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Quantification des protéines solubles végétales et glucides digestibles contenu, à l’aide de maïs (Zea mays) As an Exemplar

Published: August 6, 2018 doi: 10.3791/58164
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 2, 2, 1
1Department of Entomology, Texas A&M University, 2Department of Entomology, University of Minnesota, 3Department of Entomology, University of Kentucky

Summary

Les protocoles décrits ci-après offrent une méthodologie claire et accessible pour mesurer les protéines solubles et le contenu en glucides digestibles (non structurelles) dans les tissus végétaux. La capacité de quantifier ces macronutriments de deux plantes a des implications importantes pour faire progresser les domaines de la physiologie végétale, écologie nutritionnelle, des interactions plantes-herbivores et l’écologie trophique.

Abstract

Données élémentaires sont utilisées pour déduire la qualité usine comme une ressource pour les herbivores. Cependant, l’omniprésence du carbone dans des biomolécules, la présence des contenant de l’azote des composés végétaux défensive et variation des corrélations spécifiques entre la teneur en protéines d’azote et de plantes tous les limitent la précision de ces déductions. En outre, la recherche axée sur la plante et/ou physiologie herbivore nécessitent un niveau de précision qui n’est pas atteint à l’aide de généralisé des corrélations. Les méthodes présentées ici offrent aux chercheurs un protocole clair et rapid pour mesurer directement les protéines solubles végétales et glucides digestibles, les macronutriments de deux plantes plus étroitement liés au rendement physiologique des animaux. Les protocoles combinent bien caractérisés dosages colorimétriques avec étapes de digestion optimisée de spécifiques à l’installation pour fournir des résultats précis et reproductibles. Nos analyses des différent tissus montrent que ces tests ont la sensibilité pour détecter des variations dans le maïs sucré plant des protéines solubles et teneur en glucides digestibles à travers plusieurs échelles spatiales. Ceux-ci incluent des différences entre les plantes dans les régions et les espèces ou les variétés de plus en plus, ainsi que dans-usine de différences dans le type de tissu et même position dans le même tissu. Combinant des protéines solubles et teneur en glucides digestibles avec données élémentaires a également le potentiel d’offrir de nouvelles opportunités en biologie végétale pour connecter la nutrition minérale des plantes avec les processus physiologiques de la plante. Ces analyses aussi aident à générer des protéines solubles et les données de glucides digestibles nécessaires pour étudier l’écologie nutritionnelle, des interactions plantes-herbivores et la dynamique trophique, qui donnera à son tour la physiologie et la recherche écologique.

Introduction

La biomasse végétale constitue la base de pratiquement tous les réseaux alimentaires terrestres. Plantes acquièrent des éléments nutritifs du sol par le biais de leurs systèmes de racines et d’utilisent la lumière du soleil dans leurs tissus foliaires de synthétiser des biomolécules. En particulier, le carbone et l’azote sont utilisés pour créer les glucides, les protéines (composés d’acides aminés), et les lipides qui sont nécessaires pour construire la biomasse végétale (il est à noter que dans les plantes physiologie que le terme « pour les macronutriments » fait souvent référence à des éléments de sol, par exemple, N, P, K et S, cependant, tout au long de ce document ce terme désigne les biomolécules, telles que des protéines, des glucides et lipides). Lorsqu’herbivores consomment des matières végétales, les macronutriments contenus dans les tissus végétaux sont ventilées en leurs éléments constitutifs et ensuite utilisés pour piloter les processus physiologiques du consommateur. De cette façon, plante macronutriments ont une forte influence sur la physiologie des consommateurs ainsi que des répercussions importantes sur les interactions écologiques ordre supérieures et dynamique du réseau trophique.

Dans le règne animal, protéines solubles et des glucides digestibles sont les macronutriments plus étroitement liées à la survie, la reproduction et performances1. En outre, la plupart des animaux réguler activement leur consommation de ces deux macronutriments pour répondre à leurs exigences physiologiques1,2. Ceci est particulièrement vrai pour les insectes herbivores qui détectent la concentration des sucres et des acides aminés dans les tissus végétaux, qui dirige à son tour le comportement alimentaire. Ainsi, les protéines solubles végétales et la teneur en glucides digestibles a joué un rôle important dans l’évolution des interactions plantes-insectes.

Alors que les données sur les protéines solubles de la plante et la teneur en glucides digestibles sont relativement rares (mais voir6,7,8,9,10,11), il y a une prépondérance de données disponibles sur la teneur en éléments végétaux (carbone, azote et phosphore). Dans une large mesure, c’est parce que les éléments jouent un rôle primordial dans le plant nutrition minérale3,4,5. Lorsque des éléments sont mesurés, des corrélations ont été utilisées pour extrapoler la quantité de protéines solubles et glucides digestibles, mais des calculs précis sont souvent difficiles à obtenir. Par exemple, il est impossible d’utiliser le carbone comme indicateur de la teneur en glucides digestibles plante car le carbone est partout présent dans tous les composés organiques. Il existe une relation plus forte entre l’azote élémentaire et teneur en protéines solubles végétales et généralisée d’azote-à-protéines facteurs de conversion sont souvent utilisés. Cependant, il existe des preuves solides que les conversions d’azote-à-protéines sont hautement spécifiques12,13,14,15, ce qui rend l’utilisation de la conversion généralisée susceptibles inexactes. Pour cette raison, facteurs de conversion d’azote-à-protéine manquent souvent de précision, en particulier dans la mesure nécessaire pour les études nutritionnelles sur les herbivores. En outre, la présence d’allélochimiques de plante contenant du N, tels que les alcaloïdes et les glucosinolates qui sont souvent toxiques pour les herbivores, peut confondre ces conversions.

