Summary
Descriviamo un sistema che utilizza tre metodi per valutare la sicurezza e l'efficacia della somministrazione di farmaci mirati placenta: in vivo imaging per monitorare l'accumulo delle nanoparticelle, ultrasuono ad alta frequenza per monitorare lo sviluppo placenta e fetale e HPLC per quantificare la consegna della droga al tessuto.
Abstract
Nessun trattamenti efficaci attualmente esistenti per le complicazioni di gravidanza placenta-collegata, e lo sviluppo di strategie per la somministrazione mirata di farmaci alla placenta, riducendo al minimo gli effetti collaterali materni e fetali rimane impegnativo. I vettori delle nanoparticelle mirate fornire nuove opportunità per trattare i disordini placentari. Recentemente abbiamo dimostrato che un peptide sintetico placentare Condroitin solfato A associazione (plCSA-BP) potrebbe essere usato per guidare le nanoparticelle per consegnare i farmaci alla placenta. In questo protocollo, descriviamo dettagliatamente un sistema per valutare l'efficienza di consegna della droga alla placenta di plCSA-BP che impiega tre metodi distinti utilizzati in combinazione: in vivo imaging, ultrasuono ad alta frequenza (HFUS) e ad alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC). Utilizzo in vivo imaging, plCSA-BP-guidata nanoparticelle sono state visualizzate in placente di animali vivi, mentre HFUS e HPLC ha dimostrato che nanoparticelle plCSA-BP-coniugato in modo efficiente e in particolare consegnato metotrexato alla placenta. Così, una combinazione di questi metodi può essere utilizzata come strumento efficace per la somministrazione mirata di farmaci alla placenta e lo sviluppo di nuove strategie di trattamento per diverse complicazioni di gravidanza.
Introduction
Complicazioni di gravidanza placenta-mediata, tra cui pre-eclampsia, la perdita di gravidanza, distacco della placenta e piccola età gestazionale (SGA), sono comuni e portare a sostanziale morbilità materna e fetale e mortalità1,2, 3e molto pochi farmaci hanno dimostrato di essere efficace per il trattamento di gravidanza disturbi4,5. Lo sviluppo di strategie per la consegna di droga placenta-mirati più selettivi e più sicura durante la gravidanza rimane impegnativo nella terapia farmacologica moderna.
Negli ultimi anni, parecchi rapporti sono concentrati sulla somministrazione mirata di farmaci di uteroplacental tessuti di rivestimento di nanoparticelle con peptidi o anticorpi come strumenti di targeting per placenta. Questi includono un anticorpo di anti-fattore di crescita recettore (EGFR)6 , tumore-homing peptidi (CGKRK e iRGD)7, placenta-mirato peptidi8, peptidi di targeting per sistema vascolare placentare9 e gli anticorpi contro il L'ossitocina del ricevitore10.
Qui, dimostriamo che un peptide sintetico placentare Condroitin solfato A associazione (plCSA-BP) può essere utilizzato per la somministrazione mirata di nanoparticelle e loro carichi di droga di placenta11. Le nanoparticelle plCSA-BP-guidati sono complementari alla uteroplacental segnalati metodi di targeting, perché prendono di mira il trofoblasto placenta.
Come un metodo non invasivo, in vivo imaging è stato utilizzato per monitorare l'espressione genica placenta-specifica in topi12e verde di indocianina (ICG) è stato ampiamente utilizzato per tenere traccia di nanoparticelle utilizzando sistemi13, di formazione immagine di fluorescenza 14,15. Così, abbiamo iniettato per via endovenosa plCSA-BP-coniugato nanoparticelle caricate con ICG (plCSA-INPs) per visualizzare la distribuzione di plCSA-INP in topi incinta con un imager di fluorescenza. Abbiamo quindi iniettato per via endovenosa di methotrexate (MTX)-caricato plCSA-NPs in topi incinti. L'ultrasuono ad alta frequenza (HFUS), un altro non-invasiva, in tempo reale strumento16,di imaging17 è stato utilizzato per monitorare lo sviluppo fetale e placenta nei topi. Infine, abbiamo usato ad alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC) per quantificare la distribuzione di MTX in placente e feti.
In questo protocollo, descriviamo dettagliatamente il sistema di tre-metodo utilizzato per valutare l'efficienza di consegna della droga placenta-mirati da nanovettori plCSA-BP-guidata.
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Protocol
Tutti gli esperimenti del mouse seguito rigorosamente i protocolli (SIAT-IRB-160520-YYS-FXJ-A0232) approvati dalla cura degli animali e uso Comitato di Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Accademia cinese delle scienze.
1. sintesi di nanoparticelle mirate A lipido-polimero placentare Condroitin solfato
- Sintetizzare MTX - e ICG-caricati del lipido-polimero nanoparticelle (MNPs e INPs rispettivamente) e nanoparticelle plCSA-BP-coniugato (plCSA-MNPs e plCSA-INPs) come descritto dettaglio altrove18.
2. in vivo Imaging di fluorescenza
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Preparazione dei topi incinto
- Posizionare i topi femminili CD-1 (8-12 settimane) con un maschio fertile dello stesso ceppo in una gabbia (maschio: femmina = 1:2) nel pomeriggio e controllo vaginale spine la seguente mattina. Se un plug vaginale è osservato, definire il mouse come giorno embrionale 0.5 (0.5).
- Topi casa incinto da sola in una stanza senza agente patogeno animale con una h di luce/10 h 14 scuro ciclo e forniscono l'accesso gratuito per cibo e acqua fino e 14.5.
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Iniezione endovenosa di nanoparticelle
- Prima della procedura, è necessario sterilizzare le nanoparticelle mediante filtrazione attraverso un filtro di 0,22 μm siringa. Pesare il mouse incinto a E11.5 per determinare la quantità e il volume di iniezione delle nanoparticelle.
Nota: Il volume di iniezione di nanoparticella dovrebbe essere meno dell'1% (peso/volume) del peso corporeo del mouse incinto. Ad esempio, il volume di iniezione di nanoparticella dovrebbe essere inferiore a 0,25 mL in un mouse di 25 g. - Per dilatare la vena della coda, caldo la coda per 5-10 min con un rilievo di riscaldamento.
- Prima dell'iniezione, aspirare l'INPs o plCSA-INPs in una siringa da insulina 28 g.
- Trasferire il mouse incinto per un dispositivo che trattiene il mouse, consentendo un accesso alla vena della coda. Pulire la coda con un tampone imbevuto di alcool. Quindi inserire la siringa nella vena caudale. Iniettare lentamente l'INPs o plCSA-INPs (equivalente ICG di 5mg/kg) con pressione uniforme sopra 5-10 s.
Nota: Interrompere l'iniezione se un blister appare sulla coda perché questo risultato indica che l'ago non è nella vena. Siringhe non devono essere condivise tra topi per minimizzare la trasmissione di malattia e la contaminazione incrociata. - Registrare il tempo di iniezione. Nel frattempo, applicare una leggera pressione al sito di iniezione fino a quando l'emorragia si ferma, che richiede normalmente 30-60 s.
- Prima della procedura, è necessario sterilizzare le nanoparticelle mediante filtrazione attraverso un filtro di 0,22 μm siringa. Pesare il mouse incinto a E11.5 per determinare la quantità e il volume di iniezione delle nanoparticelle.
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In vivo imaging
- 30 min dopo l'iniezione, i topolini incinto usando la fluorescenza in vivo imaging sistema di immagine.
- Anestetizzare i topi incinto con un tasso di flusso di ossigeno di 1,0 L/min e isoflurano al 2-4% in un alloggiamento associato dell'unità anestesia e verificare l'anestesia completo di lento e respiro regolare. Quindi, spostarli nella camera di imaging. Posizionare i topi anestetizzati incinto nella camera di imaging, tenere gli animali in posizione supina.
- Posizionare un cono di naso sopra la bocca e il naso per consentire l'inalazione di isoflurane 1-2% con un tasso di flusso di ossigeno di 1,0 L/min per mantenere l'anestesia.
- Selezionare parametri 2D-fluorescenza e fotografici all'immagine i segnali di fluorescenza di ICG. Impostare l'esposizione di auto e le lunghezze d'onda di eccitazione/emissione di 710/820 nm.
- Al termine della procedura di imaging, spegnere l'afflusso di isoflurane per interrompere l'anestesia e attentamente tornare i topi incinto loro gabbie.
- 48 h dopo l'iniezione delle nanoparticelle, anestetizzare i topi incinto con isofluorano e quindi sacrificare la diga di dislocazione cervicale. Raccogliere i feti e placente utilizzando Graefe pinze, pinze di Graefe e forbici di dissezione.
- Posizionare le placente e feti nella camera di imaging e immagine utilizzando il metodo descritto al punto 2.3.4.
3. HFUS valutazione dello sviluppo embrionale
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Modelli animali
- Ottenere e preparare i topi incinto come descritto al punto 2.1.
- Utilizzare HFUS ai topi incinta immagine a E 6,5 (protocolli 3.2 e 3.3.3). In primo luogo, conferma gravidanza visualizzando embrioni il giorno E6.5 e quindi allocare in modo casuale i topi incinto in tre gruppi: il gruppo MNP, plCSA-MNP gruppo e gruppo di tampone fosfato salino (PBS).
- Iniettare PBS, MNPs o plCSA-MNPs (1 mg/kg equivalente di MTX) nelle vene dei topi incinta coda ogni giorno a partire da E6.5 come descritto al punto 2.2.
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Preparazione per l'imaging
- 24 h dopo l'iniezione di nanoparticelle, immagine i topi incinto utilizzando il HFUS sistema di imaging.
- Anestetizzare i topi incinto come descritto al punto 2.3.2. Attivare i controlli di temperatura integrato della piattaforma imaging e preriscaldare la piattaforma a 37-42 ° C. Fissare i topi incinto in posizione supina sulla piattaforma usando del nastro.
- Posto il cono di naso collegato all'unità di anestesia sopra il muso. Applicare isoflurano 2% con un tasso di flusso di ossigeno di 1,0 L/min per mantenere l'anestesia costante.
- Rimuovere chimicamente i capelli dall'addome usando una crema depilatoria. Spazzare via la crema residua accuratamente con una garza imbevuta di acqua e poi ricoprire l'addome con gel di accoppiamento acustico.
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Procedura di imaging
- Posizionare il trasduttore di 40 MHz nel braccio meccanico.
