם אין אינטראקציה משמעותית בין מגוון רקמות (ANOVA דו-כיווני; F(3, 64) = 2.26, P = 0.092). איור 2a -b מראה כי לכל רקמות הציג על תוכן הממוצע של 36.5% (± 0.53).

דוגמאות צפון קרוליינה הראו השפעה משמעותית של סוג הרקמה על תוכן לעיכול פחמימות (ANOVA דו-כיווני; F(3, 77) = 3.99, P = 0.011), אבל אין השפעה של מגוון (ANOVA דו-כיווני; F(1, 77) = 1.06, P = 0.307) או אינטראקציה (ANOVA דו-כיווני; F(3, 77) = 0.465, P = 0.708). איור 2 c -d מראה שיש משי התכנים לעיכול פחמימות הנמוך, ואחריו מקליפות, עצה גרעינים, גרעינים הבסיס. לכל רקמות היו דומים מבחינה סטטיסטית חוץ משי, גרעינים הבסיס.

דוגמאות טקסס הראה השפעה משמעותית של מגוון (ANOVA דו-כיווני; F(1, 76) = 0.834, P = 0.364) או סוג הרקמה (ANOVA דו-כיווני; F(3, 76) = 1.03, P = 0.385), אך אינטראקציה משמעותית (ANOVA דו-כיווני; F(3, 76) =  3.34, P = 0.024). אפקט זה היה בעיקר בגלל גרעינים הבסיס במגוון bicolor (Sh2 SS2742 NAT III) שהיה פחמימה לעיכול גבוהות משמעותית תוכן מאשר אלה במגוון כסף המלכה (TRTD F1 (סו)). איור 2e -f מראה כי שם היו אין הבדל סטטיסטי בין תוכן לעיכול פחמימות על פני סוגי רקמות במגוון כסף המלכה (TRTD F1 (סו)), אך היה הבדל משמעותי בין משי ורקמות הבסיס הקרנל עבור (מגוון bicolor Sh2 SS2742 NAT III).

Figure 1
איור 1. עקומות סטנדרטי עבור מבחני חומר מזין. (א) עקומת סטנדרטי עבור וזמינותו חלבון מסיס מציג את הצלחת עם מקדם המתאם הגבוה ביותר (עיקול הטובה ביותר). (ב') את עקומת סטנדרטי עבור וזמינותו חלבון מסיס מציג את הצלחת עם מקדם המתאם הנמוך (עיקול הגרוע ביותר). (ג) את עקומת סטנדרטי עבור וזמינותו לעיכול פחמימות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
באיור 2. מתכוון % חלבון מסיס ותוכן לעיכול פחמימות % עבור כל סוג הרקמה. (א) MN - Bt הפריבט/NK-3122A-EZ (שדה תירס), (B) MN - שאינם -Bt פרובידנס Bicolor, NC - Seedway (ג) Bt 1576, (ד) NC - שאינם -Bt מתוק G90 היברידית, (E) TX - Sh2 SS2742 F1 NAT III Bicolor, (נ) TX - כסף המלכה TRTD F1 (סו). חוגים מציגים נתונים גולמיים, בעוד ריבועים מציגות את ערכי מרושע. ירוק (קליפה), אדום (משי), צהוב (עצה גרעינים), וסגול (גרעינים הבסיס). המנוקד-הקווים המחברים את המקור על כל ריבוע להראות את היחס P:C עבור כל רקמות (יחס הוא השיפוע של קו המנוקד). אותיות הצג תוצאות פוסט הוק להבדלים חלבון לאורך ההבדלים העליון, פחמימות לאורך הצד, עם אותיות שונות המייצגים ערכים שונה באופן משמעותי על פני רקמות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

אג ריכוז (ug/uL) חלבון בדגימות סטנדרטי (ug)
0.0000 0
0.0125 2
0.0250 4
0.0375 6
0.0500 8
0.1000 16

טבלה 1- עיקול רגיל שהחישובים וזמינותו חלבון מסיס. כמות החלבונים בתקן כל מחושבת על-ידי לקיחת הריכוז של כל תקן הכפלתו לפי הסכום של פתרון רגיל מכל קידוח (160 µL).

