Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Количественная оценка завод растворимого белка и усваиваемых углеводов контента, используя кукурузы (Zea mays) как образец

Published: August 6, 2018 doi: 10.3791/58164
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 2, 2, 1
1Department of Entomology, Texas A&M University, 2Department of Entomology, University of Minnesota, 3Department of Entomology, University of Kentucky

Summary

Протоколы, описанные здесь обеспечивают четкий и доступный методологии для измерения растворимого белка и легкоусвояемые углеводы (неструктурных) содержание в тканях растений. Возможность количественной оценки этих двух растений макро имеет существенные последствия для продвижения вперед в области физиологии растений, питания Экология, взаимодействия растений травоядных и веб пищевой экологии.

Abstract

Элементаль данные обычно используются для выведения растений качество как ресурс для травоядных животных. Однако повсеместное распространение углерода в биомолекулы, присутствие азотсодержащих соединений завод оборонительных и различия в вегетационных корреляции между азотом и растений все содержание белка ограничивают точность этих выводов. Кроме того исследования сосредоточены на завод и/или травоядных физиологии требуют, что уровень точности, что не достигается с помощью обобщенной корреляции. Представленные здесь методы предложить исследователи четкое и быстрое протокол для измерения непосредственно завод растворимые белки и усваиваемые углеводы, макроэлементы два завода, наиболее тесно связана с физиологическое состояние животных. Протоколы сочетают хорошо характеризуется колориметрические анализов с оптимизированной пищеварение завод конкретные шаги предоставлять точные и воспроизводимые результаты. Наш анализ различных сахарная кукуруза, что ткани показывают, что эти анализы чувствительности, чтобы обнаружить различия в завод растворимого белка и содержанием усваиваемых углеводов через несколько пространственных масштабах. Эти включают различия между завод через растущих регионов и видов растений и сортов, а также в рамках завода, различия в типе ткани и даже позиционные различия внутри же ткани. Сочетание растворимого белка и содержанием усваиваемых углеводов с элементарного данных также имеет потенциал, чтобы обеспечить новые возможности для подключения минерального питания растений с завода физиологических процессов в биологии растений. Эти анализы также помогают генерировать растворимого белка и данных усваиваемых углеводов, необходимых для изучения питания Экология, взаимодействия растений травоядных и веб-продуктов питания динамика, которая в свою очередь укрепит физиологии и экологических исследований.

Introduction

Биомассы растений является основой практически всех наземных пищевых цепях. Растения приобретают элементов питания из почвы через их корни системы и использовать солнечный свет в их внекорневая тканей для синтеза биомолекул. В частности углерода и азота используются для создания углеводы, белки (в составе аминокислот), и липиды, которые необходимы для создания биомассы растений (следует отметить, что в физиологии термин «макро» часто относится к почвы элементы, такие как N, растений P, K и S, однако, в этом документе этот термин будет относиться к биомолекул, такие как белки, углеводы и липиды). Когда травоядных потреблять растительного материала, макроэлементы, содержащиеся в тканях растений разбита на их составные части и затем используется для привода физиологические процессы потребителя. Таким образом завод макроэлементов имеют сильное влияние на потребителей физиологии наряду с важные последствия для высшего порядка экологических взаимодействий и динамика веб еда.

Через животного царства растворимого белка и легкоусвояемые углеводы являются макроэлементы, наиболее тесно связана с выживания, воспроизводства и производительности1. Кроме того большинство животных активно регулировать свое потребление этих двух макроэлементов для удовлетворения их физиологические требования1,2. Это особенно верно для насекомых травоядные животные, которые обнаруживают концентрации сахаров и аминокислот в тканях растений, который в свою очередь направляет кормления поведение. В результате растение растворимого белка и усваиваемых углеводов сыграла заметную роль в развитии растений насекомое взаимодействий.

Хотя данные на завод растворимого белка и содержанием усваиваемых углеводов являются относительно редкими (но см6,,78,9,10,11), существует преобладание имеющиеся данные о Элементаль содержание растений (углерод, азот и фосфор). Во многом это потому, что элементы играют главную роль в завод минерального питания3,4,5. Там, где элементы измеряются, корреляции были использованы для экстраполирования количества растворимого белка и легкоусвояемые углеводы, но зачастую трудно получить точные расчеты. Например невозможно использовать углерода как индикатор растений усваиваемых углеводов, потому что углерода повсеместно присутствует во всех органических соединений. Сильнее связь существует между элементарный азот и содержание растворимого белка растений, и часто используются обобщенные коэффициенты пересчета азота и белков. Однако есть убедительные доказательства того, что преобразования азота и белков являются весьма вегетационных12,13,14,15, делая использование обобщенных преобразования вероятно неточными. Из-за этого коэффициенты пересчета азота белок часто не хватает точности, особенно в той степени, которая требуется для питания исследований на травоядных животных. Кроме того присутствие N-содержащих растений allelochemicals, такие как алкалоиды и глюкозинолатов, часто являются токсичными для травоядных животных, можно смешивать эти преобразования.

Здесь мы предлагаем два химических анализов для измерения концентрации растворимые белки и легкоусвояемые углеводы в тканях растений. Отдельно представлены эти анализы, но предполагается, что они одновременно использоваться для анализа же образцы растений для того, чтобы достичь более всесторонний анализ растений макро. Оба используют одинаковые методологии, состоящий из извлечения шаг, следуют количественной оценки через поглощения. Подготовки образцов растений также является одинаковой для обоих протоколов, что делает его легко запустить оба анализы в тандеме. Полезность этих анализов не проистекают из их новизны, как они полагаются на старых, (Брэдфорд, Джонс, Дюбуа) устоявшихся колориметрические анализов16,17,18, но здесь мы организовали четкие и easy-to последующие Протокол, который сочетает в себе эти методы более неясными извлечения завода специфические методы17,19 для того, чтобы сделать более доступными для тех, кто в завод соответствующих областях применения этих анализов.

