Summary
נתאר מערכת אשר מנצל שלוש שיטות כדי להעריך את הבטיחות והיעילות של תרופות ממוקדות השליה: ויוו הדמיה כדי לפקח nanoparticle הצטברות, אולטרסאונד בתדירות גבוהה כדי לעקוב אחר ההתפתחות העוברית של היפרדות , ו- HPLC לכמת משלוח סמים לרקמות.
Abstract
אין טיפולים יעילים כיום קיימים סיבוכים הקשורים השליה הריון, לפתח אסטרטגיות למסירה יישוב של סמים טבור תוך מזעור תופעות לוואי עוברית אימהי נותר מאתגר. ננו-חלקיק יישוב נושאות מספקים הזדמנויות חדשות לטיפול בהפרעות היפרדות. לאחרונה להדגים כי פפטיד איגוד סינתטי היפרדות כונדרויטין סולפט A (plCSA-BP) יכול לשמש כדי להנחות חלקיקים כדי לספק סמים השליה. ב פרוטוקול זה, נתאר בפירוט מערכת להערכת היעילות של משלוח סמים השליה על ידי BP-plCSA מעסיקה שלוש שיטות נפרד בשילוב: ויוו הדמיה סאונד בתדירות גבוהה (HFUS), ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC). שימוש ב- vivo חלקיקים הדמיה, plCSA BP-מונחה היו דמיינו ב מאחד לשני של בעלי חיים, בעוד HFUS ו- HPLC הדגימו כי plCSA-BP-מצומדת חלקיקים ביעילות, במיוחד נמסר מטוטרקסט השליה. לפיכך, שילוב של שיטות אלה יכול לשמש ככלי יעיל מסירת תרופות השליה יישוב ופיתוח אסטרטגיות טיפול חדש עבור מספר סיבוכים בהריון.
Introduction
סיבוכים הריון בתיווך השליה, כולל רעלת היריון, אובדן הריון, היפרדות שליה, גיל ההיריון קטנים (מועצת התלמידים), הן נפוצות והפניות ניכר תחלואה עוברית, אימהית, התמותה1,2, 3, ומעט מאוד תרופות הוכחו להיות יעיל בטיפול הריון והפרעות4,5. פיתוח אסטרטגיות עבור משלוח סמים השליה במיקוד סלקטיבי יותר ובטוח יותר במהלך ההריון נותר מאתגר בטיפול התרופה המודרנית.
בשנים האחרונות, מספר דיווחים התמקדו יישוב מסירת תרופות uteroplacental רקמות על ידי ציפוי חלקיקים עם פפטידים או נוגדנים ככלים ממוקדות השליה. אלה כוללים נוגדן6 קולטן (EGFR) גורם הגדילה באפידרמיס-נגד, הגידול-יונת פפטידים (CGKRK ו- iRGD)7, פפטידים, ממוקדות השליה8, פפטידים, ממוקדות להערכת היפרדות9 ונוגדנים נגד אוקסיטוצין קולטן10.
. הנה, נדגים כי פפטיד איגוד סינתטי היפרדות כונדרויטין סולפט A (plCSA-BP) יכול לשמש את משלוח ממוקד של חלקיקים, מטענים הסמים שלהם השליה11... PlCSA-BP-מודרכת ' חלקיקים הם משלים uteroplacental שדווחו מיקוד שיטות משום שהם יעד trophoblast היפרדות.
שיטה לא פולשנית, הדמיה ויוו שימש כדי לפקח על ביטוי גנים ספציפיים השליה עכברים12, וגם indocyanine גרין (ICG) כבר בשימוש נרחב כדי לעקוב אחר חלקיקים באמצעות קרינה פלואורסצנטית הדמיה מערכות13, 14,15. לפיכך, אנו לווריד מוזרק חלקיקים plCSA-BP-מצומדת עמוסה ICG (plCSA-INPs) כדי להמחיש את ההתפלגות plCSA-INP בעכברים בהריון עם imager-ידי קרינה פלואורסצנטית. לאחר מכן אנחנו מוזרק לווריד מטוטרקסט (MTX)-נטענת plCSA-NPs עכברים בהריון. אולטרסאונד בתדירות גבוהה (HFUS), אחרת לא פולשנית, בזמן אמת הדמיה כלי16,17 השתמשו כדי לעקוב אחר התפתחות העובר, היפרדות בעכברים. לבסוף, השתמשנו ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) לכמת MTX ההפצה מאחד לשני, העוברים.
ב פרוטוקול זה, נתאר בפירוט במערכת שלוש-שיטה המשמשת כדי להעריך את היעילות של תרופות ממוקדות השליה nanocarriers plCSA-BP-מודרכת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל עכבר ניסויים בקפדנות אחרי פרוטוקולים (SIAT-IRB-160520-YYS-FXJ-A0232) אושרה על ידי חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה של שנג'ן מוסדות של טכנולוגיה מתקדמת, האקדמיה הסינית למדעים.
1. סינתזה של היפרדות כונדרויטין סולפט, ממוקדות A השומנים-פולימר חלקיקים
- לסנתז טעון MTX ICG חלקיקים השומנים-פולימר (MNPs ו- INPs בהתאמה) ו- plCSA-BP-מצומדת חלקיקים (plCSA-MNPs ו- plCSA-INPs) כפי שמתואר פירוט במקום18.
2. in vivo הדמיה קרינה פלואורסצנטית
-
הכנה של עכברים בהריון
- מקום CD-1 נקבה עכברים (8-12 שבועות) עם זכר מפרה של המתח אותו בכלוב אחד (זכר: נקבה = 1:2) אחר הצהריים. ואבדוק הנרתיק מחבר הבאות בבוקר. אם פקק הנרתיק הוא ציין, להגדיר את העכבר כמו יום עובריים 0.5 (E0.5).
- הבית בהריון עכברים לבד בחדר הפתוגן חינם בעלי חיים עם אור/10 h 14 h כהה מחזור ומספקים גישה חופשית מזון ומים עד E14.5.
-
חלקיקים תוך ורידיות
- לפני ההליך, לעקר חלקיקים על-ידי סינון דרך מסנן מזרק 0.22 μm. שוקלים את העכבר בהריון-E11.5 כדי לקבוע את כמות ונפח של הזרקת nanoparticle.
הערה: אמצעי האחסון הזרקת ננו-חלקיק צריך להיות פחות מ 1% (משקל/נפח) של משקל הגוף של העכבר בהריון. לדוגמה, האחסון הזרקת ננו-חלקיק צריך להיות פחות מ- 0.25 מ ל עכבר 25 גרם. - להתרחב את הווריד הזנב, לחמם את הזנב למשך 5-10 דקות עם כרית חימום.
- לפני זריקה, וארוקן את INPs או plCSA-INPs לתוך מזרק אינסולין 28 גרם.
- להעביר את העכבר בהריון מכשיר אחזקות ומרסן את העכבר תוך מתן אפשרות גישה לוריד הזנב. לנקות את הזנב עם ספוגית אלכוהול. לאחר מכן להוסיף את המזרק לווריד הזנב. לאט לאט להחדיר את INPs או plCSA-INPs (5 מ"ג/ק"ג ICG המקביל) גם הלחץ מעל 5-10 s.
הערה: להפסיק הזרקת שלפוחית המופיע על הזנב כי התוצאה מציין כי אינה המחט בווריד. לא צריך להיות משותף מזרקים בין עכבר כדי למזער העברת מחלות זיהום צולב. - רשום את הזמן הזרקה. בינתיים, להחיל לחץ עדין על ההזרקה עד התחנות דימום, אשר בדרך כלל לוקח s 30-60.
- לפני ההליך, לעקר חלקיקים על-ידי סינון דרך מסנן מזרק 0.22 μm. שוקלים את העכבר בהריון-E11.5 כדי לקבוע את כמות ונפח של הזרקת nanoparticle.
-
דימות in vivo
- 30 דקות לאחר ההזרקה תמונה העכברים בהריון באמצעות פלורסצנטיות ויוו מערכת הדמיה.
- עזים ומתנגד עכברים בהריון עם שיעור זרימת החמצן של 1.0 L/min ואיזופלוריין-2-4% ב חדר המשויך של יחידת הרדמה ואמת הרדמה מלאה על ידי איטי ונשימה רגיל. לאחר מכן, להעביר אותם לתוך החדר הדמיה. הצב העכברים בהריון anesthetized לחדר ההדמיה, שמירה על בעלי החיים במצב פרקדן.
- הצב קונוס האף מעל הפה והאף כדי לאפשר שאיפת 1-2% איזופלוריין עם שיעור זרימת החמצן של 1.0 L/דקה כדי לשמור על הרדמה.
- בחר פרמטרים 2D-זריחה, צילום תמונה את האותות פלורסצנטיות ICG. הגדר את החשיפה אוטומטית על אורכי הגל של עירור/פליטה כדי 710/820 nm.
- בסוף ההליך הדמיה, לבטל את זרם איזופלוריין כדי לעצור את ההרדמה, ולחזור בקפידה העכברים בהריון לכלובים.
- 48 שעות לאחר ההזרקה ננו-חלקיק, עזים ומתנגד עכברים בהריון עם isofluorane ולאחר מכן להקריב את הסכר על ידי נקע בצוואר הרחם. לאסוף את העוברים ואת מאחד לשני באמצעות מלקחיים Graefe, Graefe רקמות מלקחיים, ולאחר לנתח מספריים.
- מקם את מאחד לשני ואת העוברים לתוך תא הדמיה, ואת התמונה באמצעות השיטה המתוארת בשלב 2.3.4.
3. HFUS הערכה של התפתחות עוברית
-
מודלים בעלי חיים
- להשיג ולהכין העכברים בהריון כפי שמתואר בשלב 2.1.
- השתמש HFUS כדי התמונה עכברים בהריון-E 6.5 (פרוטוקולים 3.2 ו- 3.3.3). ראשית, לאשר הריון דמיין עוברי ביום E6.5 ולאחר מכן להקצות באופן אקראי העכברים בהריון לשלוש קבוצות: MNP קבוצה, plCSA-MNP, וקבוצת באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).
- להזריק PBS, MNPs או plCSA-MNPs (1 מ"ג/ק"ג MTX שוות ערך) לתוך הוורידים הזנב של העכברים בהריון בכל יום החל מ- E6.5 כפי שמתואר בשלב 2.2.
-
הכנה הדמיה
- 24 שעות לאחר ההזרקה של חלקיקים, תמונה העכברים בהריון באמצעות HFUS את מערכת הדמיה.
- עזים ומתנגד העכברים בהריון כפי שמתואר בשלב 2.3.2. הפעל את הפקדים טמפרטורה משולב של פלטפורמת הדמיה ומחממים את הפלטפורמה כדי 37-42 ° C. לאבטח העכברים בהריון במצב פרקדן על פלטפורמה באמצעות הקלטת.
- המקום קונוס האף מחובר יחידת הרדמה מעל החוטם. חלות 2% איזופלוריין עם שיעור זרימת החמצן של 1.0 L/דקה כדי לשמור על יציבות הרדמה.
- מבחינה כימית להסיר שיער בבטן באמצעות קרם depilatory. למחוק את הקרם שיורית ביסודיות עם גזה ספוגי מים ולאחר מכן מעיל הבטן עם הגיטרה האקוסטית צימוד ג'ל.
-
הליך הדמיה
- מקום 40 מגה-הרץ מתמר זרוע מכנית.
- להתאים את מיקום מתמר להשיג תמונות האורך של העובר ואת השליה אזור את עניין ממוקם באזור מוקד.
-
B-מצב הדמיה וניתוח
הערה: ראה סרט 1.- לחץ על הלחצן B-מצב והורד המתמר מעל הבטן, עד העובר ואת השליה לתצוגה. לחץ על סריקה/הקפאת כדי החניך/הפסק הדמיה, הקש Cine לאחסן כדי לאחסן את הלולאה cine והקש מסגרת לאחסן לאחסון תמונות מסגרת.
- לחץ על לחצן אמצעי כדי לנתח את שק הריון אורך (אלף), crown עוברי עכוז אורך (CRL), קוטר biparietal. קוראים לו אהרון (. דאוני), היקף בטן (AC), היפרדות קוטר (PD) ועובי היפרדות (PT).
-
PW-דופלר הדמיה וניתוח
הערה: ראה סרט 1.- באמצעות אותו לסרוק ההקרנה, לחץ על לחצן PW , מקם את תיבת אחסון הדגימה במרכז בעורק הטבור, והקש סריקה/הקפאת ליזום הדמיה. לחץ על Cine לאחסן לאסוף תמונות בעורק הטבור.
- לחץ על לחצן אמצעי כדי לחשב את מהירות שיא בעורק הטבור (UA).
-
צבע דופלר במצב הדמיה וניתוח
- באמצעות אותו לסרוק ההקרנה, לחץ על לחצן צבע , להתאים את מיקום מתמר כדי להשיג כמה תמונות של הלב העוברי. לחץ על סריקה/הקפאת ליזום Cine לאחסן לאסוף תמונות של הדמיה.
- לחץ על לחצן אמצעי לחישוב קצב הלב העוברי (HR).
4. hplc, קורס ניתוח
-
הכנת הרקמה
- להזריק העכברים בהריון עם מנה אחת של MNPs או plCSA-MNPs (המקביל MTX 1 מ"ג/ק"ג)-ההריון (למשל., E14.5) כפי שמתואר בשלב 3.1.3.
- לאחר 24 שעות, עזים ומתנגד העכברים על ידי זריקה בקרום הבטן של avertin על המשקל גוף μg/240 (g). ודא אין תגובה קמצוץ רגל כדי לוודא כי העכברים הם מורדם לחלוטין.
- תרסיס לאזור החזה עם 75% אתנול. לבצע זלוף הלב (לחתוך את אטריה נכון, perfuse דרך החדר השמאלי) כאמור המתוארת בעלון פירוט19,,20 , 50 מ ל תמיסת 0.9% קר כקרח 10 דקות להסיר חלקיקים לא מאוגד.
- המתת חסד הסכר. לבצע ניתוח קיסרי כדי לאסוף את העוברים ואת מאחד לשני באמצעות מלקחיים Graefe, לנתח את המספריים, וחדים Graefe רקמות, ולאחסן את הרקמות ב-80 מעלות צלזיוס לפני ניתוח.
- להכין את הפתרון המגון (10% חומצה על-כלורית) ולשמור על קרח. לאסוף כ- 200 מ ג של רקמות, ולהוסיף 500 μL של פתרון המגון כל דגימה. Homogenize את הדגימות באמצעות מהמגן במלוא המהירות עבור 30 s, חזור על הליך זה פעמיים.
- Centrifuge את הדגימות-14,000 g × עבור 20 דקות ב 4 º C. לסנן את תגובת שיקוע (כ-300 μL) דרך מסנן מזרק μm 0.45, להעביר את הנוזל שהתקבל המבחנה HPLC. מניחים צלוחיות מדגם במגש תעשיה להזרקה.
-
הכנת תקנים
- להכין את הפתרון הבא לשלב ניידים: 40 מ מ אשלגן פוספט dibasic (pH 4.5), acetonitrile (88:12, וי/v). לסנן את הפתרון דרך מסנן מזרק 0.45 μm גודל הנקבוביות והעבר את הנוזל שהתקבל לבקבוק נקי של מאגר HPLC.
הערה: להתאים את ה-pH עם חומצה זרחתית 0.1 M. השתמש רטט קולי למשך 15 דקות כדי דגה השלב ניידים בכל פעם מוקדמת לשימוש. - שוקלת 10 מ ג של MTX לתוך שפופרת צנטרפוגה 1.5 mL. להוסיף 1 מ"ל של 1 מ' נתרן הידרוקסידי.
- מערבולת במהירות גבוהה עד MTX מתמוסס לחלוטין.
הערה: זהו המניות העיקרי והוא ניתן לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים. - כדי ליצור את המניה MTX המשני (500 μg/mL), לדלל 50 μL של המניה הראשי ב μL 950 השלב ניידים.
הערה: לאחסן בקירור עד השימוש והכן טריים מדי יום. חשוב להשתמש השלב ניידים עבור הכנת תקנים כדי להימנע פסגות הנובע ערבוב פתרונות שונים לאחר הזרקה מדגם. - לבצע נוספים דילולים כדי ליצור את הסטנדרטים (טבלה 1). לאחסן את הסטנדרטים בקרח והכן טריים מדי יום. הפעל את הסטנדרטים בסדרה עם הדגימות ניסיוני.
- להכין את הפתרון הבא לשלב ניידים: 40 מ מ אשלגן פוספט dibasic (pH 4.5), acetonitrile (88:12, וי/v). לסנן את הפתרון דרך מסנן מזרק 0.45 μm גודל הנקבוביות והעבר את הנוזל שהתקבל לבקבוק נקי של מאגר HPLC.
| מספר | ריכוז סופי (μg/mL) | ΜL סטנדרטי, 500 μg/mL | Phase(μL) נייד |
| 1 | 0.5 | 1 | 999 |
| 2 | 1 | 2 | 998 |
| 3 | 2.5 | 5 | 995 |
| 4 | 10 | 20 | 980 |
| 5 | 25 | 50 | 950 |
| 6 | 50 | 100 | 900 |
| 7 | 100 | 200 | 800 |
טבלה 1. להתכונן של עיקול רגיל MTX. הריכוז הסופי של כל פתרון MTX נמצא במרחק של 0.5-100 μg/mL.
-
מכשור HPLC ו מבצע פרמטרים
הערה: דגימות נותחו על מערכת HPLC מצויד עם משאבה הממס, גלאי spectrophotometric UV (313 ננומטר), ועמודה סי18 (250 × 4-6 מ מ, גודל החלקיקים μm 5).- הפעל את degasser HPLC כדי להוציא אוויר מהמערכת. הפעל את הזרימה, equilibrating את העמודה עם השלב ניידים למשך 30 דקות להפחית את הרעש בסיסית.
- לקבוע את הטמפרטורה של העמודה עד 25 ° C, להזריק 20 כרכים מדגם μL בספיקה של 1 מ"ל לדקה ולחץ את שיטת הפעלת להתחיל את הניתוח.
- בעת שלשול הושלמו, לשנות באופן ידני את שלב נייד כדי acetonitrile HPLC-כיתה. הפעל למשך כ 15 דקות להגן על המערכת.
הערה: כשל לבצע שלב זה לאחר הזמן רץ המומלצת יכולה לגרום נזק לעמודה. - עבור ניתוח כמותי, לחשב את האזורים תחת הפסגות MTX סטנדרטי של הריבית באמצעות תוכנת המערכת HPLC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כתב יד זה, plCSA-BP-מצומדת חלקיקים טעונים עם MTX (plCSA-MNPs) או ICG (plCSA-INPs) היו מוזרק לווריד עכברים בהריון. דימות in vivo חשף אותות חזקים ICG באזור הרחם 30 דקות לאחר ההזרקה plCSA-INP. INPs היו בעיקר מקומי באזור הכבד, הטחול (איור 1 א'). -48 שעות לאחר ההזרקה plCSA-INP, עכברים בהריון הוקרבו, חשיפת ICG אותות רק ב השליה, ואילו עם אותות לא היו לזיהוי העובר (איור 1B).
. אז השתמשנו HFUS לעקוב אחר התפתחות העובר לאחר הזרקה תוך ורידי של חלקיקים. מדידות ביומטריים הכלולים שק הריון (אלף), crown עוברי עכוז אורך (CRL), קוטר biparietal. קוראים לו אהרון (. דאוני), היקף בטן (AC), היפרדות קוטר (PD), היפרדות עובי (PT), מהירות שיא בעורק הטבור (UA), לאורכה לב העובר קצב (HR) (סרט 1). הפרמטרים מורפולוגי נמדד בגילאים שונים הריונית מפורטים בטבלה מס ' 2. בקבוצה plCSA-MNP, ביחס לקבוצה PBS, כלומר היקף בטן העובר ומהירות השיא בעורק הטבור ירדו באופן משמעותי ב- E12.5 (דמויות 2A ו- 2 H), כתר עכוז לאורכה קוטר היפרדות היו ירד באופן משמעותי ב- E10.5 (דמויות 2B ו- 2F). החל מה-E9.5, אורך שק הריון היה גם ירד משמעותית (איור 2C), קוטר biparietal, עובי היפרדות, והחל קצב דפיקות הלב להפחתה משמעותית על E 11.5 ביחס לאלה בקבוצה PBS (דמויות 2D 2E ו- 2 G). יחד, ממצאים אלה מראים כי plCSA-MNPs יש השפעה ציטוטוקסיות חזקה על התפתחות עוברית והן היפרדות. מעניין, טיפול עם MNPs נפגעת גם מעט עוברי היפרדות ופיתוח (דמויות 2A-2 H), המציין כי חלקיקים עשוי לשפר את המסירה של MTX טבור באמצעות חדירות משופרת ותוצאה השמירה (EPR).
| גיל ההיריון | קבוצה | רותמי (מ מ) | GS (מ מ) | רשימת ביטול אישורים (מ מ) | קוראים לו אהרון דאוני (מ מ) | AC (מ מ) | PD (מ מ) | PT (מ מ) | HR (bpm) | UA (מ מ/s) |
| E6.5 | 0.92±0.23 | / | / | / | / | / | / | / | / | |
| E7.5 | PBS | / | 0.82±0.24 | 0.72±0.18 | / | / | / | / | / | / |
| MNPs | / | 0.83±0.14 | 0.83±0.14 | / | / | / | / | / | / | |
| plCSA-MNPs | / | 0.65±0.23 | 0.65±0.23 | / | / | / | / | / | / | |
| E8.5 | PBS | / | 2.02±0.54 | 1.88±0.40 | 0.93±0.23 | / | / | / | / | / |
| MNPs | / | 1.49±0.50 | 1.49±0.50 | 0.82±0.20 | / | / | / | / | / | |
| plCSA-MNPs | / | 1.14±0.46 | 1.02±0.42 | 0.83±0.18 | / | / | / | / | / | |
| E9.5 | PBS | / | 3.31±0.62 | 3.49±0.65 | 1.39±0.54 | / | / | / | / | / |
| MNPs | / | 2.34±0.68 | 2.23±0.49 | 0.98±0.34 | / | / | / | / | / | |
| plCSA-MNPs | / | 1.83±0.42 | 1.59±0.59 | 0.94±0.25 | / | / | / | / | / | |
| E10.5 | PBS | / | 4.43±0.67 | 4.97±0.80 | 2.10±0.61 | 4.83±1.40 | 2.91±0.23 | 2.24±0.24 | 100±30 | 30.16±9.40 |
| MNPs | / | 3.28±0.64 | 2.91±0.83 | 1.46±0.54 | 3.95±1.28 | 2.66±0.33 | 2.17±0.19 | 87±21 | 24.63±7.35 | |
| plCSA-MNPs | / | 2.64±0.66 | 2.17±0.85 | 1.12±0.33 | 3.82±1.13 | 2.13±0.35 | 1.94±0.15 | 83±22 | 15.37±5.70 | |
| E11.5 | PBS | / | 5.68±0.73 | 6.45±0.90 | 3.08±0.70 | 8.67±2.08 | 4.16±0.39 | 2.75±0.26 | 124±28 | 31.62±7.76 |
| MNPs | / | 4.36±0.39 | 3.74±1.2 | 2.31±0.53 | 6.69±1.85 | 3.56±0.40 | 2.39±0.23 | 106±22 | 25.20±6.18 | |
| plCSA-MNPs | / | 3.42±0.76 | 2.61±0.84 | 1.51±0.54 | 4.59±1.57 | 2.54±0.49 | 2.09±0.27 | 79±20 | 16.66±5.69 | |
| E12.5 | PBS | / | / | 8.12±1.29 | 3.90±0.65 | 12.43±2.48 | 5.37±0.42 | 3.14±0.24 | 141±26 | 40.62±10.89 |
| MNPs | / | / | 4.87±1.29 | 2.87±0.62 | 8.29±1.78 | 4.25±0.67 | 2.65±0.26 | 119±18 | 27.76±7.52 | |
| plCSA-MNPs | / | / | 3.2±1.28 | 1.75±0.60 | 5.47±1.39 | 3.05±0.50 | 2.28±0.26 | 72±22 | 18.76±7.20 | |
| E13.5 | PBS | / | / | 10.04±1.2 | 4.67±0.65 | 15.64±2.33 | 6.03±0.60 | 3.49±0.23 | 157±28 | 54.62±12.37 |
| MNPs | / | / | 6.17±1.29 | 3.37±0.55 | 9.39±1.88 | 4.77±0.69 | 2.92±0.43 | 109±22 | 35.84±9.49 | |
| plCSA-MNPs | / | / | 3.57±1.71 | 1.87±0.73 | 6.25±1.41 | 3.42±0.63 | 2.37±0.34 | 60±23 | 20.02±11.20 | |
| E14.5 | PBS | / | / | 12.35±1.6 | 5.36±0.71 | 18.38±2.53 | 6.70±0.64 | 3.75±0.35 | 167±27 | 71.48±10.72 |
| MNPs | / | / | 7.6±1.56 | 3.90±0.70 | 10.31±2.31 | 5.23±0.76 | 3.10±0.39 | 99±23 | 45.80±13.07 | |
| plCSA-MNPs | / | / | / | / | / | / | / | / | / |
בטבלה 2. למדוד את הפרמטרים מורפולוגיות של כל גיל ההיריון. GS: שק הריון אורך; רשימת ביטול אישורים: כתר עכוז אורך; קוראים לו אהרון דאוני: קוטר Biparietal; AC: היקף בטן; המשטרה: היפרדות קוטר; PT: היפרדות עובי; HR: קצב דפיקות הלב; UA: בעורק הטבור שיא מהירות; /: אי אפשר לאמוד.
אנחנו הבא נמדדים ריכוזים MTX מאחד לשני, העוברים באמצעות HPLC. באמצעות הפרמטרים של הפעולה HPLC המתוארים לעיל, זמן השמירה MTX היה נחוש בדעתו להיות 7 דקות, MTX זוהה מאחד לשני של קבוצת plCSA-MNP (איור 3). הריכוזים MTX מאחד לשני, העוברים היו נחושים באמצעות MTX רגיל עקומות (איור 4). 24 שעות לאחר ההזרקה, רמת MTX היפרדות בקבוצה MNP הייתה נמוכה באופן משמעותי מזו בקבוצה plCSA-MNP, אין MTX אותרה ההתעסקות של קבוצת plCSA-MNP. MTX יכול עדיין ניתן לזהות את השליה 48 שעות לאחר ההזרקה plCSA-MNP (איור 5). תוצאות אלו מדגימים כי plCSA-MNPs לא יכול לחצות את השליה, ובכך לחסוך פוטנציאלית השפעות שליליות על העובר.
לסיכום, מערכת 3-שיטה זו מורכבת ויוו פלורסצנטיות הדמיה, HFUS ו- HPLC יכול להיות מועסק כדי לקבוע עד כמה רכב משלוח סמים מטרות nanocarriers ומעבירה סמים טבור. באמצעות שיטות אלה, אנחנו הראו כי חלקיקים BP-plCSA מודרכים הינם כלי יעיל עבור מיקוד משלוח סמים השליה.
איור 1 . אין ויוו קרינה פלואורסצנטית הדמיה- (א) עכברים-. בהריון (n = 5 כל) ב E11.5 הוזרקו INPs או plCSA-INPs (ICG המקביל 5 מ"ג/ק"ג) דרך הווריד של הזנב. לאחר 30 דקות, העכברים היו עם תמונה באמצעות פלורסצנטיות מערכת הדמיה. (ב) 48 שעות לאחר ההזרקה של INPs או plCSA-INPs, העוברים (F, n = 2 לכל העכבר), מאחד לשני (P, n = 2 לכל עכבר) היו נאספים וכוח עם תמונה עם פלורסצנטיות מערכת הדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . כימות של צמיחה עובריים מאת HFUS. (א) היקף בטן (n = 30-51 עוברי/יום), (ב) כתר עכוז אורך (n = 30-51 עוברי/יום), אורך שק הריון (ג) (n = 10-30 עוברי/יום), קוטר (ד) biparietal (n = 30-51 עוברי/יום), עובי היפרדות (E) (n = 30-51 עוברי/יום), (F). קוטר היפרדות (n = 30-51 עוברי/יום), קצב הלב העוברי (G) (n = 20-33 עוברי/day), (H) בעורק הטבור שיא מהירות (n = 12-36 עוברי/יום) כפי שהיא נמדדת לא פולשני אולטרסאונד ויוו. כל הבחינות הושוו על ידי 2-זנבי לזווג t-test, ו- p < 0.05 נחשב משמעותי סטטיסטית. ערכים מבוטא את האמצעים ± SD. * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001 לעומת הקבוצה PBS. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . נציג HPLC chromatograms של דגימות היפרדות. עכברים בהריון (n = 5 כל) דרך הווריד הוזרקו PBS או plCSA-MNPs, שלהם מאחד לשני (n = 15 לכל קבוצה) שנאספו 24 שעות מאוחר יותר לבדיקות. באמצעות פתרון רגיל של MTX עם זיהוי UV-313 ננומטר, משך הזמן שבו היה נחוש בדעתו להיות מינימלית 7 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . עקומות סטנדרטי עבור MTX. הריכוזים של MTX נע בין 0.5 μg/mL אל μg/מ. הנתונים מייצגים את ±SD רע עבור n = 3. קווי השגיאה של חלק מהנתונים קטנים הסמלים ומעוינים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 . יישום של HPLC כדי לקבוע את biodistributions של חלקיקים מאחד לשני, העוברים. עכברים בהריון נוהלו זריקה אחת של MNPs או plCSA-MNPs (המקביל MTX 1 מ"ג/ק"ג) בשלב הריון E13.5. לאחר 24 שעות ביממה ו- h 48, ריכוזי MTX ב מאחד לשני (n = 15), העוברים (n = 15) נמדדו על ידי HPLC. הערכים מבוטאים כמו ההבדלים means±SD. בריכוזים MTX בין הקבוצות MNP ו- plCSA-MNP נותחו באמצעות אינטראקצית הסטודנט t-מבחן (* * * p < 0.001); nd: לא זוהה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
סרט 1- HFUS תמונות של עוברים מאחד לשני הממחישות מדידה ביומטרי מיקומים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כתב יד זה, אנחנו חלוקה לרמות מערכת 3-שיטה לקביעת אם plCSA-BP-מודרכת ' חלקיקים הם כלי יעיל עבור מיקוד משלוח סמים השליה. השימוש ויוו הדמיה לעקוב אחר האות האינפרא-אדום ICG פלורסנט אישר יחודיות מיקוד היפרדות של שימוש plCSA-BP. HFUS, HPLC, הפגנו כי חלקיקים plCSA-BP-מצומדת יכול ביעילות לספק MTX רק תאי השליה, אל העובר.
ב ויוו פלורסצנטיות הדמיה ניסויים, הגילאים עכברים בהריון הריונית חשובים. השליה מתחילה להיווצר סביב E9.521. בנוסף, בהתחשב לרזולוציה של הצלם, ה- ויוו הדמיה ניסוי יש לבצעו לאחר ה 10.5. לאחר ההזרקה plCSA-INP-E 11.5 לפי פרוטוקול זה, אין קליטה פלורסצנטיות זוהה עם הצלם בתנאים המתוארים, שיכול להיות שהוא עקב עור ואיברים פנימיים מונעים אות שידור22. כדי להתגבר על מגבלה זו, הגדלת את הזרקת מינון או אוסף של מאחד לשני, העוברים לדימות vivo לשעבר חייב להיות מנוצל.
שלב קריטי בתחום ההדמיה HFUS הוא השימוש של מתמר מתאימים כדי לקבל תמונות עובריים באיכות גבוהה. תדירות ממוטב עבור הדמיה אמבריולוגיה העכבר הוא 40-50 מגה-הרץ. יתר על כן, שמירה על טמפרטורת הגוף הפיזיולוגיות של העכבר בהריון לפני רכישת תמונות חשוב גם. בסופו של דבר, הצופה צריך להיות זהיר בעת הקלטת סרטים B-מצב במהלך התפתחות העובר מוקדם (ה 8.5 6.5-E), זה תלוי יותר ניסיון. הוודאות במדידה עשויים להיות מתוגמלים על-ידי השוואת תכונות אנטומיות עם מסגרת ההתייחסות של העובר ולתנועת היפרדות במהלך אולטרסאונד עיבוד16,23,24. דיוק הנתונים הדמיה שיפור על ידי ביצוע מדידות מרובות והגברת המספרים של העוברים, מאחד לשני.
לא מאוגד שיורית ננו-חלקיק של כלי הדם הוא גורם יעיל להערכת משלוח סמים יישוב השלייה והעובר. לפיכך, זלוף הלב בוצע כדי להסיר חלקיקים לא מאוגד לפני העוברים, נאספו מאחד לשני. מחקרים קודמים7,8,9 גם ציינו כי לפני ניתוח היכולת של פפטיד לאגד את השליה, העמדת העכבר זלוף הלב הוא חיוני.
כנחותים אפשרי במהלך ניתוח HPLC הוא החפיפה של MTX עם פסגות אחרות. Acetonitrile משמש elute MTX מן העמודה. אם הפסגות חופפים התרחשה לפני 5 דקות, הפחתת ריכוז acetonitrile בשלב נייד עשוי להיות שימושי. אם אין פסגות או חופפים פסגות התרחשה לאחר 30 דקות, הגדלת ריכוז acetonitrile שימושית. מגבלה הראשי של HPLC היא כי זה אינו חושף הלוקליזציה של חלקיקים בתוך השליה. חלקיקים plCSA BP-מונחה דווקא בחרו המבוך היפרדות השליה11העכבר. לפיכך, ניתוח מורפולוגי של השליה הכרחי.
זהו השימוש הראשון שילוב הדמיה ויוו , HFUS ו- HPLC כדי לקבוע את היעילות של השליה, ממוקדות משלוח בהדרכת פפטיד. HFUS התפתחה מתקדם, לא פולשנית, כספת, בזמן אמת הדמיה שיטה, שימש בהצלחה במשך דימות ברזולוציה של העכבר התפתחות17,25,26. למרות ויוו פלורסצנטיות הדמיה כבר בשימוש נרחב כדי להמחיש היווצרות סרטן, גרורות עכברים חיים27,28,29, זה כבר לא בעבר בשימוש במחקר של תרופות היפרדות. כגישה חלופית, ויוו פלורסצנטיות הדמיה יש יתרון בולט על פני HFUS מסוגל לדמיין ישירות את ההפצה של חלקיקים מוזרק לווריד בעכברים בשידור חי אבל לא יכול לעקוב אחר ההתפתחות העוברית של היפרדות. לפיכך, אנו משלבים את היתרונות של ויזואליזציה על-ידי קרינה פלואורסצנטית ויוו דימות ברזולוציה גבוהה לשעבר HFUS-המאפשר ויזואליזציה של plCSA-BP-מודרכת ' INPs ויוו, ועל הפעלת האחרון אין ויוו ניטור של ההשפעות של plCSA-MNPs על ההתפתחות העוברית של היפרדות והישרדות. יתר על כן, HPLC אישר כי plCSA-MNPs נמסרו במיוחד מאחד לשני, לא הגיעו העוברים.
ננו-רפואה יישוב הוא התפתחות חדשה בתחום של הפרעות הריון, גישות חדשות ניכרים במיוחד לספק תרופות לאיברים אימהי נדרשים לטיפול בהפרעות הריון אצל מרפאה30. מערכת שלוש-שיטת שמתואר פרוטוקול זה הוא שילוב של ויוו מסלול הזמן הדמיה של ננו-חלקיק מיקוד וגם ההשפעות המתאימים על ההתפתחות העוברית של היפרדות, המאפשר מדידה הביוכימי מדויקת יותר של כמות התרופה ברקמות להעריך כלים למסירה השליה ממוקד לטיפול של ההריון בתיווך השליה סיבוכים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
X.f. ב עורכים: ב"צ ממציאים על יישום הפטנטים PCT/CN2017/108646 נאספו על ידי האירוע מתקיים המכסה שיטת משלוח סמים ספציפיים השליה ואת היישום שלו בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. כל מחברים אחרים מצהירים כי יש להם אין אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי הקרן מדעי הטבע הלאומית (81771617), את מדעי הטבע קרן של בפרובינצית גואנג-דונג (2016A030313178) הוענק x.f. ב; מענק מהקרן שנג'ן בסיסי מחקר (JCYJ20170413165233512) הוענק X.F; ו יוניס קנדי שרייבר המכון הלאומי הילד לבריאות & פיתוח אנושי של מכוני הבריאות הלאומיים תחת פרס מספר R01HD088549 (התוכן מוטלת אך ורק על המחברים, ואינם מייצגים בהכרח הרשמי תצוגות של מכוני הבריאות הלאומיים) כדי N.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD-1 mice | Beijing Vital River | 201 | Female (8-12 week) |
| Insulin syringe | BD | 328421 | for IV injection |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Methotrexate (MTX) | Sigma-Aldrich | V900324 | for nanoparticles synthesis |
| Indocyanine green (ICG) | Sigma-Aldrich | 1340009 | for in vivo imaging |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Hyclone | SH30028.01 | |
| IVIS spectrum instrument | Perkin Elmer | for in vivo imaging | |
| Ultrasound transmission gel | Guanggong | ZC4252418 | for ultrasound imaging |
| Isoflurane | Lunan Pharmaceutical | I0040 | for maintain the anesthesia |
| Depilatory cream | Nair | TMG001 | for removing fur |
| 40 MHz transducer | VisualSonics | MS550S | for ultrasound imaging |
| High-frequency ultrasound imaging system | VisualSonics | Vevo2100 | for ultrasound imaging |
| Avertin | Sigma-Aldrich | T48402 | for anesthesia |
| Syringe pump | Mindray | SK-500III | forcardiac perfusion |
| 0.9% saline solution | Meilunbio | MA0083 | forcardiac perfusion |
| 1.5 mL Polypropylene tubes | AXYGEN | MCT-150-C | |
| -80 °C freezer | Thermo Fisher Scientific | 88600V | |
| Centriguge | Cence | H1650R | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | for precipitating protein |
| Homogenizer | SCIENTZ | SCIENTZ-48 | for homogenizing tissue |
| Syringe filter (0.45 μm) | Millipore | SLHV033RS01 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical | 10019763 | for solving MTX |
| HPLC vials | Waters | 670650620 | for HPLC |
| Potassium phosphate dibasic | Sinopharm Chemical | 20032117 | for HPLC |
| Acetonitrile | JKchemical | 932537 | for HPLC |
| C18 column | Waters | 186003966 | for HPLC |
| HPLC system | Shimadzu | for HPLC |
References
- Rodger, M. A., et al. The Association of Factor V Leiden and Prothrombin Gene Mutation and Placenta-Mediated Pregnancy Complications: A Systematic Review and Meta-analysis of Prospective Cohort Studies. PLOS Medicine. 7 (6), e1000292 (2010).
- Rodger, M. A., et al. Inherited thrombophilia and pregnancy complications revisited. Obstetrics & Gynecology. 112 (2 Pt 1), 320-324 (2008).
- Brenner, B., Aharon, A. Thrombophilia and adverse pregnancy outcome. Clinics in Perinatology. 34 (4), 527-541 (2007).
- Fisk, N. M., McKee, M., Atun, R. Relative and absolute addressability of global disease burden in maternal and perinatal health by investment in R&D. Tropical Medicine & International Health. 16 (6), 662-668 (2011).
- Fisk, N. M., Atun, R. Market failure and the poverty of new drugs in maternal health. PLOS Medicine. 5 (1), e22 (2008).
- Kaitu'u-Lino, T. uJ., et al. Targeted nanoparticle delivery of doxorubicin into placental tissues to treat ectopic pregnancies. Endocrinology. 154 (2), 911-919 (2013).
- King, A., et al. Tumor-homing peptides as tools for targeted delivery of payloads to the placenta. Science Advances. 2 (5), e1600349 (2016).
- Beards, F., Jones, L. E., Charnock, J., Forbes, K., Harris, L. K. Placental Homing Peptide-microRNA Inhibitor Conjugates for Targeted Enhancement of Intrinsic Placental Growth Signaling. Theranostics. 7 (11), 2940-2955 (2017).
- Cureton, N., et al. Selective Targeting of a Novel Vasodilator to the Uterine Vasculature to Treat Impaired Uteroplacental Perfusion in Pregnancy. Theranostics. 7 (15), 3715-3731 (2017).
- Paul, J. W., et al. Drug delivery to the human and mouse uterus using immunoliposomes targeted to the oxytocin receptor. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 216 (3), e281-e283 (2017).
- Zhang, B., et al. Placenta-specific drug delivery by trophoblast-targeted nanoparticles in mice. Theranostics. 8 (10), 2765-2781 (2018).
- Fan, X., et al. Noninvasive monitoring of placenta-specific transgene expression by bioluminescence imaging. PloS One. 6 (1), e16348 (2011).
- Murata, M., Tahara, K., Takeuchi, H. Real-time in vivo imaging of surface-modified liposomes to evaluate their behavior after pulmonary administration. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (1), 115-119 (2014).
- Ito, A., et al. New whole-body multimodality imaging of gastric cancer peritoneal metastasis combining fluorescence imaging with ICG-labeled antibody and MRI in mice. Gastric Cancer. 17 (3), 497-507 (2014).
- Mazza, M., et al. Liposome-Indocyanine Green Nanoprobes for Optical Labeling and Tracking of Human Mesenchymal Stem Cells Post-Transplantation In Vivo. Advanced Healthcare Materials. 6 (21), (2017).
- Greco, A., et al. High frequency ultrasound for in vivo pregnancy diagnosis and staging of placental and fetal development in mice. PloS One. 8 (10), e77205 (2013).
- Spurney, C. F., Leatherbury, L., Lo, C. W. High-frequency ultrasound database profiling growth, development, and cardiovascular function in C57BL/6J mouse fetuses. Journal of the American Society of Echocardiography. 17 (8), 893-900 (2004).
- Zhang, B., et al. Synthesis and characterization of placental chondroitin sulfate A (plCSA) -targeting lipid-polymer nanoparticles. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Beeton, C., Chandy, K. G. Isolation of mononuclear cells from the central nervous system of rats with EAE. Journal of Visualized Experiments. (10), 527 (2007).
- Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology. 20 (3), 180-193 (2005).
- Frangioni, J. V. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 626-634 (2003).
- Flores, L. E., Hildebrandt, T. B., Kuhl, A. A., Drews, B. Early detection and staging of spontaneous embryo resorption by ultrasound biomicroscopy in murine pregnancy. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 38 (2014).
- Khankin, E. V., Hacker, M. R., Zelop, C. M., Karumanchi, S. A., Rana, S. Intravital high-frequency ultrasonography to evaluate cardiovascular and uteroplacental blood flow in mouse pregnancy. Pregnancy Hypertension. 2 (2), 84-92 (2012).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatric Research. 60 (1), 14-21 (2006).
- Pallares, P., Gonzalez-Bulnes, A. Non-invasive ultrasonographic characterization of phenotypic changes during embryo development in non-anesthetized mice of different genotypes. Theriogenology. 70 (1), 44-52 (2008).
- Parvani, J. G., Gujrati, M. D., Mack, M. A., Schiemann, W. P., Lu, Z. -R. Silencing β3 integrin by targeted ECO/siRNA nanoparticles inhibits EMT and metastasis of triple-negative breast cancer. Cancer Research. 75 (11), 2316-2325 (2015).
- Zhang, B., et al. Targeted delivery of doxorubicin by CSA-binding nanoparticles for choriocarcinoma treatment. Drug Delivery. 25 (1), 461-471 (2018).
- Jenkins, D. E., et al. Bioluminescent imaging (BLI) to improve and refine traditional murine models of tumor growth and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 20 (8), 733-744 (2003).
- Keelan, J. A., Leong, J. W., Ho, D., Iyer, K. S. Therapeutic and safety considerations of nanoparticle-mediated drug delivery in pregnancy. Nanomedicine. 10 (14), 2229-2247 (2015).