D (+) גלוקוז בריכוז (ug/uL) D (+) גלוקוז בדגימות סטנדרטי (ug)
0.0000 0
0.0375 15
0.0750 30
0.1125 45
0.1500 60
0.1875 75

בטבלה 2. חישוב עיקול רגיל עבור assay לעיכול פחמימות. כמות הגלוקוז בתקן כל מחושבת על-ידי לקיחת הריכוז של כל תקן הכפלתו לפי הסכום של פתרון רגיל בכל מבחנה (400 µL).

אזור מגוון מיקום N
מינסוטה Bt הפריבט/NK-3122A-EZ (שדה תירס) Rosemount, MN (44.7070,-93.1073) 10
הלא - Bt פרובידנס Bicolor Rosemount, MN (44.7070,-93.1073) 10
צפון קרוליינה הלא Bt מתוק G90 היברידית רוקי הר, NC (35.8918,-77.6780) 10
Seedway Bt 1576 Edenton, צפון קרוליינה (36.1758,-76.7057) 10
טקסס Sh2 SS2742 F1 NAT השלישי Bicolor אילת (33.6935,-101.8249) 10
סילבר קווין TRTD F1 (סו) אילת (33.6935,-101.8249) 10

בטבלה 3. סיכום של מיקום הדגימה תירס, זנים. עבור כל צירוף אזור ומגוון, שנאספו 10 האוזניים ואת רקמות ארבע נותחו: קליפה, בדי משי, עצה גרעינים, גרעינים הבסיס.

אזור מגוון % חלבון מסיס
קליפה בדי משי עצה ליבה הבסיס ליבה
מינסוטה Bt הפריבט/NK-3122A-EZ (שדה תירס) 3.29 ± 0.38 4.57 ± 1.27 14.74 ± 1.54 7.07 ± 0.84
הלא - Bt פרובידנס Bicolor 3.35 ± 0.58 6.71 ± 0.70 17.87 ± 3.85 48.41 ± 2.85
צפון קרוליינה הלא Bt מתוק G90 היברידית 2.90 ± 0.60 6.97 ± 0.63 12.95 ± 0.86 ולגובה 12.23 ± 0.83
Seedway Bt 1576 5.48 ± 0.73 9.08 ± 0.62 10.75 ± 0.93 12.76 ± 1.16
טקסס Sh2 SS2742 F1 NAT השלישי Bicolor 7.74 ± 1.03 12.15 ± 0.63 14.79 ± 0.69 14.88 ± 0.48
סילבר קווין TRTD F1 (סו) 6.06 ± 1.05 8.17 ± 0.79 12.95 ± 1.19 12.32 ± 1.23

בטבלה 4. מתכוון ערכי חלבון עבור כל סוג אזור מגוון, רקמות. כלומר אחוזים (על-ידי המסה יבש) מוצגים ± 1 SE.

אזור מגוון % לעיכול פחמימות
קליפה בדי משי עצה ליבה הבסיס ליבה
מינסוטה Bt הפריבט/NK-3122A-EZ (שדה תירס) 37.55 ± 0.88 32.31 ± 1.38 36.79 ± 1.60 38.66 ± 1.57
הלא - Bt פרובידנס Bicolor 37.30 ± 0.82 37.31 ± 2.30 35.80 ± 1.77 34.83 ± 1.37
צפון קרוליינה הלא Bt מתוק G90 היברידית 35.79 ± 0.81 35.28 ± 1.17 36.13 ± 0.91 39.47 ± 1.18
Seedway Bt 1576 35.75 ± 0.58 34.91 ± 0.76 35.73 ± 1.35 37.29 ± 1.13
טקסס Sh2 SS2742 F1 NAT השלישי Bicolor 35.55 ± 0.87 33.40 ± 1.10 34.85 ± 1.01 39.14 ± 1.22
סילבר קווין TRTD F1 (סו) 34.63 ± 1.13 33.42 ± 2.33 35.16 ± 1.16 33.93 ± 1.03

