Summary
Мы описываем метод инженер ткани сетчатки, состоящий из эпителиальных клеток сетчатки пигмент, производный от человеческих плюрипотентных стволовых клеток, культивируемых на вершине человека амниотической мембраны и подготовки ее к прививке в животных моделях.
Abstract
Ряд патологических состояний глаз влияет на функциональность и/или выживание пигментный эпителий сетчатки (ПЭС). К ним относятся некоторые формы пигментный ретинит (RP) и возрастной макулярной дегенерации (AMD). Клеточная терапия является одним из наиболее перспективных терапевтических стратегий, предложенных для лечения этих заболеваний, с уже обнадеживающие предварительные результаты в организме человека. Однако метод подготовки трансплантат имеет значительное влияние на его функциональных результатов в естественных условиях. Действительно НПП клетки, привитые как суспензию клеток менее функциональной, чем те же клетки, пересаженные в ткани сетчатки. Здесь мы опишем простой и воспроизводимый метод инженер НПП ткани и ее подготовка к имплантации в естественных условиях . НПП клетки, полученные из человеческих плюрипотентных стволовых клеток являются семенами на биологических поддержки, человека амниотической мембраны (Хам). По сравнению с искусственных лесов, эта поддержка имеет преимущество базальной мембраны, что близко к мембраны Бруха, где прилагаются эндогенного НПП клетки. Однако его манипуляции не легко, и мы разработали ряд стратегий для ее надлежащего культивирования и подготовки для прививки в естественных условиях.
Introduction
НПП имеет решающее значение для выживания и гомеостаза фоторецепторов, с которыми это тесно связанные1. Ряд патологических состояний изменить его функциональность и/или выживание, включая RP и AMD.
RP — это группа унаследованных Моногенные мутаций, которые влияют на функции фоторецепторов или НПП клетки или оба2,3. Предполагается, что мутации, которые влияют на специально НПП клетки приходится 5% RP2. AMD является еще одним условием, где изменяется уровень ПЭС, ведущих в конечном итоге на центральное зрение потери. AMD обусловлено сложных взаимодействий генетических и экологических факторов и затрагивает пожилых4,5,6. Согласно прогнозам AMD будет проблемой для 196 миллионов пациентов во всем мире к 2020 году7. Для этих расстройств Существует нет эффективного лечения, и одна из предлагаемых стратегий является трансплантация новых НПП клеток для того чтобы компенсировать мертвых/нефункциональных существовавшие ранее НПП клетки8.
Режим разработки окончательного продукта, чтобы быть привиты имеет важное значение для обеспечения лучших функциональных результатов. НПП клетки вводят в виде суспензии клеток, несмотря на легкий и простой метод доставки, вызывают озабоченность по поводу их выживания, интеграции и функциональность9,10,11,12 , 13. ученые в настоящее время разрабатывают более сложных составов для доставки инженерии тканей сетчатки9,13,14,,1516. В этом контексте мы разработали оригинальный метод для создания в vitro НПП ткани, которые могут быть использованы для трансплантации9.
Банки НПП клеток, полученные из клеток человеческих эмбриональных стволовых (ES) используются в настоящем Протоколе. Однако альтернативные НПП мобильных банков из источников различных клеток (человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, первичный НПП клетки и т.д.) и продифференцировано с другой метод, также пригодны для этого протокола. Она включает в себя направленного дифференцирования протоколов с помощью цитокинов и/или малых молекул,1718,19,20,21,22.
Чтобы быть трансплантированы, инженерии ткани должен быть подготовлен на леске. В последние несколько лет различные строительные леса были разработаны на основе полимера или на матрицу биологического происхождения13,,23-24. Здесь биологического субстрата используется ветчина, но других субстратов, как оголенные мембраны Бруха, могут быть реализованы. Метод, описанный здесь имеет преимущество использования биологических эшафот, что более актуально для родной среде ПЭС.