- Regolare la posizione del trasduttore per ottenere immagini longitudinale del feto e della placenta con la regione di interesse che si trova nella zona focale.
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Analisi e formazione immagine B-Mode
Nota: Vedere film 1.- Fare clic sul pulsante B-Mode e abbassare il trasduttore sopra l'addome, fino a quando il feto e la placenta entrare in vista. Premere Scansione/Freeze per avvio/arresto imaging, premere Cine memorizzare per memorizzare il ciclo di cinematografia e premere telaio memorizzare per memorizzare immagini telaio.
- Fare clic sul pulsante di misura per analizzare la lunghezza sac gestational (GS), lunghezza della groppa di corona fetale (CRL), diametro biparietale (BPD), circonferenza addominale (AC), diametro placenta (PD) e spessore placenta (PT).
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Analisi e PW-Doppler imaging
Nota: Vedere film 1.- Utilizzando la stessa proiezione di scansione, fare clic sul pulsante PW , posizionare la casella di volume di campionamento al centro dell'arteria ombelicale e premere Scan/Freeze per avviare la formazione immagine. Fare clic su Cine memorizzare per raccogliere immagini di arteria ombelicale.
- Fare clic sul pulsante di misura per calcolare la velocità di picco dell'arteria ombelicale (UA).
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Analisi e formazione immagine di Doppler modalità colore
- Utilizzando la stessa proiezione di scansione, fare clic sul pulsante colore e regolare la posizione del trasduttore per ottenere immagini del cuore fetale. Premere scansione/freeze per avviare imaging e Cine memorizzare per raccogliere immagini.
- Fare clic sul pulsante di misura per calcolare la frequenza cardiaca fetale (HR).
4. analisi HPLC
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Preparazione tessuto
- Iniettare i topi incinto con una singola dose di MNPs o plCSA-MNPs (equivalente MTX di 1 mg/kg) a fine gravidanza (ad es., e 14.5) come descritto al punto 3.1.3.
- Dopo 24 h, anestetizzare i topi tramite un'iniezione intraperitoneale di avertin alle 240 μg/peso (g). Non garantire nessuna risposta a un pizzico di piede per verificare che i topi sono completamente anestetizzati.
- Spruzzare la zona del torace con etanolo al 75%. Eseguire perfusione cardiaca (tagliare gli atri destro e irrorare attraverso il ventricolo sinistro) come precedentemente descritto in dettaglio19,20 con 50 mL di soluzione fisiologica 0,9% ghiacciata per 10 min rimuovere le nanoparticelle non associate.
- La diga di eutanasia. Eseguire un taglio cesareo per raccogliere i feti e placente usando il forcipe di Graefe, dissezione Forbici e pinze di Graefe e conservare i tessuti a-80 ° C prima dell'analisi.
- Preparare la soluzione di omogeneizzazione (10% acido perclorico) e tenere il ghiaccio. Raccogliere circa 200 mg di tessuto e aggiungere 500 μL di soluzione di omogeneizzazione per ogni campione. Omogeneizzare i campioni utilizzando un omogeneizzatore a tutta velocità per 30 s e ripetere questa procedura due volte.
- Centrifugare i campioni a 14.000 × g per 20 min a 4 ° C. Filtrare il surnatante (circa 300 μL) attraverso una siringa filtro 0,45 μm e trasferire il liquido risultante a un flacone HPLC. Inserire fiale del campione in un vassoio di autocampionatori per iniezione.
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Preparazione di standard di
- Preparare la seguente soluzione per la fase mobile: 40mm potassio fosfato bibasico (pH 4,5) e acetonitrile (88:12, v/v). Filtrare la soluzione attraverso un filtro per siringa dimensione dei pori 0,45 μm e trasferire il liquido risultante in una bottiglia pulita del serbatoio HPLC.
Nota: Regolare il pH con acido fosforico 0.1 M. Utilizzare la vibrazione ultrasonica per 15 min per degassare la fase mobile ogni volta prima di utilizzare. - Pesare 10 mg di MTX in una provetta da centrifuga da 1,5 mL. Aggiungere 1 mL di idrossido di sodio 1 M.
- Vortice ad alta velocità fino a quando il MTX si dissolve completamente.
Nota: Questo è lo stock di primario e possa essere conservato a-20 ° C per diversi mesi. - Per creare lo stock MTX secondario (500 μg/mL), diluire 50 μL dello stock primario a 950 μL della fase mobile.
Nota: Conservare il ghiaccio fino all'utilizzo e preparati freschi ogni giorno. È importante utilizzare la fase mobile per l'elaborazione di norme per evitare picchi derivanti da miscelare dissimili soluzioni dopo l'iniezione del campione. - Effettuare ulteriori diluizioni per creare gli standard (tabella 1). Conservare gli standard sul ghiaccio e preparare freschi ogni giorno. Eseguire le norme della serie con i campioni sperimentali.
- Preparare la seguente soluzione per la fase mobile: 40mm potassio fosfato bibasico (pH 4,5) e acetonitrile (88:12, v/v). Filtrare la soluzione attraverso un filtro per siringa dimensione dei pori 0,45 μm e trasferire il liquido risultante in una bottiglia pulita del serbatoio HPLC.
| Numero | Concentrazione finale (μg/mL) | ΜL di standard, 500 μg/mL | Mobile phase(μL) |
| 1 | 0,5 | 1 | 999 |
| 2 | 1 | 2 | 998 |
| 3 | 2.5 | 5 | 995 |
| 4 | 10 | 20 | 980 |
| 5 | 25 | 50 | 950 |
| 6 | 50 | 100 | 900 |
| 7 | 100 | 200 | 800 |
Tabella 1. Preparazione della curva standard per MTX. La concentrazione finale della soluzione standard di MTX è da 0,5 a 100 μg/mL.
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Strumentazione HPLC e parametri di funzionamento
Nota: I campioni sono stati analizzati su un sistema HPLC dotato di pompa solvente, un rivelatore spettrofotometrico UV (313 nm) e una colonna C18 (250 × 4.6 mm, 5 μm granulometria).- Accendere il degassificatore di HPLC per eliminare l'aria dal sistema. Attivare il flusso, equilibrare la colonna con la fase mobile per 30 min per ridurre il rumore della linea di base.
- Impostare la temperatura della colonna a 25 ° C, iniettare 20 volumi μL del campione ad una portata di 1 mL/min e scegliere il Metodo Run per avviare l'analisi.
- Quando le piste sono state completate, modificare manualmente la fase mobile acetonitrile di grado HPLC. Eseguire per circa 15 min proteggere il sistema.
Nota: Per eseguire questo passaggio dopo il tempo di esercizio raccomandato potrebbe comportare danni alla colonna. - Per l'analisi quantitativa, calcolare le aree sotto le cime MTX standard di interesse utilizzando il software di sistema HPLC.
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Representative Results
In questo manoscritto, plCSA-BP-coniugato nanoparticelle caricato con MTX (plCSA-MNPs) o ICG (plCSA-INPs) sono state iniettate per via endovenosa in topi incinti. In vivo imaging ha rivelato segnali forti di ICG nella regione dell'utero 30 min dopo l'iniezione plCSA-INP. L'INPs sono stata localizzata principalmente nella regione di fegato e milza (Figura 1A). A 48 h dopo l'iniezione plCSA-INP, incinto topi sono stati sacrificati, rivelando ICG segnali solo nella placenta, mentre con nessun segnale erano rilevabili nel feto (Figura 1B).
Abbiamo poi utilizzato HFUS per monitorare lo sviluppo dell'embrione dopo l'iniezione endovenosa di nanoparticelle. Misure biometriche includono la lunghezza sac gestational (GS), lunghezza della groppa di corona fetale (CRL), diametro biparietale (BPD), circonferenza addominale (AC), diametro placenta (PD), spessore placenta (PT), velocità di picco dell'arteria ombelicale (UA) e cuore fetale tasso (HR) (film 1). I parametri morfologici misurati a diverse età gestazionale sono elencati nella tabella 2. Nel gruppo plCSA-MNP, riguardante il gruppo di PBS, la circonferenza addominale fetale media e la velocità di picco dell'arteria ombelicale sono stati diminuiti significativamente a 12.5 (figure 2A e 2 H), e la lunghezza della groppa corona e placenta diametro erano significativamente diminuito a e 10.5 (figure 2B e 2F). A partire dal E9.5, la lunghezza di sac gestational era inoltre significativamente in diminuzione (Figura 2) e il diametro biparietale, spessore placenta, e frequenza cardiaca fetale ha cominciato a diminuire drammaticamente a 11.5 E rispetto a quelli nel gruppo PBS (figure 2D 2E e 2 G). Insieme, questi risultati suggeriscono che plCSA-MNPs hanno un forte effetto citotossico sullo sviluppo sia feto e placentare. Interessante, il trattamento con allontaneranno anche leggermente alterato sviluppo fetale e placenta (Figure 2A-2 H), che indica che le nanoparticelle potrebbero migliorare la consegna di MTX alla placenta tramite la permeabilità migliorata e l'effetto di ritenzione (EPR).
| Età gestazionale | Gruppo | Decidua (mm) | GS (mm) | CRL (mm) | BPD (mm) | AC (mm) | PD (mm) | PT (mm) | HR (bpm) | UA (mm/s) |
| E6.5 | 0.92±0.23 | / | / | / | / | / | / | / | / | |
| E7.5 | PBS | / | 0.82±0.24 | 0.72±0.18 | / | / | / | / | / | / |
| Allontaneranno | / | 0.83±0.14 | 0.83±0.14 | / | / | / | / | / | / | |
| plCSA-MNPs | / | 0.65±0.23 | 0.65±0.23 | / | / | / | / | / | / | |
| E8.5 | PBS | / | 2.02±0.54 | 1.88±0.40 | 0.93±0.23 | / | / | / | / | / |
| Allontaneranno | / | 1.49±0.50 | 1.49±0.50 | 0.82±0.20 | / | / | / | / | / | |
| plCSA-MNPs | / | 1.14±0.46 | 1.02±0.42 | 0.83±0.18 | / | / | / | / | / | |
| E9.5 | PBS | / | 3.31±0.62 | 3.49±0.65 | 1.39±0.54 | / | / | / | / | / |
| Allontaneranno | / | 2.34±0.68 | 2.23±0.49 | 0.98±0.34 | / | / | / | / | / | |
| plCSA-MNPs | / | 1.83±0.42 | 1.59±0.59 | 0.94±0.25 | / | / | / | / | / | |
| E 10.5 | PBS | / | 4.43±0.67 | 4.97±0.80 | 2.10±0.61 | 4.83±1.40 | 2.91±0.23 | 2.24±0.24 | 100±30 | 30.16±9.40 |
| Allontaneranno | / | 3.28±0.64 | 2.91±0.83 | 1.46±0.54 | 3.95±1.28 | 2.66±0.33 | 2.17±0.19 | 87±21 | 24.63±7.35 | |
| plCSA-MNPs | / | 2.64±0.66 | 2.17±0.85 | 1.12±0.33 | 3.82±1.13 | 2.13±0.35 | 1.94±0.15 | 83±22 | 15.37±5.70 | |
| E11.5 | PBS | / | 5.68±0.73 | 6.45±0.90 | 3.08±0.70 | 8.67±2.08 | 4.16±0.39 | 2.75±0.26 | 124±28 | 31.62±7.76 |
| Allontaneranno | / | 4.36±0.39 | 3.74±1.2 | 2.31±0.53 | 6.69±1.85 | 3.56±0.40 | 2.39±0.23 | 106±22 | 25.20±6.18 | |
| plCSA-MNPs | / | 3.42±0.76 | 2.61±0.84 | 1.51±0.54 | 4.59±1.57 | 2.54±0.49 | 2.09±0.27 | 79±20 | 16.66±5.69 | |
| 12.5 | PBS | / | / | 8.12±1.29 | 3.90±0.65 | 12.43±2.48 | 5.37±0.42 | 3.14±0.24 | 141±26 | 40.62±10.89 |
| Allontaneranno | / | / | 4.87±1.29 | 2.87±0.62 | 8.29±1.78 | 4.25±0.67 | 2.65±0.26 | 119±18 | 27.76±7.52 | |
| plCSA-MNPs | / | / | 3.2±1.28 | 1.75±0.60 | 5.47±1.39 | 3.05±0.50 | 2.28±0.26 | 72±22 | 18.76±7.20 | |
| E13.5 | PBS | / | / | 10.04±1.2 | 4.67±0.65 | 15.64±2.33 | 6.03±0.60 | 3.49±0.23 | 157±28 | 54.62±12.37 |
| Allontaneranno | / | / | 6.17±1.29 | 3.37±0.55 | 9.39±1.88 | 4.77±0.69 | 2.92±0.43 | 109±22 | 35.84±9.49 | |
| plCSA-MNPs | / | / | 3.57±1.71 | 1.87±0.73 | 6.25±1.41 | 3.42±0.63 | 2.37±0.34 | 60±23 | 20.02±11.20 | |
| E 14.5 | PBS | / | / | 12.35±1.6 | 5.36±0.71 | 18.38±2.53 | 6.70±0.64 | 3.75±0.35 | 167±27 | 71.48±10.72 |
| Allontaneranno | / | / | 7.6±1.56 | 3.90±0.70 | 10.31±2.31 | 5.23±0.76 | 3.10±0.39 | 99±23 | 45.80±13.07 | |
| plCSA-MNPs | / | / | / | / | / | / | / | / | / |
Tabella 2. Misurare parametri morfologici di ogni età gestazionale. GS: Lunghezza sac Gestational; CRL: Lunghezza della groppa corona; BPD: Diametro biparietale; AC: Circonferenza addominale; PD: Diametro placenta; PT: Spessore placenta; HR: Frequenza cardiaca fetale; UA: Velocità di picco arteria ombelicale; /: non è possibile misurare.
Abbiamo quindi misurato le concentrazioni di MTX in placente e feti con metodo HPLC. Utilizzando i parametri di funzionamento di HPLC descritti sopra, il tempo di ritenzione MTX è stato determinato per essere 7 min e MTX è stato rilevato in placente del gruppo plCSA-MNP (Figura 3). Le concentrazioni di MTX in placente ed i feti sono state determinate utilizzando curve standard di MTX (Figura 4). 24 h dopo l'iniezione, il livello MTX placenta nel gruppo MNP era significativamente più basso di quello nel gruppo plCSA-MNP, e nessun MTX è stato rilevato in feti del gruppo plCSA-MNP. MTX potrebbe ancora essere rintracciabile nella placenta 48 h dopo l'iniezione plCSA-MNP (Figura 5). Questi risultati dimostrano che plCSA-MNPs non può attraversare la placenta, riducendo così al minimo gli effetti negativi potenziali sul feto.
In sintesi, questo sistema di tre-metodo composto in vivo imaging di fluorescenza, HFUS e HPLC può essere impiegato per determinare quanto bene un veicolo di consegna di droga destinato nanovettori e trasporta droga alla placenta. Usando questi metodi, abbiamo dimostrato che le nanoparticelle plCSA-BP guidati sono un efficace strumento per il targeting la consegna di farmaci alla placenta.
Figura 1 . In vivo fluorescenza. (A) incinto topi (n = 5 ciascuno) a E11.5 sono stati iniettati con INPs o plCSA-INPs (ICG equivalente 5 mg/kg) tramite vena caudale. Dopo 30 min, i topi erano imaged usando un sistema di formazione immagine di fluorescenza. (B) 48 h dopo l'iniezione di INPs o plCSA-INPs, i feti (F, n = 2 per topo) e placente (P, n = 2 per topo) sono stati raccolti ed imaged con un sistema di formazione immagine di fluorescenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Quantificazione di crescita embrionale di HFUS. (A) la circonferenza addominale (n = 30-51 embrioni/giorno), lunghezza della groppa (B) Corona (n = 30-51 embrioni/giorno), lunghezza (C) gestational sac (n = 10-30 embrioni/giorno), diametro biparietale (D) (n = 30-51 embrioni/giorno), spessore (E) placenta (n = 30-51 embrioni/giorno), (F). diametro placenta (n = 30-51 embrioni/giorno), frequenza cardiaca fetale (G) (n = 20-33 embrioni/giorno) e velocità di picco dell'arteria ombelicale (H) (n = 12-36 embrioni/giorno) come misurato in modo non invasivo con l'ecografia in vivo. Tutti i test sono stati confrontati da 2-tailed accoppiata di t-test e p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. I valori sono espressi come il mezzo ± SD. * p < 0,05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001 confrontato al gruppo di PBS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Cromatogrammi HPLC rappresentante dei campioni placentari. Topi in gravidanza (n = 5 ciascuno) sono stati iniettati per via endovenosa con PBS o plCSA-MNPs e loro placente (n = 15 ogni gruppo) sono stati raccolti 24 ore più tardi per HPLC. Utilizzando una soluzione standard di MTX con rilevazione UV a 313 nm, il tempo di ritenzione è stato determinato per essere 7 min Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . Le curve standard per MTX. Le concentrazioni di MTX hanno variato da 0,5 µ g/mL a 100 μg/mL. I dati rappresentano la media ± SD per n = 3. Le barre di errore di alcuni dati sono inferiori i simboli rombici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 . Applicazione di HPLC per determinare il biodistributions di nanoparticelle in placente e feti. Topi incinti sono stati amministrati una singola iniezione di MNPs o plCSA-MNPs (equivalente MTX di 1 mg/kg) in fase gestazionale E13.5. Dopo 24 h e 48 h, le concentrazioni di MTX in placente (n = 15) e feti (n = 15) sono stati misurati da HPLC. I valori sono espressi come means±SD. differenze nelle concentrazioni di MTX fra i gruppi MNP e plCSA-MNP sono state analizzate usando spaiata dello studente t-test (* * * p < 0,001); ND: non rilevato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Film 1. Immagini HFUS di feti e placente che illustrano i punti di misurazione biometrica. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
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Discussion
In questo manoscritto, delineiamo un sistema di tre-metodo per determinare se le nanoparticelle plCSA-BP-guida sono uno strumento efficace per la consegna di farmaci alla placenta di targeting. L'uso di in vivo imaging per monitorare il segnale a infrarossi fluorescente ICG confermato la specificità di targeting placenta di plCSA-BP. Using HFUS e HPLC, abbiamo dimostrato che nanoparticelle plCSA-BP-coniugato possono fornire in modo efficiente MTX solo per il cellule della placenta, non per il feto.
La fluorescenza in vivo imaging esperimenti, le età gestazionale di topi incinti sono importanti. La placenta comincia a formarsi intorno a E9.521. Inoltre, considerando la risoluzione del dispositivo di imaging, l' in vivo imaging esperimento deve essere eseguita dopo E 10.5. Dopo l'iniezione di plCSA-INP a 11,5 E secondo questo protocollo, è stato rilevato nessun segnale di fluorescenza con il dispositivo di imaging nelle condizioni descritte, che può essere dovuto la pelle e gli organi interni che impediscono la trasmissione di segnale22. Per superare questa limitazione, aumentando la dose di iniezione o raccolta di placente e feti per ex vivo imaging deve essere utilizzato.
Un passo fondamentale nella formazione immagine HFUS è l'uso di un trasduttore adatto per ottenere immagini embrionali di alta qualità. La frequenza ottimizzata per l'imaging di embriologia del mouse è di 40-50 MHz. Inoltre, inoltre è importante mantenere la temperatura corporea fisiologica del mouse incinta prima dell'acquisizione delle immagini. Infine, l'osservatore deve fare attenzione quando i film B-modalità di registrazione durante lo sviluppo embrionale precoce (E 6,5 E 8,5), e questo dipende di più esperienza. L'incertezza nella misura può essere compensato confrontando le caratteristiche anatomiche con il quadro di riferimento per il feto e circolazione placentare durante ecografia elaborazione16,23,24. L'accuratezza dei dati di imaging può essere migliorata facendo misurazioni multiple e aumentare il numero dei feti e placente.
La nanoparticella residua non associata nel vaso sanguigno è un efficace fattore per valutare la consegna mirata di farmaci per la placenta ed il feto. Così, perfusione cardiaca è stato effettuato per rimuovere le nanoparticelle non associate prima i feti e placente sono stati raccolti. Precedenti studi7,8,9 hanno anche notato che prima di analizzare la capacità di un peptide di legare la placenta, sottoponendo il mouse alla perfusione cardiaca è essenziale.
Un trabocchetto possibile durante l'analisi in HPLC è la sovrapposizione di MTX con altre cime. Acetonitrile è usato per eluire MTX dalla colonna. Se i picchi sovrapposti si verificano prima di 5 min, diminuendo la concentrazione di acetonitrile nella fase mobile può essere utile. Se dopo 30 min si verificano senza picchi o picchi sovrapposti, aumentando la concentrazione di acetonitrile è utile. Una limitazione principale di HPLC è che non rivela la localizzazione di nanoparticelle all'interno della placenta. Le nanoparticelle plCSA-BP-guida mirate il labirinto placenta nella placenta del mouse11. Così, l'analisi morfologica della placenta è necessario.
Questo è il primo uso della combinazione di imaging in vivo , HFUS e HPLC per determinare l'efficienza della consegna placenta-mirati guidato da un peptide. HFUS è emerso come un avanzato, non invasiva, sicura e in tempo reale metodo di formazione immagine ed è stato usato con successo per l'imaging ad alta risoluzione del mouse sviluppo embrionale17,25,26. Anche se in vivo imaging di fluorescenza è stato ampiamente utilizzato per visualizzare la formazione del tumore e metastasi in topi dal vivo27,28,29, esso precedentemente non è stato utilizzato nello studio di consegna della droga placentare. Come approccio alternativo, in vivo imaging di fluorescenza ha un vantaggio distinto sopra HFUS nell'essere in grado di visualizzare direttamente la distribuzione delle nanoparticelle per via endovenosa iniettate in topi dal vivo ma non è possibile monitorare lo sviluppo placenta e fetale. Quindi, abbiamo combinato i vantaggi di visualizzazione in vivo imaging in fluorescenza e ad alta risoluzione ex HFUS, il che consente la visualizzazione di plCSA-BP-guida INPs in vivo, e l'attivazione di quest'ultimo in vivo monitoraggio degli effetti del plCSA-MNPs su sviluppo placenta e fetale e la sopravvivenza. Inoltre, HPLC ha confermato che plCSA-MNPs specificamente sono state consegnate alla placente e non ha raggiunto i feti.
Mirate la nanomedicina è un nuovo sviluppo nel campo dei disturbi in gravidanza, e sostanziali nuovi approcci per consegnare i farmaci specificamente agli organi materni sono necessari per trattare i disordini di gravidanza nella clinica30. Il sistema di tre-metodo descritto in questo protocollo è una combinazione di in vivo tempo corso di imaging di nanoparticelle di targeting e i corrispondenti effetti sullo sviluppo placenta e fetale, consentendo misurazioni ancora più precise biochimici di la quantità di farmaco nei tessuti per valutare strumenti per la consegna di placenta mirati per il trattamento delle complicanze della gravidanza placenta-mediata.
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Disclosures
X.F. e B.Z. inventori su domanda di brevetto PCT/CN2017/108646 presentato da SIAT che riguarda un metodo di consegna di droga placenta-specifico e la sua applicazione. Tutti gli altri autori dichiarano di non avere nessun interessi concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da borse di studio dalla Fondazione nazionale di scienze naturali (81771617) e la scienza naturale Fondazione della provincia di Guangdong (2016A030313178) assegnato a X.F.; una sovvenzione dalla Shenzhen Basic Research Fund (JCYJ20170413165233512) assegnato a X.F; Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health e lo sviluppo umano del National Institutes of Health, sotto Premio numero R01HD088549 (il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il funzionario viste del National Institutes of Health) di N.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD-1 mice | Beijing Vital River | 201 | Female (8-12 week) |
| Insulin syringe | BD | 328421 | for IV injection |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Methotrexate (MTX) | Sigma-Aldrich | V900324 | for nanoparticles synthesis |
| Indocyanine green (ICG) | Sigma-Aldrich | 1340009 | for in vivo imaging |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Hyclone | SH30028.01 | |
| IVIS spectrum instrument | Perkin Elmer | for in vivo imaging | |
| Ultrasound transmission gel | Guanggong | ZC4252418 | for ultrasound imaging |
| Isoflurane | Lunan Pharmaceutical | I0040 | for maintain the anesthesia |
| Depilatory cream | Nair | TMG001 | for removing fur |
| 40 MHz transducer | VisualSonics | MS550S | for ultrasound imaging |
| High-frequency ultrasound imaging system | VisualSonics | Vevo2100 | for ultrasound imaging |
| Avertin | Sigma-Aldrich | T48402 | for anesthesia |
| Syringe pump | Mindray | SK-500III | forcardiac perfusion |
| 0.9% saline solution | Meilunbio | MA0083 | forcardiac perfusion |
| 1.5 mL Polypropylene tubes | AXYGEN | MCT-150-C | |
| -80 °C freezer | Thermo Fisher Scientific | 88600V | |
| Centriguge | Cence | H1650R | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | for precipitating protein |
| Homogenizer | SCIENTZ | SCIENTZ-48 | for homogenizing tissue |
| Syringe filter (0.45 μm) | Millipore | SLHV033RS01 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical | 10019763 | for solving MTX |
| HPLC vials | Waters | 670650620 | for HPLC |
| Potassium phosphate dibasic | Sinopharm Chemical | 20032117 | for HPLC |
| Acetonitrile | JKchemical | 932537 | for HPLC |
| C18 column | Waters | 186003966 | for HPLC |
| HPLC system | Shimadzu | for HPLC |
References
- Rodger, M. A., et al. The Association of Factor V Leiden and Prothrombin Gene Mutation and Placenta-Mediated Pregnancy Complications: A Systematic Review and Meta-analysis of Prospective Cohort Studies. PLOS Medicine. 7 (6), e1000292 (2010).
- Rodger, M. A., et al. Inherited thrombophilia and pregnancy complications revisited. Obstetrics & Gynecology. 112 (2 Pt 1), 320-324 (2008).
- Brenner, B., Aharon, A. Thrombophilia and adverse pregnancy outcome. Clinics in Perinatology. 34 (4), 527-541 (2007).
- Fisk, N. M., McKee, M., Atun, R. Relative and absolute addressability of global disease burden in maternal and perinatal health by investment in R&D. Tropical Medicine & International Health. 16 (6), 662-668 (2011).
- Fisk, N. M., Atun, R. Market failure and the poverty of new drugs in maternal health. PLOS Medicine. 5 (1), e22 (2008).
- Kaitu'u-Lino, T. uJ., et al. Targeted nanoparticle delivery of doxorubicin into placental tissues to treat ectopic pregnancies. Endocrinology. 154 (2), 911-919 (2013).
- King, A., et al. Tumor-homing peptides as tools for targeted delivery of payloads to the placenta. Science Advances. 2 (5), e1600349 (2016).
- Beards, F., Jones, L. E., Charnock, J., Forbes, K., Harris, L. K. Placental Homing Peptide-microRNA Inhibitor Conjugates for Targeted Enhancement of Intrinsic Placental Growth Signaling. Theranostics. 7 (11), 2940-2955 (2017).
- Cureton, N., et al. Selective Targeting of a Novel Vasodilator to the Uterine Vasculature to Treat Impaired Uteroplacental Perfusion in Pregnancy. Theranostics. 7 (15), 3715-3731 (2017).
- Paul, J. W., et al. Drug delivery to the human and mouse uterus using immunoliposomes targeted to the oxytocin receptor. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 216 (3), e281-e283 (2017).
- Zhang, B., et al. Placenta-specific drug delivery by trophoblast-targeted nanoparticles in mice. Theranostics. 8 (10), 2765-2781 (2018).
- Fan, X., et al. Noninvasive monitoring of placenta-specific transgene expression by bioluminescence imaging. PloS One. 6 (1), e16348 (2011).
- Murata, M., Tahara, K., Takeuchi, H. Real-time in vivo imaging of surface-modified liposomes to evaluate their behavior after pulmonary administration. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (1), 115-119 (2014).
- Ito, A., et al. New whole-body multimodality imaging of gastric cancer peritoneal metastasis combining fluorescence imaging with ICG-labeled antibody and MRI in mice. Gastric Cancer. 17 (3), 497-507 (2014).
- Mazza, M., et al. Liposome-Indocyanine Green Nanoprobes for Optical Labeling and Tracking of Human Mesenchymal Stem Cells Post-Transplantation In Vivo. Advanced Healthcare Materials. 6 (21), (2017).
- Greco, A., et al. High frequency ultrasound for in vivo pregnancy diagnosis and staging of placental and fetal development in mice. PloS One. 8 (10), e77205 (2013).
- Spurney, C. F., Leatherbury, L., Lo, C. W. High-frequency ultrasound database profiling growth, development, and cardiovascular function in C57BL/6J mouse fetuses. Journal of the American Society of Echocardiography. 17 (8), 893-900 (2004).
- Zhang, B., et al. Synthesis and characterization of placental chondroitin sulfate A (plCSA) -targeting lipid-polymer nanoparticles. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Beeton, C., Chandy, K. G. Isolation of mononuclear cells from the central nervous system of rats with EAE. Journal of Visualized Experiments. (10), 527 (2007).
- Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology. 20 (3), 180-193 (2005).
- Frangioni, J. V. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 626-634 (2003).
- Flores, L. E., Hildebrandt, T. B., Kuhl, A. A., Drews, B. Early detection and staging of spontaneous embryo resorption by ultrasound biomicroscopy in murine pregnancy. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 38 (2014).
- Khankin, E. V., Hacker, M. R., Zelop, C. M., Karumanchi, S. A., Rana, S. Intravital high-frequency ultrasonography to evaluate cardiovascular and uteroplacental blood flow in mouse pregnancy. Pregnancy Hypertension. 2 (2), 84-92 (2012).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatric Research. 60 (1), 14-21 (2006).
- Pallares, P., Gonzalez-Bulnes, A. Non-invasive ultrasonographic characterization of phenotypic changes during embryo development in non-anesthetized mice of different genotypes. Theriogenology. 70 (1), 44-52 (2008).
- Parvani, J. G., Gujrati, M. D., Mack, M. A., Schiemann, W. P., Lu, Z. -R. Silencing β3 integrin by targeted ECO/siRNA nanoparticles inhibits EMT and metastasis of triple-negative breast cancer. Cancer Research. 75 (11), 2316-2325 (2015).
- Zhang, B., et al. Targeted delivery of doxorubicin by CSA-binding nanoparticles for choriocarcinoma treatment. Drug Delivery. 25 (1), 461-471 (2018).
- Jenkins, D. E., et al. Bioluminescent imaging (BLI) to improve and refine traditional murine models of tumor growth and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 20 (8), 733-744 (2003).
- Keelan, J. A., Leong, J. W., Ho, D., Iyer, K. S. Therapeutic and safety considerations of nanoparticle-mediated drug delivery in pregnancy. Nanomedicine. 10 (14), 2229-2247 (2015).