טבלה 5. כלומר פחמימות ערכים עבור כל סוג אזור מגוון, רקמות. כלומר אחוזים (על-ידי המסה יבש) מוצגים ± 1 SE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

על ידי שילוב מבחני ערכי צבע מוחלטים ומבוססת עם מיצוי הצמח ספציפי יעיל פרוטוקולים, מבחני המודגמות כאן מספקות שיטה הגיונית ומדויק למדידת הצמח חלבון מסיס ותוכן לעיכול פחמימות. התוצאות שלנו באמצעות תירס כפי דוגמה מאליזבת מדגים כיצד ניתן להשתמש בפרוטוקולים אלה כדי לקבל מידות מדויקות מעבר סולמות שונים מרחבי רלוונטי מבחינה ביולוגית. לדוגמה, היינו מסוגלים לזהות הבדלים הצמח חלבון מסיס ותוכן לעיכול פחמימות בין סוגי רקמות הגיאוגרפי של אזורים, זנים (או אחרים), רקמות אפילו במרחב הפרדה. שני מבחני יכול להיעשות שימוש נפוץ ציוד מעבדה, ריאגנטים, הדורשות מיומנויות מעבדה בסיסיות בלבד, ולא ניתן לנתח מספר יחסית גדול של דוגמאות (50-75) בתוך פרק זמן קצר.

אמנם יחסית קל לביצוע, כמה צעדים יותר קריטי יותר מאחרים, אם נעשה בצורה לא נכונה יכול להגביל את הדיוק של התוצאות. לדוגמה, זה הכרחי צמח חומרי מטופלות כראוי בשלב הדגימה. רקמות הצמח גזור אפילו יישאר פעיל סמויה עד חשוף לטמפרטורה קטלני, במהלך צמח תקופתי זה חומר מזין תוכן יכול לשנות. כתוצאה מכך, פרקי זמן ארוכים בין הצמח דגימה ועיבוד קפוא (גם על-ידי אחסון N או במקפיא נוזלי) שיכולים להגביר את הסיכוי כי מדגם צמח חומר מזין תוכן שלא לשקף את התוכן שהיה קיים בזמנו של הדגימה.

צעדים 2.3.3-2.3.5 בפרוטוקול חלבון חשובים במיוחד עבור תוצאות מוצלחות, כמו השלבים להתמודד עם החלבונים precipitated. יש לנקוט כדי להימנע מאובדן מכל בגדר חלבון כאשר לשאוב את TCA supernatant מן הצינורות microcentrifuge, מכיוון שביצוע תגרום underestimation של תכולת החלבון. חשוב גם כאשר הכביסה בגדר חלבון עם אצטון לעשות זאת מהר מאוד. אצטון יכול לבזות בגדר אם נשאר בקשר יותר ממספר שניות. אנו ממליצים להגביל את הקשר בין אצטון בגדר פחות מ 5 שניות. לבסוף, כאשר ייבוש בגדר, חשוב לדאוג רק לאפשר מספיק זמן אצטון מתמוססות. אם נשאר בגדר להתייבש במשך זמן רב מדי, הוא הופך להיות קשה מאוד resuspend של NaOH. אנו מציעים ייבוש בגדר במשך 30 דקות, ואז בדיקת נוכחות של אצטון, או על ידי התבוננות חזותית נוזל בצינור או על ידי בקפידה מזהה הריח של אצטון האדים. להמשיך לבדוק את צניפה כל 10-15 דקות עד אצטון התאדו.

