Summary
Beschrijven we een systeem dat gebruik maakt van drie methoden voor evaluatie van de veiligheid en effectiviteit van placenta-gerichte drug delivery: in vivo imaging als u wilt controleren nanoparticle accumulatie, hoge-frequentie echografie placenta en foetale ontwikkeling te volgen , en HPLC te kwantificeren drug levering aan weefsel.
Abstract
Geen effectieve behandelingen bestaan momenteel voor placenta-geassocieerde zwangerschapscomplicaties, en ontwikkelen van strategieën voor de beoogde levering van drugs aan de placenta terwijl het minimaliseren van de foetale en maternale bijwerkingen blijft uitdagend. Gerichte nanoparticle vervoerders bieden nieuwe mogelijkheden voor de behandeling van aandoeningen van de placenta. We onlangs aangetoond dat een synthetische placenta chondroitin sulfaat A bindend peptide (plCSA-BP) kan worden gebruikt om het begeleiden van nanodeeltjes om drugs te leveren aan de placenta. In dit protocol, beschrijven we in detail een systeem voor de beoordeling van de efficiëntie van de drug levering aan de placenta door plCSA-BP die drie afzonderlijke methodes gebruikt in combinatie hanteert: in vivo imaging, hoge-frequentie echografie (HFUS), en high-performance vloeibare chromatografie (HPLC). Met behulp van in vivo zijn imaging, plCSA-BP-geleide nanodeeltjes gevisualiseerd in de placentas van levende dieren, terwijl HFUS en HPLC aangetoond dat plCSA-BP-geconjugeerde nanodeeltjes efficiënt en in het bijzonder bezorgd methotrexaat bij de placenta. Dus, kan een combinatie van deze methoden worden gebruikt als een effectief instrument voor de beoogde levering van drugs naar de placenta en de ontwikkeling van nieuwe behandelingsstrategieën voor verschillende zwangerschapscomplicaties.
Introduction
Placenta-gemedieerde zwangerschapscomplicaties, met inbegrip van pre-eclampsie, verlies van de zwangerschap, placenta abruption en kleine zwangerschapsduur (SGA), zijn gemeenschappelijk en leiden tot aanzienlijke foetale en maternale morbiditeit en mortaliteit1,2, 3, en zeer weinig drugs hebben bewezen effectief te zijn voor de zwangerschap te behandelen aandoeningen4,5. De ontwikkeling van strategieën voor meer selectieve en veiliger placenta-gerichte drug delivery tijdens de zwangerschap blijft uitdagend in moderne medicamenteuze therapie.
In de afgelopen jaren hebben verschillende rapporten als placenta-gerichte instrumenten gericht op de gerichte levering van drugs aan uteroplacental weefsels door coating nanodeeltjes met peptiden of antilichamen. Deze omvatten een anti-epidermale groeifactor receptor (EGFR)6 antilichaam, tumor-homing peptiden (CGKRK en iRGD)7, placenta-gerichte peptiden8, placenta therapieën-gerichte peptiden9 en antistoffen tegen de oxytocine receptor10.
Hier, we laten zien dat een synthetische placenta chondroitin sulfaat A bindend peptide (plCSA-BP) kan worden gebruikt voor de gerichte levering van nanodeeltjes en hun drug lading aan de placenta11. De plCSA-BP-geleide nanodeeltjes zijn een aanvulling op de gerapporteerde uteroplacental dat targeting methoden omdat ze gericht zijn de placenta trofoblast.
Als een niet-invasieve methode, in vivo imaging is gebruikt voor het controleren van de placenta-specifieke genexpressie in muizen12en indocyanine groen (ICG) is wijd verbeid gebruikt voor het bijhouden van nanodeeltjes met behulp van fluorescentie imaging systemen13, 14,,15. Dus, we intraveneus geïnjecteerd plCSA-BP-geconjugeerde nanodeeltjes geladen met ICG (plCSA-INPs) de verdeling van de plCSA-INP bij zwangere muizen met een fluorescentie imager visualiseren. Wij vervolgens intraveneus geïnjecteerd methotrexaat (MTX)-plCSA-NPs in zwangere muizen geladen. Hoge-frequentie echografie (HFUS), een ander niet-invasieve, real-time imaging tool16,17 werd gebruikt voor het bewaken van de foetale en placenta ontwikkeling in de muizen. Tot slot hebben we gebruikt krachtige vloeibare chromatografie (HPLC) te kwantificeren MTX distributie in de placentas en foetussen.
In dit protocol beschrijven we in detail het systeem van de drie-methode gebruikt om de efficiëntie van placenta-gerichte drug delivery te beoordelen door plCSA-BP-geleide nanocarriers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten strikt gevolgd protocollen van de muis (SIAT-IRB-160520-YYS-FXJ-A0232) goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comité van Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academie van Wetenschappen.
1. synthese van placenta Chondroitin sulfaat A-gerichte lipide-Polymer nanodeeltjes
- Synthetiseren MTX - en IGC-loaded lipide-polymeer nanodeeltjes (MNPs en INPs respectievelijk) en plCSA-BP-geconjugeerde nanodeeltjes (plCSA-MNPs en plCSA-INPs) zoals beschreven in detail elders18.
2. in vivo Imaging fluorescentie
-
Voorbereiding van zwangere muizen
- Plaats van vrouwelijke CD-1 mice (8-12 weken) met een vruchtbare man van dezelfde stam in een kooi (mannelijke: vrouwelijke = 1:2) in de middag en controleer de vaginale stekkers de volgende ochtend. Als een vaginale plug wordt waargenomen, definieert u de muis als embryonale dag 0,5 (E0.5).
- Huis zwangere muizen alleen in dierlijke pathogenen vrije speelkamer met een 14 licht/10 uur donker cyclus en bieden gratis toegang tot voedsel en water tot E14.5.
-
Intraveneuze injectie van nanodeeltjes
- Voordat de procedure, steriliseren nanoparticles door filtratie door een 0,22 μm spuit filter. Weeg de zwangere muis op E11.5 om te bepalen van de hoeveelheid en het volume van nanoparticle injectie.
Opmerking: Het nanoparticle geïnjecteerde volume moet minder dan 1% (gewicht/volume) van het lichaamsgewicht van de zwangere muis. Bijvoorbeeld moet het nanoparticle geïnjecteerde volume minder dan 0,25 mL in een muis 25 g. - Warm om te verwijden de staart ader, de staart voor 5-10 min met een verwarming pad.
- Gecombineerd het INPs of plCSA-INPs in een 28 g insuline spuit vóór injectie.
- De zwangere muis overbrengen in een bedrijf-apparaat dat de muis weerhoudt terwijl het toestaan van toegang tot de staart ader. Reinig de staart met een alcohol doekje. Voeg vervolgens de spuit in de ader van de staart. Langzaam het INPs of plCSA-INPs (5 mg/kg ICG equivalent) injecteren met zelfs druk 5-10 s.
Opmerking: Stop injecteren als een blaar op de staart verschijnt omdat dit resultaat geeft aan dat de naald niet in de ader. Spuiten mag niet worden gedeeld tussen muizen voor de transmissie van de ziekte minimaliseren en kruisbesmetting. - De injectie tijd vastleggen. Ondertussen, zachte druk uitoefenen op de injectieplaats tot het bloeden stopt, die normaal gesproken 30-60-s duurt.
- Voordat de procedure, steriliseren nanoparticles door filtratie door een 0,22 μm spuit filter. Weeg de zwangere muis op E11.5 om te bepalen van de hoeveelheid en het volume van nanoparticle injectie.
-
In vivo imaging
- 30 min na de injectie, het imago van de zwangere muizen met behulp van de fluorescentie in vivo imaging systeem.
- Anesthetize de zwangere muizen met een debiet van de zuurstof van 1,0 L/min en Isofluraan op 2-4% in een bijbehorende zaal van de narcose-unit en controleer of de volledige narcose door trage en regelmatige ademhaling. Verplaatst u ze in de beeldvorming kamer. Plaats de narcose zwangere muizen in de beeldvorming zaal, houden van de dieren in een liggende positie.
- Plaats een neus kegel boven de mond en de neus om de inhalatie van 1-2% Isofluraan met een debiet van de zuurstof van 1,0 L/min te houden van de verdoving.
- Selecteer 2D-fluorescentie en fotografische parameters om het imago van de ICG fluorescentie signalen. Instellen van de blootstelling aan de auto en de excitatie/emissie golflengten te 710/820 nm.
- Aan het einde van de beeldvorming procedure, de Isofluraan toestroom te stoppen met de narcose uitschakelen en de zwangere muizen zorgvuldig terug te keren naar hun kooien.
- 48 uur na de injectie van de nanoparticle, anesthetize de zwangere muizen met isofluorane, en vervolgens het offeren van de dam door cervicale dislocatie. Het verzamelen van de foetussen en placentas met behulp van Graefe pincet, Graefe weefsel pincet, en de ontrafeling van de schaar.
- Plaats de placentas en foetussen in de beeldvorming kamer, en beeld met behulp van de methode in stap 2.3.4 beschreven.
3. HFUS evaluatie van embryonale ontwikkeling
-
Dierlijke modellen
- Verkrijgen en de zwangere muizen te bereiden zoals beschreven in stap 2.1.
- Gebruik HFUS om de zwangere muizen afbeelding op E 6.5 (protocollen 3.2 en 3.3.3). Ten eerste zwangerschap te bevestigen door het visualiseren van de embryo's op dag E6.5, en vervolgens willekeurig verdelen de zwangere muizen in drie groepen: de groep MNP, plCSA-MNP groep en -fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) groep.
- Injecteren PBS, MNPs of plCSA-MNPs (1 mg/kg MTX equivalent) in de aders van de staart van de zwangere muizen om de andere dag basisgewicht van E6.5 zoals beschreven in stap 2.2.
-
Voorbereiding voor imaging
- 24 uur na de injectie van nanodeeltjes, het imago van de zwangere muizen met behulp van het imaging systeem HFUS.
- Anesthetize de zwangere muizen zoals beschreven in stap 2.3.2. Inschakelen van de geïntegreerde kleurtemperatuurregelaar van de imaging platform en verwarm het platform tot 37-42 ° C. Beveilig de zwangere muizen in een liggende positie op het platform met behulp van tape.
- Plaats de neus kegel verbonden aan de eenheid van de verdoving via de snuit. 2% Isofluraan met een debiet van de zuurstof van 1,0 L/min om gestage verdoving toepassen.
- Chemisch verwijderen haren uit de buik met behulp van een ontharende room. De resterende room grondig met water doordrenkte gaas uitroeien, en vervolgens de jas van de buik met akoestische koppeling gel.
-
Imaging-procedure
- Plaats de 40 MHz transducer in de mechanische arm.
- Pas de transducer positie te verkrijgen van longitudinale beelden van de foetus en de placenta met de regio van belang in de focale zone.
-
B-Mode beeldvorming en analyse
Opmerking: Zie film 1.- Klik op de knop B-modus en de transducer over de buik te verlagen totdat de foetus en de placenta in zicht komt. Druk op Scannen/bevriezen voor initiëer/stop imaging, druk op Cine slaan slaan de cine lus, en drukt u op Frame opslaan om te slaan Frameafbeeldingen.
- Klik op de knop van de maatregel om de lengte van de zwangerschapsduur oss (GS), foetale crown rump length (CRL), biparietal diameter (BPD), buik omtrek (AC), placenta diameter (PD) en placenta dikte (PT) te analyseren.
-
PW-Doppler Beeldvorming en analyse
Opmerking: Zie film 1.- Met behulp van hetzelfde projectie scannen, klikt u op de knop van de PW , plaatst u het volume bemonstering in het midden van de navelstreng ader en druk op Scan/bevriezen tot imaging. Klik op Cine opslaan voor het verzamelen van beelden van de navelstreng slagader.
- Klik op de knop van de maatregel voor het berekenen van de navelstreng ader piek snelheid (UA).
-
Kleur Doppler modus beeldvorming en analyse
- Met behulp van hetzelfde projectie scannen, klikt u op de knop kleur en pas de positie van de transducer om te halen beelden van het foetale hart. Druk op scannen/bevriezen tot beeldvorming en Cine Opslaan voor het verzamelen van beelden.
- Klik op de knop van de maatregel voor het berekenen van de foetale hartslag (HR).
4. HPLC analyse
-
Weefsel voorbereiding
- Injecteren van de zwangere muizen met een enkelvoudige dosis van MNPs- of plCSA-MNPs (1 mg/kg MTX equivalent) op late zwangerschap (bv., E14.5) zoals beschreven in stap 3.1.3.
- Anesthetize na 24 h, de muizen door een intraperitoneale injectie van avertin op 240 μg/lichaamsgewicht (g). Geen reactie is op een snuifje van de voet om te verifiëren dat de muizen zijn volledig verdoofd te zorgen.
- Spray de borst gebied met 75% ethanol. Uitvoeren van cardiale perfusie (de juiste atria knippen en perfuse via het linkerventrikel) zoals eerder beschreven in detail19,20 met 50 mL ijskoud 0,9% zoutoplossing voor 10 min voor het verwijderen van niet-afhankelijke nanodeeltjes.
- Euthanaseren van de dam. Uitvoeren van een keizersnede voor het verzamelen van de foetussen en placentas met behulp van Graefe pincet, schaar, en Graefe weefsel pincet, ontleden en bewaar de weefsels bij-80 ° C vóór de analyse.
- Bereid de homogenisering oplossing (10% perchloorzuur) en houd op ijs. Verzamelen van ongeveer 200 mg van weefsel, en voeg 500 μL van homogenisering oplossing aan elk monster. Meng de monsters met behulp van een homogenizer op volle snelheid voor 30 s, en herhaal deze procedure tweemaal.
- Centrifugeer de monsters bij 14.000 × g gedurende 20 min bij 4 ° C. Filtreer het supernatant (ongeveer 300 μL) door een 0,45 micrometer spuit filter, en de resulterende vloeistof overbrengen in een flacon van HPLC. Schakel Monster flesjes in de lade van een autosampler voor injectie.
-
Opstelling van normen
- Bereid de volgende oplossing voor de mobiele fase: 40 mM kalium fosfaat dibasische (pH 4.5) en acetonitril (88:12, v/v). Filtreer de oplossing door een 0,45 micrometer porie grootte spuit filter en de resulterende vloeistof overbrengen in een schone fles van HPLC reservoir.
Opmerking: Breng de pH met 0,1 M fosforzuur. Kunt ultrasone trillingen voor 15 min ontgas de mobiele fase telkens vooraf te gebruiken. - Weeg 10 mg MTX in een centrifugebuis 1,5 mL. Voeg 1 mL 1 M natronloog.
- Vortex op hoge snelheid tot de MTX volledig oplost.
Opmerking: Dit is de primaire voorraad en kan worden opgeslagen bij-20 ° C voor enkele maanden. - Als u wilt maken van de secundaire MTX voorraad (500 μg/mL), Verdun 50 μl van het primaire bestand in 950 μL van de mobiele fase.
Opmerking: Bewaren in de ijskast tot gebruik, en voor te bereiden verse dagelijks. Het is belangrijk om het gebruik van de mobiele fase voor de opstelling van normen te voorkomen pieken die voortvloeien uit ongelijke mengoplossingen na injectie van de steekproef. - Zorg verder verdunningen maken de normen (tabel 1). Opslaan van de normen op ijs en vers dagelijks te bereiden. De normen in serie met de experimentele monsters worden uitgevoerd.
- Bereid de volgende oplossing voor de mobiele fase: 40 mM kalium fosfaat dibasische (pH 4.5) en acetonitril (88:12, v/v). Filtreer de oplossing door een 0,45 micrometer porie grootte spuit filter en de resulterende vloeistof overbrengen in een schone fles van HPLC reservoir.
| Nummer | Eindconcentratie (μg/mL) | Standaard, μL van 500 μg/mL | Mobiele phase(μL) |
| 1 | 0,5 | 1 | 999 |
| 2 | 1 | 2 | 998 |
| 3 | 2.5 | 5 | 995 |
| 4 | 10 | 20 | 980 |
| 5 | 25 | 50 | 950 |
| 6 | 50 | 100 | 900 |
| 7 | 100 | 200 | 800 |
Tabel 1. Voorbereiden van standaard curve MTX. De uiteindelijke concentratie van MTX standaardoplossing is van 0,5-100 μg/mL.
-
HPLC instrumentatie en bewerkingsparameters
Opmerking: Monsters werden geanalyseerd op een HPLC-systeem voorzien van een oplosmiddel pomp, een spectrofotometrische UV-detector (313 nm), en een C18-kolom (250 × 4.6 mm, 5 micrometer deeltjesgrootte).- De HPLC-degasser lucht uit het systeem verwijderen inschakelen. Inschakelen van de stroom, zo van de kolom met de mobiele fase voor 30 min ter vermindering van lawaai van de basislijn.
- De temperatuur van de kolom ingesteld op 25 ° C, injecteren 20 μL monster volumes op een debiet van 1 mL/min, en klikt u op de Methode Run om te beginnen met de analyse.
- Wanneer de punten voltooid zijn, handmatig wijzigen in de mobiele fase HPLC-grade acetonitril. Een looptijd van ongeveer 15 min om het systeem te beschermen.
Opmerking: Niet uitvoeren van deze stap na de aanbevolen lopende tijd kan leiden tot schade aan de kolom. - Berekenen voor kwantitatieve analyse, de gebieden die onder de standaard MTX pieken van belang met behulp van de HPLC-systeemsoftware.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit manuscript, waren plCSA-BP-geconjugeerde nanodeeltjes geladen met MTX (plCSA-MNPs) of ICG (plCSA-INPs) intraveneus geïnjecteerd in zwangere muizen. In vivo imaging geopenbaard sterke ICG signalen in de regio van de baarmoeder 30 min na plCSA-INP injectie. Het INPs waren voornamelijk gelokaliseerd aan de lever en milt regio (figuur 1A). 48 uur na plCSA-INP injectie, werden zwangere muizen opgeofferd, onthullend ICG signalen alleen in de placenta, terwijl met geen signalen waren in de foetus (figuur 1B) worden opgespoord.
Wij vervolgens gebruikt HFUS om te controleren van embryo-ontwikkeling na de intraveneuze injectie van nanodeeltjes. Biometrische metingen opgenomen de zwangerschapsduur OSS lengte (GS), foetale crown rump length (CRL's) biparietal diameter (BPD), buik omtrek (AC), placenta diameter (PD), placenta dikte (PT), navelstreng slagader piek snelheid (UA) en foetale hart tarief (HR) (film 1). De morfologische parameters gemeten op verschillende zwangerschapsduur leeftijd zijn vermeld in tabel 2. In de groep plCSA-MNP ten opzichte van de PBS-group, de gemiddelde foetale buik omtrek en de navelstreng ader piek snelheid werden aanzienlijk verlaagd op E12.5 (figuren 2A en 2 H), en de crown rump lengte en diameter van de placenta waren aanzienlijk gedaald aan E10.5 (cijfers 2B en 2F). Vanaf E9.5, de lengte van de zwangerschapsduur OSS was ook aanzienlijk afgenomen (figuur 2C) en de diameter van de biparietal, de dikte van de placenta, en foetale hartslag begon te dramatisch dalen op E 11,5 ten opzichte van die in de PBS-groep (cijfers 2D 2E en 2 G). Deze bevindingen suggereren samen dat plCSA-MNPs een sterke cytotoxisch effect op zowel de placenta als de foetale ontwikkeling hebben. Interessant is dat verminderde behandeling met MNPs ook enigszins foetale en placenta ontwikkeling (Cijfers 2A-2 H), die aangeeft dat de nanodeeltjes de levering van de MTX aan de placenta via de verbeterde permeabiliteit en retentie (EPR) effect kunnen verbeteren.
| Zwangerschapsduur | Groep | Decidua (mm) | GS (mm) | CRL (mm) | BPD (mm) | AC (mm) | PD (mm) | PT (mm) | HR (bpm) | UA (mm/s) |
| E6.5 | 0.92±0.23 | / | / | / | / | / | / | / | / | |
| E7.5 | PBS | / | 0.82±0.24 | 0.72±0.18 | / | / | / | / | / | / |
| MNPs | / | 0.83±0.14 | 0.83±0.14 | / | / | / | / | / | / | |
| plCSA-MNPs | / | 0.65±0.23 | 0.65±0.23 | / | / | / | / | / | / | |
| E8.5 | PBS | / | 2.02±0.54 | 1.88±0.40 | 0.93±0.23 | / | / | / | / | / |
| MNPs | / | 1.49±0.50 | 1.49±0.50 | 0.82±0.20 | / | / | / | / | / | |
| plCSA-MNPs | / | 1.14±0.46 | 1.02±0.42 | 0.83±0.18 | / | / | / | / | / | |
| E9.5 | PBS | / | 3.31±0.62 | 3.49±0.65 | 1.39±0.54 | / | / | / | / | / |
| MNPs | / | 2.34±0.68 | 2.23±0.49 | 0.98±0.34 | / | / | / | / | / | |
| plCSA-MNPs | / | 1.83±0.42 | 1.59±0.59 | 0.94±0.25 | / | / | / | / | / | |
| E10.5 | PBS | / | 4.43±0.67 | 4.97±0.80 | 2.10±0.61 | 4.83±1.40 | 2.91±0.23 | 2.24±0.24 | 100±30 | 30.16±9.40 |
| MNPs | / | 3.28±0.64 | 2.91±0.83 | 1.46±0.54 | 3.95±1.28 | 2.66±0.33 | 2.17±0.19 | 87±21 | 24.63±7.35 | |
| plCSA-MNPs | / | 2.64±0.66 | 2.17±0.85 | 1.12±0.33 | 3.82±1.13 | 2.13±0.35 | 1.94±0.15 | 83±22 | 15.37±5.70 | |
| E11.5 | PBS | / | 5.68±0.73 | 6.45±0.90 | 3.08±0.70 | 8.67±2.08 | 4.16±0.39 | 2.75±0.26 | 124±28 | 31.62±7.76 |
| MNPs | / | 4.36±0.39 | 3.74±1.2 | 2.31±0.53 | 6.69±1.85 | 3.56±0.40 | 2.39±0.23 | 106±22 | 25.20±6.18 | |
| plCSA-MNPs | / | 3.42±0.76 | 2.61±0.84 | 1.51±0.54 | 4.59±1.57 | 2.54±0.49 | 2.09±0.27 | 79±20 | 16.66±5.69 | |
| E12.5 | PBS | / | / | 8.12±1.29 | 3.90±0.65 | 12.43±2.48 | 5.37±0.42 | 3.14±0.24 | 141±26 | 40.62±10.89 |
| MNPs | / | / | 4.87±1.29 | 2.87±0.62 | 8.29±1.78 | 4.25±0.67 | 2.65±0.26 | 119±18 | 27.76±7.52 | |
| plCSA-MNPs | / | / | 3.2±1.28 | 1.75±0.60 | 5.47±1.39 | 3.05±0.50 | 2.28±0.26 | 72±22 | 18.76±7.20 | |
| E13.5 | PBS | / | / | 10.04±1.2 | 4.67±0.65 | 15.64±2.33 | 6.03±0.60 | 3.49±0.23 | 157±28 | 54.62±12.37 |
| MNPs | / | / | 6.17±1.29 | 3.37±0.55 | 9.39±1.88 | 4.77±0.69 | 2.92±0.43 | 109±22 | 35.84±9.49 | |
| plCSA-MNPs | / | / | 3.57±1.71 | 1.87±0.73 | 6.25±1.41 | 3.42±0.63 | 2.37±0.34 | 60±23 | 20.02±11.20 | |
| E14.5 | PBS | / | / | 12.35±1.6 | 5.36±0.71 | 18.38±2.53 | 6.70±0.64 | 3.75±0.35 | 167±27 | 71.48±10.72 |
| MNPs | / | / | 7.6±1.56 | 3.90±0.70 | 10.31±2.31 | 5.23±0.76 | 3.10±0.39 | 99±23 | 45.80±13.07 | |
| plCSA-MNPs | / | / | / | / | / | / | / | / | / |
Tabel 2. Meten van morfologische parameters van elke zwangerschapsduur. GS: Gestational OSS lengte; CRL: Crown rump length; BPD: De diameter van de Biparietal; AC: Buik omtrek; PD: Diameter van de placenta; PT: Placenta dikte; HR: Foetale hartslag; UA: Navelstreng slagader piek snelheid; /: niet meten.
We vervolgens gemeten MTX concentraties in de placentas en foetussen met behulp van HPLC. Met de HPLC operatie parameters zoals hierboven beschreven, de retentietijd van de MTX was vastbesloten om te worden 7 min en MTX werd ontdekt in de placentas van de plCSA-MNP groep (Figuur 3). De concentraties van de MTX in placentas en foetussen werden bepaald met behulp van de MTX standaard curven (Figuur 4). 24 uur na de injectie, de placenta MTX-niveau in de groep MNP was aanzienlijk lager dan die in de groep plCSA-MNP, en geen MTX in foetussen van de plCSA-MNP-groep werd ontdekt. MTX kan nog worden gedetecteerd in de placenta 48u na plCSA-MNP injectie (Figuur 5). Deze resultaten tonen aan dat plCSA-MNPs niet kunnen de placenta passeren, dus het minimaliseren van potentiële schadelijke effecten op de foetus.
Kortom, kan dit systeem van de drie-methode bestaat uit het in vivo fluorescence imaging, HFUS en HPLC worden gebruikt om te bepalen hoe goed een drug leveringsvoertuig richt zich op nanocarriers en drugs levert aan de placenta. Met behulp van deze methoden hebben wij bewezen dat plCSA-BP begeleide nanodeeltjes een doeltreffend instrument zijn voor het gericht op de levering van geneesmiddelen aan de placenta.
Figuur 1 . In vivo fluorescentie imaging. (A) zwangere muizen (n = 5 elke) op E11.5 werden ingespoten met INPs of plCSA-INPs (ICG gelijkwaardig 5 mg/kg) via de ader van de staart. Na 30 min, waren de muizen beeld met behulp van een fluorescentie imaging systeem. (B) 48 h na de injectie van INPs of plCSA-INPs, de foetussen (F, n = 2 per muis) en placentas (P, n = 2 per muis) werden verzameld en beeld met een fluorescentie imaging systeem. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Kwantificering van embryonale groei door HFUS. (A) de buik omtrek (n = 30-51 embryo's / dag), (B) crown rump length (n = 30-51 embryo's / dag), (C) de zwangerschapsduur OSS lengte (n = 10-30 embryo's / dag), (D) biparietal diameter (n = 30-51 embryo's / dag), (E) de placenta dikte (n = 30-51 embryo's / dag), (F). de diameter van de placenta (n = 30-51 embryo's / dag), (G) foetale hartslag (n = 20-33 embryo's / dag), en (H) navelstreng slagader piek snelheid (n = 12-36 embryo's / dag) gemeten niet-gebeurt door echografie in vivo. Alle tests werden met elkaar vergeleken door 2-tailed gepaarde t-test en p < 0.05 werd beschouwd als een statistisch significant. Waarden worden uitgedrukt als de middelen ± SD. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0.001 ten opzichte van de PBS-groep. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Vertegenwoordiger HPLC chromatogrammen van placenta monsters. Zwangere muizen (n = 5 per stuk) werden intraveneus ingespoten met PBS of plCSA-MNPs, en hun placentas (n = 15 elke groep) 24 h later werden verzameld voor HPLC. Een standaardoplossing voor MTX met UV-detectie op 313 nm, de retentietijd was vastbesloten om te worden 7 min. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Standaard curven voor MTX. De concentraties van MTX varieerden van 0.5 μg/mL tot 100 μg/mL. De gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ±SD voor n = 3. De foutbalken van sommige gegevens zijn kleiner dan de rhombic symbolen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 . Toepassing van HPLC op het bepalen van de biodistributions van nanodeeltjes in placentas en foetussen. Zwangere muizen werden toegediend een enkele injectie van MNPs- of plCSA-MNPs (1 mg/kg MTX equivalent) zwangerschapsduur stadium E13.5. Na 24 uur en 48 uur, de concentraties van MTX in de placentas (n = 15) en foetussen (n = 15) werden gemeten door HPLC. Waarden worden uitgedrukt als de verschillen means±SD. MTX concentraties tussen de groepen MNP en plCSA-MNP zijn geanalyseerd met behulp van de ongepaarde Student t-test (*** p < 0.001); ND: niet gedetecteerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Film 1. HFUS beelden van foetussen en placentas biometrische meetpunten te illustreren. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit manuscript schetsen we een drie-methode-systeem om te bepalen of plCSA-BP-geleide nanodeeltjes een doeltreffend instrument zijn voor het gericht op de levering van geneesmiddelen aan de placenta. Het gebruik van in vivo imaging als u wilt controleren het infrarood signaal voor fluorescerende ICG bevestigd de placenta targeting specificiteit van plCSA-BP. gebruiken HFUS en HPLC, we laten zien dat plCSA-BP-geconjugeerde nanodeeltjes MTX efficiënt kunnen leveren alleen aan de placenta cellen, niet voor de foetus.
In de in vivo fluorescentie imaging experimenten, zijn de gestational leeftijd van de zwangere muizen belangrijk. De placenta begint te vormen rond E9.521. Bovendien, gezien de resolutie van de imager, de in vivo imaging experiment moet worden uitgevoerd na E 10.5. Na plCSA-INP injectie op E 11,5 volgens dit protocol, was geen fluorescentie signaal gevonden met de imager onder de beschreven omstandigheden, die het gevolg zijn van de huid en inwendige organen voorkomen signaal transmissie22. Om deze beperking ondervangen, moet verhoging van de dosis van de injectie of de collectie van placentas en foetussen voor ex vivo imaging worden gebruikt.
Een cruciale stap in HFUS imaging is het gebruik van een geschikte transducer te verkrijgen van embryonale afbeeldingen van hoge kwaliteit. De geoptimaliseerde frequentie voor muis embryologie imaging is 40-50 MHz. Bovendien is het ook belangrijk de fysiologische lichaam maximumtemperatuur van de zwangere muis voorafgaand aan afbeeldingen ophalen. Tot slot, de waarnemer moeten voorzichtig met het opnemen van B-modus films tijdens de vroege ontwikkeling van het embryo (E 6.5-E 8,5), en dit is meer afhankelijk van ervaring. De onzekerheid in de meting kan worden gecompenseerd door het vergelijken van anatomische eigenschappen met het referentiekader voor de foetus en placenta verkeer tijdens echografie verwerking16,23,24. De nauwkeurigheid van imaging gegevens kan worden verbeterd door het maken van meerdere metingen en het vergroten van de nummers van de foetussen en placentas.
De niet-afhankelijke residuele nanoparticle in het bloedvat is een doeltreffende factor voor de evaluatie van de gerichte drug levering aan de placenta en foetus. Dus, cardiale perfusie werd uitgevoerd om te verwijderen van niet-afhankelijke nanodeeltjes voordat de foetussen en placentas werden verzameld. Eerdere studies7,-8,9 hebben ook opgemerkt dat voordat het analyseren van het vermogen van een peptide te binden de placenta, onderwerpen van de muis aan cardiale perfusie is essentieel.
Een mogelijke valkuil tijdens de HPLC analyse is de overlapping van MTX met andere pieken. Acetonitril wordt gebruikt om de MTX Elueer uit de kolom. Als de overlappende pieken vóór 5 min optreedt, kan verminderen de concentratie van acetonitril in de mobiele fase nuttig zijn. Als er geen pieken of overlappende pieken na 30 min optreden, is verhoging van de concentratie van acetonitril handig. Een belangrijke beperking van HPLC is dat het niet de lokalisatie van nanodeeltjes in de placenta onthullen. PlCSA-BP-geleide nanoparticles specifiek gericht de placenta labyrint in de muis placenta11. Morfologische analyse van de placenta is dus noodzakelijk.
Dit is het eerste gebruik van het combineren van in vivo imaging, HFUS en HPLC om de efficiëntie van placenta-gerichte levering geleid door een peptide. HFUS heeft ontpopt als een geavanceerde, real-time imaging methode, niet-invasieve, veilig en met succes heeft ingezet voor de hoge-resolutie beeldvorming van muis embryonale ontwikkeling17,25,26. Hoewel in vivo fluorescence imaging wijd verbeid gebruikt is om te visualiseren tumor vorming en metastase in levende muizen27,28,29, heeft het niet eerder is gebruikt in de studie van placenta drug delivery. Als een alternatieve benadering, in vivo fluorescence imaging heeft een verschillend voordeel over HFUS in kunnend direct visualiseren de verdeling van intraveneus ingespoten nanodeeltjes in levende muizen maar niet controleren placenta en foetale ontwikkeling. Vandaar, wij de voordelen van visualisatie gecombineerd door fluorescentie in vivo imaging en hoge resolutie HFUS-de voormalige inschakelen visualisatie van plCSA-BP-geleide INPs in vivo, en de laatste inschakelen in vivo monitoring van de effecten van plCSA-MNPs op zowel placenta en foetale ontwikkeling en overleving. Bovendien, HPLC bevestigd dat plCSA-MNPs specifiek werden geleverd aan placentas en niet de foetussen haalde.
Gerichte nanogeneeskunde is een nieuwe ontwikkeling op het gebied van zwangerschap aandoeningen en aanzienlijke nieuwe benaderingen te specifiek drugs te leveren aan de moederlijke organen zijn nodig voor de behandeling van aandoeningen van de zwangerschap in de kliniek30. Het systeem van de drie-methode zoals beschreven in dit protocol is een combinatie van het in vivo tijdsverloop imaging van nanoparticle gericht op én de bijbehorende gevolgen voor de ontwikkeling van de placenta en foetus, waardoor meer precieze biochemische meting het bedrag van de drug in de weefsels te evalueren van hulpmiddelen voor gerichte placenta levering voor de behandeling van placenta-gemedieerde zwangerschapscomplicaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
X.F. en B.Z. zijn uitvinders op octrooi PCT/CN2017/108646 ingediende aanvraag door SIAT dat betrekking heeft op een methode voor het bezorgen van placenta-specifieke drug en de toepassing ervan. Alle andere auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door subsidies van de nationale Stichting voor Natuurwetenschappen (81771617) en de Natural Science Foundation van Guangdong provincie (2016A030313178) uitgereikt aan X.F.; een subsidie van de Shenzhen Basic onderzoeksfonds (JCYJ20170413165233512) uitgereikt aan X.F; en de Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health & Human Development van de National Institutes of Health onder Award nummer R01HD088549 (de inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs de ambtenaar uitzicht op de National Institutes of Health) met N.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD-1 mice | Beijing Vital River | 201 | Female (8-12 week) |
| Insulin syringe | BD | 328421 | for IV injection |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Methotrexate (MTX) | Sigma-Aldrich | V900324 | for nanoparticles synthesis |
| Indocyanine green (ICG) | Sigma-Aldrich | 1340009 | for in vivo imaging |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Hyclone | SH30028.01 | |
| IVIS spectrum instrument | Perkin Elmer | for in vivo imaging | |
| Ultrasound transmission gel | Guanggong | ZC4252418 | for ultrasound imaging |
| Isoflurane | Lunan Pharmaceutical | I0040 | for maintain the anesthesia |
| Depilatory cream | Nair | TMG001 | for removing fur |
| 40 MHz transducer | VisualSonics | MS550S | for ultrasound imaging |
| High-frequency ultrasound imaging system | VisualSonics | Vevo2100 | for ultrasound imaging |
| Avertin | Sigma-Aldrich | T48402 | for anesthesia |
| Syringe pump | Mindray | SK-500III | forcardiac perfusion |
| 0.9% saline solution | Meilunbio | MA0083 | forcardiac perfusion |
| 1.5 mL Polypropylene tubes | AXYGEN | MCT-150-C | |
| -80 °C freezer | Thermo Fisher Scientific | 88600V | |
| Centriguge | Cence | H1650R | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | for precipitating protein |
| Homogenizer | SCIENTZ | SCIENTZ-48 | for homogenizing tissue |
| Syringe filter (0.45 μm) | Millipore | SLHV033RS01 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical | 10019763 | for solving MTX |
| HPLC vials | Waters | 670650620 | for HPLC |
| Potassium phosphate dibasic | Sinopharm Chemical | 20032117 | for HPLC |
| Acetonitrile | JKchemical | 932537 | for HPLC |
| C18 column | Waters | 186003966 | for HPLC |
| HPLC system | Shimadzu | for HPLC |
References
- Rodger, M. A., et al. The Association of Factor V Leiden and Prothrombin Gene Mutation and Placenta-Mediated Pregnancy Complications: A Systematic Review and Meta-analysis of Prospective Cohort Studies. PLOS Medicine. 7 (6), e1000292 (2010).
- Rodger, M. A., et al. Inherited thrombophilia and pregnancy complications revisited. Obstetrics & Gynecology. 112 (2 Pt 1), 320-324 (2008).
- Brenner, B., Aharon, A. Thrombophilia and adverse pregnancy outcome. Clinics in Perinatology. 34 (4), 527-541 (2007).
- Fisk, N. M., McKee, M., Atun, R. Relative and absolute addressability of global disease burden in maternal and perinatal health by investment in R&D. Tropical Medicine & International Health. 16 (6), 662-668 (2011).
- Fisk, N. M., Atun, R. Market failure and the poverty of new drugs in maternal health. PLOS Medicine. 5 (1), e22 (2008).
- Kaitu'u-Lino, T. uJ., et al. Targeted nanoparticle delivery of doxorubicin into placental tissues to treat ectopic pregnancies. Endocrinology. 154 (2), 911-919 (2013).
- King, A., et al. Tumor-homing peptides as tools for targeted delivery of payloads to the placenta. Science Advances. 2 (5), e1600349 (2016).
- Beards, F., Jones, L. E., Charnock, J., Forbes, K., Harris, L. K. Placental Homing Peptide-microRNA Inhibitor Conjugates for Targeted Enhancement of Intrinsic Placental Growth Signaling. Theranostics. 7 (11), 2940-2955 (2017).
- Cureton, N., et al. Selective Targeting of a Novel Vasodilator to the Uterine Vasculature to Treat Impaired Uteroplacental Perfusion in Pregnancy. Theranostics. 7 (15), 3715-3731 (2017).
- Paul, J. W., et al. Drug delivery to the human and mouse uterus using immunoliposomes targeted to the oxytocin receptor. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 216 (3), e281-e283 (2017).
- Zhang, B., et al. Placenta-specific drug delivery by trophoblast-targeted nanoparticles in mice. Theranostics. 8 (10), 2765-2781 (2018).
- Fan, X., et al. Noninvasive monitoring of placenta-specific transgene expression by bioluminescence imaging. PloS One. 6 (1), e16348 (2011).
- Murata, M., Tahara, K., Takeuchi, H. Real-time in vivo imaging of surface-modified liposomes to evaluate their behavior after pulmonary administration. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (1), 115-119 (2014).
- Ito, A., et al. New whole-body multimodality imaging of gastric cancer peritoneal metastasis combining fluorescence imaging with ICG-labeled antibody and MRI in mice. Gastric Cancer. 17 (3), 497-507 (2014).
- Mazza, M., et al. Liposome-Indocyanine Green Nanoprobes for Optical Labeling and Tracking of Human Mesenchymal Stem Cells Post-Transplantation In Vivo. Advanced Healthcare Materials. 6 (21), (2017).
- Greco, A., et al. High frequency ultrasound for in vivo pregnancy diagnosis and staging of placental and fetal development in mice. PloS One. 8 (10), e77205 (2013).
- Spurney, C. F., Leatherbury, L., Lo, C. W. High-frequency ultrasound database profiling growth, development, and cardiovascular function in C57BL/6J mouse fetuses. Journal of the American Society of Echocardiography. 17 (8), 893-900 (2004).
- Zhang, B., et al. Synthesis and characterization of placental chondroitin sulfate A (plCSA) -targeting lipid-polymer nanoparticles. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Beeton, C., Chandy, K. G. Isolation of mononuclear cells from the central nervous system of rats with EAE. Journal of Visualized Experiments. (10), 527 (2007).
- Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology. 20 (3), 180-193 (2005).
- Frangioni, J. V. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 626-634 (2003).
- Flores, L. E., Hildebrandt, T. B., Kuhl, A. A., Drews, B. Early detection and staging of spontaneous embryo resorption by ultrasound biomicroscopy in murine pregnancy. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 38 (2014).
- Khankin, E. V., Hacker, M. R., Zelop, C. M., Karumanchi, S. A., Rana, S. Intravital high-frequency ultrasonography to evaluate cardiovascular and uteroplacental blood flow in mouse pregnancy. Pregnancy Hypertension. 2 (2), 84-92 (2012).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatric Research. 60 (1), 14-21 (2006).
- Pallares, P., Gonzalez-Bulnes, A. Non-invasive ultrasonographic characterization of phenotypic changes during embryo development in non-anesthetized mice of different genotypes. Theriogenology. 70 (1), 44-52 (2008).
- Parvani, J. G., Gujrati, M. D., Mack, M. A., Schiemann, W. P., Lu, Z. -R. Silencing β3 integrin by targeted ECO/siRNA nanoparticles inhibits EMT and metastasis of triple-negative breast cancer. Cancer Research. 75 (11), 2316-2325 (2015).
- Zhang, B., et al. Targeted delivery of doxorubicin by CSA-binding nanoparticles for choriocarcinoma treatment. Drug Delivery. 25 (1), 461-471 (2018).
- Jenkins, D. E., et al. Bioluminescent imaging (BLI) to improve and refine traditional murine models of tumor growth and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 20 (8), 733-744 (2003).
- Keelan, J. A., Leong, J. W., Ho, D., Iyer, K. S. Therapeutic and safety considerations of nanoparticle-mediated drug delivery in pregnancy. Nanomedicine. 10 (14), 2229-2247 (2015).