Для обоих анализов завод макроэлементы сначала извлекаются физически, замораживания, лиофилизации и шлифовка растительного материала. Далее для assay растворимого белка, химического извлечения делается19 17,через несколько раундов vortexing и нагрева образцов в растворе NaOH. Хорошо известные assay Брадфорд, используя Кумасси блестящий синий G-250, затем используется для количественной оценки растворимые белки и полипептиды между 3000-5000 Дальтон16,17. Этот assay имеет дальность обнаружения между 1-20 мкг Гербера за Гонав хорошо или < 25 мкг/мл, но это не мера свободные амино кислоты. Извлечения шаг усваиваемых углеводов assay основан на разбавленные кислоты методом Smith et al. 20 и позволяет для изоляции растворимых сахаров, крахмал и fructosan – но не структурный углеводов. Фенол серная кислота количественного определения метода берется из Дюбуа и др. 18 и мер всех моно-, олиго- и полисахаридов (а также производные метил). Этот assay может дать количественную оценку конкретных сахара, но здесь мы используем его в качестве показателя общего усваиваемых углеводов (см. Смит и др. 20 для более детального анализа). Вместе эти анализы измерить два макроэлементы, которые сильно привязаны к заводе эко физиологии и травоядных производительность, предоставляя важные данные по качества ресурсов на базе наземных трофических. Представляя эти протоколы способствует поколения растений макро наборов данных для того чтобы получить более глубокое понимание физиологии растений, травоядных питания Экология и взаимодействия растений-травоядное животное.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. сбор и обработка растений

  1. Собирать и обрабатывать образцов растений
    1. После сбора образцов растений, флэш замораживание образцов путем погружения в жидкий азот растительного материала с щипцами и хранить при температуре-80 ° C. Если завод пробы слишком велики для флэш замораживание, быстро охладить примеров с использованием сухого льда и передачи в морозильной камере-80 ° C как можно скорее. После тканей отделены от завода, поэтому очень важно для замораживания образцы растений как можно скорее после коллекции можно изменить содержание макро растительного материала.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Жидкий азот может вызвать тяжелые обморожения при контакте с кожей. Пожалуйста убедитесь, что для транспортировки жидкого азота в утвержденных контейнерах и носить надлежащего СИЗ во время его обработки, включая крио перчатки, googles глаз, защитная маска, фартук и халате.
    2. Lyophilize растительного сырья с использованием замораживания сушилка для обеспечения того, чтобы ткани метаболически неактивны в то время как вода удаляется. Сухой до массы образца стабилизирует обеспечить вся вода была удалена.
    3. Однажды образцы сухой, измельчить в порошок точильщика или мельница. Хранить образцы в шкафу высушивания до анализа.

2. растворимого белка Assay

  1. Подготовка образца
    1. Весят реплицировать образцы каждой ткани, примерно 20 мг каждая, в 1,5 мл полистирола microcentrifuge трубы и трубы метки. Эти образцы будут впоследствии называться неизвестных образцов. Запишите точные массы каждого образца, как эта информация потребуется для расчета % растворимого белка в каждом неизвестных образцов. Используйте трубы microcentrifuge с блокировки крышки, как неблокирующих крышки может открыть на этапе последующих Отопление, что приводит к потере образца решения.
  2. Солюбилизировать последнего и изолировать неизвестный образец белки
    1. С помощью микро дозаторов, добавьте 500 мкл 0,1 М NaOH в каждую пробирку. Плотно закрыть крышками и sonicate за 30 минут. Подогрева горячей воды ванны 90 ° C.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Гидроксид натрия является мощной базой и может вызвать ожоги при попадании на кожу. Хотя 0,1 М NaOH представляет низкой концентрации, надевайте защитные перчатки во избежание раздражения кожи.
    2. Место труб в стойку на горячей водяной бане 15 минут.
    3. Центрифуга трубы на 15000 x g за 10 минут. Пипетка супернатанта жидкости в новые трубки помечены microcentrifuge, используя новый наконечник пипетки для каждого образца. Добавьте 300 мкл 0,1 М NaOH в пробирку, содержащую гранул и центрифуги снова на 15000 x g 10 минут. Опять же собирать супернатанта жидкости и объединить его с другими супернатанта жидкость из того же образца. Это потенциал, остановочный пункт, и образцы могут храниться при температуре 4 ° C на ночь при необходимости.
  3. Осадок растительных белков
    1. Нейтрализации рН раствора супернатанта, добавив 11 мкл 5,8 М HCl. подтверждение рН ~ 7 путем погружения лакмусовая бумага в каждого образца решения.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Соляная кислота является сильным коррозионные кислоты, которые могут вызвать ожоги при попадании на кожу (приложения кожи или ингаляции). Пожалуйста, наденьте перчатки для предотвращения раздражения кожи при обработке HCl.
    2. Мкл 90 100% трихлоруксусной кислоты (TCA) к каждой пробке и Инкубируйте 30 минут трубки на льду. Высыпание белков станет решение от прозрачного непрозрачным. Если этого не происходит после 30 минут, охладите трубы на 1 час. Это потенциал, остановочный пункт, и образцы могут храниться при температуре 4 ° C на ночь при необходимости.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Трихлоруксусная кислота вызывает коррозию. Пожалуйста, носите перчатки при обработке для предотвращения контакта с кожей и избегать вдыхания.
    3. Центрифуга образцы на 13 000 x g 10 минут при 4 ° C. Тщательно удалите супернатант TCA, аспирации с помощью вакуумной линией к тонкой микропипеткой кончик стекла (тот же Совет может использоваться через образцы). Не беспокоить белка Пелле, избегая тяжелых всасывания и сохраняя соответствующее расстояние между наконечник пипетки и Пелле.
    4. Помойте лепешка быстро с 100 мкл-20 ° C ацетона. Этот шаг удаляет любые оставшиеся TCA из Пелле, который может мешать последующим assay Брадфорд; Однако ацетон начнут распустить белка Пелле, если оставить в контакт слишком долго, так что ацетон следует добавить быстро, извлеченные из гранул в течение 5 секунд.
    5. Разрешить ацетона не испарится, поместив трубы Зонта или холодильник. Затем растворяют гранулы белка, добавив 1 мл 0,1 М NaOH в каждую пробирку. Полностью растворяют гранулы может потребовать несколько раундов нагрева в горячей воде Ванна, vortexing и sonicating.
      Примечание: Чем длиннее трубы сидеть в Зонта или холодильник и осушитель гранулы получают, тем сложнее они будут повторно солюбилизировать последнего. Он предложил, чтобы высушить гранулы для 30 минут, а затем проверить на наличие ацетона каждые 10-15 минут до тех пор, пока это ясно, что ацетон испарилась (обнаруживаются не испарения ацетона).
  4. Смешайте стандартных решений, разбавить неизвестный образец решения и количественно содержание общего белка в неизвестных образцов, используя assay Брадфорд.
    1. Готовить говядину иммуноглобулина G (IgG) стандартные решения согласно концентрации, перечисленных в таблице 1 (лиофилизованный препарат или IgG Стоковый раствор может быть смешан с дейонизированной водой для достижения каждой концентрации). Стандарты хранить при 4 ° C. В 96-луночных пластине, мкл 160 каждого IgG стандартные решения в трех экземплярах, начиная с позиции A1 хорошо пластины (0 мкг/мкл в A1, A2, A3 позиции, 0,0125 мкг/мкл в B1, B2, B3 позиции и т.д.).
    2. Подготовьте разбавленный раствор NaOH, добавляя 50 мкл 0,1 М NaOH до 950 мкл дистиллированной воды. Как элемент пустым отрицательным добавьте 60 мкл это решение хорошо пластины в трех экземплярах (G1, G2, G3 позиций).
    3. Подготовьте разведений неизвестных образцов, добавляя 50 мкл каждого образца решения до 950 мкл в новые пробки microcentrifuge 1,5 мл дистиллированной воды. Затем, добавьте 60 мкл каждого образца разреженных хорошо плиты в трех экземплярах, начиная с позиции H1. 96-луночных плита должна предусматривать анализ 6 стандартов, 1 бланк и 25 неизвестных образцов, когда прочитал в трех экземплярах. Каждый хорошо пластины анализ должен содержать свой собственный образцы стандартных и пустой IgG.
    4. Добавьте 100 мкл дистиллированной воды для всех скважин пустой и неизвестных образцов. Теперь каждый должен содержать в общей сложности 160 мкл. Использование многоканальных дозаторов (8 каналов), добавить 40 мкл Кумасси блестящий синий G-250 белка красить каждый хорошо в первом столбце хорошо пластины. Mix красителя с образцами, погружаясь несколько раз. Повторите для всех остальных столбцов, заменив пипеткой советы, чтобы избежать загрязнения.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Блестящий синий G-250 Кумасси является раздражителем и контакт с кожей, глазами, или легкие следует избегать. Пожалуйста, наденьте перчатки для предотвращения контакта с кожей. В случае контакта с кожей, этот продукт будет пятно.
    5. Используйте иглу поп любые пузыри в скважинах, поскольку они могут мешать Гонав спектрофотометр чтения. Очистите иглой, чтобы избежать загрязнения между скважинами. Пусть микроплиты инкубации при комнатной температуре в течение 5 минут.
    6. Используя спектрофотометр микроплиты, записывать значения поглощения для каждой скважины в 595 Нм.
    7. Запишите Среднее поглощение для трех пустых скважин и вычесть это значение каждого из стандартных и неизвестных образцов чтений. Затем запись средняя поглощения для каждого стандарта и неизвестных образцов.
      Примечание: Чтобы вычислить количество белка в каждый неизвестный образец, с использованием стандартной кривой, проще регресс средняя absorbance каждого стандарта против мкг белка в каждого стандарта, но одно можно участок концентрацию белка (мкг g/мкл) каждого стандарта, если желательно. Следующие вычисления, однако, относятся к стандартной кривой, основанный на мкг, не концентрации (мкг/мкл).
    8. Участок средняя absorbance каждого стандарта против общее количество белков, присутствующих в каждом стандарт хорошо (Таблица 1). Соответствовать линии линейной регрессии для этих данных и использовать уравнение для расчета количества белка (мкг) в каждую неизвестный образец, также основанный на среднем поглощения (рис. 1a).
      Примечание: Коэффициент корреляции (r -значение) этой линии должна быть больше, чем 0,98 и регулярно около 0,99. Стандартные регрессии будет характерных для каждой пластины, поэтому неизвестный образец скважин в каждой плиты должны быть проанализированы отдельно.
    9. Как только среднее количество белка рассчитывается для каждой скважины неизвестный образец, используйте следующее уравнение для расчета общее количество белка (мкг) в каждую исходного образца:
      Mp = (((Wp/60) x 1000) / 50) * 1000
      Mp = мкг белка в исходного образца
      Wp = мкг белка в неизвестный образец хорошо
      1. Затем используйте следующее уравнение для определения доли белка в каждом образце:
        Pp = ((Mp/1000) / mi) * 100
        Pp = % белка в образце
        Mя = первоначальной массы образца (мг)
        Примечание: В некоторых случаях, образец может превысить порог верхние поглощения. Если это так, примеры решений может потребовать дальнейшего разрежения на шаге 2.4.3.
        Дополнительные разведений затем должны учитываться для последующих расчетов. Некоторые бренды Считыватель микропланшетов также предоставляют компьютерное программное обеспечение, которое автоматически вычислит среднее белка концентрацию каждого неизвестных образцов, на основе стандартной кривой данных.

3. усваиваемых углеводов Assay

  1. Подготовка образца
    1. Весят реплицировать образцы каждой ткани, примерно 20 мг, в стекло 15 мл пробирок с выстроились резиновые колпачки (длина 100 мм). Эти примеры будут впоследствии называться неизвестных образцов. Этикетке трубки с водонепроницаемый маркер или маркировки ленты на крышках и записать точные массы каждого образца, как эта информация потребуется для расчета % углеводов в каждом неизвестных образцов.
  2. Извлечь усваиваемые углеводы из каждого неизвестных образцов.
    1. Добавьте 1 мл 0,1 М H2, чтобы4 каждой пробки и колпачки на трубки плотно. Место в кипящей водяной бане 1 час.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Серная кислота очень агрессивных. Пожалуйста, носите перчатки, googles глаз и фартук при обработке H2так4 и выполнить этот шаг в зонта.
    2. Охладиться трубы в ванне с теплой водой. Залейте содержимое трубки в меткой 1,5 мл microcentrifuge трубы (не быть обеспокоены, если некоторые завод материал остается в стеклянных трубок).
    3. Центрифуга трубы на 15000 x g за 10 минут. Удалите супернатант жидкость с микро дозаторов и место в новой трубы microcentrifuge меткой 1,5 мл. Трубы могут быть охлажденных ночь на данный момент. Если продолжить с assay, обратитесь к шагу 3.3.2.
  3. Mix стандартных решений и количественно содержание всего усваиваемых углеводов неизвестных образцов.
    1. Подготовка D(+) глюкозы, стандартных растворов с концентрациями, перечисленные в таблице 2. Подготовьте шесть стеклянные пробирки с 400 мкл каждого стандартного решения.
    2. Пипетка 15 мкл каждого неизвестного образца в свой собственный пробирку и 385 мкл дистиллированной воды для каждого на суммарный объем 400 мкл в каждую пробирку. В Зонта 400 мкл 5% фенола в пробирке каждого стандарта и неизвестных образцов, и затем быстро Пипетка 2 мл концентрированной H2т4 в каждую пробирку. Не прикасайтесь содержимое пробирки с кончиком пипетки, просто добавьте в решение поверхности (пипетки ретранслятор работает лучше всего для этого).
    3. Пусть трубы инкубировать на 10 минут и затем тщательно вихревых трубок смешать содержимое. Инкубируйте еще 30 минут.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Фенол и серной кислоты являются коррозионные раздражителей. Для защиты от воздействия на кожу, глаза и ингаляции, этот шаг следует выполнять в химической Зонта с помощью надлежащего СИЗ, который включает в себя: сталкиваются щит или глаз очки, резиновые перчатки, фартук лаборатории и сапоги. Смешивание фенола серной кислотой также результаты в экзотермическая реакция, которая приведет к трубы, становится жарко.
    4. Пипетка 800 мкл пример из каждой трубки в каждой из 3 полу микро Кюветы полистирольные 1,5 мл (3 технические реплицирует на сэмпл). Установите спектрофотометр для чтения на 490 Нм. Калибровка в пустой кюветы, содержащие дистиллированной воды, перед чтением стандартов или неизвестных образцов и периодически на протяжении образца чтений. Запустите каждый кювет через спектрофотометр и записывать поглощения. В среднем через технический реплицирует для каждого образца, неизвестно.
      Примечание: В некоторых случаях, образцы может превысить порог верхние поглощения. Если это так, образцы должны быть разбавлен на шаге 3.2.3. Разведений также должны учитываться для последующих расчетов.
    5. Рассчитайте средний absorbance каждого стандарта.
      Примечание: Чтобы вычислить количество всего усваиваемые углеводы присутствуют в каждом неизвестный образец, с использованием стандартной кривой, проще регресс средняя absorbance каждого стандарта против микрограмм D (+) глюкозы в каждого стандарта, но можно также участок D (+) концентрация глюкозы (мкг/мкл) каждого стандарта, если желательно. Следующие вычисления, однако, относятся к стандартной кривой, основанный на мкг, не концентрации (мкг/мкл).
    6. Расчет стандартной кривой путем построения Среднее поглощение против общее количество глюкозы (мкг) D (+) в каждом стандартного решения. Соответствовать линии линейной регрессии для этих данных, а затем использовать следующее уравнение для расчета общее количество углеводов (мкг) в каждую неизвестный образец:
      Mc = (((Ax -b)/m)/(15)) * 1000
      Mc = мкг углеводов в образце
      X = Среднее поглощение неизвестный образец
      b = y пересечение (стандартные регрессии линия)
      m = наклона (стандартные регрессии линия)
      Коэффициент корреляции этой линии должна быть больше, чем 0,98 и регулярно около 0,99. Затем используйте следующее уравнение для определения доли углеводов в каждом образце:
      Pc = ((Mc/1000) / (iM)) * 100
      Pc = % углеводов
      Mя = первоначальной массы образца (мг)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Чтобы показать полезность этих методов, мы проанализировали растворимого белка и усваиваемых углеводов четырех разных местах и кукуруза тканей, которые служат различные потенциальные ресурсы питания для травоядных насекомых. Мы собрали колосьев из трех сельскохозяйственных регионов в Соединенных Штатах (Миннесота, Северная Каролина и Техас), охватывающих пять различных сортов кукурузы (то есть, генотипов) и одна разновидность как аутгрупповой поля кукурузы. Таблица 3 показывает резюме этих образцов кукурузы и где они были собраны. Все сорта были собраны в конце срока, но вследствие развития различий между разновидностями, они были не все собранные в тот же день после посадки. Мы обработали уши в различных тканях, быстро разделяя лузги (изменены листья окружают початка), и шелка (блестящий волокна между шелухи и ядер) от уха до сохранения всех тканей-80 ° c, как указано в методах. Каждая ткань была затем Сублимированные замораживанием. После того, как сушеные, мы отделены ядра от базы и кончик уха, бреют ядра от верхней трети (Совет) и нижней трети (база) коксовой батареи. Далее все ткани были земли в мелкий порошок. Затем мы проанализировали, лузги, шелка, кончик ядра и образцы тканей базового ядра для растворимого белка и усваиваемых углеводов в соответствии с процедурами, изложенными в методах выше. Учитывая ограничения на количество ткани доступны, мы проанализировали в общей сложности 217 завод образцов для растворимого белка и содержанием усваиваемых углеводов.

Растворимого белка
Мы побежали через спектрофотометром в общей сложности девять пластины образца, и в целом, стандартные кривые имели высокие коэффициенты корреляции (r), с значениями между 0.985-1.00. Рисунок 1 показывает калибровочной кривой, полученные с высоким (A) и низкие значения r (B) выставлять изменчивости, которую мы наблюдали через пластины. Мы рассчитывается % растворимого белка для всех образцов, с использованием исходного образца массы (Таблица 4) и затем проанализированы данные для статистических различий между регионами, сорта и типы тканей в содержание растворимого белка. Данные были, ранг трансформированных встретиться предположения нормальности при необходимости.

Мы отметили значительные различия между регионами (ANOVA Уэлч; в содержание растворимого белка F(2, 133,5) = 4.303, P = 0,015), как результат, данные от каждого региона были впоследствии проанализированы отдельно. Миннесота образцов показал значительное взаимодействие между разнообразием и типа ткани на содержание растворимого белка (двусторонний ANOVA; F(3, 64) = 16.51, P < 0,001). Большинство тканей были аналогичные растворимого белка, содержание в обоих вариантах, за исключением базового ядра, где кукуруза разнообразие содержится почти в 7 раз сумму по сравнению с разнообразием поле кукурузы. Для разнообразия поле кукурузы (Сингента/НК 3122A-EZ) лузги и шелка были похожи и низкие содержание растворимого белка всех тканей. Ядра от кончика уха высокое содержание растворимого белка, а ядра от основания уха были промежуточные (рис. 2a). Для разнообразия кукуруза (Провиденс биколор) отличались все ткани, с рожками и шелка, содержащий низкие содержание растворимого белка и базового ядра, содержащихся ~2.5 раз больше, чем Совет ядра (рис. 2b).

Северная Каролина образцов также показал значительное взаимодействие между разнообразием и тканей типа (двусторонний ANOVA; F(3, 77) = 3.33, P < 0,024). Большинство тканей показали аналогичные растворимого белка содержание различных сортов, за исключением ядра оконечности, которые выставлены более высокое содержание в не -Bt разнообразие (Sweet G90 гибрид). Для Bt лузги разнообразие (Seedway Bt 1576) были ткани с низким содержание растворимого белка следуют шелками и кончик ядра, которые имели похожих по содержанию. Базовый ядра имеют высокое содержание растворимого белка, но не были статистически отличаются от кончика ядер (рис. 2 c). В не -Bt разнообразие (Sweet G90 гибрид) все ткани отличаются за исключением кончика и базового ядра, которые были статистически похожи. Шелуха имел низкий растворимого белка контента, следуют шелка и подсказки и база ядра, которые имеют высокое содержание (Рисунок 2d).

Техас образцов показали значительные различия в содержание растворимого белка между сортов (двусторонний ANOVA; F(1, 76) = 12,91, P = 0,001) и тканей (двусторонний ANOVA; F(3, 76) 21.90, P = < 0,001), но без существенного взаимодействия (двусторонний ANOVA; F(3, 76) = 0.436, P = 0.728). В целом, биколор разнообразие (Ш2 SS2742 NAT III) показал более низкое содержание средняя растворимого белка, чем разновидности Серебряная Королева (TRTD F1 (su)). Через обе разновидности шелуха имели низкие содержание белка, следуют шелка и затем Совет и базы ядер, оба из которых были аналогичным образом высокое содержание (Рисунок 2e-f).

Усваиваемые углеводы
Потому что все образцы были проанализированы в одно время, мы только побежал один калибровочной кривой. Рисунок 1 c показывает, что коэффициент корреляции был высоким, в 0,998. Мы рассчитывается % усваиваемых углеводов для всех образцов (Таблица 5) и затем проанализированы данные для статистических различий между регионами, сорта и типы тканей в усваиваемых углеводов. Данные преобразованы ранга при необходимости для удовлетворения предположения нормальности.

Существовали никаких существенных различий между регионами (ANOVA; F(2, 216) = 1.47, P = 0.231), но ради преемственности с анализа белка, мы снова анализировали данные от каждого региона отдельно. Миннесота образцы показали статистически значимых различий усваиваемых углеводов между сортами (двусторонний ANOVA; F(1, 64) = 0.00014, P = 0.990) или тип ткани (двусторонний ANOVA; F(3, 64) = 0.818, P = 0.489). Существовал также не существенного взаимодействия между разнообразием и тканей (двусторонний ANOVA; F(3, 64) = 2.26, P = 0,092). Рисунок 2a -b показывает, что все ткани выставлены среднее содержание 36,5% (± 0,53).

Северная Каролина образцов показал значительное влияние типа ткани на усваиваемых углеводов (двусторонний ANOVA; F(3, 77) = 3,99, P = 0,011), но никакого эффекта разновидности (двусторонний ANOVA; F(1, 77) = 1.06, P = 0,307) или взаимодействия (двусторонний ANOVA; F(3, 77) = 0.465, P = 0.708). Рисунок 2 c -d показывает, что шелк был наименьшим содержанием усваиваемых углеводов, следуют шелухи, Совет ядра и базового ядра. Все ткани были статистически похожи, за исключением шелками и базового ядра.

Техас образцов показал статистически значимого влияния разновидности (двусторонний ANOVA; F(1, 76) = 0.834, P = 0,364) или тип ткани (двусторонний ANOVA; F(3, 76) = 1,03, P = 0.385), но показывают значительное взаимодействие (двусторонний ANOVA; F(3, 76) = 3.34, P = 0,024). Этот эффект был главным образом потому, что базовый ядер в различных биколор (Ш2 SS2742 NAT III) был значительно выше усваиваемых углеводов контента, чем те, в разнообразных Серебряная Королева (TRTD F1 (su)). Рисунок 2e -f показывает, что были не статистические различия в усваиваемых углеводов разных типов тканей в различных Серебряная Королева (TRTD F1 (su)), но существует значительная разница между шелка и ткани базового ядра для двухцветной разнообразие ( SH2 SS2742 NAT III).

Figure 1
Рисунок 1. Стандартные кривые для макро анализов. (A) калибровочной кривой для assay растворимого белка, показаны пластину с высоким коэффициентом корреляции (лучший кривая). (B) стандартной кривой для assay растворимого белка, показаны пластины с низким коэффициентом корреляции (худший кривая). (C) стандартная кривая для assay усваиваемых углеводов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2. Означать % растворимого белка и % усваиваемых углеводов для каждого типа ткани. (A) MN - Bt Syngenta/НК 3122A-EZ (поле кукурузы), (B) MN - не -Bt Провиденс биколор, (C) НК - Seedway Bt 1576, (D) NC - не -Bt сладкий G90 гибрид, (E) TX - Ш2 SS2742 F1 NAT III Двухцветная, (F) TX - Серебряная Королева TRTD F1 (su). Круги показывают необработанных данных, в то время как квадраты показывают средние значения. Зеленый (лузги), красный (шелк), желтый (Подсказка ядра) и фиолетовый (базового ядра). Пунктирные линии, соединяющие происхождение каждый квадрат показать соотношение P:C для каждой ткани (соотношение является наклон пунктирные линии). Письма показывают пост Специального результаты для белка различия вдоль верхней и углеводов различия вдоль стороны, с разными буквами, представляющие значительно отличаются значения различных тканей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

IgG концентрации (ug/uL) Белка в стандартных образцов (ug)
0.0000 0
0,0125 2
0.0250 4
0,0375 6
0.0500 8
0.1000 16

Таблица 1. Калибровочной кривой расчеты для растворимого белка assay. Количество белка в каждом стандарте рассчитывается путем концентрации каждого стандарта и умножения на количество стандартного раствора в каждой скважине (160 мкл).

D (+) глюкозы концентрации (ug/uL) D (+) глюкозы в стандартных образцов (ug)
0.0000 0
0,0375 15
0.0750 30
0.1125 45
0.1500 60
0,1875 75

В таблице 2. Расчет стандартной кривой для assay усваиваемых углеводов. Количество глюкозы в каждом стандарте рассчитывается путем концентрации каждого стандарта и умножения на количество стандартного раствора в каждую пробирку (400 мкл).

Регион Разнообразие Местоположение N
Миннесота BT Syngenta/НК 3122A-EZ (поле кукурузы) Розмаунт, MN (44.7070,-93.1073) 10
не - Bt Провиденс биколор Розмаунт, MN (44.7070,-93.1073) 10
Северная Каролина не - Bt сладкий G90 гибрид Роки Маунт, Северная Каролина (35.8918,-77.6780) 10
Seedway БТ 1576 Эдентон, NC (36.1758,-76.7057) 10
Техас SH2 SS2742 F1 NAT III биколор Лаббок, TX (33.6935,-101.8249) 10
Серебряная Королева TRTD F1 (su) Лаббок, TX (33.6935,-101.8249) 10

В таблице 3. Резюме кукурузы выборки местоположения и разновидностей. Для каждого региона и различные комбинации, 10 уши были собраны и проанализированы четыре тканей: шелуху, шелками, кончик ядра и базового ядра.

Регион Разнообразие % растворимого белка
шелуха шелк Совет ядра Базовый ядра
Миннесота BT Syngenta/НК 3122A-EZ (поле кукурузы) 3.29 ± 0,38 4.57 ± 1.27 14,74 ± 1,54 7.07 ± 0,84
не - Bt Провиденс биколор 3.35 ± 0,58 6.71 ± 0,70 17,87 ± 3.85 48.41 ± 2,85
Северная Каролина не - Bt сладкий G90 гибрид 2.90 ± 0,60 6,97 ± 0,63 12.95 ± 0,86 12.23 ± 0,83
Seedway БТ 1576 5.48 ± 0,73 9.08 ± 0,62 10,75 ± 0,93 12.76 ± 1.16
Техас SH2 SS2742 F1 NAT III биколор 7.74 ± 1.03 12.15 ± 0,63 14.79 ± 0,69 14.88 ± 0,48
Серебряная Королева TRTD F1 (su) 6.06 ± 1,05 8.17 ± 0,79 12.95 ± 1.19 12.32 ± 1.23

Таблица 4 . Средние значения белка для каждого региона, разнообразие и ткани типа. Означает, проценты (по массе сухого вещества) показываются ± 1 SE.

Регион Разнообразие усваиваемые углеводы %
шелуха шелк Совет ядра Базовый ядра
Миннесота BT Syngenta/НК 3122A-EZ (поле кукурузы) 37.55 ± 0,88 32.31 ± 1,38 36.79 ± 1,60 38.66 ± 1,57
не - Bt Провиденс биколор 37.30 ± 0,82 37.31 ± 2,30 35.80 ± 1.77 34.83 ± 1.37
Северная Каролина не - Bt сладкий G90 гибрид 35.79 ± 0,81 35.28 ± 1,17 36.13 ± 0,91 39.47 ± 1.18
Seedway БТ 1576 35.75 ± 0,58 34.91 ± 0,76 35.73 ± 1.35 37.29 ± 1.13
Техас SH2 SS2742 F1 NAT III биколор 35.55 ± 0,87 33.40 ± 1.10 34.85 ± 1.01 39.14 ± 1.22
Серебряная Королева TRTD F1 (su) 34.63 ± 1.13 33,42 ± 2.33 35.16 ± 1.16 33.93 ± 1.03

В таблице 5. Значения для каждого региона, разнообразие и ткани типа углеводов. Означает, проценты (по массе сухого вещества) показываются ± 1 SE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Объединив устоявшихся колориметрические анализов с эффективной добычи конкретных протоколов, анализов, продемонстрировали здесь предоставляют разумные и точный метод измерения завод растворимого белка и содержанием усваиваемых углеводов. Наши результаты, используя кукурузы как образец показывает, как эти протоколы могут использоваться для получения точных измерений через различных биологически соответствующих пространственных масштабах. Например мы смогли обнаружить различия в завод растворимого белка и содержанием усваиваемых углеводов географических регионов, разновидностей (или генотипов), типы тканей и даже пространственной сегрегации тканей. Обе анализов может быть сделано с помощью общей лабораторного оборудования и реагентов, требующих только основных лабораторных навыков и можно анализировать относительно большое количество образцов (50-75) в течение короткого периода времени.

Хотя сравнительно легко выполнить, некоторые шаги более критичны, чем другие и если сделано неправильно, можно ограничить точность результатов. Например важно, что растительные материалы обрабатываются должным образом на этапе отбора проб. Даже расчлененных растительной ткани будет оставаться метаболически активной, пока не подвергаются смертельной температуры, и в течение этого периода растения можно изменить содержание макро. В результате длительных периодов времени между завод выборки и замораживания (либо жидкий N или морозильной камеры хранения) может увеличить вероятность того, что образцы растений макро контента может не отражать содержание, который присутствовал во время выборки.

2.3.3-2.3.5 шаги в протоколе белка особенно важны для успеха, как эти шаги имеют дело с осажденный белки. Необходимо позаботиться о том, чтобы избежать потери любого из Пелле белка при вакуумирования супернатанта тук от microcentrifuge трубы, потому что это приведет к недооценке содержание белка. Также важно, когда Стиральная белка лепешка с ацетоном, сделать это очень быстро. Ацетон может ухудшить гранулы, если оставить в контакт для более чем несколько секунд. Мы предлагаем ограничить контакт между ацетон и Пелле менее 5 секунд. Наконец при сушке гранул, важно заботиться только предусмотреть достаточно времени для ацетона не испарится. Если гранулы оставляют сушиться слишком долго, она становится очень трудно Ресуспензируйте в NaOH. Мы предлагаем сушки гранул на 30 минут, а затем проверка на присутствие ацетона, либо путем визуального наблюдения жидкости в трубе тщательно обнаружения запаха ацетона паров. Продолжить проверку таблетки каждые 10-15 минут, пока испарится ацетон.

Как указано в Брэдфорд 197616, количественная оценка шагов, используя Кумасси блестящий синий краситель G-250 позволяют для высокой чувствительности, со стандартным отклонением белка только 5 мкг/мл, высокий белок краситель комплекс стабильности и ограниченного вмешательства -белковых соединений. Этот assay имеет дальность обнаружения между 1-20 мкг Гербера за Гонав хорошо (низкие концентрации пробирного) или максимум 25 мкг/мл; Однако любой концентрации, превышающие наивысший стандарт следует разбавлять и заново проанализированы наиболее точные результаты, (протокол производит избыток раствора, в случае необходимости таких разведений и ре анализ). Существует предубеждение для красителя преференциально связывают основные аминокислоты, такие как аргинин и ароматических аминокислотных остатков; Однако assay Брадфорд остается наиболее точный и простой в использовании метод для количественного определения общего белка в смешанных образцов.

Assay усваиваемых углеводов является экономически, быстрый и простой метод для количественной оценки завод углеводов исключая структурных углеводов (например, целлюлоза), которые переваривается, большинство травоядных животных. Наиболее проблематичным шаги в анализов углеводов являются шаги 3.2.1 и 3.3.2-3.3.4. Здесь важно, чтобы держать upright трубы и ужесточить screwcaps хорошо, когда закипит, как введение любой воды развести образцы и влияют на точной количественной оценки. Кроме того должны быть приняты при работе с фенола и сконцентрировано серная кислота, поскольку оба сильнокоррозионные. Следует отметить, что мы выступаем за записи оптической плотности образца на 490 Нм, который является максимальная абсорбция для гексоз, но не другие сахара, такие как пентозы и уроновых кислот, которые имеют максимум поглощения в 480 Нм20,21. Для сахарной смеси в образцы растений, 490 Нм обеспечивает соответствующие волны для количественного определения общего углеводов содержание22,23,24, но для более подробного анализа различных сахаров см20, 21. Следует также отметить, что Масуко и др. 23 предоставляет метод обтекаемый Гонав для анализа фенола серной кислоты углеводов.

Другим заметным метод оценки завод содержания питательных веществ в25,,2627 — ближней инфракрасной спектроскопии (НИРС). НДК технология широко используется в сельском хозяйстве и производстве продовольствия. Этот альтернативный метод неинвазивной, неразрушающего, занимает часть времени в любом методе мокрой химии и может применяться в различных масштабах от ландшафта вплоть до отдельных кусок ткани растений. Эта техника меры косвенно питательных веществ и опирается на измерения точные мокрой химии химического завода интерес для калибровки. Методы, описанные здесь, поэтому будет иметь критическое место в будущем растений питательных анализа, обеспечивая что калибровки основывается на растворимые и легкоусвояемые макро количественной оценки и не предвзято пустышки Элементаль суррогаты.

Представлены методы для измерения завод растворимого белка и содержанием усваиваемых углеводов имеют существенные последствия для экологических и биологических наук. Несмотря на обилие информации о элементного состава растительных тканей сильно не хватает информации о содержании растений макро. Учитывая ограничения, которые существуют в корреляции элементарных мер с макро содержание и признавая прочные отношения между завод питания содержание и выше порядке экологических процессов, получения такого рода данных имеет важное значение для продвижение области физиологии растений, питания Экология, взаимодействия растений травоядных, еда web динамика11,28,29,30. Это наша надежда, что предоставление четкой и доступной методологии для измерения завод растворимого белка и содержанием усваиваемых углеводов будет стимулировать исследователей для сбора и учета будущих исследований такого рода данных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Спасибо всем из наших сотрудников, которые оказывали помощь с коллекции полей кукуруза включая Доминик Райзиг и Dan Мотт в государственном университете Северной Каролины и ПЭТ Портер в Texas A & M University в Лаббок, штат Техас. Благодаря Фиона Клиссолд для помогая оптимизировать протоколов и обеспечения изменения этой рукописи. Эта работа частично поддержали Texas A & M C. Everette Салье стипендий (Кафедра энтомологии) и биотехнологии риска Грант программы оценки конкурсных грантов № 2015-33522-24099 из Департамента сельского хозяйства США (присуждена газ и STB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
microplate reader (spectrophotometer) Bio-Rad Model 680 XR
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent concentrate Bio-Rad #5000006 450mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Simpson, S. J., Raubenheimer, D. The Nature of Nutrition: A Unifying Framework from Animal Adapation to Human Obesity. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (2012).
  2. Behmer, S. T. Insect herbivore nutrient regulation. Annual Review of Entomology. 54, 165-187 (2009).
  3. Epstein, E. Mineral nutrition of plants: mechanisms of uptake and transport. Annual Review of Plant Physiology. 7 (1), 1-24 (1956).
  4. Chapin, F. S. III The mineral nutrition of wild plants. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 11 (1), 233-260 (1980).
  5. Marschner, H. Marschner's Mineral Nutrition of Higher Plants. , Academic press. London, UK. (1956).
  6. Stieger, P. A., Feller, U. Senescence and protein remobilization in leaves of maturing wheat plants grown on waterlogged soil. Plant and Soil. 166, 173-179 (1994).
  7. Li, R., Volenec, J. J., Joern, B. C., Cunningham, S. M. Seasonal changes in nonstructural carbohydrates, protein, and macronutrients in roots of alfalfa, red clover, sweetclover, and birdsfoot trefoil. Crop Science. 36, 617-623 (1996).
  8. Sánchez, E., Rivero, R. M., Ruiz, J. M., Romero, L. Changes in biomass, enzymatic activity and protein concentration in roots and leaves of green bean plants (Phaseolus vulgaris L. cv. Strike) under high NH4NO3 application rates. Scientia Horticulturae. 99, 237-248 (2004).
  9. Lenhart, P. A., Eubanks, M. D., Behmer, S. T. Water stress in grasslands: Dynamic responses of plants and insect herbivores. Oikos. 124, 381-390 (2015).
  10. Machado, A. R., Arce, C. C. M., Ferrieri, A. P., Baldwin, I. T., Erb, M. Jasmonate-dependent depletion of soluble sugars compromises plant resistance to Manduca sexta. New Phytologist. 207, 91-105 (2015).
  11. Deans, C. A., Behmer, S. T., Fiene, J., Sword, G. A. Spatio-temporal, genotypic, and environmental effects of plant soluble protein and digestible carbohydrate content: implications for insect herbivores with cotton as an exemplar. Journal of Chemical Ecology. 42 (11), 1151-1163 (2016).
  12. Boisen, S., Bech-Andersen, S., Eggum, B. O. A critical view of the conversion factor 6.25 from total nitrogen to protein. Acta Agriculturae Scandinavica. 37, 299-304 (1987).
  13. Seed protein contents and nitrogen-to-protein conversion factors for some uncultivated tropical plant seeds. Food Chemistry. Ezeagu, I. E., Petzke, J. K., Metges, C. C., Akinsoyinu, A. O., Ologhobo, A. D. 78, 105-109 (2002).
  14. Izhaki, I. Influence of nonprotein nitrogen on estimation of protein from total nitrogen in fleshy fruits. Journal of Chemical Ecology. 19, 2605-2615 (1993).
  15. Mossé, J. Nitrogen to protein conversion factor for ten cereals and six legume or oilseeds. A reappraisal of its definition and determination. Variation according to species and seed protein content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 38, 18-24 (1990).
  16. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  17. Jones, C. G., Hare, J. D., Compton, S. J. Measuring plant protein with the Bradford assay. Journal of Chemical Ecology. 15 (3), 979-992 (1989).
  18. Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colormetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Biochemistry. 28, 350-358 (1956).
  19. Clissold, F. J., Sanson, G. D., Read, J. The paradoxical effects of nutrient ratios and supply rates on an outbreaking insect herbivore, the Australian plague locust. Journal of Animal Ecology. 75, 1000-1013 (2006).
  20. Smith, D., Paulsen, G. M., Raguse, C. A. Extraction of total available carbohydrates from grass and legume tissue. Plant Physiology. 39 (6), 960-962 (1964).
  21. Cui, S. W. Food carbohydrates: Chemistry, physical properties, and applications. , CRC Press. Boca Raton, FL, USA. (2005).
  22. Chow, P. S., Landhäusser, S. M. A method for routine measurements of total sugar and starch content in woody plant tissues. Tree Physiology. 24 (10), 1129-1136 (2004).
  23. Masuko, T., Minami, A., Iwasaki, N., Majima, T., Nishimura, S. I., Lee, Y. C. Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format. Analytical Biochemistry. 339 (1), 69-72 (2005).
  24. Foley, W. J., McIlwee, A., Lawler, I., Aragones, L., Woolnough, A. P., Berding, N. Ecological applications of near infrared reflectance spectroscopy- a tool for rapid, cost-effective prediction of the composition of plant and animal tissues and aspects of animal performance. Oecologia. 116 (3), 292-305 (1998).
  25. Kokaly, R. F. Investigating a physical basis for spectroscopic estimates of leaf nitrogen concentration. Remote Sensing of Environment. 75 (2), 153-161 (2001).
  26. Schulz, H., Baranska, M. Identification and quantification of valuable plant substances by IR and Raman spectroscopy. Vibrational Spectroscopy. 43 (1), 13-25 (2007).
  27. Cozzolino, D., Morón, A. The potential of near-infrared reflectance spectroscopy to analyse soil chemical and physical characteristics. The Journal of Agricultural Science. 140, 65-71 (2003).
  28. Simpson, S. J., Sword, G. A., Lorch, P. D., Couzin, I. D. Cannibal crickets on a forced march for protein and salt. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4152-4156 (2006).
  29. Lihoreau, M., Buhl, J., Sword, G. A., Raubenheimer, D., Simpson, S. J. Nutritional ecology beyond the individual: a conceptual framework for integrating nutrition and social interactions. Ecology Letters. 18 (3), 273-286 (2015).
  30. Deans, C. A., Behmer, S. T., Tessnow, A., Tamez-Guerra, P., Pusztai-Carey, M., Sword, G. A. Nutrition affects insect susceptibility to Bt. Scientific Reports. 7, 39705 (2017).

Tags

Экологических наук выпуск 138 макроэлементы УФБ питание сельское хозяйство геометрические основы физиологии насекомых,
Количественная оценка завод растворимого белка и усваиваемых углеводов контента, используя кукурузы (<em>Zea mays</em>) как образец
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Deans, C. A., Sword, G. A., Lenhart, … More

Deans, C. A., Sword, G. A., Lenhart, P. A., Burkness, E., Hutchison, W. D., Behmer, S. T. Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn (Zea mays) As an Exemplar. J. Vis. Exp. (138), e58164, doi:10.3791/58164 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter