Summary
Descrevemos um sistema que utiliza três métodos para avaliar a segurança e a eficácia da entrega da droga placenta-alvo: no vivo de imagem para monitorar o acúmulo de nanopartículas, ultra-som de alta frequência para monitorar o desenvolvimento placentário e fetal e HPLC para quantificar a entrega da droga ao tecido.
Abstract
Não há tratamentos eficazes existem, atualmente, por complicações de gravidez associada a placenta, e desenvolver estratégias para a entrega de alvo de drogas para a placenta, minimizando efeitos colaterais fetais e maternos continua a ser um desafio. Transportadoras de nanopartículas alvo proporcionam novas oportunidades para tratar anormalidades da placenta. Recentemente demonstramos que um peptídeo sintético placentária sulfato de condroitina A ligação (plCSA-BP) poderia ser usado para guiar as nanopartículas para entregar drogas para a placenta. Neste protocolo, descrevemos detalhadamente um sistema para avaliar a eficiência da entrega da droga para a placenta pela plCSA-BP que emprega três métodos distintos, usados em combinação: na vivo de imagem, ultra-som de alta frequência (HFUS) e alto desempenho cromatografia líquida (HPLC). Usando na vivo da imagem latente, plCSA BP-guiada por nanopartículas foram visualizadas nas placentas de animais vivos, enquanto HFUS e HPLC demonstraram que nanopartículas plCSA-BP-conjugados com eficiência e especificamente entregues metotrexato da placenta. Assim, uma combinação desses métodos pode ser usada como uma ferramenta eficaz para a entrega de alvo de drogas para a placenta e desenvolvimento de novas estratégias de tratamento para várias complicações na gravidez.
Introduction
Complicações da gravidez placenta-mediada, incluindo pré-eclâmpsia, perda de gravidez, descolamento prematuro da placenta e pequena idade gestacional (SGA), são comuns e levam a substancial morbidade fetal e materna e mortalidade1,2, 3e muito poucas drogas têm provado ser eficaz para tratar a gravidez distúrbios4,5. O desenvolvimento de estratégias para a entrega da droga placenta-alvo mais seletivo e segura durante a gravidez permanece desafiador em terapia com drogas modernas.
Nos últimos anos, vários relatos têm focado a alvo entrega de drogas aos tecidos uteroplacentária por nanopartículas de revestimento com peptídeos ou anticorpos como ferramentas de placenta-alvo. Estes incluem um anticorpo de6 do fator de crescimento epidérmico anti receptor (EGFR), tumor-homing peptídeos (CGKRK e iRGD)7, peptídeos de placenta-alvo8, peptídeos placentários vasculatura-alvo9 e anticorpos contra a receptor de ocitocina10.
Aqui, demonstramos que um peptídeo sintético placentária sulfato de condroitina A ligação (plCSA-BP) pode ser usado para a entrega de alvo de nanopartículas e suas cargas de drogas para a placenta11. As nanopartículas plCSA-BP-guiadas são complementares a uteroplacentária relatada visando métodos porque alvo o trofoblasto da placenta.
Como um método não-invasivo, na vivo a imagem tem sido usada para monitorar a expressão gênica de placenta específicas em ratos12e indocianina verde (ICG) tem sido amplamente utilizada para rastrear nanopartículas usando fluorescência de imagem sistemas13, 14,15. Assim, por via intravenosa injetamos nanopartículas plCSA-BP-conjugados, carregadas com o ICG (plCSA-INPs) para visualizar a distribuição de plCSA-INP em ratos grávidas com um gerador de imagens de fluorescência. Nós, em seguida, por via intravenosa injetado metotrexato (MTX)-carregado plCSA-NPs em ratos grávidos. Ultra-som de alta frequência (HFUS), outro não-invasiva, em tempo real de imagens ferramenta16,17 foi usado para monitorar o desenvolvimento fetal e placentário nos ratos. Finalmente, usamos a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) para quantificar a distribuição de MTX na placenta e fetos.
Neste protocolo, descrevemos em detalhe o sistema de três-método usado para avaliar a eficiência da entrega da droga placenta-alvo por nanocarriers plCSA-BP-guiada.
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Protocol
Todos os experimentos de rato rigorosamente os protocolos (SIAT-IRB-160520-YYS-FXJ-A0232), aprovados pelo cuidado Animal e uso Comissão de Shenzhen institutos de tecnologia avançada, da Academia Chinesa de Ciências.
1. síntese de nanopartículas de lipídios-polímero direcionados A placentária sulfato de condroitina
- Sintetizar a nanopartículas de lipídios-polímero MTX e ICG-carregado (MNPs e INPs respectivamente) e plCSA-BP-conjugados de nanopartículas (plCSA-MNPs e plCSA-INPs) conforme descrito em detalham em outro lugar18.
2. in vivo da fluorescência Imaging
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Preparação de ratos grávidas
- Coloque a fêmeas ratos CD-1 (8-12 semanas) com um macho fértil da mesma estirpe em uma gaiola (masculino: feminino = 1:2) na tarde e verifique o vaginal conecta o seguinte manhã. Se for observado um plug vaginal, defina o mouse como embrionário dia 0,5 (E0.5).
- Ciclo de ratos grávidas casa sozinhos em um quarto livre de patógeno animal com luz/10 h 14 h escuro e fornecem o acesso livre à comida e água até E14.5.
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Injeção intravenosa de nanopartículas
- Antes do procedimento, esterilize as nanopartículas por filtração através de um filtro de seringa 0,22 μm. Pese o mouse grávido no E11.5 para determinar a quantidade e volume de injeção de nanopartículas.
Nota: O volume de injeção de nanopartículas deve ser inferior a 1% (volume/peso) do peso do corpo do mouse grávido. Por exemplo, o volume de injeção de nanopartículas deve ser menos de 0,25 mL em um rato de 25 g. - Para dilatar a veia da cauda, aquecer a cauda por 5-10 min com uma almofada de aquecimento.
- Antes da injeção, Aspire o INPs ou plCSA-INPs em uma seringa de insulina de 28 g.
- Transferi o mouse grávido para um dispositivo de exploração que restringe o mouse ao permitir o acesso para a veia da cauda. Limpe o rabo com um algodão embebido em álcool. Em seguida, insira a seringa na veia da cauda. Lentamente injete o INPs ou plCSA-INPs (equivalente a 5 mg/kg ICG) com pressão durante 5 a 10 s.
Nota: Pare de injetar se uma bolha aparece na cauda, porque este resultado indica que a agulha não está na veia. As seringas não devem ser compartilhadas entre ratos para minimizar a transmissão da doença e a contaminação cruzada. - Registrar o tempo de injeção. Enquanto isso, exerça uma ligeira pressão para o local da injeção até o sangramento parar, que normalmente demora 30-60 s.
- Antes do procedimento, esterilize as nanopartículas por filtração através de um filtro de seringa 0,22 μm. Pese o mouse grávido no E11.5 para determinar a quantidade e volume de injeção de nanopartículas.
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Imagem latente na vivo
- 30 min após a injeção, os ratos grávidas usando a fluorescência na vivo , sistema de imagem da imagem.
- Anestesiar os ratos grávidas com uma taxa de fluxo de oxigênio de 1,0 L/min e isoflurano em 2-4% em uma câmara de associado da unidade de anestesia e verificar completa anestesia pelo lento e respiração regular. Em seguida, movê-los para a câmara de imagem. Coloque os ratos anestesiados grávidos dentro da câmara de imagem, mantendo os animais em posição supina.
- Coloque um cone de nariz sobre a boca e o nariz para permitir que a inalação de 1-2% de isoflurano com uma taxa de fluxo de oxigênio de 1,0 L/min para manter a anestesia.
- Selecione parâmetros 2D-fluorescência e fotográficos para os sinais de fluorescência ICG da imagem. Definir a exposição a auto e os comprimentos de onda de excitação/emissão de 710/820 nm.
- No final do processo de imagem, desligue o influxo de isoflurano para parar a anestesia e voltar os ratos grávidas cuidadosamente suas gaiolas.
- 48 h após a injeção de nanopartículas, anestesiar os ratos grávidos com isofluorano e então sacrificar a represa por deslocamento cervical. Recolha os fetos e placentas usando pinça Graefe, Graefe fórceps do tecido e tesouras de dissecação.
- Coloque as placentas e fetos na câmara de imagem e imagem usando o método descrito na etapa 2.3.4.
3. HFUS avaliação do desenvolvimento embrionário
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Modelos animais
- Obter e preparar os ratos grávidas, conforme descrito no passo 2.1.
- Use HFUS para ratos grávidas imagem no E 6.5 (protocolos 3.2 e 3.3.3). Primeiro, confirmar a gravidez através da visualização de embriões no dia E6.5 e em seguida, alocar aleatoriamente os ratos grávidas em três grupos: o grupo MNP, grupo plCSA-MNP e grupo fosfato-salino (PBS).
- Injete PBS, MNPs ou plCSA-MNPs (1 mg/kg MTX equivalente) as veias de cauda dos ratos grávidas todos os dias, começando em E6.5, conforme descrito no passo 2.2.
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Preparação para a imagem latente
- 24 h após a injeção de nanopartículas, os ratos grávidas usando o HFUS sistema de imagem da imagem.
- Anestesia os ratos grávidas conforme descrito na etapa 2.3.2. Ativar os controles de temperatura integrado da plataforma de geração de imagens e pré-aqueça a plataforma-37-42 ° C. Fixe os ratos grávidas em posição supina na plataforma utilizando a fita.
- Lugar do cone de nariz ligado à unidade de anestesia sobre o focinho. Aplica 2% de isoflurano com uma taxa de fluxo de oxigênio de 1,0 L/min para manter constante anestesia.
- Quimicamente, remova pelos do abdômen usando um creme depilatório. Acabar com o creme residual cuidadosamente com gaze embebida em água e depois revestir o abdômen com acústico acoplamento gel.
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Procedimento de imagem
- Coloque o transdutor de 40 MHz no braço mecânico.
- Ajuste a posição do transdutor para obter imagens longitudinais do feto e placenta com a região de interesse localizado na zona focal.
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Análise e imagem modo-B
Nota: Ver filme 1.- Clique no botão Modo-B e abaixe o transdutor sobre o abdômen até o feto e a placenta entram em vista. Pressione Scan/Freeze para iniciar/parar de imagem, pressione Cine armazenar para armazenar o laço da cinematografia e pressione Frame armazenar para armazenar imagens do quadro.
- Clique no botão de medida para analisar o comprimento do saco gestacional (GS), comprimento de garupa fetal coroa (CRL), diâmetro biparietal (DBP), circunferência abdominal (AC), diâmetro da placenta (PD) e espessura placentária (PT).
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Análise e imagens Doppler PW
Nota: Ver filme 1.- Usando o mesmo digitalizar projeção, clique no botão PW , coloque a caixa de volume de amostragem no centro da artéria umbilical e pressione Scan/Freeze para iniciar a geração de imagens. Clique em armazenar Cine para coletar imagens de artéria umbilical.
- Clique no botão de medida para calcular a velocidade de pico de artéria umbilical (UA).
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Análise e imagem latente de modo Doppler cor
- Usando a mesma projeção de digitalizar, clique no botão cor e ajustar a posição do transdutor para obter imagens do coração fetal. Pressione Scan/congelamento para iniciar a imagem latente e Cine armazenar para coletar imagens.
- Clique no botão de medida para calcular a frequência cardíaca fetal (HR).
4. HPLC análise
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Preparação do tecido
- Injetar os ratos grávidas com uma única dose de MNPs ou plCSA-MNPs (equivalente MTX de 1 mg/kg) no final da gravidez (ex., E14.5) conforme descrito na etapa 3.1.3.
- Após 24h, anestesia os ratos por uma injeção intraperitoneal de avertin em 240 μg/peso (g). Não certifique-se de nenhuma resposta para uma pitada de pé para verificar que os ratos são totalmente anestesiados.
- Pulverize a área do peito com 75% de etanol. Executar a perfusão cardíaca (cortar os átrios direito e perfundir através do ventrículo esquerdo) conforme descrito em detalhe19,20 com 50 mL de soro fisiológico 0,9% gelada por 10 min remover nanopartículas desacopladas.
- Eutanásia em barragem. Realizar uma cesariana para recolher os fetos e placentas usando pinça Graefe, dissecando a tesoura e pinça de tecido Graefe e armazenar os tecidos a-80 ° C, antes da análise.
- Preparar a solução de homogeneização (ácido perclórico a 10%) e manter-se no gelo. Coletar aproximadamente 200 mg de tecido e adicionar 500 μL de solução de homogeneização para cada amostra. Homogeneizar as amostras usando um homogeneizador a toda a velocidade para 30 s e repita este procedimento duas vezes.
- Centrifugar as amostras a 14.000 × g por 20 min a 4 ° C. Filtrar o sobrenadante (aproximadamente 300 μL) através de um filtro de seringa 0,45 μm e transferir o líquido resultante para um frasco HPLC. Coloque os frascos de amostra em uma bandeja de mostruário para injeção.
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Elaboração de normas
- Prepare a seguinte solução para a fase móvel: 40mm potássio Fosfato dibásico (pH 4.5) e acetonitrila (88:12, v/v). Filtrar a solução através de um filtro de seringa de tamanho de poros de 0,45 μm e transferir o líquido resultante para uma garrafa de reservatório limpa HPLC.
Nota: Ajuste o pH com ácido fosfórico a 0,1 M. Use vibração ultra-sônica por 15 min para desgaseificar a fase móvel cada vez antes de usar. - Pese 10 mg de MTX em um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Adicione 1 mL de hidróxido de sódio 1 M.
- Vórtice em alta velocidade até o MTX se dissolva completamente.
Nota: Este é o estoque principal e pode ser armazenado a-20 º C durante vários meses. - Para criar o estoque MTX secundário (500 μg/mL), dilua 50 μL do regulador primário em 950 μL da fase móvel.
Nota: Guarde no gelo até o uso e preparar fresca diariamente. É importante usar a fase móvel para a elaboração de normas para evitar picos resultantes da mistura de diferentes soluções após a injeção da amostra. - Fazer mais diluições para criar as normas (tabela 1). Armazenar as normas no gelo e preparar fresca diariamente. Execute as normas em série com as amostras experimentais.
- Prepare a seguinte solução para a fase móvel: 40mm potássio Fosfato dibásico (pH 4.5) e acetonitrila (88:12, v/v). Filtrar a solução através de um filtro de seringa de tamanho de poros de 0,45 μm e transferir o líquido resultante para uma garrafa de reservatório limpa HPLC.
| Número | Concentração final (μg/mL) | Padrão, μL 500 μg/mL | Phase(μL) móvel |
| 1 | 0,5 | 1 | 999 |
| 2 | 1 | 2 | 998 |
| 3 | 2.5 | 5 | 995 |
| 4 | 10 | 20 | 980 |
| 5 | 25 | 50 | 950 |
| 6 | 50 | 100 | 900 |
| 7 | 100 | 200 | 800 |
Tabela 1. Preparação da curva de calibração para MTX. A concentração final da solução padrão de MTX é de 0,5-100 μg/mL.
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Instrumentação de HPLC e parâmetros de operação
Nota: As amostras foram analisadas em um sistema HPLC equipado com uma bomba de solvente, um detector espectrofotométrico UV (313 nm) e uma coluna C18 (250 × 4. 6mm, tamanho de partícula 5 μm).- Ligue o desgaseificador HPLC para retirar o ar do sistema. Ative o fluxo, desenroscada a coluna com a fase móvel por 30 min reduzir o ruído da linha de base.
- Regule a temperatura da coluna, a 25 ° C, injetar 20 volumes de amostra μL em uma taxa de fluxo de 1 mL/min e clique no Método execute para iniciar a análise.
- Quando as pistas estiverem completas, altere manualmente a fase móvel para acetonitrila grau HPLC. Executado por aproximadamente 15 min proteger o sistema.
Nota: Execute esta etapa após o tempo de execução recomendado pode resultar em danos à coluna. - Para análise quantitativa, calcule as áreas sob os picos MTX padrão de interesse usando o software de sistema HPLC.
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Representative Results
Neste manuscrito, carregado com MTX (plCSA-MNPs) ou ICG (plCSA-INPs) plCSA-BP-conjugados de nanopartículas foram injetadas por via intravenosa ratos grávidas. Imagem latente na vivo revelou sinais ICG fortes na região do útero 30 min após a injeção de plCSA-INP. O INPs foram localizado principalmente na região do fígado e baço (figura 1A). A 48 h após a injeção de plCSA-INP, ratos grávidas foram sacrificados, revelando sinais ICG somente na placenta, enquanto com sem sinais eram detectáveis no feto (figura 1B).
Então usamos HFUS para monitorar o desenvolvimento do embrião após a injeção intravenosa de nanopartículas. Medições biométricas incluíam o comprimento do saco gestacional (GS), comprimento de garupa fetal coroa (CRL), diâmetro biparietal (DBP), circunferência abdominal (AC), diâmetro da placenta (PD), espessura da placenta (PT), velocidade de pico de artéria umbilical (UA) e batimentos cardíacos fetais taxa (HR) (filme 1). Os parâmetros morfológicos, medidos em diferentes idades gestacional estão listados na tabela 2. No grupo plCSA-MNP, em relação ao grupo de PBS, a circunferência abdominal fetal média e velocidade de pico de artéria umbilical foram significativamente menores no E12.5 (figuras 2A e 2 H), e o comprimento de garupa de coroa e diâmetro da placenta foram diminuiu significativamente em E10.5 (figuras 2B e 2F). Começando na E9.5, o comprimento do saco gestacional foi também significativamente diminuída (Figura 2) e o diâmetro biparietal, espessura da placenta, e frequência cardíaca fetal começou a diminuir drasticamente na E 11,5 em relação aqueles no grupo de PBS (figuras 2D 2E e 2G). Juntos, estes achados sugerem que a plCSA-MNPs têm um forte efeito citotóxico sobre o desenvolvimento fetal e placentário. Curiosamente, o tratamento com MNPs também ligeiramente prejudicada fetal e placentário desenvolvimento (Figuras 2A-2 H), indicando que as nanopartículas podem melhorar a entrega de MTX para a placenta através da maior permeabilidade e efeito de retenção (EPR).
| Idade gestacional | Grupo | Decídua (mm) | GS (mm) | CRL (mm) | BPD (mm) | AC (mm) | PD (mm) | PT (mm) | HR (bpm) | UA (mm/s) |
| E6.5 | 0.92±0.23 | / | / | / | / | / | / | / | / | |
| E7.5 | PBS | / | 0.82±0.24 | 0.72±0.18 | / | / | / | / | / | / |
| MNPs | / | 0.83±0.14 | 0.83±0.14 | / | / | / | / | / | / | |
| plCSA-MNPs | / | 0.65±0.23 | 0.65±0.23 | / | / | / | / | / | / | |
| 8.5 | PBS | / | 2.02±0.54 | 1.88±0.40 | 0.93±0.23 | / | / | / | / | / |
| MNPs | / | 1.49±0.50 | 1.49±0.50 | 0.82±0.20 | / | / | / | / | / | |
| plCSA-MNPs | / | 1.14±0.46 | 1.02±0.42 | 0.83±0.18 | / | / | / | / | / | |
| E9.5 | PBS | / | 3.31±0.62 | 3.49±0.65 | 1.39±0.54 | / | / | / | / | / |
| MNPs | / | 2.34±0.68 | 2.23±0.49 | 0.98±0.34 | / | / | / | / | / | |
| plCSA-MNPs | / | 1.83±0.42 | 1.59±0.59 | 0.94±0.25 | / | / | / | / | / | |
| E10.5 | PBS | / | 4.43±0.67 | 4.97±0.80 | 2.10±0.61 | 4.83±1.40 | 2.91±0.23 | 2.24±0.24 | 100±30 | 30.16±9.40 |
| MNPs | / | 3.28±0.64 | 2.91±0.83 | 1.46±0.54 | 3.95±1.28 | 2.66±0.33 | 2.17±0.19 | 87±21 | 24.63±7.35 | |
| plCSA-MNPs | / | 2.64±0.66 | 2.17±0.85 | 1.12±0.33 | 3.82±1.13 | 2.13±0.35 | 1.94±0.15 | 83±22 | 15.37±5.70 | |
| E11.5 | PBS | / | 5.68±0.73 | 6.45±0.90 | 3.08±0.70 | 8.67±2.08 | 4.16±0.39 | 2.75±0.26 | 124±28 | 31.62±7.76 |
| MNPs | / | 4.36±0.39 | 3.74±1.2 | 2.31±0.53 | 6.69±1.85 | 3.56±0.40 | 2.39±0.23 | 106±22 | 25.20±6.18 | |
| plCSA-MNPs | / | 3.42±0.76 | 2.61±0.84 | 1.51±0.54 | 4.59±1.57 | 2.54±0.49 | 2.09±0.27 | 79±20 | 16.66±5.69 | |
| E12.5 | PBS | / | / | 8.12±1.29 | 3.90±0.65 | 12.43±2.48 | 5.37±0.42 | 3.14±0.24 | 141±26 | 40.62±10.89 |
| MNPs | / | / | 4.87±1.29 | 2.87±0.62 | 8.29±1.78 | 4.25±0.67 | 2.65±0.26 | 119±18 | 27.76±7.52 | |
| plCSA-MNPs | / | / | 3.2±1.28 | 1.75±0.60 | 5.47±1.39 | 3.05±0.50 | 2.28±0.26 | 72±22 | 18.76±7.20 | |
| E13.5 | PBS | / | / | 10.04±1.2 | 4.67±0.65 | 15.64±2.33 | 6.03±0.60 | 3.49±0.23 | 157±28 | 54.62±12.37 |
| MNPs | / | / | 6.17±1.29 | 3.37±0.55 | 9.39±1.88 | 4.77±0.69 | 2.92±0.43 | 109±22 | 35.84±9.49 | |
| plCSA-MNPs | / | / | 3.57±1.71 | 1.87±0.73 | 6.25±1.41 | 3.42±0.63 | 2.37±0.34 | 60±23 | 20.02±11.20 | |
| E14.5 | PBS | / | / | 12.35±1.6 | 5.36±0.71 | 18.38±2.53 | 6.70±0.64 | 3.75±0.35 | 167±27 | 71.48±10.72 |
| MNPs | / | / | 7.6±1.56 | 3.90±0.70 | 10.31±2.31 | 5.23±0.76 | 3.10±0.39 | 99±23 | 45.80±13.07 | |
| plCSA-MNPs | / | / | / | / | / | / | / | / | / |
Tabela 2. Medir parâmetros morfológicos de cada idade gestacional. GS: Comprimento do saco gestacional; CRL: Comprimento de garupa coroa; BPD: Diâmetro Biparietal; AC: Circunferência Abdominal; PD: Diâmetro da placenta; PT: Espessura placentária; HR: Frequência cardíaca Fetal; UA: Velocidade de pico artéria Umbilical; /: não se pode medir.
Em seguida medimos as concentrações de MTX na placenta e fetos usando HPLC. Usando os parâmetros de operação de HPLC descritos acima, o tempo de retenção MTX estava determinado a ser 7 min, e MTX foi detectada nas placentas do grupo plCSA-MNP (Figura 3). As concentrações de MTX em placentas e fetos foram determinadas utilizando curvas padrão MTX (Figura 4). 24 h após a injeção, o nível MTX placentário no grupo MNP foi significativamente menor do que no grupo plCSA-MNP e MTX não foi detectado em fetos do grupo plCSA-MNP. MTX ainda podia ser detectada na placenta 48 h após a injeção plCSA-MNP (Figura 5). Estes resultados demonstram que o plCSA-MNPs não podem atravessar a placenta, minimizando assim os potenciais efeitos adversos sobre o feto.
Em resumo, este sistema de três-método composto por imagens de fluorescência na vivo , HFUS e HPLC pode ser empregado para determinar o quão bem um veículo de entrega de droga metas nanocarriers e entrega de drogas para a placenta. Usando estes métodos, demonstrámos que nanopartículas de plCSA-BP guiada são uma ferramenta eficiente para o direcionamento a entrega de drogas para a placenta.
Figura 1 . Na vivo imagens de fluorescência. (A) grávidos ratos (n = 5 cada) no E11.5 foram injetados com INPs ou plCSA-INPs (ICG equivalente 5 mg/kg) através da veia da cauda. Depois de 30 min, os ratos foram fotografados usando uma sistema de imagens de fluorescência. (B) 48 h após a injeção do INPs ou plCSA-INPs, os fetos (F, n = 2 por rato) e placenta (P, n = 2 por rato) foram coletadas e fotografada com uma sistema de imagens de fluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Quantificação de crescimento embrionário por HFUS. (A) a circunferência abdominal (n = 30-51 embriões/dia), comprimento de garupa (B) coroa (n = 30-51 embriões/dia), comprimento (C) gestacional sac (n = 10-30 embriões/dia), o diâmetro biparietal (D) (n = 30-51 embriões/dia), espessura (E) da placenta (n = 30-51 embriões/dia), (F). diâmetro da placenta (n = 30-51 embriões/dia), frequência cardíaca fetal de (G) (n = 20-33 embriões/dia) e velocidade de pico de artéria umbilical (H) (n = 12-36 embriões/dia) medida não invasiva pelo ultra-som in vivo. Todos os testes foram comparados por par-de-cauda-2 t-teste e p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Os valores são expressos como a meios ± SD. * p < 0.05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001 em relação ao grupo de PBS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Cromatogramas representante HPLC de amostras placentárias. Ratos grávidas (n = 5 cada) por via intravenosa foram injetados com PBS ou plCSA-MNPs e sua placenta (n = 15 cada grupo) foram coletadas 24 horas mais tarde para HPLC. Usando uma solução-padrão de MTX com detecção no ultravioleta em 313 nm, o tempo de retenção foi determinada como sendo 7 min. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Curvas padrão para MTX. As concentrações de MTX variou de 0,5 μg/mL a 100 μg/mL. Os dados representam a média ±SD para n = 3. As barras de erro de alguns dados são menores que os símbolos rômbicos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . Aplicação de HPLC para determinar a biodistributions de nanopartículas em placentas e fetos. Foram administrados a ratos grávidas uma única injeção de MNPs ou plCSA-MNPs (equivalente a 1 mg/kg MTX) fase gestacional E13.5. Após 24 h e 48 h, as concentrações de MTX nas placentas (n = 15) e fetos (n = 15) foram medidos por HPLC. Os valores são expressos como as means±SD. diferenças nas concentrações de MTX entre os grupos MNP e plCSA-MNP foram analisadas usando pareado de Student t-teste (* * * p < 0,001); Nd: não detectado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1. Imagens HFUS de fetos e placentas ilustrando locais de medição biométrica. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
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Discussion
Neste manuscrito, descrevem um sistema de três-método para determinar se plCSA BP-guiada por nanopartículas são uma ferramenta eficiente para o direcionamento a entrega de drogas para a placenta. O uso do na vivo de imagem para monitorar o sinal infravermelho de ICG fluorescente confirmou a especificidade de direcionamento da placenta de plCSA-BP usando HFUS e HPLC, demonstrámos que nanopartículas plCSA-BP-conjugados com eficiência podem entregar MTX apenas para o células da placenta, não para o feto.
A fluorescência na vivo experimentos de imagem, a idade gestacional de ratos grávidas é importante. A placenta começa a se formar em torno de E9.521. Além disso, considerando a resolução da câmera, o na vivo de imagem experiência deve ser realizada após E 10.5. Após a injeção de plCSA-INP em 11,5 E de acordo com este protocolo, nenhum sinal de fluorescência foi detectado com a câmera nas condições descritas, que pode ter sido devido a pele e órgãos internos, impedindo o sinal de transmissão22. Para contornar essa limitação, aumentar a dose de injeção ou a coleção de placentas e fetos por ex vivo de imagem deve ser utilizado.
Um passo fundamental na imagem latente de HFUS é a utilização de um transdutor adequado para obter imagens de alta qualidade embrionárias. A frequência otimizada para a imagem latente de embriologia do rato é 40-50 MHz. Além disso, a manutenção da temperatura do corpo fisiológico do mouse grávida antes da aquisição de imagens também é importante. Finalmente, o observador deve ter cuidado quando gravar filmes de modo-B durante o desenvolvimento precoce do embrião (E 6,5 E 8,5), e isto é mais dependente da experiência. A incerteza de medição pode ser compensada, comparando características anatômicas com o quadro de referência para o feto e circulação placentária durante ultra-som processamento16,23,24. A precisão dos dados de imagem pode ser melhorada, fazendo várias medições e aumentando o número de fetos e placentas.
As nanopartículas residual não acoplada no vaso sanguíneo é um fator eficaz para avaliar a entrega de drogas específicas para a placenta e o feto. Assim, perfusão cardíaca foi realizada para remover nanopartículas desacopladas antes os fetos e placentas foram coletados. Estudos anteriores7,8,9 também notaram que, antes de analisar a capacidade de um peptídeo de vincular a placenta, submetendo-o mouse a perfusão cardíaca é essencial.
Uma possível armadilha durante a análise HPLC é a sobreposição de MTX com outros picos. Acetonitrilo é usado para eluir MTX da coluna. Se os picos sobrepostos ocorrerem antes de 5 min, diminuindo a concentração de acetonitrilo na fase móvel pode ser útil. Se não há picos ou picos sobrepostos ocorrem após 30 min, aumentando a concentração de acetonitrilo é útil. A principal limitação da HPLC é que ele não revela a localização de nanopartículas dentro da placenta. As nanopartículas plCSA-BP-guiada direcionado especificamente o labirinto da placenta na placenta rato11. Assim, a análise morfológica da placenta é necessário.
Este é o primeiro uso da combinação de imagem na vivo , HFUS e HPLC para determinar a eficiência de entrega de placenta-alvo, guiada por um peptídeo. HFUS tem emergido como um avançado, não-invasivo, seguro e em tempo real de imagens método e tem sido usada com sucesso para a imagem de alta resolução do desenvolvimento embrionário de rato17,25,26. Embora na vivo imagens de fluorescência tem sido amplamente utilizada para visualizar a formação de tumor e metástases em ratos ao vivo27,28,29, ele não anteriormente foi usado no estudo da entrega da droga da placenta. Como uma abordagem alternativa, imagens de fluorescência na vivo tem uma vantagem distinta sobre HFUS em ser capaz de Visualizar diretamente a distribuição de nanopartículas injetadas por via intravenosa em ratos ao vivo, mas não podem acompanhar o desenvolvimento fetal e da placenta. Daí, nós combinamos as vantagens da visualização por fluorescência na vivo imaging e ex HFUS, o de alta resolução, permitindo a visualização do plCSA-BP-guiada INPs na vivo, e permitindo que o último na vivo monitorização dos efeitos da plCSA-MNPs no desenvolvimento placentário e fetal e sobrevivência. Além disso, HPLC confirmou que plCSA-MNPs especificamente foram entregues a placenta e não atingem os fetos.
Nanomedicina alvo é um novo desenvolvimento no campo dos transtornos de gravidez, e substanciais novas abordagens para entregar drogas especificamente os órgãos maternos são necessários para tratar transtornos de gravidez na clínica30. O sistema de três-método descrito neste protocolo é uma combinação na vivo tempo curso de imagem de direcionamento de nanopartículas e os correspondentes efeitos sobre o desenvolvimento fetal e da placenta, permitindo a medição mais precisa, bioquímica a quantidade de droga em tecidos para avaliar ferramentas para entrega de placenta direcionados para o tratamento das complicações da gravidez placenta-mediada.
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Disclosures
X.F. e B.Z. são inventores no pedido de patente PCT/CN2017/108646 enviado por SIAT que abrange um método de entrega de drogas específicas de placenta e sua aplicação. Todos os outros autores declaram que eles têm não tem interesses concorrente.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Nacional de ciências naturais (81771617) e a ciência Natural Fundação da província de Guangdong (2016A030313178) concedido a X.F.; uma concessão da Shenzhen básica fundo de investigação (JCYJ20170413165233512) atribuído a X.F; e a Eunice Kennedy Shriver National Institute de saúde infantil & desenvolvimento humano do institutos nacionais da saúde sob prêmio número R01HD088549 (o conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, o funcionário vista para o National Institutes of Health) de N.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD-1 mice | Beijing Vital River | 201 | Female (8-12 week) |
| Insulin syringe | BD | 328421 | for IV injection |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Methotrexate (MTX) | Sigma-Aldrich | V900324 | for nanoparticles synthesis |
| Indocyanine green (ICG) | Sigma-Aldrich | 1340009 | for in vivo imaging |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Hyclone | SH30028.01 | |
| IVIS spectrum instrument | Perkin Elmer | for in vivo imaging | |
| Ultrasound transmission gel | Guanggong | ZC4252418 | for ultrasound imaging |
| Isoflurane | Lunan Pharmaceutical | I0040 | for maintain the anesthesia |
| Depilatory cream | Nair | TMG001 | for removing fur |
| 40 MHz transducer | VisualSonics | MS550S | for ultrasound imaging |
| High-frequency ultrasound imaging system | VisualSonics | Vevo2100 | for ultrasound imaging |
| Avertin | Sigma-Aldrich | T48402 | for anesthesia |
| Syringe pump | Mindray | SK-500III | forcardiac perfusion |
| 0.9% saline solution | Meilunbio | MA0083 | forcardiac perfusion |
| 1.5 mL Polypropylene tubes | AXYGEN | MCT-150-C | |
| -80 °C freezer | Thermo Fisher Scientific | 88600V | |
| Centriguge | Cence | H1650R | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | for precipitating protein |
| Homogenizer | SCIENTZ | SCIENTZ-48 | for homogenizing tissue |
| Syringe filter (0.45 μm) | Millipore | SLHV033RS01 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical | 10019763 | for solving MTX |
| HPLC vials | Waters | 670650620 | for HPLC |
| Potassium phosphate dibasic | Sinopharm Chemical | 20032117 | for HPLC |
| Acetonitrile | JKchemical | 932537 | for HPLC |
| C18 column | Waters | 186003966 | for HPLC |
| HPLC system | Shimadzu | for HPLC |
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