Человеческие клетки ES клеток ПЭС культивированный для по крайней мере 4 недель для того, чтобы быть полностью организованы как булыжник монослоя. На этом этапе эпителии полученных функциональных и поляризованных9. Наконец как эта ткань морщины легко, он внедрен в тонком слое гидрогеля перевозчика дать ему больше жесткости и упругости и защитить его во время процедуры инъекции. Затем этот продукт хранится при температуре 4 ° C до прививки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все человеческие материалы, используемые в настоящем протоколе были использованы в соответствии с правилами Европейского союза. Человеческой линии клеток ES, используемые в данном исследовании была получена из уникальных эмбриона. Пара, кто пожертвовал эмбрион был полностью информированы и дали согласие на анонимное пожертвование. Линия человеческие клетки ES клинико класс был производным от этого эмбрион, накренился, квалифицированный и должным образом документально Roslin клетки (Великобритания). Окорока были закуплены в стерильных условиях во время кесарева сечения у матерей, которые подписали информированного согласия для плаценты пожертвование согласно руководство больницы (APHP, Hôpital Сент-Луис).
1. Подготовка культуры средств массовой информации и реагенты
-
Подготовка среды культуры клеток НПП
- Для подготовки среды культуры клеток НПП, добавьте 4% сыворотки замену (20 мл для окончательный объем 500 мл), 1000 x разбавленным 2-меркаптоэтанол (500 мкл окончательный объем 500 мл) и 1% Eagle′s минимальных основных средних (MEM) несущественные аминокислот решение (5 мл для окончательного объемом 500 мл) до Дульбекко изменение орла среднего (DMEM) высокая глюкозы (475 мл окончательный объем 500 мл).
-
Подготовка транспорта/сохранения среды
- Чтобы подготовить средства транспорта/сохранения, добавить 1% пенициллин-стрептомицина (5 мл на окончательный объем 500 мл) CO2-независимый средний (495 мл окончательный объем 500 мл) и держать его на 4 ° C.
-
Ресуспендирования фермента thermolysin
- Подготовка Стоковый раствор thermolysin
- Чтобы подготовить Стоковый раствор thermolysin, оттепели thermolysin порошок, который был сохранен при-20 ° C, при комнатной температуре.
- Как Ферментативная активность может быть переменная от партии к партии, вычислите эту деятельность на основании свидетельства о анализа с порошком thermolysin пакета для использования. Разделить «активность нейтральной протеазы рассчитывается = ANPC» (указывается в сертификат анализа) 181 (который тирозина в молекулярный вес). Полученный результат соответствует общей Ферментативная активность предоставленный thermolysin порошка (U/флакона).
- Подготовьте раствор на 200 ед/мл, добавляя объем воды, соответствующую общей ферментативной активности (U/флакона) делится на 200 (ед/мл).
- Растворите фермента, дозирование воды, которая была добавлена вверх и вниз. Вихревой решение для 30 s и проверить ли порошок полностью приостановлена. Более закупорить могут потребоваться для полного растворения.
- Алиготе Стоковый раствор и хранить его при-20 ° C.
- Приготовление рабочего раствора thermolysin
Примечание: Решение thermolysin должны быть готовы в день обращения с ветчиной.- Оттепель запасов аликвоты thermolysin на 200 ед/мл, хранятся при температуре-20 ° C. Разбавьте раствор 200 x в фосфат амортизированное saline (PBS) для того чтобы получить окончательный Ферментативная активность 1 ед/мл. Подготовьте 40 мл для лечения 1 – 4 ветчина патчи.
- Фильтр thermolysin решение через фильтр 0.2 мкм до использования.
- Подготовка Стоковый раствор thermolysin
-
Ресуспендирования желатина
- Подготовка 20% раствор желатина и блок
Примечание: 20% раствор желатина и блок может быть готовы до 1 неделю перед использованием.- Теплый CO2-независимый средний до 42 ° C на водяной бане 30 мин (до 1 ч). Добавьте в 50 мл трубки, 10 г желатина в 40 мл утепленные CO2-независимый средний и вихревой решение.
- Растворить желатин для 30 – 60 мин при 42 ° C. Вихревой каждый 10 мин для гомогенизации решения.
- После того, как решение однородной, добавьте 4 мл раствора 20% желатина четыре блюда культуры 6 см. Избегайте пузырей. Добавить фильм пластиковые парафин для защиты блюда и позволяют решение закрепить на 4 ° C.
- Подготовка 8% раствор желатина
Примечание: 8% желатина решение может готовить в день до использования и хранить при 4 ° C.- Теплый CO2-независимый средний до 42 ° C за 30 мин (до 1 ч). В 50 мл трубки, добавить 4 g желатина 46 мл утепленные CO2-независимый средний и вихревой решение.
- Растворить желатин для 30 – 60 мин при 42 ° C. Добавьте фильм пластиковые парафин для защиты трубки и держать его в водяной бане при 37 ° C, если она будет использоваться в тот же день, или хранить при 4 ° C, если она будет использоваться позднее.
- Подготовка 20% раствор желатина и блок
2. Thermolysin лечение человека амниотической мембраны
-
Мыть человека амниотической мембраны
- У ветчины, поставляется как мелкие кусочки (примерно 30 x 30 мм) исправлена в нейлон леску, либо уже при температуре 4 ° C в PBS или заморожены. Если замороженные, оттепель мембраны при 37 ° C в инкубаторе для 30 мин.
- Вымойте мембраны:
- Место 1 – 4 мембраны в флаконе 250 мл, содержащих 80 мл ФСБ. Используйте как много бутылок по мере необходимости.
- Встряхнуть каждая бутылка в шейкере пластина с высокой скоростью на 5 минут, а затем отбросить PBS. Добавьте 80 мл PBS и повторить.
-
Thermolysin лечение
- Добавить 40 мл рабочего раствора thermolysin (1 ед/мл) за бутылку, содержащие мембраны (1 – 4 мембраны на бутылки; до 3 бутылки в то время).
- Встряхнуть бутылки для 5 мин при 450 об/мин, а затем вихревой их для 30 s. повторить 1 x.
- Отменить решение thermolysin и добавьте 80 мл ФСБ.
- Встряхните бутылки для 5 мин при 450 об/мин. Отменить PBS и добавьте 80 мл ФСБ. Повторите 3 x.
3. Фиксация человека амниотической мембраны на вставке культуры
- Используйте длинные стерильный пинцет, (который можно добраться до нижней части бутылки) для удаления окорока по одному и передавать каждый Хэм культуры блюдо 10 см, содержащие 10 мл PBS.
- В новой культуры 10 см блюдо содержащие 10 мл PBS место один из оболочек с нейлоном, вниз. Отсоедините два из четырех клипов, которые используются для устранения мембраны нейлона.
- Вставьте меньший кольцо культуры вставки между нейлона и мембраны.
- Убедитесь, что мембрана охватывает небольшие кольца полностью. Клип со второй частью культуры вставки на верхней части мембраны. Базальной мембраны ветчиной вверх внутри вставить культуры. Отсоедините два последних клипов.
- Вырежьте, стерильными ножницами, избыток мембраны вне культуры Вставка при необходимости. С помощью щипцов, передачи мембраны, фиксированной в культуре insert к пластине 12-хорошо, добавить PBS и хранить пластину в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2.
- Повторите эти операции (от шага 3,2-3,5) с другими мембраны.
4. оттаивания и заполнение клеток сетчатки пигментного эпителия на человека амниотической мембраны
-
Отогрева клетки сетчатки пигментного эпителия
- Банк клеток НПП замораживается на 1 миллион клеток в криогенных флакон в жидком азоте. Оттепель столько криогенных флаконы по необходимости (350 000 клеток посеян на мембраны).
- Подготовка 15 мл трубка, содержащая НПП среды на криогенных флакон 3 мл. Как только разморожен флакона, передача клетки к каждой трубе. Повторите эту операцию для других флаконов.
- Однородный (Пипетка вверх и вниз несколько раз для Ресуспензируйте клеток в среде НПП) и принять 10 мкл раствора клеток и перенести его на 1,5 мл. 10 мкл Трипановый синий. Место 15 мкл этого решения в Счетной палате, затем подсчитать количество жизнеспособных клеток (не окрашены в синий) под микроскопом с 4 X цели. Повторите эту операцию для других флаконов.
- В то же время центрифуга для 15 мл пробирок на 110 x g для 5 минут удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки на 700 000 клеток/мл.
-
Посев из клетки сетчатки пигментного эпителия человека амниотической мембраны
- Снять пластину 12-а, содержащий мембраны из инкубатора.
- Аспирационная PBS. 500 мкл суспензии клеток, подготовленную на этапе 4.1.4 в центре культуры вставки. Добавьте 1 mL НПП среды вне культуры вставка (внутри колодца). Повторите для других оболочек.
- Место пластину 12-а, содержащий мембраны в инкубаторе.
5. поддержание культур клеток сетчатки пигментного эпителия на человека амниотической мембраны
- Продлить среднего 2 x в неделю, обычно в понедельник и пятницу, до тех пор, пока по крайней мере 30 дней культуры.
- Аспирационная среднего внутри и за пределами культуры вставка для каждой скважины и возобновить его с свежие среднего (1 мл за пределами культуры вставки и 500 мкл внутри). Место пластину в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2.
6. Подготовка сетчатки пигментного эпителия патч для трансплантации
Примечание: Начиная день 30 культуры, тканей готовых для трансплантации.
- Теплый раствор 8% желатина в водяной бане при 37 ° C на 30 мин заполнения внутренней палаты vibratome с холодной CO2-независимый средний (при 4 ° C).
-
Поместите блок желатина 20% в vibratome.
- Возьмите блюдо культуры 6 см, содержащий блок 20% желатина из холодильника. С помощью скальпеля, вырезать блок 5 x 5 см. Вставьте в верхней части блока для поддержки с Цианакрилатный клей или его эквивалент.
- Место нового лезвия в vibratome.
- Отрегулируйте уровень блока до тех пор, пока он находится на том же уровне лезвие бритвы.
- Наполнить ванну вокруг поддержки с свежими CO2-независимый средний при 4 ° C. Вырежьте блок с vibratome с использованием средней скорости, пока равномерно вырезать блок, что приводит к гладкой поверхности. Установите в положение 0.
- Аспирационная среды вокруг блок желатина, до тех пор, пока она полностью высохнет, а затем взять 12-ну культуры пластины, содержащий тканей из инкубатора 37 ° c.
- С помощью щипцов, тщательно открываете культуры вставки на верхней части блока желатина. С ножницами, вырежьте все части мембраны, которые не содержат клетки (за пределами кольца, где не были культивируемых клеток). Аспирационная весь остаточный среднего.
- Добавьте 1 мл жидкого раствора желатина 8% при 37 ° C для покрытия мембраны. Осторожно удалите избыток. Подождите 5-8 мин разрешить желатин затвердеть.
- Добавить свежие CO2-независимый средний (при 4 ° C) в ванну, пока покрыто мембраны.
- Вырежьте, с vibratome на позиции-100 мкм, с средней скоростью, оставаясь в курсе как ведет себя блок. В конце раздела будьте осторожны, чтобы сохранить ориентацию ткани.
- С помощью скальпеля вырежьте угол для определения ориентации секции.
- Собирать мембраны, встроенных в желатин с помощью шпателя и поместите его в тарелку 6-ну заполнены с сохранения среды при температуре 4 ° C, до прививки в получателя глаз.
- В то время трансплантации Отрегулируйте размер имплантата с размером получателя глаза под микроскопом хирургические (1 – 3 для крыс, 10 – 15 мм2 для нечеловеческих приматов).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Окорока содержат эпителиального пласта, который должен быть удален перед посевом НПП клеток. Ферментативная обработка мембраны выполняется с thermolysin под встряхивания. В порядке не чтобы не потерять полярности мембраны (эпителий находится на одной стороне), он фиксируется на поддержки, в состав которой могут быть разными в зависимости от провайдера (рис. 1A). Проверка адгезии мембраны для своей поддержки на этот шаг и при необходимости добавить клипы. В то время фиксации в культуре insert работать осторожно, чтобы избежать дыр в мембране и держать ее полярности с базальной мембраны, вверх (рис. 1B). Когда клетки посеян на мембраны, они могут убежать от этих отверстий и окончательный клетки концентрация будет сокращен. Наличие отверстия могут быть визуализированы под микроскопом или путем добавления PBS внутри insert культуры и проверки, если утечка PBS. Любые мембраны с отверстиями должны быть отброшены.
После фиксации на Вставка культуры наличие остаточного клеток в фазово контрастной Микроскоп является вычисленное (цифры 1 c и 1 D). Классически, несколько мертвых клеток может оставаться на поверхности мембраны, но эти клетки будут устранены при изменении культуры среднего (рис. 1 c). Белки базальной мембраны можно увидеть с большим увеличением (рис. 1 d), если не клетки остаются. Если это не так, могут быть изменены сроки инкубации с thermolysin.
В первые дни после посева НПП клеток проверьте, если придерживаться клетки. В зависимости от Микроскоп используется это может быть трудно четко видеть клетки в течение первых нескольких недель, но если не придерживаться клетки, клетки будут рассматриваться плавающей вокруг в среде культуры клеток. Как только эпителий формируется и начинает Зрелые, она становится легче увидеть его под микроскопом (цифры 2A, 2Bи 2 C). На 3 недели клетки образуют полный монослоя эпителия, типичный НПП (булыжник организация). После 4 недель эпителий является достаточно зрелым для его подготовки к имплантации (Рисунок 2D). Однако она может храниться в культуре недель по техническим причинам.
Подготовка трансплантат для имплантации описана на рисунке 3. После приложение мембраны к блоку 20% желатина аспирационная все излишки клеток питательной среды. Этот шаг имеет важное значение, поскольку любые оставшиеся средства могут препятствовать адгезии 8% желатина ПЭС и мембраны. Действительно носитель будет образуют пленку жидкости между слоями желатина.
Желатин используется для встраивания имплантат может быть различной прочности, в зависимости от ее индекс Блум (т.е., контроль качества тестирования, выполнены и предоставляемые поставщиками, которая оценивает прочность геля на стандартизованной температуре и концентрация). Если используется желатин не является достаточно жесткой и отражает во время прививки, используется желатин ссылку следует заменить на другой с более высокой прочности. Концентрация желатина, также могут быть изменены, на основе экспериментов, чтобы отрегулировать его прочность и эластичность.
Рисунок 1: представитель изображения ветчины до и после лечения thermolysin и фиксации на культуру вставить. (A) представитель изображение мембраны, поставляемые банка тканей. (B) представитель изображение мембраны на вставке культуры. (C) представитель изображение мембраны, относились с thermolysin на малое увеличение. (D) представитель изображение мембраны, относились с thermolysin с высоким увеличением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: представитель изображения ветчины после посева НПП клетки. (A) представитель изображение мембраны перед посевом. (B и C) представитель изображений НПП клеток на мембраны на 3 недели после посева. Мембрана не может быть полностью плоской, как видно в панели C. Шкалы бар = 100 мкм (C), 20 мкм для увеличения. (D) представитель изображение НПП клеток на мембрану в течение 30 дней после посева, соответствующее время их встраивания в желатин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: схемы, описывающий последовательных шагов для включения инженерии тканей сетчатки, содержащие слоя клеток ПЭС на Хэм внутри желатин фильм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описали метод для культуры клеток ПЭС на биологические леску и его подготовка к имплантации в животных моделях. Одним из важнейших шагов протокола является поддержание ориентации Хэм вдоль всей процедуры до его включения в желатин. Действительно родной эпителия мембрану удаляется и его базальной мембраны становится подвергаются9. НПП клетки должны быть посеяны на вершине этой базальной мембраны. После подготовки для встраивания желатина крайне важно для работы со всеми продуктами при определенной температуре. Действительно желатин имеет свойство быть жесткой на 4 ° C и жидкости тела (37 ° C) температуры9. Если температура не соблюдается, желатин может затвердеть или расплавляться в шаге, где этот эффект не желателен.
Были предложены несколько биологических подмостей, как Десцеметовой мембраны25 или окорока26. В частности окорока, кесарева сечения27, были продемонстрированы быть хорошо переносится в субретинальное пространстве, вызывая ограниченное воспаление и снижение хориоидеи неоваскуляризация26. Мембрана успешно поддерживает культуру человека НПП клетки9,28. Кроме того эти мембраны также имеют долгую историю в клиниках29, что делает их хорошими кандидатами для лески для ПЭС клеточной терапии. Другие биологические поддерживает могут быть легко реализованы с настоящим Протоколом. Синтетические строительные леса, на основе полимера уже являются жесткими и не могли желатина, встраивание до имплантации13,30,,3132,33. Другие системы для имплантации недавно была разработана для субретинальное доставки в человеческий глаз Госкомсанэпиднадзором производные НПП монослоя на жесткой полиэстер эшафот34 или синтетических парилена субстрат предназначен для имитации мембраны Бруха35 . Даже несмотря на то, что эти стратегии являются многообещающими, мы считаем, что биологические леса может предоставить лучшей платформой для ПЭС тканевой инженерии.
В настоящем Протоколе семенами НПП клетки были получены с помощью метода спонтанное дифференцировки клеток человека ES. Однако могут быть использованы различные типы клеток ПЭС, либо продифференцировано от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток или от первичных НПП клетки, полученные из трупов или даже НПП клеток линии19,,3637, 38. Кроме того при использовании плюрипотентных стволовых клеток, несколько протоколов были разработаны в последние годы для получения клеток ПЭС на основе спонтанной дифференциации или с использованием малых молекул для дифференциации18,22. НПП клетки, полученные из этих различных дифференциация протоколов также может использоваться с этим методом для тканевой инженерии.
Один предел этого метода является стабильность встроенных ткани при 4 ° C. Как он включен в желатин только перед отправкой на хирургии сайт, он должен быть выдерживается при этой температуре до приживления. В этом контексте операции следует выполнять в течение 48 ч.
Этот метод может быть легко передан в клинику. НПП ткани, встроенных в желатин сохраняется на 4 ° C на CO2-независимый средний. Эта среда может быть заменен, при необходимости, с другими уже одобрен в США продуктов питания и медикаментов (FDA) для сохранения роговицы получил post-mortem и которые используются для трансплантации в людей. Мы успешно продемонстрировали эффективность этой стратегии для трансплантации в исследование грызунов модели9доказательства в концепция, и мы в настоящее время проверяют хирургический подход в нечеловеческих приматов до его осуществления для клинических испытаний для лечения пациентов с определенными формами RP, затрагивающих ПЭС.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Оливье Goureau является изобретателем на ожидании патентов, связанных с поколения клетки сетчатки от человеческих плюрипотентных стволовых клеток. Другие авторы имеют ничего не разглашать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Жером Larghero и Валери Vanneaux (Hôpital Сент-Луис, Париж, Франция) за их вклад в создание метода, описанного здесь.
Эта работа была поддержана от грантов от НРУ [GPiPS: АНР-2010-RFCS005; SightREPAIR: АНР-16-CE17-008-02], Фонд pour la Recherche сообщала [Программа инженерно био - DBS20140930777] и от LABEX ОЖИВИТЬ [АНР-10-LABX-73] Оливье Goureau и Кристель Монвиля. Оно было поддержано NeurATRIS, поступательные исследовательской инфраструктуры (будущее Investissements) для biotherapies в неврологии [АНР-11-INBS-0011] и INGESTEM, национальной инфраструктуры (будущее Investissements) техника для плюрипотентных и дифференцированные стволовые клетки [АНР-11-INBS-000] Кристель Монвиля. Карим Бен Мбарек была поддержана стипендии от DIM Stempole и LABEX ОЖИВИТЬ [АНР-10-LABX-73]. Стволовых является частью Biotherapies института для редких заболеваний, поддержке французской ассоциации contre les миопатии (AFM)-Téléthon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile biosafety cabinet | TechGen International | Not applicable | |
| Liquid waste disposal system for aspiration | Vacuubrand | BVC 21 | |
| CO2-controlled +37 °C cell incubator | Thermo Electron Corporation | BVC 21 NT | |
| 200 µL pipette: P200 | Gilson | F144565 | |
| 1 mL pipette: P1000 | Gilson | F144566 | |
| Pipet aid | Drummond | 75001 | |
| +4 °C refrigerator | Liebherr | Not applicable | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fine scissors | WPI | 501758 | |
| Forceps (x2) | WPI | 555227F | |
| Water bath | Grant subaqua pro | SUB6 | |
| Precision balance | Sartorius | CP225D | |
| Centrifuge | Eppendorff | 5804 | |
| Microscope | Olympus | SC30 | |
| Horizontal Rocking Shaker | IKA-WERKE | IKA MTS 214D | |
| Vortex | VWR | LAB DANCER S40 | |
| Disposable Scalpel | WPI | 500351 | |
| plastic paraffin film | VWR | PM992 | |
| 0.200 µm single use syringe filter | SARTORIUS | 16532 | |
| Syringe without needle 50 mL | Dutscher | 50012 | |
| Bottles 250 mL | Dutscher | 28024 | |
| 15 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352097 | |
| 50 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352098 | |
| culture insert | Scaffdex | C00001N | |
| 60 mm cell culture disches: B6 | Dutscher | 353004 | |
| 12 well cell culture plate | Corning | 3512 | |
| 6-well culture plates | Corning | 3506 | |
| Razor blades | Ted Pella, Inc | 121-9 | |
| Cyanoacrylate glue | Castorama | 3178040670105 | |
| PBS 1x (500 mL) | Sigma | D8537 | |
| Thermolysine | Roche | 5339880001 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965-026 | |
| KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS) | Invitrogen | 12618-013 | |
| MEM-NEAA (100x) | Invitrogen | 11140-035 | |
| b-mercaptoethanol (50 mM) | Invitrogen | 31350-010 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| CO2-independent medium | GIBCO | 18045-054 | |
| Gelatin | MERCK | 104078 | |
| human amniotic membrane | Tissue bank St Louis hospital (Paris, France) | Not applicable |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
- Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
- Gehrs, K. M., Anderson, D. H., Johnson, L. V., Hageman, G. S. Age-related macular degeneration--emerging pathogenetic and therapeutic concepts. Annals of Medicine. 38 (7), 450-471 (2006).
- Swaroop, A., Chew, E. Y., Rickman, C. B., Abecasis, G. R. Unraveling a multifactorial late-onset disease: from genetic susceptibility to disease mechanisms for age-related macular degeneration. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 10, 19-43 (2009).
- Khandhadia, S., Cherry, J., Lotery, A. J.
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Ben M'Barek, K., Regent, F., Monville, C. Use of human pluripotent stem cells to study and treat retinopathies. World Journal of Stem Cells. 7 (3), 596-604 (2015).
- Ben M'Barek, K., et al. Human ESC-derived retinal epithelial cell sheets potentiate rescue of photoreceptor cell loss in rats with retinal degeneration. Science Translational Medicine. 9 (421), (2017).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: Follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
- Hsiung, J., Zhu, D., Hinton, D. R. Polarized human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cell monolayers have higher resistance to oxidative stress-induced cell death than nonpolarized cultures. Stem Cells Translational Medicine. 4 (1), 10-20 (2015).
- Diniz, B., et al. Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: improved survival when implanted as a monolayer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (7), 5087-5096 (2013).
- Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
- Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Thomas, B. B., et al. Survival and functionality of hESC-derived retinal pigment epithelium cells cultured as a monolayer on polymer substrates transplanted in RCS rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (6), 2877-2887 (2016).
- Borooah, S., et al. Using human induced pluripotent stem cells to treat retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. 37, 163-181 (2013).
- Leach, L. L., Clegg, D. O. Concise review: Making stem cells retinal: Methods for deriving retinal pigment epithelium and implications for patients with ocular disease. Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Lustremant, C., et al. Human induced pluripotent stem cells as a tool to model a form of Leber congenital amaurosis. Cellular Reprogramming. 15 (3), 233-246 (2013).
- Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS Cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
- Maruotti, J., et al. Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10950-10955 (2015).
- Stanzel, B. V., et al. Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
- Ilmarinen, T., et al. Ultrathin polyimide membrane as cell carrier for subretinal transplantation of human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelium. PloS One. 10 (11), e0143669 (2015).
- Thumann, G., Schraermeyer, U., Bartz-Schmidt, K. U., Heimann, K. Descemet's membrane as membranous support in RPE/IPE transplantation. Current Eye Research. 16 (12), 1236-1238 (1997).
- Kiilgaard, J. F., Scherfig, E., Prause, J. U., la Cour, M. Transplantation of amniotic membrane to the subretinal space in pigs. Stem Cells International. 2012, 716968 (2012).
- Capeans, C., et al. Amniotic membrane as support for human retinal pigment epithelium (RPE) cell growth. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 81 (3), 271-277 (2003).
- Ohno-Matsui, K., et al. The effects of amniotic membrane on retinal pigment epithelial cell differentiation. Molecular Vision. 11, 1-10 (2005).
- Paolin, A., et al. Amniotic membranes in ophthalmology: long term data on transplantation outcomes. Cell and Tissue Banking. 17 (1), 51-58 (2016).
- Hu, Y., et al. A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer. Ophthalmic Research. 48 (4), 186-191 (2012).
- Pennington, B. O., Clegg, D. O. Pluripotent stem cell-based therapies in combination with substrate for the treatment of age-related macular degeneration. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics: The Official Journal of the Association. 32 (5), 261-271 (2016).
- Song, M. J., Bharti, K. Looking into the future: Using induced pluripotent stem cells to build two and three dimensional ocular tissue for cell therapy and disease modeling. Brain Research. 1638 (Pt A), 2-14 (2016).
- Ramsden, C. M., et al. Stem cells in retinal regeneration: Past, present and future). Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).
- da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
- Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Science Translational Medicine. 10 (435), (2018).
- Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C.
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
- Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
