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Developmental Biology

इंजीनियरिंग प्रत्यारोपण-उपयुक्त रेटिना वर्णक उपकला ऊतक मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पन्न

Published: September 6, 2018 doi: 10.3791/58216
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 4, 5, 1,2
1U861, I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), 2U861, I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Université Evry Val-d'Essonne (UEVE), 3I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Centre pour L’Etude des Cellules Souches (CECS), 4Banque de tissus humain, Hôpital Saint Louis, Assistance Publique - Hôpitaux de Paris (AP-HP), 5Sorbonne Université, INSERM, CNRS, Institut de la Vision, F-75012

Summary

हम मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं मानव एमनियोटिक झिल्ली के शीर्ष पर कल्चरित और पशु मॉडलों में भ्रष्टाचार के लिए अपनी तैयारी से व्युत्पंन रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं से बना एक रेटिना ऊतक इंजीनियर करने के लिए एक विधि का वर्णन ।

Abstract

नेत्र की कई रोग स्थितियों कार्यक्षमता और/या रेटिना वर्णक उपकला (RPE) के अस्तित्व को प्रभावित. ये रेटनाइटिस pigmentosa (आरपी) और उम्र से संबंधित धब्बेदार अध-पतन (AMD) के कुछ रूपों में शामिल हैं । सेल थेरेपी सबसे होनहार चिकित्सकीय इन रोगों के इलाज के लिए प्रस्तावित रणनीतियों में से एक है, पहले से ही मनुष्य में प्रारंभिक परिणामों को बढ़ावा देने के साथ । हालांकि, भ्रष्टाचार की तैयारी की विधि vivo मेंउसके कार्यात्मक परिणामों पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है । दरअसल, RPE कोशिकाओं एक सेल निलंबन के रूप में भ्रष्टाचारी एक ही कोशिकाओं एक रेटिना ऊतक के रूप में प्रत्यारोपित की तुलना में कम कार्यात्मक हैं. इस के साथ साथ, हम एक सरल और reproducible विधि का वर्णन करने के लिए इंजीनियर RPE ऊतक और इसकी तैयारी में एक के लिए vivo आरोपण. मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पंन RPE कोशिकाओं को एक जैविक समर्थन पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, मानव एमनियोटिक झिल्ली (हैम) । कृत्रिम पाड़ों की तुलना में, इस समर्थन एक तहखाने झिल्ली है कि Bruch की झिल्ली के करीब है जहां अंतर्जात RPE कोशिकाओं संलग्न कर रहे है होने का लाभ है । हालांकि, इसके हेरफेर आसान नहीं है, और हम vivo मेंभ्रष्टाचार के लिए अपनी उचित संवर्धन और तैयारी के लिए कई रणनीतियों का विकास किया ।

Introduction

RPE के अस्तित्व और photoreceptors के homeostasis के लिए महत्वपूर्ण है जिसके साथ यह कसकर जुड़ा हुआ है1. कई रोग की स्थिति आरपी और AMD सहित अपनी कार्यक्षमता और/

आरपी विरासत में मिला monogenic उत्परिवर्तनों कि photoreceptors या RPE कोशिकाओं या दोनों2,3के कार्यों को प्रभावित का एक समूह है । यह अनुमान है कि उत्परिवर्तनों कि विशेष रूप से प्रभावित RPE कोशिकाओं आरपी2के 5% के लिए खाते । AMD एक और शर्त है जहां RPE परत बदल गया है, केंद्रीय दृष्टि नुकसान के लिए अंततः अग्रणी । AMD आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारकों की जटिल बातचीत के कारण होता है और बुजुर्ग4,5,6को प्रभावित करता है । अनुमानों के अनुसार, AMD २०२०7द्वारा दुनिया भर में १९६,०००,००० रोगियों के लिए एक चिंता का विषय होगा । इन विकारों के लिए, कोई प्रभावी इलाज मौजूद है, और प्रस्तावित रणनीतियों में से एक है नई RPE कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए मर/कार्यात्मक मौजूदा RPE कोशिकाओं8।

अंतिम उत्पाद के निर्माण की विधा को भ्रष्टाचारित होना करने के लिए सबसे अच्छा कार्यात्मक परिणाम सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है । RPE कोशिकाओं को एक सेल निलंबन के रूप में इंजेक्शन, प्रसव का एक आसान और सरल तरीका होने के बावजूद, उनके अस्तित्व, एकीकरण के बारे में चिंताओं को बढ़ा, और कार्यक्षमता9,10,11,12 , 13. वैज्ञानिकों अबऔर अधिक जटिल योगों इंजीनियर रेटिना ऊतक9,13,14,15,16देने के लिए विकसित कर रहे हैं । इस संदर्भ में, हम एक मूल विधि इन विट्रो RPE ऊतक कि प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता में उत्पन्न करने के लिए विकसित9.