כפי שמתואר בספר ברדפורד 197616, השלבים כימות באמצעות צבע מבריק Coomassie G-250 כחול לאפשר רגישות גבוהה, עם סטיית תקן של µg רק 5 חלבונים/mL חלבון גבוהה-לצבוע מורכבות ויציבות הפרעה מוגבלת על ידי תרכובות שאינן-חלבון. Assay הזה יש מגוון זיהוי בין 1-20 חלבונים הכולל µg לכל microplate היטב (ריכוז נמוך assay) או מספר מרבי של 25 µg/mL; עם זאת, כל הריכוז שחורג ברמה הגבוהה ביותר צריכה להיות מדולל וניתח מחדש עבור התוצאות המדויקות ביותר (הפרוטוקול מייצרת עודף של פתרון למקרה כזה דילולים, שאריץ ניתוח הכרחי). יש דעה קדומה על לצבוע לאיגוד מעדיפים חומצות אמינו בסיסיות, כגון ארגינין, חומצה אמינו ארומטיות משקעים; עם זאת, וזמינותו ברדפורד נשאר השיטה הכי מדויק, קל לשימוש עבור כימות חלבון הכולל בדגימות מעורבת.

וזמינותו לעיכול פחמימות היא שיטה מהירה, חסכונית ופשוטה לכימות תנועת צמח saccharides שיתופם של פחמימות מבניים (כגון תאית), אשר לעיכול על ידי רוב אוכלי עשב. הפעולות הבעייתי ביותר מבחני פחמימות הם צעדים 3.2.1 3.3.2-3.3.4. כאן, חיוני לשמירה על צינורות זקוף וכדי לחזק את screwcaps היטב כאשר רותח, כמו חדירת מים לדלל דגימות ומשפיעים כימות מדויק. כמו כן, טיפול יש לנקוט בעת עבודה עם פנול, מרוכז חומצה גופרתית, שתיהן הן קורוזיבית מאוד. יצוין, כי אנו עו ד הקלטה מדגם ספיגת 490 nm, אשר את ספיגת המרבי עבור hexoses, אבל לא אחרים סוכרים, כגון pentoses, חומצות uronic אשר יש ספיגת המרבי של 480 ננומטר20,21. לתערובות סוכר בדגימות צמח, 490 nm מספק של אורך גל המתאים עבור לכימות הכוללת פחמימות תוכן22,23,24, אבל ראו ניתוח מפורט יותר של סוכרים שונים20, 21. זה צריך להיות גם ציין את. Masuko, et al. 23 מספק שיטה יעילה microplate לניתוח פחמימות חומצה גופרתית-פנול.

שיטה נוספת ראויה לציון עבור הערכת צמח מזין תוכן25,26,27 הוא ספקטרוסקופיית אינפרא אדום (NIRS). טכנולוגיה NIRS נעשה שימוש נרחב בחקלאית וייצור מזון. טכניקה חלופית זו היא לא פולשנית, גמישה, לוקח הרבה פחות זמן מעורב בשום שיטה וכימיה רטובה, יכול להיות מיושם בקני מידה שונים מבחינה נופית ל כלי בודד של רקמת הצמח. טכניקה זו מודד חומרים מזינים בעקיפין ומסתמך על מדידות וכימיה רטובה מדויק של הכימיקל צמח עניין לצורך כיול. בשיטות המתוארות בזאת ולכן יהיה מקום הקריטי בעתיד של קולחין מזין, כיול מבוסס על חומר מזין מסיסים ובחלקם לעיכול כימות של שאינה מוטה על ידי המחליפים אלמנטלים שאינם התזונתי.

השיטות הציג למדידת הצמח חלבון מסיס, תוכן לעיכול פחמימות יש השלכות משמעותיות על המדעים ביולוגיות וסביבתיות. למרות שפע של מידע על הרכב היסודות של רקמות הצמח, מידע על הצמח חומר מזין תוכן חסר קשות. לנוכח המגבלות הקיימות בהתאמת אמצעי היסודות עם חומר מזין תוכן ומתן וידוע הקשר החזק בין צמחים תהליכים אקולוגיים תוכן תזונה וסדר גבוהים יותר, קבלת נתונים מסוג זה הוא חיוני עבור קידום בתחומי המזון-web dynamics11,28,29,30אינטראקציות צמח-הרביוור, אקולוגיה תזונתי, פיזיולוגיה של הצמח. . זוהי תקוותנו כי מתן מתודולוגיה ברור ונגיש למדידת הצמח חלבון מסיס ותוכן לעיכול פחמימות יעודד חוקרים כדי לאסוף לשלב סוג זה של נתונים למחקר עתידי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