Ici, nous vous proposons deux tests chimiques pour mesurer la concentration des protéines solubles et des glucides digestibles dans les tissus végétaux. Ces essais sont présentés séparément, mais il est suggéré qu’ils être utilisés simultanément pour analyser les échantillons de plantes même afin d’obtenir une analyse plus détaillée des macronutriments de plante. Tous les deux emploient des méthodologies similaires, consistant en une étape d’extraction, suivie de quantification par absorbance. Plante échantillon prep est également identique pour les deux protocoles, rendant facile d’exécuter les deux analyses en tandem. L’utilité de ces analyses ne découlent pas de leur nouveauté, comme ils se fient plus âgés, (Bradford, Jones, Dubois) dosages colorimétriques bien établi16,17,18, mais ici nous avons organisé une claire et facile à suivre protocole qui allie ces méthodes plus obscurs propres à chaque usine d’extraction techniques17,19 pour rendre l’application de ces tests plus accessible à ceux dans les domaines pertinents à l’usine.

Pour les deux tests, usine macronutriments sont extraits d’abord physiquement par congélation, lyophilisation et broyage de la matière végétale. Pour le dosage des protéines solubles, plus extraction chimique se faite17,19 à plusieurs séances d’agitation et de chauffage des échantillons dans une solution de NaOH. L’analyse bien connue de Bradford, utilisant le bleu de Coomassie brillant bleu G-250, est ensuite utilisée pour quantifier les protéines solubles et polypeptides entre 3 000-5 000 Daltons16,17. Ce test a une portée de détection entre 1 à 20 µg de protéines totales par microplaque bien ou < 25 µg/mL, mais il ne mesure pas les acides aminés libres. L’étape d’extraction du dosage des glucides digestibles est basée sur la méthode à l’acide diluée de Smith et al. 20 et permet l’isolement des sucres solubles, amidon et fructosanes – mais non structurales carbohydrates. Une méthode de dosage acide-phénol sulfurique provient de Dubois et al. 18 et mesures tous les mono-, oligo- et polysaccharides (ainsi que dérivés méthylés). Ce test est en mesure de quantifier les sucres spécifiques, mais ici nous l’utilisons comme un indicateur de la teneur en glucides digestibles (voir Smith et al. 20 pour une analyse plus détaillée). Ensemble, ces tests mesurent les deux macronutriments qui sont fortement liés pour planter les performances éco-physiologie et herbivore, fournissant des données importantes sur la qualité de la ressource à la base des réseaux trophiques terrestres. Présentant ces protocoles favorise la génération de plantes macronutriments datasets afin d’obtenir une compréhension plus approfondie de la physiologie végétale, écologie nutritionnelle herbivore et les interactions plantes-herbivores.

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Protocol

1. collecte et traitement des plantes

  1. Collecter et traiter les échantillons de végétaux
    1. Après avoir collecté des échantillons de végétaux, flash gel des échantillons en trempant le matériel végétal dans l’azote liquide avec forceps et conserver à-80 ° C. Si les échantillons de végétaux recueillis sont trop grosses pour flash-gel, refroidir rapidement les échantillons à l’aide de neige carbonique et transfert d’un congélateur à-80 ° C dès que possible. La teneur en macronutriments du matériel végétal peut changer après que les tissus sont séparés de la plante, il est donc important de congeler les échantillons végétaux dès que possible après le prélèvement.
      Mise en garde : Azote liquide peut provoquer des gelures graves lors du contact avec la peau. S’il vous plaît assurez-vous de transport d’azote liquide dans des contenants approuvés et porter les EPI approprié au cours de sa gestion, y compris la cryo-gants, œil googles, écran facial, tablier et une blouse de laboratoire.
    2. Lyophiliser matériel végétal à l’aide d’un lyophilisateur pour s’assurer que les tissus sont métaboliquement inactives, tandis que l’eau est enlevé. Sec jusqu'à ce que la masse de l’échantillon se stabilise à s’assurer que toute l’eau a été supprimé.
    3. Une fois les échantillons sont secs, broyer en une poudre fine à l’aide d’une meuleuse ou une usine. Conserver les échantillons dans une armoire desséchant jusqu'à l’analyse.

2. dosage de la protéine soluble

  1. Préparation des échantillons
    1. Peser les échantillons de chaque tissu, environ 20 mg chacune, en tubes et tubes de polystyrène microtubes de 1,5 mL étiquette. Ces échantillons seront par la suite être appelés échantillons inconnus. Enregistrer la masse exacte de chaque échantillon, ces informations seront nécessaires pour calculer le % de protéines solubles dans chaque échantillon inconnu. Utilisez microtubes à centrifuger avec couvercles de fermeture, comme les couvercles sans blocage peuvent s’ouvrir pendant l’étape de chauffage subséquent, résultant en une perte de solution d’échantillon.
  2. Solubiliser et isoler des protéines de l’échantillon inconnu
    1. À l’aide d’une micro-pipette, ajouter 500 µL de NaOH 0,1 M à chaque tube. Bien fermer le couvercle et laisser agir pendant 30 minutes. Préchauffer l’eau chaude bain 90 ° C.
      Mise en garde : Hydroxyde de sodium est une base forte et peut causer des brûlures au contact de la peau. Bien que NaOH 0,1 M représente une faible concentration, porter des gants pour éviter les irritations de la peau.
    2. Placer les tubes dans un rack dans le bain d’eau chaude pendant 15 minutes.
    3. Centrifuger les tubes à 15 000 x g pendant 10 minutes. Pipeter le liquide surnageant dans nouveaux tubes de microcentrifuge étiquetées, utilisant un nouvel embout de la pipette pour chaque échantillon. Ajouter 300 µL de NaOH 0,1 M dans le tube contenant le culot et centrifuger à nouveau à 15 000 x g pendant 10 minutes. Encore une fois, recueillir le liquide surnageant et combinez-le avec le surnageant du même échantillon. Il s’agit d’un potentiel point d’arrêt, et les échantillons peuvent être conservés à 4 ° C durant la nuit si nécessaire.
  3. Précipiter les protéines végétales
    1. Neutraliser le pH de la solution surnageante en ajoutant 11 µL de 5,8 M HCl. confirmer un pH de 7 ~ en plongeant le papier tournesol dans chaque solution d’échantillon.
      Mise en garde : L’acide chlorhydrique est un acide fort corrosif qui peut provoquer des brûlures au contact de la peau (application de la peau ou par inhalation). Veuillez porter des gants pour éviter les irritations de la peau lors de la manipulation des HCl.
    2. Ajouter 90 µL de 100 % l’acide trichloracétique (TCA) dans chaque tube et incuber les tubes sur la glace pendant 30 minutes. La précipitation des protéines va passer la solution de transparent à opaque. Si cela ne fonctionne pas après 30 minutes, réfrigérer les tubes pendant 1 heure. Il s’agit d’un potentiel point d’arrêt, et les échantillons peuvent être conservés à 4 ° C durant la nuit si nécessaire.
      Mise en garde : L’acide trichloroacétique est corrosif. Veuillez porter des gants lors de la manipulation pour éviter tout contact avec la peau et évitez d’inhaler.
    3. Centrifuger les échantillons à 13 000 x g pendant 10 minutes à 4 ° C. Retirer délicatement le surnageant TCA par elle à aspirer à l’aide d’une ligne vide, attachée à une extrémité de micropipette bon verre (le même embout peut être utilisé dans les trois échantillons). Ne pas déranger le culot de protéines en évitant les dragues lourdes et garder une distance appropriée entre la pointe de pipette et le pellet.
    4. Pastille de lavage rapidement avec 100 µL d’acétone de-20 ° C. Cette étape supprime tout TCA restant de la pastille, qui peut interférer avec l’analyse subséquente de Bradford ; Toutefois, l’acétone va commencer à dissoudre le culot de protéines si laissé en contact trop long, donc, devrait figurer l’acétone puis rapidement extraite de l’extrait concentré dans les 5 secondes.
    5. Laisser l’acétone s’évaporer en plaçant des tubes dans une hotte ou un réfrigérateur. Ensuite, dissoudre le culot de protéines en ajoutant 1 mL de NaOH 0,1 M à chaque tube. Dissoudre complètement le culot peut exiger plusieurs cycles de chauffage dans une eau chaude bain, Vortex et sonification.
      Remarque : Les tubes de plus s’asseoir dans la hotte ou réfrigérateur et sèche les pastilles obtiennent, ils seront plus difficiles à re-solubiliser. Il est suggéré de sécher le culot pendant 30 minutes, et ensuite vérifier la présence d’acétone toutes les 10-15 minutes jusqu'à ce qu’il soit clair que l’acétone s’est évaporée (aucuns l’acétone de fumées ne sont détectables).
  4. Mélanger les solutions étalons, échantillon inconnu solutions diluées et quantifier la teneur en protéines totales d’échantillons inconnus à l’aide de l’analyse de Bradford.
    1. Préparer une bovine immunoglobuline G (IgG) standard selon les concentrations énumérés dans le tableau 1 (lyophilisé ou solution d’IgG peut être mélangé avec de l’eau déionisée pour atteindre chaque concentration). Normes de magasin à 4 ° C. Dans une plaque à 96 puits, ajoutez 160 µL de chaque solution titrée d’IgG en trois exemplaires à partir de la position A1 de la plaque bien (0 µg/µL dans A1, A2, A3 positionner, 0,0125 µg/µL en B1, B2, B3 postes, etc.).
    2. Préparer une solution de NaOH diluée en ajoutant 50 µL de NaOH 0,1 M à 950 µL d’eau distillée. Comme témoin négatif vide, ajouter 60 µL de cette solution sur la plaque bien en trois exemplaires (G1, G2, G3 postes).
    3. Préparer des dilutions d’échantillons inconnus en ajoutant 50 µL de chaque solution d’échantillon à 950 µL d’eau distillée dans un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL. Puis, ajoutez 60 µL de chaque échantillon dilué à la plaque bien en triple exemplaire, en démarrant à la position de H1. Une plaque à 96 puits devrait permettre l’analyse des 6 normes, 1 blanc et 25 échantillons inconnus quand lues en trois exemplaires. Chaque plaque bien analysé doit contenir ses propres échantillons standards et vierges de IgG.
    4. Ajouter 100 µL d’eau distillée dans tous les puits échantillons à blanc et inconnu. Maintenant chacun doit bien contenir un total de 160 µL. à l’aide d’une pipette multicanaux (8 canaux), ajouter 40 µL de protéine G-250 bleu brillant de Coomassie teindre à chaque bien dans la première colonne de la plaque bien. Mélanger la teinture avec les échantillons en plongeant plusieurs fois. Répétez pour tous les autres colonnes, remplacement de pointes de pipette pour éviter la contamination.
      Mise en garde : G-250 bleu brillant de Coomassie est un irritant et le contact avec la peau, yeux, ou poumons doivent être évitées. Veuillez porter des gants pour éviter tout contact avec la peau. En cas de contact avec la peau, ce produit se tachera.
    5. Utiliser une aiguille faire pour éclater les bulles présentes dans les puits, car elles risquent d’interférer avec la lecture du spectrophotomètre microplaques. Nettoyer l’aiguille pour éviter toute contamination entre les puits. Laisser la microplaque incuber à température ambiante pendant 5 minutes.
    6. À l’aide d’un spectrophotomètre microplaques, enregistrer les valeurs d’absorbance pour chaque puits à 595 nm.
    7. Mesurer l’absorbance moyenne pour les trois puits vides et soustraire cette valeur de chacune des lectures échantillon standard et inconnu. Ensuite, enregistrez l’absorbance moyenne pour chaque échantillon standard et inconnu.
      Remarque : Pour calculer la quantité de protéines présente dans chaque échantillon inconnu à l’aide de la courbe d’étalonnage, il est plus facile à régresser l’absorption moyenne de chaque norme contre le microgrammes de protéine présente dans chaque norme, mais on peut tracer la concentration de protéine (µ g/µL) de chaque norme si désirable. Cependant, les calculs suivants, consulter une courbe standard basée sur microgrammes, pas des concentrations (µg/µL).
    8. Reporter l’absorbance moyenne de chaque norme contre la quantité totale de protéine présente dans chaque norme bien (tableau 1). Monter une ligne de régression linéaire à ces données et l’équation permet de calculer la quantité de protéines (µg) dans chaque échantillon inconnu bien basé sur l’absorption moyenne (Figure 1 a).
      Remarque : Le coefficient de corrélation (valeurr ) de cette ligne doit être supérieur à 0,98 et régulièrement près de 0,99. La régression standard seront spécifique à chaque assiette, d'où les puits échantillon inconnu dans chaque plaque doivent être analysés séparément.
    9. Une fois que le montant moyen des protéines est calculé pour chaque puits échantillon inconnu, utilisez l’équation suivante pour calculer la quantité totale de protéines (µg) dans chaque échantillon d’origine :
      P = (((Wp60) x 1000) / 50) * 1000
      P = µg de protéines dans l’échantillon original
      Wp = µg de protéines dans l’échantillon inconnu bien
      1. Ensuite, utilisez l’équation suivante pour déterminer le pourcentage de protéines dans chaque échantillon :
        Pp = ((p/1000) / mi) * 100
        Pp = % de protéines dans l’échantillon
        Mj’ai = masse initiale de l’échantillon (mg)
        Remarque : Dans certains cas, l’échantillon peut dépasser le seuil d’absorption supérieur. Dans l’affirmative, exemples de solutions peuvent exiger davantage dilution à étape 2.4.3.
        Dilutions supplémentaires doivent alors être comptabilisées dans les calculs ultérieurs. Certaines marques de lecteur de microplaque fournissent également un logiciel qui calcule automatiquement le taux protéique moyen de chaque échantillon inconnu basé sur les données de la courbe d’étalonnage.

3. dosage des glucides digestibles

  1. Préparation des échantillons
    1. Peser les échantillons de chaque tissu, environ 20 mg chacune, en verre 15 tubes mL avec bouchons à vis en caoutchouc doublé (100 mm de longueur). Ces échantillons seront par la suite dénommé échantillons inconnus. Identifier les tubes avec un marqueur imperméable à l’eau ou à l’étiquetage des bandes sur les couvercles et noter la masse exacte de chaque échantillon, ces informations seront nécessaires pour calculer le % de glucides dans chaque échantillon inconnu.
  2. Extrait des glucides digestibles de chaque échantillon inconnu.
    1. Ajouter 1 mL de 0.1 M H2donc4 à chaque tube et les bouchons à visser sur tubes hermétiquement. Placer dans un bain d’eau bouillante pendant 1 heure.
      Mise en garde : L’acide sulfurique est très corrosif. Veuillez porter des gants et un tablier googles œil lorsque vous manipulez H2SO4 et effectuez cette étape sous une hotte.
    2. Rafraîchir les tubes dans un bain d’eau tiède. Verser le contenu de tube dans étiquetées 1,5 mL tubes de microcentrifuge (ne soyez pas inquiet si certaines plant vestiges matériels dans les tubes de verre).
    3. Centrifuger les tubes à 15 000 x g pendant 10 minutes. Retirer le liquide surnageant avec un micro-multipipette et place dans nouveaux tubes de microcentrifuge étiquetées 1,5 mL. Tubes peuvent être réfrigérés pendant la nuit à ce stade. Si continuer avec le dosage, reportez-vous à l’étape 3.3.2.
  3. Mélanger les solutions étalons et de quantifier la teneur en glucides digestibles total des échantillons inconnus.
    1. Préparer d glucose solutions standards de la concentration figurant au tableau 2. Préparer six éprouvettes de verre avec 400 µL de chaque solution standard.
    2. Pipetter 15 µL de chaque échantillon inconnu dans son propre tube à essai et ajouter 385 µL d’eau distillée à chacun pour un montant record de 400 µL dans chaque tube à essai. Sous une hotte, ajouter 400 µL de 5 % de phénol à chaque tube échantillon standard et inconnu, et puis rapidement Pipeter 2 mL de concentré H2SO4 dans chaque tube. Ne pas toucher le contenu du tube à essai avec l’embout de la pipette, il suffit d’ajouter à la surface de la solution (une pipette de répéteur fonctionne le mieux pour cela).
    3. Laisser les tubes à incuber pendant 10 minutes, puis soigneusement vortex les tubes à mélanger le contenu. Incuber pendant encore 30 minutes.
      Mise en garde : Phénol et acide sulfurique sont irritants corrosifs. Pour protéger contre l’exposition à la peau, des yeux et inhalation, cette étape doit être effectuée sous une hotte chimique à l’aide de l’EPI adéquate, qui comprend : face à bouclier ou œil de lunettes de protection, gants en caoutchouc, tablier de labo et bottes. Résultats de mélange phénol avec l’acide sulfurique aussi dans une réaction exothermique, qui se traduira par des tubes s’échauffer.
    4. Pipetter 800 µL de l’échantillon de chaque éprouvette dans chacun des 3 cuves semi-micro polystyrène 1,5 mL (3 répétitions techniques par exemple). Régler le spectrophotomètre à lire à 490 nm. Étalonnage à une cuvette vide contenant de l’eau distillée avant de lire les normes ou les échantillons inconnus et par intermittence tout au long de la lecture de l’échantillon. Chaque cuvette faire executer un spectrophotomètre et mesurer l’absorbance. Moyenne dans l’ensemble technique réplique pour chaque échantillon inconnu.
      Remarque : Dans certains cas, des échantillons peuvent surpasser le seuil d’absorption supérieure. Dans l’affirmative, les échantillons doivent être dilués au palier 3.2.3. Les dilutions doivent également être comptabilisées dans les calculs ultérieurs.
    5. Calculer l’absorbance moyenne pour chaque norme.
      Remarque : Pour calculer la quantité de glucides digestibles totales présents dans chaque échantillon inconnu à l’aide de la courbe d’étalonnage, il est plus facile à régresser l’absorption moyenne de chaque norme contre le microgrammes de D (+) glucose présent dans chaque norme, mais on peut aussi tracer la concentration de glucose de D (+) (µg/µL) de chaque norme si désirable. Cependant, les calculs suivants, consulter une courbe standard basée sur microgrammes, pas des concentrations (µg/µL).
    6. Calculer la courbe d’étalonnage en traçant l’absorbance moyenne par rapport au montant total de D (+) glucose (µg) dans chaque solution étalon. Monter une ligne de régression linéaire de ces données et ensuite utiliser l’équation suivante pour calculer la quantité totale de glucides (µg) dans chaque échantillon inconnu :
      Mc = (((Ax -b)/m)/(15)) * 1000
      Mc = µg d’hydrates de carbone dans l’échantillon
      Unx = absorbance moyenne d’échantillon inconnu
      b = ordonnée à l’origine (standard de régression)
      m = pente (courbe de régression standard)
      Le coefficient de corrélation de cette ligne devrait être supérieur à 0,98 et régulièrement près de 0,99. Ensuite, utilisez l’équation suivante pour déterminer le pourcentage de glucides dans chaque échantillon :
      Pc = ((Mc/1000) / (Mi)) * 100
      Pc = % de glucides
      Mj’ai = masse initiale de l’échantillon (mg)

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Representative Results

Pour montrer l’utilité de ces méthodes, nous avons analysé les protéines solubles et la teneur en glucides digestibles de quatre différents domaines et des tissus de maïs doux qui servent de distinctes ressources nutritionnelles potentielles pour les insectes herbivores. Nous avons recueilli des épis de maïs provenant de trois régions agricoles aux Etats-Unis (Minnesota, la Caroline du Nord et Texas), qui englobe les cinq variétés de maïs sucré (c.-à-d., les génotypes) et une variété de maïs comme un exogroupe. Le tableau 3 montre un résumé de ces échantillons de maïs et où ils ont été recueillis. Toutes les variétés ont été récoltées à maturité, mais en raison des différences de développement entre les variétés, ils n’ont pas tous recueillis lors de la journée même après la plantation. Nous avons traité les oreilles dans les tissus distinctes en séparant rapidement les spathes (feuilles modifiées entourent le s/n), et soies (brillants fibres entre la cosse et noyaux) de l’oreille avant de ranger tous les tissus à-80 ° C comme indiquent dans les méthodes. Chaque tissu a été ensuite lyophilisé. Une fois sec, nous avons séparé les noyaux de la base et la pointe de l’oreille en rasant les noyaux de la top tiers (Conseil) et en bas un tiers (base) de la cob. Ensuite, tous les tissus ont été moulues en poudre fine. Nous avons ensuite analysé cosse, soie, noyau de pointe et des échantillons de tissu de noyau de base pour les protéines solubles et teneur en glucides digestibles conformément aux procédures énoncées dans les méthodes ci-dessus. Etant donné les contraintes sur la quantité de tissu disponible, nous avons analysé un total de 217 échantillons de végétaux pour les protéines solubles et la teneur en glucides digestibles.

Protéines solubles
Nous traversait le spectrophotomètre au total neuf plaques d’échantillon, et des courbes dans l’ensemble, le standards avaient élevé des coefficients de corrélation (r), avec des valeurs comprises entre 1.00 0,985. La figure 1 montre la courbe d’étalonnage obtenue avec le plus haut (A) et les valeurs de r (B) le plus bas à exposer la variabilité entre les plaques. Nous avons calculé le % de protéines solubles pour tous les échantillons à l’aide de la masse de l’échantillon initial (tableau 4) et ensuite analysé les données pour la teneur en protéines solubles des différences statistiques entre les régions, les variétés et types de tissus. Données ont été transformées par grade pour répondre aux hypothèses de normalité lorsque cela est nécessaire.

Nous avons observé des différences significatives dans la teneur en protéines solubles entre régions (ANOVA Welch ; F(2, 133,5) = 4.303, P = 0,015), comme un résultat, les données de chaque région ont été par la suite analysées séparément. Les échantillons de Minnesota ont montré une interaction significative entre la variété ou du type de tissu sur la teneur en protéines solubles (ANOVA bidirectionnelle ; F(3, 64) = 16.51, P < 0,001). Plupart des tissus étaient semblable protéine soluble contenu dans les deux variétés, à l’exception des noyaux de base, où la variété de maïs sucré contenue près de 7 fois la quantité par rapport à la variété de maïs. Pour la variété de maïs de grande culture (Syngenta/NK-3122A-EZ), coques et les soies étaient semblables et avaient la plus faible teneur en protéines solubles de tous les tissus. Les noyaux de la pointe de l’oreille ont la plus haute teneur en protéines solubles et les noyaux de la base de l’oreille sont intermédiaires (Figure 2 a). Pour la variété de maïs sucré (Providence Bicolor), tous les tissus étaient distinctes, avec les coques et les soies contenant la plus faible teneur en protéines solubles et base amandes contenues ~2.5 fois plus que les noyaux de pointe (Figure 2 b).

Échantillons de Caroline du Nord a également montrent une interaction significative entre la variété et le type de tissu (ANOVA bidirectionnelle ; F(3, 77) = 3.33, P < 0,024). Plupart des tissus a montré semblable protéine soluble contenu dans l’ensemble de variétés, à l’exception des noyaux de pointe qui présentaient une teneur plus élevée en non -Bt variété (Sweet G90 hybride). Pour le Bt , enveloppes de variété (Seedway Bt 1576) étaient le tissu avec la plus basse protéine soluble contenu, suivie de soies et de grains de pointe, qui avaient un contenu similaire. Grains de base étaient la plus forte teneur en protéines solubles, mais n’étaient pas statistiquement différentes de celle des noyaux de pointe (Figure 2c). Dans la variété non -Bt (Sweet G90 hybride), tous les tissus étaient distinctes à l’exception de la pointe et la base amandes qui étaient statistiquement similaires. Spathes étaient la plus basse protéine soluble contenue, suivie de soies et noyaux de pointe et la base qui avaient contenu le plus élevé (Figure 2d).

Échantillons de Texas ont montré des différences significatives dans la teneur en protéines solubles entre variétés (ANOVA bidirectionnelle ; F(1, 76) = 12.91, P = 0,001) et tissus (ANOVA bidirectionnelle ; F(3, 76) = 21.90, P < 0,001), mais aucune interaction significative (ANOVA bidirectionnelle ; F(3, 76) = 0.436, P = 0,728). Dans l’ensemble, la variété bicolore (Sh2 SS2742 NAT III) ont montré une teneur moyenne de protéines solubles plus faible que la variété Silver Queen (TRTD F1 (su)). Dans les deux variétés, cosses avaient la plus faible teneur en protéines, suivie de soies et puis bout et noyaux, qui avaient de même teneur élevée (Figure 2e-f) de base.

Glucides digestibles
Parce que tous les échantillons ont été analysés en même temps, nous avons couru seulement une courbe d’étalonnage. C de la figure 1 montre que le coefficient de corrélation était élevé, à 0,998. Nous avons calculé la teneur en glucides digestibles % pour tous les échantillons (tableau 5) et ensuite analysé les données des différences statistiques en glucides digestibles entre régions, les variétés et types de tissus. Données ont été transformées rang lorsque cela est nécessaire pour répondre aux hypothèses de normalité.

Il n’y a pas de différences significatives entre les régions (analyse de la variance ; F(2, 216) = 1,47, P = 0,231), mais dans un souci de continuité avec les analyses de protéines encore une fois, nous avons analysé les données de chaque région séparément. Échantillons de Minnesota ont montré aucune différence significative dans la teneur en glucides digestibles entre variétés (ANOVA bidirectionnelle ; F(1, 64) = 0.00014, P = 0,990) ou le type de tissu (ANOVA bidirectionnelle ; F(3, 64) = 0,818, P = 0,489). Il n’y avait également aucune interaction significative entre variété et tissus (ANOVA bidirectionnelle ; F(3, 64) = 2.26, P = 0,092). Figure 2 a -b montre que tous les tissus présentaient une teneur moyenne de 36,5 % (± 0,53).

Échantillons de Caroline du Nord ont montré un effet significatif du type de tissu sur la teneur en glucides digestibles (ANOVA bidirectionnelle ; F(3, 77) = 3,99, P = 0,011), mais aucun effet de variété (ANOVA bidirectionnelle ; F(1, 77) = 1.06, P = 0,307) ou d’une interaction (ANOVA bidirectionnelle ; F(3, 77) = 0,465, P = 0,708). Figure 2c -d indique que les soies avaient la plus faible teneur en glucides digestibles, suivi par des cosses, astuce et amandes de base. Tous les tissus ont été statistiquement similaires à l’exception de soies et de grains de base.

Échantillons de Texas a montré aucun effet significatif de la variété (ANOVA bidirectionnelle ; F(1, 76) = 0,834, P = 0,364) ou le type de tissu (ANOVA bidirectionnelle ; F(3, 76) = 1,03, P = 0,385), mais n’a montré une interaction significative (ANOVA bidirectionnelle ; F(3, 76) = 3.34, P = 0,024). Cet effet a été en grande partie parce que base amandes dans la variété bicolore (Sh2 SS2742 NAT III) avaient un glucide digestible significativement plus élevé que ceux de la variété Silver Queen la teneur (TRTD F1 (su)). Figure 2e -f montre qu’il n’y a aucune différence statistique dans la teneur en glucides digestibles dans l’ensemble de types de tissus dans la variété Silver Queen (TRTD F1 (su)), mais il y avait une différence significative entre la soie et les tissus de base de noyau pour la variété bicolor ( SH2 SS2742 NAT III).

Figure 1
Figure 1. Courbes standard pour des dosages de macronutriments. (A) la courbe d’étalonnage pour le dosage de la protéine soluble montrant la plaque avec le plus haut coefficient de corrélation (meilleure courbe). (B) la courbe d’étalonnage pour le dosage de la protéine soluble montrant la plaque avec le plus bas coefficient de corrélation (courbe de pire). (C) la courbe d’étalonnage pour le dosage des glucides digestibles. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Que signifie % soluble de protéine et teneur en glucides digestibles % pour chaque type de tissu. (A) MN - Bt Syngenta/NK-3122A-EZ (maïs), (B) MN - non -Bt Providence Bicolor, (C) Seedway NC - Bt 1576, (D) NC - non -Bt Sweet G90 hybride, (E) TX - Sh2 SS2742 F1 NAT III Bicolore, (F) TX - Silver Queen TRTD F1 (su). Cercles affichent des données brutes, alors que carrés affichent les valeurs moyennes. Vert (cosse), rouge (soie), jaune (cerneaux de pointe) et violet (cerneaux de base). Les pointillés-lignes reliant l’origine de chaque carré montrent le rapport de P:C pour chacun des tissus (ratio représente la pente de la ligne pointillée). Lettres afficher les résultats post hoc pour différences de protéines le long les différences haut et hydrates de carbone sur le côté, avec des lettres différentes, ce qui représente des valeurs significativement différentes à travers les tissus. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

IgG Concentration (ug/uL) Protéines dans des échantillons étalons (ug)
0.0000 0
0,0125 2
0.0250 4
0,0375 6
0,0500 8
0,1000 16

Table 1. Calculs de la courbe d’étalonnage pour le dosage de la protéine soluble. La quantité de protéines dans chaque norme est calculée en prenant la concentration de chaque étalon et en multipliant par la quantité de solution standard dans chaque puits (160 µL).

Glucose de D (+) Concentration (ug/uL) D (+) glucose dans les échantillons étalons (ug)
0.0000 0
0,0375 15
0,0750 part 30
0.1125 45
0.1500 60
0,1875 75

Le tableau 2. Calcul de la courbe d’étalonnage pour l’analyse de glucides digestibles. La quantité de glucose dans chaque norme est calculée en prenant la concentration de chaque étalon et en multipliant par la quantité de solution standard dans chaque tube à essai (400 µL).

Région Variété Emplacement N
Minnesota BT Syngenta/NK-3122A-EZ (maïs) Rosemount, MN (44.7070,-93.1073) 10
non - Bt Providence Bicolor Rosemount, MN (44.7070,-93.1073) 10
Caroline du Nord non - Bt Sweet G90 hybride Rocky Mount, Caroline du Nord (35.8918,-77.6780) 10
Seedway Bt 1576 Edenton, Caroline du Nord (36.1758,-76.7057) 10
Texas SH2 SS2742 F1 NAT III Bicolor Lubbock, TX (33.6935,-101.8249) 10
Silver Queen TRTD F1 (su) Lubbock, TX (33.6935,-101.8249) 10

Tableau 3. Sommaire de l’emplacement de prélèvement d’échantillons de maïs et de variétés. Pour chaque combinaison de région et de la variété, 10 oreilles ont été recueillies et quatre tissus ont été analysés : cosse, soies, astuce et amandes de base.

Région Variété % de protéines solubles
brou soies noyau de pointe noyau de base
Minnesota BT Syngenta/NK-3122A-EZ (maïs) 3,29 ± 0,38 4,57 ± 1,27 14,74 ± 1,54 7,07 ± 0,84
non - Bt Providence Bicolor 3.35 ± 0,58 6.71 ± 0,70 17.87 ± 3,85 48,41 ± 2,85
Caroline du Nord non - Bt Sweet G90 hybride 2.90 ± 0,60 6,97 ± 0,63 12,95 ± 0,86 12.23 ± 0,83
Seedway Bt 1576 5.48 ± 0,73 9.08 ± 0.62 10.75 ± 0,93 12.76 ± 1,16
Texas SH2 SS2742 F1 NAT III Bicolor 7,74 ± 1,03 12.15 ± 0,63 ± 14,79 0,69 ± 14,88 0,48
Silver Queen TRTD F1 (su) 6.06 ± 1,05 8,17 ± 0,79 12,95 ± 1,19 12.32 ± 1,23

Tableau 4. Les valeurs de protéines moyennes pour chaque type de région, la variété et le tissu. Dire les pourcentages (par masse sèche) sont montrés ± 1 SE.

Région Variété % de glucides digestibles
brou soies noyau de pointe noyau de base
Minnesota BT Syngenta/NK-3122A-EZ (maïs) 37.55 ± 0,88 32,31 ± 1,38 36.79 ± 1,60 38.66 ± 1.57
non - Bt Providence Bicolor 37.30 ± 0,82 37,31 ± 2.30 35,80 ± 1,77 34.83 ± 1,37
Caroline du Nord non - Bt Sweet G90 hybride 35,79 ± 0,81 35.28 ± 1,17 36.13 ± 0,91 39.47 ± 1.18
Seedway Bt 1576 35.75 ± 0,58 34,91 ± 0,76 35.73 ± 1,35 37.29 ± 1.13
Texas SH2 SS2742 F1 NAT III Bicolor 35.55 ± 0,87 33.40 ± 1,10 34.85 ± 1,01 39.14 ± 1,22
Silver Queen TRTD F1 (su) 34.63 ± 1.13 33.42 ± 2.33 35,16 ± 1,16 33.93 ± 1,03

Tableau 5. Les valeurs de glucides moyennes pour chaque type de région, la variété et tissus. Dire les pourcentages (par masse sèche) sont montrés ± 1 SE.

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Discussion

En combinant les dosages colorimétriques bien établies avec des protocoles efficaces propres à chaque usine d’extraction, les essais ont démontré ici fournissent une méthode raisonnable et précise pour mesurer les protéines solubles de la plante et la teneur en glucides digestibles. Nos résultats à l’aide de maïs comme un exemple illustre comment ces protocoles peuvent être utilisés pour obtenir des mesures précises à travers différentes échelles spatiales pertinentes sur le plan biologique. Par exemple, nous avons été en mesure de détecter des différences dans les protéines solubles de la plante et la teneur en glucides digestibles géographique régions, variétés (ou génotypes), types de tissus et tissus même dans l’espace réservés. Les deux tests peuvent être faits à l’aide de matériel de laboratoire et des réactifs, nécessitant uniquement des compétences de laboratoire de base, communs et permet d’analyser un nombre relativement élevé d’échantillons (50-75) dans un délai court.

Bien que relativement facile à exécuter, certaines étapes sont plus critiques que d’autres et si fait correctement peuvent restreindre l’exactitude des résultats. Par exemple, il est impératif que les matières végétales sont manipulés correctement pendant la phase d’échantillonnage. Tissus de la plante même disséqués restera métaboliquement active jusqu'à ce que l’exposé à une température létale, et durant cette période plante teneur en macronutriments peut changer. En conséquence, longues périodes entre usine d’échantillonnage et de gel (soit en stockage de liquides N ou au congélateur) peuvent augmenter la probabilité que la teneur en macronutriments plante échantillon peut-être ne pas refléter le contenu qui était présent au moment de l’échantillonnage.

Étapes 2.3.3-2.3.5 dans le protocole de protéine sont particulièrement importants pour la réussite, car ces étapes traitent les protéines précipitées. Il faut pour éviter de perdre de l’extrait concentré de protéine quand aspirer le surnageant TCA provenant des tubes de microcentrifuge, parce que cela se traduira par une sous-estimation de la teneur en protéines. Il est également important lors du lavage de l’extrait concentré de protéine avec de l’acétone pour le faire très rapidement. L’acétone peut dégrader le culot si laissée en contact pendant plus de quelques secondes. Nous vous conseillons de limiter le contact entre l’acétone et le culot à moins de 5 secondes. Enfin, lors du séchage de la pastille, il est important de prendre soin de seulement prévoir suffisamment de temps pour l’acétone s’évaporer. Si la pastille est laissée à sécher pendant trop longtemps, il devient très difficile de resuspendre dans NaOH. Nous suggérons la pastille de séchage pendant 30 minutes et puis vérifiant la présence d’acétone, en observant visuellement le liquide dans le tube soit en détectant soigneusement l’odeur des vapeurs d’acétone. Poursuivre la vérification de la pastille toutes les 10-15 minutes jusqu'à évaporation de l’acétone.

Décrites dans Bradford 197616, les étapes de la quantification à l’aide de colorant de G-250 bleu brillant de Coomassie permettent pour une sensibilité élevée, avec un écart-type de protéine de seulement 5 µg/mL, la stabilité complexe haute protéine-colorant et ingérence limitée par composés non protéiques. Ce test a une portée de détection entre 1 à 20 µg de protéines totales par microplaque bien (dosage faible concentration), soit un maximum de 25 µg/mL ; Cependant, toute concentration qui dépasse les plus hauts standards doit être diluée et ré-analysée pour les résultats les plus précis (le protocole produit un excès de solution dans le cas où ces dilutions et la ré-analyse est nécessaire). Il y a un biais pour le colorant lier préférentiellement à des acides aminés basiques, tels que l’arginine et de résidus d’acides aminés aromatiques ; Cependant, l’analyse de Bradford reste la méthode plus précise et facile à utiliser pour la quantification des protéines totales dans les échantillons mixtes.

L’essai de glucides digestibles est une méthode simple, rapide et rentable pour quantifier les saccharides plante tout en excluant des hydrates de carbone structurales (tels que la cellulose), qui sont indigestes de la plupart des herbivores. Les étapes plus problématiques dans les essais d’hydrates de carbone sont des étapes 3.2.1 et 3.3.2-3.3.4. Ici, il est essentiel de garder les tubes verticaux et serrer la vis bien en bouillant, car l’introduction de l’eau va diluer les échantillons et affecter une quantification précise. Également, les soins doivent être prises lorsque vous travaillez avec le phénol et concentrent acide sulfurique, car tous deux sont très corrosifs. Il est à noter que nous préconisons enregistrement absorbance d’échantillon à 490 nm, ce qui est l’absorbance maximale pour les hexoses, mais pas des autres sucres, comme les pentoses et acides uroniques qui ont une absorption maximum à 480 nm20,21. Pour les mélanges de sucre dans des échantillons de végétaux, 490 nm offre une longueur d’onde appropriée de quantification globale en glucides contenu22,23,24, mais pour une analyse plus détaillée des différents sucres voir20, 21. Il devrait aussi être noté que Masuko et al. 23 fournit une méthode de microplaque simplifiée pour l’analyse des hydrates de carbone acide sulfurique-phénol.

Une autre méthode remarquable pour estimer la plante en éléments nutritifs contenu25,26,27 est la spectroscopie proche infrarouge (NIRS). La technologie NIRS est largement utilisée dans l’agriculture et la production alimentaire. Cette autre technique est non invasive et non destructeur, prend une fraction du temps impliqué dans n’importe quelle méthode de chimie par voie humide et peut être appliquée à différentes échelles d’un paysage vers le bas pour une pièce de tissus végétaux. Cette technique mesure nutriments indirectement et s’appuie sur des mesures précises chimie humide de la substance végétale d’intérêt pour l’étalonnage. Les méthodes décrites dans les présentes auront donc un endroit critique à l’avenir de l’analyse des éléments nutritifs végétaux, s’assurant que l’étalonnage est basée sur la quantification des macronutriments soluble et assimilable et pas faussée par les substituts élémentaires acalorique.

Les méthodes présentées pour la mesure de la protéine soluble plant et teneur en glucides digestibles ont des implications importantes pour les sciences environnementales et biologiques. Malgré une foule de renseignements sur la composition élémentaire des tissus végétaux, les informations sur la teneur en macronutriments plante sont cruellement. Compte tenu de la limitation qui existerait corrélation entre les mesures élémentaires avec macronutriments content et reconnaissant la relation entre l’usine de processus écologiques nutritionnelle ordre contenu et supérieur, obtenir ce genre de données est essentielle pour faire progresser les domaines de la physiologie végétale, écologie nutritionnelle, des interactions plantes-herbivores trophique dynamique11,28,29,30. C’est notre espoir que fournit une méthodologie claire et accessible pour la mesure des protéines solubles de la plante et la teneur en glucides digestibles encouragera les chercheurs à recueillir et intégrer ce type de données de recherches futures.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Merci à tous nos collaborateurs qui ont participé avec des collections de champ de maïs sucré, dont Dominic Reisig Dan Mott à North Carolina State University et Pat Porter à Texas A & M University à Lubbock, au Texas. Merci à Fiona Clissold pour aider à optimiser les protocoles et de fournir des modifications à ce manuscrit. Ce travail a été soutenu en partie par la Texas A & M C. STRUILLOU Salyer Fellowship (département d’entomologie) et la biotechnologie risque évaluation Grant programme compétitif Don no 2015-33522-24099 de l’US Department of Agriculture (décerné à gaz et STB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
microplate reader (spectrophotometer) Bio-Rad Model 680 XR
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent concentrate Bio-Rad #5000006 450mL

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