RPE सेल बैंकों मानव भ्रूण स्टेम (ES) कोशिकाओं से व्युत्पंन इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है । हालांकि, विभिंन सेल स्रोतों से वैकल्पिक RPE सेल बैंकों (मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल, प्राथमिक RPE कोशिकाओं, आदि) और एक अलग विधि के साथ विभेदित भी इस प्रोटोकॉल के लिए उपयुक्त हैं । यह साइटोकिंस और/या छोटे अणुओं17,18,19,20,21,22का उपयोग करते हुए भेदभाव प्रोटोकॉल निर्देशित शामिल हैं ।

प्रत्यारोपण किया जा करने के लिए, इंजीनियर ऊतक एक पाड़ पर तैयार किया जाना चाहिए । पिछले कुछ वर्षों में, विभिंन पाड़ों एक बहुलक के आधार पर या जैविक मूल के एक मैट्रिक्स पर विकसित किए गए13,23,24। यहाँ, जैविक सब्सट्रेट इस्तेमाल किया हैम है, लेकिन अन्य सब्सट्रेट, नंगा Bruch झिल्ली की तरह, लागू किया जा सकता है. यहां वर्णित विधि एक जैविक पाड़ है कि अधिक RPE देशी पर्यावरण के लिए प्रासंगिक है का उपयोग करने का लाभ है ।

मानव ES cell-व्युत्पन्न RPE कोशिकाओं को कम से 4 सप्ताह के लिए प्रसंस्कृत किया जाता है ताकि पूरी तरह से एक cobblestone monolayer के रूप में संगठित हो सके । उस चरण में, उपकला प्राप्त कार्यात्मक और ध्रुवीकरण9है. अंत में, इस ऊतक के रूप में आसानी से झुर्रियां, यह एक hydrogel वाहक की एक पतली परत में एंबेडेड इसे और अधिक कठोरता और लोच देने के लिए और इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान इसे बचाने के लिए है । यह उत्पाद तो 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत है जब तक भ्रष्टाचार ।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त सभी मानव सामग्री यूरोपीय संघ विनियमों के अनुसार उपयोग किया गया था । मानव ES सेल लाइन इस अध्ययन में इस्तेमाल एक अद्वितीय भ्रूण से प्राप्त किया गया था । जो दंपति ने भ्रूण दान किया था, उन्हें पूरी जानकारी दी गई और एक गुमनाम दान के लिए अपनी सहमति दे दी । एक नैदानिक ग्रेड मानव ES सेल लाइन इस भ्रूण से व्युत्पंन किया गया था, बैंक, योग्य, और ठीक से Roslin कोशिकाओं (ब्रिटेन) द्वारा प्रलेखित । hAMs माताओं में एक सीजेरियन सेक्शन के दौरान बाँझ शर्तों के तहत खरीद रहे थे, जो अस्पताल के दिशा निर्देशों (APHP, Hôpital सेंट लुई) के अनुसार अपरा दान के लिए एक सूचित सहमति पर हस्ताक्षर किए ।

1. संस्कृति मीडिया और रिएजेंट की तैयारी

  1. RPE सेल कल्चर मीडियम की तैयारी
    1. RPE सेल संस्कृति माध्यम तैयार करने के लिए, 4% सीरम विकल्प जोड़ें (५०० एमएल के एक अंतिम खंड के लिए 20 मिलीलीटर), 1, 000x पतला 2-mercaptoethanol (५०० एमएल के अंतिम खंड के लिए ५०० µ एल), और 1% Eagle′s ंयूनतम आवश्यक माध्यम (मेम) गैर आवश्यक अमीनो एसिड समाधान (एक अंतिम के लिए 5 मिलीलीटर ५०० मिलीलीटर की मात्रा) है Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) उच्च ग्लूकोज (५०० मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए ४७५ मिलीलीटर) ।
  2. परिवहन/संरक्षण माध्यम की तैयारी
    1. परिवहन/संरक्षण माध्यम तैयार करने के लिए,2-स्वतंत्र मध्यम (५०० मिलीलीटर की अंतिम मात्रा के लिए ४९५ मिलीलीटर) के 1% पेनिसिलिन-streptomycin (5 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा के लिए ५०० मिलीलीटर) का जोड़ें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें ।
  3. thermolysin एंजाइम का पुनर्निलंबन
    1. thermolysin के शेयर सॉल्यूशन की तैयारी
      1. thermolysin का एक शेयर समाधान तैयार करने के लिए, गल thermolysin पाउडर, जो-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया गया था, कमरे के तापमान पर ।
      2. के रूप में एंजाइमी गतिविधि बैच के लिए बैच से चर सकता है, इस गतिविधि का उपयोग किया जा करने के लिए बैच के thermolysin पाउडर के साथ प्रदान की विश्लेषण के प्रमाण पत्र के आधार पर गणना । विभाजित "गतिविधि तटस्थ को छेड़ो गणना = ANPC" (विश्लेषण के प्रमाण पत्र में संकेत दिया) द्वारा १८१ (जो है tyrosine आणविक वजन) । प्राप्त किए गए thermolysin पाउडर की कुल एंजाइमी गतिविधि से संबंधित परिणाम (यू/
      3. २०० (यू/एमएल) द्वारा विभाजित कुल एंजाइमी गतिविधि (यू/शीशी) के लिए इसी पानी की मात्रा जोड़कर २०० U/एमएल में एक शेयर समाधान तैयार करें ।
      4. एंजाइम को पानी कि ऊपर और नीचे जोड़ा गया था pipetting द्वारा भंग । भंवर 30 एस के लिए समाधान और जांच करें कि पाउडर पूरी तरह से निलंबित कर दिया गया है । अधिक pipetting एक पूर्ण विघटन के लिए आवश्यक हो सकता है ।
      5. शेयर समाधान Aliquot-20 डिग्री सेल्सियस पर यह स्टोर ।
    2. thermolysin के कार्य समाधान की तैयारी
      नोट: thermolysin समाधान हैम उपचार के दिन पर तैयार किया जाना चाहिए ।
      1. गल-20 ° c में संग्रहित २०० U/mL पर thermolysin का स्टॉक aliquots । 1 U/एमएल के अंतिम एंजाइमी गतिविधि प्राप्त करने के लिए फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पंजाब) में स्टॉक समाधान 200x को पतला करें । 1-4 हैम पैच के इलाज के लिए ४० मिलीलीटर तैयार करें ।
      2. thermolysin समाधान के माध्यम से एक ०.२ µm फ़िल्टर का उपयोग करने से पहले फ़िल्टर करें ।
  4. जिलेटिन का पुनर्निलंबन
    1. 20% जिलेटिन समाधान और ब्लॉक की तैयारी
      नोट: 20% जिलेटिन समाधान और ब्लॉक का उपयोग करने से पहले 1 सप्ताह के लिए तैयार किया जा सकता है ।
      1. 30 मिनट (1 घंटे के लिए) के लिए एक पानी के स्नान में सह2-स्वतंत्र माध्यम ४२ ° c गर्म । एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में, गरम सह2के ४० मिलीलीटर-स्वतंत्र माध्यम और भंवर समाधान के लिए जिलेटिन की 10 ग्राम जोड़ें ।
      2. ४२ डिग्री सेल्सियस पर 30-60 मिनट के लिए जिलेटिन भंग । समाधान homogenize करने के लिए प्रत्येक 10 मिनट भंवर ।
      3. एक बार समाधान सजातीय है, चार 6 सेमी संस्कृति व्यंजन के लिए 20% जिलेटिन समाधान के 4 मिलीलीटर जोड़ें । बुलबुले से बचें । बर्तन की रक्षा के लिए एक प्लास्टिक आयल फिल्म जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर जमना के समाधान की अनुमति दें ।
    2. 8% जिलेटिन समाधान की तैयारी
      नोट: 8% जिलेटिन समाधान उपयोग करने से पहले दिन तैयार किया जा सकता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत ।
      1. 30 मिनट के लिए ४२ ° c के लिए सह2-स्वतंत्र माध्यम गर्म (1 घंटे तक) । एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में,2गरम सह के ४६ मिलीलीटर के लिए जिलेटिन की 4 जी-स्वतंत्र माध्यम और भंवर समाधान जोड़ें ।
      2. ४२ डिग्री सेल्सियस पर 30-60 मिनट के लिए जिलेटिन भंग । ट्यूब की रक्षा के लिए एक प्लास्टिक आयल फिल्म जोड़ें और इसे बाद में इस्तेमाल किया जा रहा है अगर यह एक ही दिन का उपयोग किया जा करने के लिए है, तो इसे एक पानी के स्नान में ३७ डिग्री सेल्सियस पर रखने के लिए, या यह 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान ।

2. मानव एमनियोटिक झिल्ली का Thermolysin उपचार

  1. मानव एमनियोटिक झिल्ली धो
    1. hAMs छोटे टुकड़ों के रूप में आपूर्ति की है (लगभग 30 मिमी x 30 मिमी) एक नायलॉन पाड़ में तय, या तो पहले से ही 4 डिग्री सेल्सियस पर पंजाब या जमे हुए । यदि जमे हुए प्रदान की, गल ३७ ° c में झिल्ली 30 मिनट के लिए एक मशीन में ।
    2. झिल्ली धो लें:
      1. एक २५० मिलीलीटर की बोतल में 1-4 झिल्ली प्लेस-पंजाब के ८० मिलीलीटर युक्त । आवश्यकता के रूप में कई बोतलों का प्रयोग करें ।
      2. 5 मिनट के लिए एक उच्च गति से एक प्लेट शेखर में प्रत्येक बोतल शेक, तो पंजाबियों को त्यागें । पंजाब के ८० मिलीलीटर जोड़ें और दोहराएं ।
  2. Thermolysin उपचार
    1. thermolysin (1 यू/एमएल) झिल्ली से युक्त बोतल प्रति (1-4 झिल्ली, एक समय में 3 बोतलों के लिए) के कार्य समाधान के ४० मिलीलीटर जोड़ें ।
    2. ४५० rpm पर 5 मिनट के लिए बोतलें हिला और फिर उंहें 30 एस के लिए भंवर 1x ।
    3. thermolysin समाधान छोड़ें और पंजाब के ८० मिलीलीटर जोड़ें ।
    4. ४५० rpm पर 5 मिनट के लिए बोतलें हिला । पंजाबियों को छोड़ें और पंजाब के ८० मिलीलीटर जोड़ें । 3x दोहराएं ।

3. एक संस्कृति डालने पर मानव एमनियोटिक झिल्ली का निर्धारण

  1. लंबे बाँझ संदंश का उपयोग करें (कि बोतल के नीचे तक पहुँच सकते हैं) एक के बाद एक hAMs को दूर करने के लिए, और एक 10 मुख्यमंत्री संस्कृति के लिए प्रत्येक हैम हस्तांतरण पंजाब के 10 मिलीलीटर युक्त पकवान ।
  2. पंजाब के 10 मिलीलीटर युक्त एक नया 10 सेमी संस्कृति पकवान में, नीचे का सामना करना पड़ नायलॉन के साथ झिल्ली के एक जगह है । चार क्लिप है कि नायलॉन के लिए झिल्ली को ठीक करने के लिए उपयोग किया जाता है के दो अलग ।
  3. नायलॉन और झिल्ली के बीच संस्कृति डालने के छोटे अंगूठी डालें ।
  4. सुनिश्चित करें कि झिल्ली छोटे अंगूठी पूरी तरह से शामिल है । झिल्ली के शीर्ष पर संस्कृति डालने के दूसरे भाग क्लिप । hAM की बेसमेंट झिल्ली कल्चरल insert के अंदर उठ कर सामने आ रही है. पिछले दो क्लिप्स अलग ।
  5. कटौती, बाँझ कैंची के साथ, यदि आवश्यक हो तो संस्कृति सम्मिलित बाहर झिल्ली की अधिक. संदंश का प्रयोग, एक 12-अच्छी तरह से थाली में संस्कृति डालने में तय झिल्ली हस्तांतरण, पंजाबियों जोड़ने, और एक मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2में थाली की दुकान ।
  6. इन कार्रवाइयों को दोहराएं (चरण ३.२ से ३.५) अंय झिल्ली के साथ ।

4. गल और मानव एमनियोटिक झिल्ली पर रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं के बोने

  1. रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं के गल
    1. RPE सेल बैंक प्रति क्रायोजेनिक शीशी लिक्विड नाइट्रोजन में १,०००,००० कोशिकाओं पर जमे हुए है । गल के रूप में कई क्रायोजेनिक शीशियों के रूप में आवश्यक (३५०,००० कोशिकाओं के प्रति झिल्ली बीज हैं) ।
    2. क्रायोजेनिक शीशी प्रति RPE मध्यम के 3 मिलीलीटर युक्त एक 15 मिलीलीटर ट्यूब तैयार करें । एक बार शीशी गल जाए तो कोशिकाओं को हर ट्यूब पर ट्रांसफर कर दीजिये । अंय शीशियों के लिए इस कार्रवाई को दोहराएं ।
    3. Homogenize (पिपेट ऊपर और नीचे कुछ समय RPE माध्यम में कोशिकाओं resuspend करने के लिए) और सेल समाधान के 10 µ एल ले और एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण । trypan नीला के 10 µ l को जोड़ें । एक गिनती कक्ष में इस समाधान के 15 µ एल प्लेस, तो एक 4x उद्देश्य के साथ एक खुर्दबीन के नीचे व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या (नीले रंग में नहीं) गिनती । अंय शीशियों के लिए इस कार्रवाई को दोहराएं ।
    4. इस बीच में, 5 मिनट के लिए ११० x g पर 15 मिलीलीटर ट्यूबों केंद्रापसारक । supernatant को छोड़ें और ७००,००० कक्षों/एमएल पर कक्षों को पुनर्स्थगित करें ।
  2. मानव एमनियोटिक झिल्ली में रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं के सीडिंग
    1. 12-अच्छी तरह से मशीन से झिल्ली युक्त थाली निकालें ।
    2. पंजाबियों को महाप्राण । कल्चर डालने के केंद्र में स्टेप 4.1.4 में तैयार किए गए सेल सस्पेंशन के ५०० µ l को जोड़ें । संस्कृति डालने के बाहर (अच्छी तरह से अंदर) RPE मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें । अंय झिल्ली के लिए दोहराएं ।
    3. 12-अच्छी तरह से मशीन में झिल्ली युक्त प्लेट रखें ।

5. मानव एमनियोटिक झिल्ली पर रेटिना वर्णक उपकला कोशिका संस्कृतियों का रखरखाव

  1. प्रति सप्ताह मध्यम 2x नवीनीकृत, आम तौर पर सोमवार और शुक्रवार को, जब तक कम संस्कृति के 30 दिन ।
  2. महाप्राण के अंदर और बाहर एक अच्छी तरह के लिए संस्कृति डालने के माध्यम और ताजा मध्यम (संस्कृति डालने के बाहर 1 मिलीलीटर और ५०० µ एल अंदर) नवीनीकृत । ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2पर मशीन में थाली प्लेस ।

6. प्रत्यारोपण के लिए रेटिना वर्णक उपकला पैच की तैयारी

नोट: संस्कृति के 30 दिन में शुरू, ऊतक प्रत्यारोपण के लिए तैयार है ।

  1. 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक पानी में स्नान में 8% जिलेटिन समाधान गर्म । शीत सह2-स्वतंत्र माध्यम (4 डिग्री सेल्सियस से कम) के साथ vibratome के आंतरिक चैंबर भरें ।
  2. vibratome में 20% जिलेटिन ब्लॉक प्लेस ।
    1. 6 सेमी संस्कृति फ्रिज से 20% जिलेटिन के ब्लॉक युक्त पकवान ले लो । एक स्केलपेल का प्रयोग, एक 5 सेमी एक्स 5 सेमी ब्लॉक में कटौती । cyanoacrylate गोंद या इसके समकक्ष के साथ समर्थन करने के लिए ब्लॉक के ऊपर की ओर पेस्ट करें ।
    2. vibratome में एक नया ब्लेड लगाएं ।
    3. ब्लॉक के स्तर को समायोजित जब तक यह उस्तरा ब्लेड के एक ही स्तर पर है ।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर ताजा सह2-स्वतंत्र माध्यम के साथ समर्थन के आसपास स्नान भरें । ब्लॉक एक चिकनी सतह के लिए अग्रणी, समान रूप से काट रहा है जब तक एक मध्यम वेग का उपयोग कर vibratome के साथ ब्लॉक में कटौती । 0 स्थिति सेट करें ।
    5. महाप्राण जिलेटिन के ब्लॉक के आसपास मध्यम जब तक यह पूरी तरह से शुष्क है, और फिर 12-अच्छी संस्कृति ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन से ऊतकों युक्त थाली ले ।
    6. संदंश का प्रयोग, ध्यान से जिलेटिन ब्लॉक के शीर्ष पर संस्कृति डालने खोलो । कट, कैंची के साथ, झिल्ली के सभी भागों है कि कोशिकाओं को शामिल नहीं है (रिंग के बाहर जहां कोशिकाओं संस्कृति नहीं थे) । संपूर्ण अवशिष्ट माध्यम महाप्राण.
    7. झिल्ली को कवर करने के क्रम में ३७ डिग्री सेल्सियस पर तरल 8% जिलेटिन समाधान की 1 मिलीलीटर जोड़ें । सावधानी से अतिरिक्त निकालें । 5 रुको-8 मिनट के लिए जिलेटिन की अनुमति जमना ।
    8. जब तक झिल्ली को कवर किया जाता है तब तक ताजा सह2-स्वतंत्र मध्यम (4 डिग्री सेल्सियस) में नहाने के लिए जोड़ें ।
    9. कट, एक मध्यम वेग के साथ-१०० µm की स्थिति पर vibratome के साथ, कैसे ब्लॉक व्यवहार के बारे में पता शेष । अनुभाग के अंत में, ऊतक के उंमुखीकरण को बनाए रखने के लिए सावधान रहना ।
    10. एक स्केलपेल के साथ, अनुभाग के उंमुखीकरण की पहचान करने के लिए एक कोने में कटौती ।
    11. एक रंग के साथ जिलेटिन में एंबेडेड झिल्ली ले लीजिए और यह एक 6 अच्छी तरह से 4 डिग्री सेल्सियस पर संरक्षण माध्यम से भरा थाली में जगह है, जब तक यह प्राप्तकर्ता आंख में भ्रष्टाचार ।
    12. प्रत्यारोपण के समय, एक शल्य माइक्रोस्कोप के तहत प्राप्तकर्ता आंख के आकार के लिए प्रत्यारोपण के आकार को समायोजित (1 – चूहों के लिए 3, 10 – गैर के लिए 15 मिमी2 -मानव रहनुमा).

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Representative Results

hAMs एक उपकला परत है कि RPE कोशिकाओं के बोने से पहले हटा दिया जाना चाहिए होते हैं. झिल्ली का एक एंजाइमी उपचार मिलाते हुए के तहत thermolysin के साथ किया जाता है । आदेश में झिल्ली (उपकला एक तरफ है) के ध्रुवीकरण खोना नहीं है, यह एक समर्थन है जो संरचना प्रदाता के आधार पर अलग किया जा सकता है पर तय हो गई है (1a आंकड़ा) । इस कदम पर अपने समर्थन करने के लिए झिल्ली के आसंजन की जांच करें और यदि आवश्यक हो तो क्लिप जोड़ें । संस्कृति डालने में निर्धारण के समय, झिल्ली में छेद करने से बचने के लिए सावधानी से काम करना और तहखाने की झिल्ली का सामना करना पड़ के साथ अपनी ध्रुवीयता रखना (आंकड़ा 1b). जब कोशिकाओं झिल्ली पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, वे इन छेद से बच सकते है और अंतिम कोशिका एकाग्रता कम हो जाएगा । छेद की उपस्थिति एक खुर्दबीन के नीचे visualized हो सकता है या संस्कृति डालने के अंदर पंजाबियों जोड़कर और अगर पंजाबियों की जांच कर रहा है टपक रहा है । छेद के साथ किसी भी झिल्ली को छोड़ दिया जाना चाहिए ।

संस्कृति डालने पर निर्धारण के बाद, एक चरण के विपरीत सूक्ष्मदर्शी में अवशिष्ट कोशिकाओं की उपस्थिति (आंकड़े 1C और 1 डी) का मूल्यांकन किया है । शास्त्रीय, कुछ मृत कोशिकाओं झिल्ली की सतह पर रह सकता है, लेकिन उन कोशिकाओं को समाप्त हो जाएगा जब संस्कृति माध्यम बदल गया है (चित्रा 1C) । तहखाने झिल्ली के तंतुओं एक उच्च आवर्धन (चित्रा 1 डी) में देखा जा सकता है अगर कोई कोशिकाओं रहते हैं । अगर वह मामला नहीं है, thermolysin के साथ मशीन के समय समायोजित किया जा सकता है ।

RPE कोशिकाओं के बोने के बाद के दिनों में, अगर कोशिकाओं का पालन की जाँच करें । इस्तेमाल माइक्रोस्कोप पर निर्भर करता है, यह स्पष्ट रूप से पहले कुछ हफ्तों के दौरान कोशिकाओं को देखने के लिए मुश्किल हो सकता है, लेकिन कोशिकाओं का पालन नहीं करते हैं, कोशिकाओं सेल संस्कृति माध्यम में खाक छानने देखा जाएगा. एक बार उपकला का गठन किया है और परिपक्व करने के लिए शुरू होता है, यह एक खुर्दबीन (आंकड़े 2a, 2 बी, और 2c) के तहत इसे देखने के लिए आसान हो जाता है. 3 सप्ताह में, कोशिकाओं RPE (cobblestone संगठन) की एक पूरी monolayer उपकला ठेठ फार्म । 4 सप्ताह के बाद, उपकला आरोपण (चित्रा 2d) के लिए इसकी तैयारी के लिए पर्याप्त परिपक्व है । हालांकि, यह सैंय कारणों के लिए और अधिक हफ्तों के लिए संस्कृति में रखा जा सकता है ।

आरोपण के लिए भ्रष्टाचार की तैयारी चित्रा 3में बताई गई है । 20% जिलेटिन ब्लॉक करने के लिए झिल्ली की apposition पर, महाप्राण सभी अतिरिक्त सेल संस्कृति माध्यम । यह कदम महत्वपूर्ण है, के रूप में किसी भी शेष माध्यम RPE और झिल्ली को 8% जिलेटिन की आसंजन बाधा सकता है । दरअसल, मध्यम जिलेटिन की परतों के बीच तरल की एक फिल्म बनेगी ।

प्रत्यारोपण की embedding के लिए इस्तेमाल किया जिलेटिन एक अलग ताकत का हो सकता है, इसके ब्लूम सूचकांक पर निर्भर करताहै (यानी, एक गुणवत्ता नियंत्रण परीक्षण, प्रदर्शन किया और आपूर्तिकर्ताओं द्वारा प्रदान की है, कि एक मानकीकृत तापमान पर एक जेल की ताकत का मूल्यांकन और एकाग्रता). यदि इस्तेमाल किया जिलेटिन कठोर नहीं है और भ्रष्टाचार के दौरान समुच्चय, इस्तेमाल किया जिलेटिन संदर्भ एक उच्च शक्ति के साथ एक दूसरे को बदल दिया जाना चाहिए । जिलेटिन की एकाग्रता भी बदल सकता है, प्रयोग के आधार पर, अपनी शक्ति और लोच को समायोजित करने के लिए ।

Figure 1
चित्रा 1: हैम के प्रतिनिधि छवियों से पहले और thermolysin उपचार और एक संस्कृति डालने पर निर्धारण के बाद । (एक) एक ऊतक बैंक द्वारा आपूर्ति की झिल्ली की प्रतिनिधि छवि । (ख) एक संस्कृति डालने पर तय की झिल्ली की प्रतिनिधि छवि । (ग) एक कम आवर्धन पर thermolysin के साथ इलाज झिल्ली की प्रतिनिधि छवि । (घ) एक उच्च आवर्धन पर thermolysin के साथ इलाज झिल्ली की प्रतिनिधि छवि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: RPE कोशिकाओं बोने पर हैम के प्रतिनिधि छवियां । (एक) बीज बोने से पहले झिल्ली की प्रतिनिधि छवि । (ख और ग) 3 सप्ताह के बाद बीज पर झिल्ली पर RPE कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियों । झिल्ली पूरी तरह से planar के रूप में पैनल सीमें देखा नहीं हो सकता है । स्केल बार = १०० µm (C), आवर्धन के लिए 20 µm । (घ) 30 दिनों में एक झिल्ली पर RPE कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवि के बाद सीडिंग, उंहें जिलेटिन में embedding के समय के लिए इसी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: योजना इंजीनियर रेटिना एक जिलेटिन फिल्म के अंदर हैम पर RPE कोशिका परत युक्त ऊतक के शामिल किए जाने के लिए क्रमिक चरणों का वर्णन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

हम एक जैविक पाड़ और पशु मॉडलों में आरोपण के लिए इसकी तैयारी पर RPE कोशिकाओं की संस्कृति के लिए एक विधि का वर्णन किया । प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम के एक सभी प्रक्रिया के साथ हैम के उंमुखीकरण के रखरखाव जब तक जिलेटिन में शामिल है । दरअसल, झिल्ली का मूल उपकला हटा दिया जाता है और उसके तहखाने झिल्ली9उजागर हो जाता है. RPE कोशिकाओं को इस तहखाने झिल्ली के शीर्ष पर वरीयता प्राप्त किया जाना है । जिलेटिन embedding के लिए तैयारी पर, यह निर्धारित तापमान पर सभी उत्पादों के साथ काम करने के लिए महत्वपूर्ण है । दरअसल, जिलेटिन की संपत्ति 4 डिग्री सेल्सियस पर कठोर और शरीर के तापमान पर तरल (३७ डिग्री सेल्सियस)9है । यदि तापमान का संमान नहीं है, जिलेटिन एक कदम है जहां इस प्रभाव वांछित नहीं है पर जमना या दव्र बनाना सकता है ।

कई जैविक पाड़ों Descemet की झिल्ली25 या hAMs26की तरह, प्रस्तावित किया गया है । विशेष रूप से, hAMs, एक सीजेरियन सेक्शन से27, रेटिना की जगह में अच्छी तरह से सहन किया जा करने के लिए प्रदर्शन किया गया, सीमित सूजन के कारण और धमनियां neovascularization26को कम करने । झिल्ली सफलतापूर्वक मानव RPE कोशिकाओं9,28की संस्कृति का समर्थन करता है । इसके अलावा, इन झिल्ली भी29क्लीनिक में एक लंबा इतिहास है, RPE सेल थेरेपी के लिए एक पाड़ के लिए उंहें अच्छा उंमीदवार बना । अंय जैविक समर्थन आसानी से इस प्रोटोकॉल के साथ कार्यांवित किया जा सकता है । सिंथेटिक पाड़ बहुलक के आधार पर पहले से ही कठोर है और एक जिलेटिन की जरूरत नहीं हो सकता है आरोपण13,30,31,३२,३३से पहले embedding । आरोपण के लिए अन्य प्रणालियों को हाल ही में एक hESC-व्युत्पंन RPE monolayer पर एक कठोर पॉलिएस्टर पाड़३४ पर या Bruch झिल्ली ३५ की नकल करने के लिए डिजाइन एक सिंथेटिक parylene सब्सट्रेट पर मानव आंख में उपरेटिना वितरण के लिए विकसित किया गया है . हालांकि इन रणनीतियों का वादा कर रहे हैं, हम मानते है कि जैविक पाड़ RPE ऊतक इंजीनियरिंग के लिए सबसे अच्छा मंच प्रदान हो सकता है ।

इस प्रोटोकॉल में, बीज RPE कोशिकाओं मानव ES एक सहज भेदभाव विधि का उपयोग कर कोशिकाओं से व्युत्पंन थे । हालांकि, RPE कोशिकाओं के विभिंन प्रकार इस्तेमाल किया जा सकता है, या तो मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं से या प्राथमिक RPE cadavers से प्राप्त कोशिकाओं से या यहां तक कि एक RPE सेल लाइन से विभेदित19,३६,३७, ३८. इसके अलावा, यदि pluripotent स्टेम कोशिकाओं का उपयोग, कई प्रोटोकॉल पिछले वर्षों में विकसित करने के लिए एक सहज भेदभाव के आधार पर RPE कोशिकाओं को प्राप्त करने या छोटे अणुओं का उपयोग करने के लिए18,22भेदभाव मार्गदर्शन कर रहे थे । RPE इन विभिंन भिंनता प्रोटोकॉल से प्राप्त कोशिकाओं को भी ऊतक इंजीनियरिंग के लिए इस पद्धति के साथ प्रयोग किया जा सकता है ।

इस विधि की एक सीमा 4 ° c पर एंबेडेड ऊतक की स्थिरता है । के रूप में यह सिर्फ सर्जरी साइट के लिए शिपमेंट से पहले जिलेटिन में शामिल है, यह engraftment तक इस तापमान पर बनाए रखा है । उस संदर्भ में, सर्जरी ४८ एच के भीतर किया जाना चाहिए ।

इस विधि को आसानी से क्लिनिक में स्थानांतरित किया जा सकता है । RPE जिलेटिन में एंबेडेड ऊतक 4 डिग्री सेल्सियस पर सह2-स्वतंत्र माध्यम में संरक्षित है । इस माध्यम से प्रतिस्थापित किया जा सकता है, यदि आवश्यक हो, दूसरों के साथ पहले से ही अमेरिका के खाद्य और औषधि प्रशासन द्वारा अनुमोदित (एफडीए) कॉर्निया के संरक्षण के लिए प्राप्त पोस्टमार्टम और जो मनुष्यों में प्रत्यारोपण के लिए उपयोग किया जाता है । हम सफलतापूर्वक एक सबूत में प्रत्यारोपण के लिए इस रणनीति की दक्षता का प्रदर्शन किया-अवधारणा के अध्ययन में कुतर मॉडल9, और हम वर्तमान में एक नैदानिक परीक्षण के लिए इसे लागू करने से पहले गैर-मानव रहनुमाओं में शल्य चिकित्सा दृष्टिकोण मान्य कर रहे हैं RPE को प्रभावित करने वाले आरपी के विशिष्ट रूपों के साथ रोगियों का इलाज करने के लिए ।

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Disclosures

ओलिवर Goureau लंबित पेटेंट मानव pluripotent स्टेम सेल से रेटिना कोशिकाओं की पीढ़ी से संबंधित पर आविष्कारक है । दूसरे लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक Jérôme Larghero और वैलेरी Vanneaux (Hôpital सेंट लुइस, पेरिस, फ्रांस) के लिए अपने इनपुट की स्थापना के दौरान यहां वर्णित विधि का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

यह काम ANR [GPiPS: ANR-२०१०-RFCS005 से अनुदान द्वारा समर्थित था; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], शौकीनों डाल ला सभ्य Médicale [जैव इंजीनियरिंग कार्यक्रम-DBS20140930777] और से LABEX पुनर्जीवित [ANR-10-LABX-७३] ओलिवर Goureau और Christelle Monville के लिए । यह NeurATRIS द्वारा समर्थित किया गया था, तंत्रिका विज्ञान में एक शोधों के लिए अनुवादात्मक अनुसंधान अवसंरचना (Investissements d'Avenir) [ANR-11-INBS-0011] और INGESTEM, राष्ट्रीय अवसंरचना (Investissements d'Avenir) इंजीनियरिंग के लिए pluripotent और विभेदित स्टेम कोशिकाएं [ANR-11-INBS-000] to Christelle Monville. करीम बेन M'Barek मंद Stempole और LABEX पुनर्जीवित [ANR-10-LABX-७३] से फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था । मैं स्टेम दुर्लभ रोग एसोसिएशन फ़्रांसेज़ contre लेस Myopathies (AFM)-Téléthon द्वारा समर्थित के लिए चिकित्सा संस्थान का हिस्सा है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile biosafety cabinet TechGen International Not applicable
Liquid waste disposal system for aspiration Vacuubrand BVC 21
CO2-controlled +37 °C cell incubator Thermo Electron Corporation BVC 21 NT
200 µL pipette: P200 Gilson F144565
1 mL pipette: P1000 Gilson F144566
Pipet aid Drummond 75001
+4 °C refrigerator Liebherr Not applicable
Vibratome Leica VT1000S
Fine scissors WPI 501758
Forceps (x2) WPI 555227F
Water bath Grant subaqua pro SUB6
Precision balance Sartorius CP225D
Centrifuge Eppendorff 5804
Microscope Olympus SC30
Horizontal Rocking Shaker IKA-WERKE IKA MTS 214D
Vortex VWR LAB DANCER S40
Disposable Scalpel WPI 500351
plastic paraffin film VWR PM992
0.200 µm single use syringe filter SARTORIUS 16532
Syringe without needle 50 mL Dutscher 50012
Bottles 250 mL Dutscher 28024
15 mL sterile Falcon tubes Dutscher 352097
50 mL sterile Falcon tubes Dutscher 352098
culture insert Scaffdex C00001N
60 mm cell culture disches: B6 Dutscher 353004
12 well cell culture plate Corning 3512
6-well culture plates Corning 3506
Razor blades Ted Pella, Inc 121-9
Cyanoacrylate glue Castorama 3178040670105
PBS 1x (500 mL) Sigma D8537
Thermolysine Roche 5339880001
DMEM, high glucose, GlutaMAX Invitrogen 61965-026
KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS) Invitrogen 12618-013
MEM-NEAA (100x) Invitrogen 11140-035
b-mercaptoethanol (50 mM) Invitrogen 31350-010
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140122
CO2-independent medium GIBCO 18045-054
Gelatin MERCK 104078
human amniotic membrane Tissue bank St Louis hospital (Paris, France) Not applicable

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References

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