תודה לכל השותפים שלנו, מי שעזרו עם אוספים שדה תירס מתוק, כולל דומיניק Reisig מוט דן-צפון קרוליינה סטייט, ואת פאט פורטר-טקסס A & M באוניברסיטת, אילת. תודה ל clissold ב פיונה שעזרת כדי למטב את הפרוטוקולים ולסיפוק עריכות כתב היד הזה. עבודה זו נתמך בחלקה על ידי טקסס A & M ג Everette Salyer אחוות (המחלקה לאנטומולוגיה) והתוכנית ביוטכנולוגיה הסיכון הערכת מענק תחרותי מענק מס 2015-33522-24099 של מחלקת החקלאות של ארצות הברית (מוענק גז, STB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
microplate reader (spectrophotometer) Bio-Rad Model 680 XR
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent concentrate Bio-Rad #5000006 450mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Simpson, S. J., Raubenheimer, D. The Nature of Nutrition: A Unifying Framework from Animal Adapation to Human Obesity. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (2012).
  2. Behmer, S. T. Insect herbivore nutrient regulation. Annual Review of Entomology. 54, 165-187 (2009).
  3. Epstein, E. Mineral nutrition of plants: mechanisms of uptake and transport. Annual Review of Plant Physiology. 7 (1), 1-24 (1956).
  4. Chapin, F. S. III The mineral nutrition of wild plants. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 11 (1), 233-260 (1980).
  5. Marschner, H. Marschner's Mineral Nutrition of Higher Plants. , Academic press. London, UK. (1956).
  6. Stieger, P. A., Feller, U. Senescence and protein remobilization in leaves of maturing wheat plants grown on waterlogged soil. Plant and Soil. 166, 173-179 (1994).
  7. Li, R., Volenec, J. J., Joern, B. C., Cunningham, S. M. Seasonal changes in nonstructural carbohydrates, protein, and macronutrients in roots of alfalfa, red clover, sweetclover, and birdsfoot trefoil. Crop Science. 36, 617-623 (1996).
  8. Sánchez, E., Rivero, R. M., Ruiz, J. M., Romero, L. Changes in biomass, enzymatic activity and protein concentration in roots and leaves of green bean plants (Phaseolus vulgaris L. cv. Strike) under high NH4NO3 application rates. Scientia Horticulturae. 99, 237-248 (2004).
  9. Lenhart, P. A., Eubanks, M. D., Behmer, S. T. Water stress in grasslands: Dynamic responses of plants and insect herbivores. Oikos. 124, 381-390 (2015).
  10. Machado, A. R., Arce, C. C. M., Ferrieri, A. P., Baldwin, I. T., Erb, M. Jasmonate-dependent depletion of soluble sugars compromises plant resistance to Manduca sexta. New Phytologist. 207, 91-105 (2015).
  11. Deans, C. A., Behmer, S. T., Fiene, J., Sword, G. A. Spatio-temporal, genotypic, and environmental effects of plant soluble protein and digestible carbohydrate content: implications for insect herbivores with cotton as an exemplar. Journal of Chemical Ecology. 42 (11), 1151-1163 (2016).
  12. Boisen, S., Bech-Andersen, S., Eggum, B. O. A critical view of the conversion factor 6.25 from total nitrogen to protein. Acta Agriculturae Scandinavica. 37, 299-304 (1987).
  13. Seed protein contents and nitrogen-to-protein conversion factors for some uncultivated tropical plant seeds. Food Chemistry. Ezeagu, I. E., Petzke, J. K., Metges, C. C., Akinsoyinu, A. O., Ologhobo, A. D. 78, 105-109 (2002).
  14. Izhaki, I. Influence of nonprotein nitrogen on estimation of protein from total nitrogen in fleshy fruits. Journal of Chemical Ecology. 19, 2605-2615 (1993).
  15. Mossé, J. Nitrogen to protein conversion factor for ten cereals and six legume or oilseeds. A reappraisal of its definition and determination. Variation according to species and seed protein content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 38, 18-24 (1990).
  16. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  17. Jones, C. G., Hare, J. D., Compton, S. J. Measuring plant protein with the Bradford assay. Journal of Chemical Ecology. 15 (3), 979-992 (1989).
  18. Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colormetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Biochemistry. 28, 350-358 (1956).
  19. Clissold, F. J., Sanson, G. D., Read, J. The paradoxical effects of nutrient ratios and supply rates on an outbreaking insect herbivore, the Australian plague locust. Journal of Animal Ecology. 75, 1000-1013 (2006).
  20. Smith, D., Paulsen, G. M., Raguse, C. A. Extraction of total available carbohydrates from grass and legume tissue. Plant Physiology. 39 (6), 960-962 (1964).
  21. Cui, S. W. Food carbohydrates: Chemistry, physical properties, and applications. , CRC Press. Boca Raton, FL, USA. (2005).
  22. Chow, P. S., Landhäusser, S. M. A method for routine measurements of total sugar and starch content in woody plant tissues. Tree Physiology. 24 (10), 1129-1136 (2004).
  23. Masuko, T., Minami, A., Iwasaki, N., Majima, T., Nishimura, S. I., Lee, Y. C. Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format. Analytical Biochemistry. 339 (1), 69-72 (2005).
  24. Foley, W. J., McIlwee, A., Lawler, I., Aragones, L., Woolnough, A. P., Berding, N. Ecological applications of near infrared reflectance spectroscopy- a tool for rapid, cost-effective prediction of the composition of plant and animal tissues and aspects of animal performance. Oecologia. 116 (3), 292-305 (1998).
  25. Kokaly, R. F. Investigating a physical basis for spectroscopic estimates of leaf nitrogen concentration. Remote Sensing of Environment. 75 (2), 153-161 (2001).
  26. Schulz, H., Baranska, M. Identification and quantification of valuable plant substances by IR and Raman spectroscopy. Vibrational Spectroscopy. 43 (1), 13-25 (2007).
  27. Cozzolino, D., Morón, A. The potential of near-infrared reflectance spectroscopy to analyse soil chemical and physical characteristics. The Journal of Agricultural Science. 140, 65-71 (2003).
  28. Simpson, S. J., Sword, G. A., Lorch, P. D., Couzin, I. D. Cannibal crickets on a forced march for protein and salt. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4152-4156 (2006).
  29. Lihoreau, M., Buhl, J., Sword, G. A., Raubenheimer, D., Simpson, S. J. Nutritional ecology beyond the individual: a conceptual framework for integrating nutrition and social interactions. Ecology Letters. 18 (3), 273-286 (2015).
  30. Deans, C. A., Behmer, S. T., Tessnow, A., Tamez-Guerra, P., Pusztai-Carey, M., Sword, G. A. Nutrition affects insect susceptibility to Bt. Scientific Reports. 7, 39705 (2017).

Tags

Macronutrients מדעי גיליון 138 איכות הסביבה תזונה herbivory חקלאות מסגרת גיאומטרית חרקים פיזיולוגיה
לכימות הצמח חלבון מסיס והתוכן לעיכול פחמימות, באמצעות תירס (<em>זיה מייז</em>) כמו שיוצרו
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Deans, C. A., Sword, G. A., Lenhart, … More

Deans, C. A., Sword, G. A., Lenhart, P. A., Burkness, E., Hutchison, W. D., Behmer, S. T. Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn (Zea mays) As an Exemplar. J. Vis. Exp. (138), e58164, doi:10.3791/58164 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter