Summary
Les auteurs décrivent un système qui utilise trois méthodes pour évaluer l’innocuité et l’efficacité de l’administration de médicaments ciblés placenta : in vivo de l’imagerie pour surveiller l’accumulation de nanoparticules, échographie de haute fréquence pour surveiller le développement placentaire et foetal et de la CLHP pour quantifier les medicaments au tissu.
Abstract
Aucun des traitements efficaces n’existent actuellement pour les complications associées à placenta pendant la grossesse, et élaborer des stratégies visant l’administration ciblée des médicaments pour le placenta tout en minimisant les effets secondaires foetus et maternels reste difficile. NANOPARTICULES ciblées transporteurs offrent de nouvelles possibilités pour traiter les troubles placentaires. Nous avons récemment démontré qu’un peptide synthétique placentaire chondroïtine sulfate A liaison (plCSA-BP) pourrait servir à orienter les nanoparticules pour libérer des médicaments le placenta. Dans ce protocole, nous décrivons en détail un système pour évaluer l’efficacité de la délivrance de médicaments pour le placenta par plCSA-BP qui emploie trois méthodes distinctes utilisées en combinaison : in vivo de l’imagerie, échographie de haute fréquence (HFUS) et haute performance chromatographie en phase liquide (HPLC). L’utilisation in vivo nanoparticules d’imagerie, plCSA-BP-guidé ont été visualisées dans les placentas d’animaux vivants, tandis que HFUS et HPLC ont démontré que le plCSA-BP-conjugué nanoparticules efficacement et précisément livré méthotrexate pour le placenta. Ainsi, une combinaison de ces méthodes peut servir comme un outil efficace pour l’administration ciblée des médicaments pour le placenta et le développement de nouvelles stratégies de traitement pour plusieurs complications de la grossesse.
Introduction
Complications de la grossesse induite par le placenta, y compris la prééclampsie, perte fœtale, placentaire et petit âge gestationnel (SGA), sont communs et conduisent à l’importante morbidité maternelle et foetale et mortalité1,2, 3et très peu de médicaments ont fait leurs preuves pour être efficace pour traiter la grossesse troubles4,5. L’élaboration de stratégies pour la livraison de médicaments ciblés placenta plus sélectif et plus sécuritaire pendant la grossesse reste difficile en pharmacothérapie modernes.
Ces dernières années, plusieurs rapports ont mis l’accent sur l’administration ciblée des médicaments aux tissus utéro de nanoparticules de revêtement avec des peptides ou des anticorps comme outils axés sur le placenta. Ceux-ci incluent un facteur de croissance épidermique anti receptor (EGFR)6 anticorps, tumeur-homing peptides (CGKRK et iRGD)7, axés sur le placenta peptides8, peptides d’axés sur la vascularisation placentaire9 et anticorps contre le récepteurs de l’ocytocine10.
Ici, nous démontrons qu’un peptide synthétique placentaire chondroïtine sulfate A liaison (plCSA-BP) peut être utilisé pour l’administration ciblée de nanoparticules et leurs charges utiles de drogue avec le placenta11. Les nanoparticules plCSA-BP-guidées complètent l’utéro déclarée méthodes de ciblage parce qu’ils ciblent les trophoblastes placentaires.
Comme une méthode non invasive, l’imagerie in vivo a été utilisé pour contrôler l’expression des gènes spécifiques placenta en souris12et vert d’indocyanine (ICG) a été largement utilisé pour suivre les nanoparticules à l’aide de systèmes13, l’imagerie de fluorescence 14,15. Ainsi, nous avons injecté par voie intraveineuse des nanoparticules plCSA-BP-conjugué chargés avec ICG (plCSA-INPs) pour visualiser la distribution de plCSA-INP chez les souris enceintes avec un imageur de fluorescence. Nous avons ensuite injectée par voie intraveineuse méthotrexate (MTX)-chargé de plCSA-NPs dans souris gravides. Échographie de haute fréquence (HFUS), non invasive, l’autre en temps réel d’imagerie outil16,17 a été utilisé pour surveiller le développement foetal et placentaire chez les souris. Enfin, nous avons utilisé chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) pour quantifier la distribution MTX dans le placenta et le fœtus.
Dans ce protocole, nous décrivons en détail le système de trois-méthode utilisé pour évaluer l’efficacité de la délivrance des médicaments ciblés placenta par nanocarriers plCSA-BP-guidé.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les expériences de souris scrupuleusement les protocoles (SIAT-IRB-160520-YYS-FXJ-A0232) approuvés par la protection des animaux et utilisation Comité de Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Académie chinoise des Sciences.
1. synthèse de nanoparticules de polymère lipidique A ciblé placentaire Sulfate de chondroïtine
- Synthétiser des nanoparticules de lipide-polymère MTX - et ICG-chargés (MNPs et INPs respectivement) et plCSA-BP-conjugué des nanoparticules (plCSA-MNPs et plCSA-INPs) comme décrit en détaillent ailleurs18.
2. in vivo d’imagerie par Fluorescence
-
Préparation des souris enceintes
- Placer les femelles souris CD-1 (8-12 semaines) avec un mâle fertile de la même souche dans une cage (mâle : femelle = 1:2) dans l’après-midi et la vérification vaginale branche suit matin. Si on observe un plug vaginal, qualifier la souris embryonnaire jour 0.5 (E0.5).
- Souris enceintes maison seuls dans une chambre exempts de micro-organismes pathogènes animale avec un h de lumière/10 14 h obscurité cycle et donnent librement accès à la nourriture et l’eau jusqu'à E14.5.
-
Injection intraveineuse de nanoparticules
- Avant l’intervention, stériliser les nanoparticules par filtration à travers un filtre de seringue 0,22 μm. Peser la souris enceinte à E11.5 pour déterminer la quantité et le volume d’injection de nanoparticules.
Remarque : Le volume d’injection de nanoparticules doit être inférieure à 1 % (poids/volume) du poids du corps de la souris enceinte. Par exemple, le volume d’injection de nanoparticules doit être inférieur à 0,25 mL chez une souris de 25 g. - Pour dilater la veine caudale, chauffer la queue pendant 5-10 min avec un coussin chauffant.
- Avant l’injection, aspirer l’INPs ou plCSA-INPs dans une seringue à insuline 28 g.
- Transférer la souris enceinte à un dispositif de maintien qui retient la souris tout en permettant l’accès à la veine caudale. Nettoyer la queue avec un tampon imbibé d’alcool. Puis insérer la seringue dans la veine caudale. Injecter lentement l’INPs ou plCSA-INPs (équivalent ICG 5 mg/kg) avec une pression uniforme sur 5-10 s.
Remarque : S’arrêter si une cloque apparaît sur la queue, car ce résultat indique que l’aiguille n’est pas dans la veine de l’injection. Seringues ne doivent pas être partagées entre les souris pour réduire au minimum la transmission de la maladie et la contamination croisée. - Enregistrer le temps d’injection. Pendant ce temps, appliquez une légère pression sur le site d’injection jusqu'à l’arrêt du saignement, qui prend normalement de 30 à 60 s.
- Avant l’intervention, stériliser les nanoparticules par filtration à travers un filtre de seringue 0,22 μm. Peser la souris enceinte à E11.5 pour déterminer la quantité et le volume d’injection de nanoparticules.
-
Imagerie in vivo
- 30 min après l’injection, les souris enceintes utilisant la fluorescence in vivo , système d’imagerie d’image.
- Anesthésier les souris enceintes avec un débit d’oxygène de 1,0 L/min et isoflurane à 2-4 % dans une enceinte associée de l’unité d’anesthésie et vérifier l’anesthésie complète de lents et une respiration régulière. Puis, les déplacer dans la chambre d’imagerie. Placez les souris enceintes anesthésiés dans la chambre d’imagerie, de garder les animaux en position couchée.
- Placez un cône de nez sur la bouche et le nez pour permettre à l’inhalation de 1 à 2 % isoflurane avec un débit d’oxygène de 1,0 L/min pour maintenir l’anesthésie.
- Sélectionnez Paramètres 2D-fluorescence et photographiques afin d’imager les signaux de fluorescence ICG. Régler l’exposition auto et les longueurs d’onde d’excitation/émission de 710/820 nm.
- À la fin de la procédure d’imagerie, éteignez l’afflux d’isoflurane pour arrêter l’anesthésie et les souris enceintes soigneusement regagner leur cage.
- 48 h après l’injection de nanoparticules, anesthésier les souris enceintes avec isofluorane et puis sacrifier le barrage par dislocation cervicale. Ramassez les foetus et les placentas avec une pincette de Graefe, Graefe forceps de tissue et ciseaux de dissection.
- Placer le placenta et le fœtus dans la chambre d’imagerie et l’image à l’aide de la méthode décrite à l’étape 2.3.4.
3. HFUS évaluation du développement embryonnaire
-
Modèles animaux
- Obtenir et préparer les souris enceintes comme indiqué au point 2.1.
- Utilisez HFUS à des souris enceintes image à 6,5 E (protocoles 3.2 et 3.3.3). Tout d’abord, confirmer la grossesse en visualisant les embryons jour E6.5 et puis au hasard d’allouer les souris enceintes en trois groupes : le groupe MNP, MNP-plCSA groupe et groupe de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Injecter le PBS, MNPs ou plCSA-MNPs (1 mg/kg équivalent MTX) dans les veines de la queue des souris enceintes tous les deux jours à partir de E6.5 comme indiqué au point 2.2.
-
Préparation pour l’imagerie
- 24 h après l’injection de nanoparticules, image les souris enceintes à l’aide de la HFUS système d’imagerie.
- Anesthésier les souris enceintes comme indiqué au point 2.3.2. Activer les contrôles de température intégré de la plate-forme d’imagerie et de préchauffer la plate-forme à 37 et 42 ° C. Fixez les souris enceintes dans une position en décubitus dorsal sur la plate-forme à l’aide de ruban adhésif.
- Place du cône de nez connecté à l’appareil d’anesthésie sur le museau. Appliquer 2 % isoflurane avec un débit d’oxygène de 1,0 L/min à maintenir stable anesthésie.
- Enlever les poils de l’abdomen à l’aide d’une crème dépilatoire chimiquement. Effacer la crème résiduelle soigneusement avec de la gaze imbibée d’eau et ensuite enduire acoustique gel de couplage de l’abdomen.
-
Procédure d’imagerie
- Placer le transducteur de 40 MHz dans le bras mécanique.
- Ajustez la position du transducteur pour obtenir des images longitudinales du fœtus et du placenta avec la région d’intérêt situé dans la zone focale.
-
Analyse et imagerie en Mode B
Remarque : Voir film 1.- Cliquez sur le bouton Mode B et baisser le transducteur sur l’abdomen jusqu'à ce que le fœtus et le placenta entreront en vue. Appuyez sur Scan/gel pour lancer/arrêter d’imagerie, appuyez sur Cine stocker pour stocker la boucle ciné et appuyez sur trame de stocker pour stocker des images de trame.
- Cliquez sur le bouton de mesure pour analyser la longueur sac gestationnel (GS), longueur de croupe Couronne foetale (CRL), diamètre biparietal (BPD), circonférence abdominale (AC), diamètre placentaire (DP) et l’épaisseur placentaire (PT).
-
Analyse et imagerie Doppler-PW
Remarque : Voir film 1.- En utilisant le même scan projection, cliquez sur le bouton PW , placez la zone de volume d’échantillonnage dans le centre de l’artère ombilicale et appuyez sur Scan/gel pour initier l’imagerie. Cliquez sur Cine stocker afin de recueillir des images de l’artère ombilicale.
- Cliquez sur le bouton de mesure pour calculer la vitesse de pointe de l’artère ombilicale (UA).
-
Analyse et imagerie en mode Doppler couleur
- En utilisant le même scan projection, cliquez sur le bouton de couleur et ajuster la position du transducteur pour obtenir des images du coeur foetal. Appuyez sur Scan/gel pour initier l’imagerie et Cine stocker pour recueillir des images.
- Cliquez sur le bouton de mesure pour calculer le rythme cardiaque fœtal (HR).
4. analyse par CLHP
-
Préparation du tissu
- Injecter les souris enceintes avec une dose unique de MNPs ou plCSA-MNPs (équivalent MTX 1 mg/kg) à la fin de grossesse (par exemple., E14.5) comme indiqué au point 3.1.3.
- Après 24h, anesthésier les souris par une injection intrapéritonéale d’avertin à 240 μg/poids (g). S’assurer que pas de réponse à une pincée de pied pour vérifier que les souris sont complètement anesthésiés.
- Vaporiser la région de la poitrine avec 75 % d’éthanol. Effectuer la perfusion cardiaque (couper les oreillettes droites et perfuse par le ventricule gauche) comme décrit dans le détail19,20 avec 50 mL de sérum physiologique 0,9 % glacée pendant 10 min enlever des nanoparticules non liés.
- Euthanasier le barrage. Faire une césarienne pour collecter le foetus et le placenta avec une pincette de Graefe, disséquant les ciseaux et pinces à tissus Graefe et stocker les tissus à-80 ° C avant l’analyse.
- Préparer la solution d’homogénéisation (10 % d’acide perchlorique) et continuer sur la glace. Recueillir environ 200 mg de tissu et ajouter 500 μl de solution d’homogénéisation à chaque échantillon. Homogénéiser les échantillons à l’aide d’un homogénéisateur à pleine vitesse pour 30 s et répéter cette procédure deux fois.
- Centrifuger les échantillons à 14 000 x g pendant 20 min à 4 ° C. Filtrer le surnageant (environ 300 μL) à travers un filtre de 0,45 μm de seringue et transférer le liquide obtenu dans un flacon HPLC. Placer les flacons d’échantillon dans un bac d’échantillonneur automatique pour injection.
-
Élaboration de normes
- Préparer la solution suivante pour la phase mobile : acétonitrile (88:12, v/v) et 40 mM potassium phosphate dibasique (pH 4,5). Filtrer la solution à travers un filtre de seringue de taille de pore 0,45 μm et transférer le liquide obtenu dans une bouteille propre de réservoir HPLC.
Remarque : Ajuster le pH à 0,1 M d’acide phosphorique. Utiliser la vibration ultrasonique pendant 15 min pour dégazer la phase mobile chaque fois avant d’utiliser. - Peser 10 mg du MTX dans un tube à centrifuger 1,5 mL. Ajouter 1 mL d’hydroxyde de sodium 1 M.
- Vortex à grande vitesse jusqu'à ce que le MTX se dissout complètement.
Note : Ceci est l’étalon primaire et peut être conservé à-20 ° C pendant plusieurs mois. - Pour créer l’étalon secondaire de MTX (500 μg/mL), diluer 50 μL de l’étalon primaire de 950 μL de la phase mobile.
Remarque : Conserver sur la glace jusqu'à l’utilisation et de préparer les frais du jour. Il est important d’utiliser la phase mobile pour l’élaboration de normes afin d’éviter les pics résultant du mélange des solutions dissemblables après injection de l’échantillon. - Apporter de nouvelles dilutions pour créer les normes (tableau 1). Stocker les normes sur la glace et préparer les frais du jour. Exécuter les normes en série avec les échantillons expérimentaux.
- Préparer la solution suivante pour la phase mobile : acétonitrile (88:12, v/v) et 40 mM potassium phosphate dibasique (pH 4,5). Filtrer la solution à travers un filtre de seringue de taille de pore 0,45 μm et transférer le liquide obtenu dans une bouteille propre de réservoir HPLC.
| Nombre | Concentration finale (μg/mL) | 500 μg/mL norme μL | Phase(μL) mobile |
| 1 | 0,5 | 1 | 999 |
| 2 | 1 | 2 | 998 |
| 3 | 2.5 | 5 | 995 |
| 4 | 10 | 20 | 980 |
| 5 | 25 | 50 | 950 |
| 6 | 50 | 100 | 900 |
| 7 | 100 | 200 | 800 |
Tableau 1. Préparation de la courbe d’étalonnage pour MTX. La concentration finale de solution étalon de MTX est de 0,5 à 100 μg/mL.
-
Instrumentation HPLC et paramètres d’opération
Remarque : Les échantillons ont été analysés sur un système HPLC équipé d’une pompe solvant, un détecteur par spectrophotométrie UV (313 nm) et une colonne C18 (250 × 4.6 mm, taille des particules 5 μm).- Allumez le dégazeur HPLC pour chasser l’air du système. Tournez le flux, l’équilibration de la colonne avec la phase mobile pendant 30 min réduire le bruit de la ligne de base.
- Régler la température de la colonne à 25 ° C, injecter 20 volumes d’échantillon μL à un débit de 1 mL/min, puis cliquez sur la Méthode Run pour démarrer l’analyse.
- Lorsque les essais sont terminés, modifier manuellement la phase mobile d’acétonitrile qualité HPLC. Fonctionner pendant environ 15 min protéger le système.
Remarque : Pour effectuer cette étape suivant la durée recommandée peut entraîner des dommages à la colonne. - Pour une analyse quantitative, calculer les aires sous les pics MTX standards d’intérêt en utilisant le logiciel de système de CLHP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dans ce manuscrit, les nanoparticules plCSA-BP-conjugué chargés de MTX (plCSA-MNPs) ou GIC (plCSA-INPs) ont été par voie intraveineuse injectées à des souris enceintes. In vivo de l’imagerie a révélé des signaux forts de ICG dans la région de l’utérus 30 min après l’injection de plCSA-INP. L’INPs ont été essentiellement localisés dans la région du foie et la rate (Figure 1 a). 48 h après l’injection de plCSA-INP, souris gravides ont été sacrifiés, révélant l’ICG signaux que dans le placenta, alors qu’avec aucun signal sont décelables chez le fœtus (Figure 1 b).
Nous avons ensuite utilisé HFUS pour surveiller le développement de l’embryon après l’injection intraveineuse de nanoparticules. Des mesures biométriques incluent le longueur sac gestationnel (GS), longueur de croupe Couronne foetale (CRL), diamètre biparietal (BPD), circonférence abdominale (AC), diamètre placentaire (DP), épaisseur placentaire (PT), vitesse maximale de l’artère ombilicale (UA) et du rythme cardiaque fœtal fréquence (FC) (film 1). Les paramètres morphologiques mesurées à des âges gestationnels différents sont répertoriés dans le tableau 2. Dans le groupe plCSA-MNP, par rapport au groupe PBS, la circonférence abdominale fœtale moyenne et la vitesse de pointe d’artère ombilicale étaient significativement diminuées à E12.5 (Figures 2 a et 2 H), et la Couronne croupe longueur et le diamètre placentaire ont été considérablement diminué à E10.5 (Figures 2 b et 2F). À partir de E9.5, la longueur du sac gestationnel a été également significativement réduite (Figure 2) et le diamètre biparietal, épaisseur placentaire, et du rythme cardiaque fœtal a commencé à diminuer considérablement sur 11,5 E par rapport à ceux du groupe PBS (Figures 2D 2E et 2 G). Ensemble, ces résultats suggèrent que les plCSA-MNPs ont un fort effet cytotoxique sur développement foetal et placentaire. Fait intéressant, le traitement par MNPs altérée aussi légèrement développement foetal et placentaire (Figures 2 a-2 H), indiquant que les nanoparticules pourraient améliorer la prestation des MTX à placenta via la perméabilité améliorée et l’effet de rétention (EPR).
| Âge gestationnel | Groupe | Decidua (mm) | GS (mm) | LCR (mm) | BPD (mm) | AC (mm) | PD (mm) | PT (mm) | HR (bpm) | UA (mm/s) |
| E6.5 | 0.92±0.23 | / | / | / | / | / | / | / | / | |
| E7.5 | PBS | / | 0.82±0.24 | 0.72±0.18 | / | / | / | / | / | / |
| MNPs | / | 0.83±0.14 | 0.83±0.14 | / | / | / | / | / | / | |
| plCSA-MNPs | / | 0.65±0.23 | 0.65±0.23 | / | / | / | / | / | / | |
| E8.5 | PBS | / | 2.02±0.54 | 1.88±0.40 | 0.93±0.23 | / | / | / | / | / |
| MNPs | / | 1.49±0.50 | 1.49±0.50 | 0.82±0.20 | / | / | / | / | / | |
| plCSA-MNPs | / | 1.14±0.46 | 1.02±0.42 | 0.83±0.18 | / | / | / | / | / | |
| E9.5 | PBS | / | 3.31±0.62 | 3.49±0.65 | 1.39±0.54 | / | / | / | / | / |
| MNPs | / | 2.34±0.68 | 2.23±0.49 | 0.98±0.34 | / | / | / | / | / | |
| plCSA-MNPs | / | 1.83±0.42 | 1.59±0.59 | 0.94±0.25 | / | / | / | / | / | |
| E10.5 | PBS | / | 4.43±0.67 | 4.97±0.80 | 2.10±0.61 | 4.83±1.40 | 2.91±0.23 | 2.24±0.24 | 100±30 | 30.16±9.40 |
| MNPs | / | 3.28±0.64 | 2.91±0.83 | 1.46±0.54 | 3.95±1.28 | 2.66±0.33 | 2.17±0.19 | 87±21 | 24.63±7.35 | |
| plCSA-MNPs | / | 2.64±0.66 | 2.17±0.85 | 1.12±0.33 | 3.82±1.13 | 2.13±0.35 | 1.94±0.15 | 83±22 | 15.37±5.70 | |
| E11.5 | PBS | / | 5.68±0.73 | 6.45±0.90 | 3.08±0.70 | 8.67±2.08 | 4.16±0.39 | 2.75±0.26 | 124±28 | 31.62±7.76 |
| MNPs | / | 4.36±0.39 | 3.74±1.2 | 2.31±0.53 | 6.69±1.85 | 3.56±0.40 | 2.39±0.23 | 106±22 | 25.20±6.18 | |
| plCSA-MNPs | / | 3.42±0.76 | 2.61±0.84 | 1.51±0.54 | 4.59±1.57 | 2.54±0.49 | 2.09±0.27 | 79±20 | 16.66±5.69 | |
| E12.5 | PBS | / | / | 8.12±1.29 | 3.90±0.65 | 12.43±2.48 | 5.37±0.42 | 3.14±0.24 | 141±26 | 40.62±10.89 |
| MNPs | / | / | 4.87±1.29 | 2.87±0.62 | 8.29±1.78 | 4.25±0.67 | 2.65±0.26 | 119±18 | 27.76±7.52 | |
| plCSA-MNPs | / | / | 3.2±1.28 | 1.75±0.60 | 5.47±1.39 | 3.05±0.50 | 2.28±0.26 | 72±22 | 18.76±7.20 | |
| E13.5 | PBS | / | / | 10.04±1.2 | 4.67±0.65 | 15.64±2.33 | 6.03±0.60 | 3.49±0.23 | 157±28 | 54.62±12.37 |
| MNPs | / | / | 6.17±1.29 | 3.37±0.55 | 9.39±1.88 | 4.77±0.69 | 2.92±0.43 | 109±22 | 35.84±9.49 | |
| plCSA-MNPs | / | / | 3.57±1.71 | 1.87±0.73 | 6.25±1.41 | 3.42±0.63 | 2.37±0.34 | 60±23 | 20.02±11.20 | |
| E14.5 | PBS | / | / | 12.35±1.6 | 5.36±0.71 | 18.38±2.53 | 6.70±0.64 | 3.75±0.35 | 167±27 | 71.48±10.72 |
| MNPs | / | / | 7.6±1.56 | 3.90±0.70 | 10.31±2.31 | 5.23±0.76 | 3.10±0.39 | 99±23 | 45.80±13.07 | |
| plCSA-MNPs | / | / | / | / | / | / | / | / | / |
Le tableau 2. Mesurer les paramètres morphologiques de chaque âge gestationnel. GS : Longueur sac gestationnel ; LCR : Longueur de la cime croupe ; BPD : Biparietal diamètre ; AC : Circonférence abdominale ; PD : Diamètre placentaire ; PT : Épaisseur placentaire ; HR : Du rythme cardiaque fœtal ; UA : Vitesse maximale artère ombilicale ; / : ne peut pas mesurer.
Nous avons ensuite mesuré les concentrations de MTX dans le placenta et le fœtus par CLHP. En utilisant les paramètres de fonctionnement de CLHP décrites ci-dessus, le temps de rétention MTX a été établi à 7 min et MTX a été détectée dans le placenta du groupe plCSA-MNP (Figure 3). Les concentrations de MTX dans le placenta et le foetus ont été déterminées à l’aide des courbes d’étalonnage MTX (Figure 4). 24 h après l’injection, le niveau MTX placentaire dans le groupe MNP était significativement plus faible que dans le groupe plCSA-MNP, et aucun MTX a été détectée chez les foetus du groupe plCSA-MNP. MTX pourrait encore être détecté dans le placenta 48 h après l’injection de plCSA-MNP (Figure 5). Ces résultats démontrent que plCSA-MNPs ne peuvent pas traverser la barrière placentaire, minimisant ainsi les effets négatifs potentiels sur le fœtus.
En résumé, ce système de trois-méthode constitué en imagerie de fluorescence in vivo , HFUS et HPLC peut être employé pour déterminer la façon dont un véhicule de livraison de drogue cible nanocarriers et délivre des médicaments pour le placenta. En utilisant ces méthodes, nous avons démontré que les nanoparticules de plCSA-BP guidé sont un outil efficace pour cibler l’administration de médicaments pour le placenta.
Figure 1 . In vivo imagerie de fluorescence. (A) les souris (n = 5 de chaque) à E11.5 ont été injectés avec INPs ou plCSA-INPs (ICG équivalent 5 mg/kg) via la veine caudale. Après 30 min, les souris étaient projetés à l’aide d’une fluorescence système d’imagerie. (B) 48 h après l’injection de INPs ou plCSA-INPs, les foetus (F, n = 2 par souris) et placentas (P, n = 2 par souris) ont été recueillies et photographié avec une système d’imagerie de fluorescence. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Quantification de la croissance embryonnaire de HFUS. (A) la circonférence abdominale (n = 30-51 embryons/jour), longueur de croupe de couronne (B) (n = 30-51 embryons/jour), longueur de sac (C) gestationnel (n = 10-30 embryons/jour), diamètre biparietal (D) (n = 30-51 embryons/jour), épaisseur (E) placentaire (n = 30-51 embryons/jour), (F). diamètre placentaire (n = 30-51 embryons/jour), du rythme cardiaque fœtal (G) (n = 20-33 embryons/jour) et la vitesse de pointe (H) l’artère ombilicale (n = 12-36 embryons/jour) mesurée de façon non invasive par échographie in vivo. Tous les tests ont été comparés par paires à queue 2 t-test et p < 0,05 était considérée comme statistiquement significative. Les valeurs sont exprimées comme le moyen ± SD. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 par rapport au groupe de PBS. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Chromatogrammes HPLC représentant des échantillons placentaires. Souris gravides (n = 5 chacun) ont été injectés par voie intraveineuse avec PBS ou plCSA-MNPs et leurs placentas (n = 15, chaque groupe) ont été prélevés 24 h plus tard pour HPLC. À l’aide d’une solution titrée de MTX avec détection UV à 313 nm, le temps de rétention a été établie à 7 min. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Les courbes standard pour MTX. Les concentrations de MTX varie de 0,5 µg/mL à 100 μg/mL. Les données représentent la moyenne ±et pour n = 3. Les barres d’erreur de certaines données sont plus petits que les symboles rhombiques. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 . Application de la CLHP pour déterminer le biodistributions des nanoparticules dans le placenta et le fœtus. Des souris enceintes ont reçu une injection unique de MNPs ou plCSA-MNPs (équivalent MTX 1 mg/kg) au stade de gestation E13.5. Après 24 h et 48 h, les concentrations de MTX dans les placentas (n = 15) et les foetus (n = 15) ont été mesurés par HPLC. Les valeurs sont exprimées comme les différences means±SD. concentrations de MTX entre les groupes MNP et plCSA-MNP ont été analysées à l’aide de l’étudiant non-appariés t-test (*** p < 0,001) ; ND : non détecté. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Movie 1. Images HFUS du fœtus et de placenta illustrant les emplacements de mesure biométrique. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dans ce manuscrit, nous décrivent un système de trois-méthode pour déterminer si les nanoparticules plCSA-BP-guidées sont un outil efficace pour cibler l’administration de médicaments pour le placenta. L’utilisationdes in vivo de l’imagerie pour surveiller le signal infrarouge de ICG fluorescent a confirmé la spécificité ciblage placentaire de plCSA-BP. Using HFUS et HPLC, nous avons démontré que plCSA-BP-conjugué des nanoparticules peuvent délivrer efficacement MTX uniquement à la cellules du placenta, pas pour le fœtus.
Dans la in vivo d’imagerie de fluorescence des expériences, l’âge gestationnel des souris enceintes est importants. Le placenta commence à se former autour de E9.521. En outre, compte tenu de la résolution de l’imageur, in vivo d’imagerie expérience doit être effectuée après 10,5 E. Injection plCSA-INP à 11,5 E selon ce protocole, aucun signal de fluorescence a été détectée avec l’imageur dans les conditions décrites, qui peut-être due à la peau et les organes internes, empêchant la transmission de signal22. Pour contourner cette limitation, augmentant la dose d’injection ou de la collecte du placenta et le foetus pour l’imagerie ex vivo doit être utilisé.
Une étape cruciale dans l’imagerie de HFUS est l’utilisation d’un transducteur approprié pour obtenir des images de haute qualité embryonnaires. La fréquence optimisée pour l’imagerie embryologie souris est 40-50 MHz. En outre, maintenir la température physiologique du corps de la souris enceinte avant d’acquérir des images est également important. Enfin, l’observateur doit être prudent lors de l’enregistrement de films B-mode au début du développement embryonnaire (E-E 6,5 8,5) et cela dépend davantage d’expérience. L’incertitude de mesure peut-être être compensé en comparant les caractéristiques anatomiques du cadre de référence pour le fœtus et de la circulation placentaire au cours de l’échographie traitement16,23,24. L’exactitude des données d’imagerie peut être améliorée en faisant plusieurs mesures et le nombre croissant du fœtus et le placenta.
La NANOPARTICULE résiduelle non liée dans le vaisseau sanguin est un facteur efficace pour l’évaluation de l’administration de médicaments ciblés pour le placenta et le fœtus. Ainsi, la perfusion cardiaque a été effectuée pour supprimer des nanoparticules indépendants avant les foetus et placentas ont été recueillis. Précédentes études7,8,9 ont en outre constaté qu’avant d’analyser la capacité d’un peptide de lier le placenta, soumettant la souris à la perfusion cardiaque est indispensable.
Un piège possible lors de l’analyse HPLC est le chevauchement de MTX avec d’autres pics. L’acétonitrile est utilisé pour éluer MTX de la colonne. Si les sommets qui se chevauchent se produisent avant 5 min, diminution de la concentration d’acétonitrile dans la phase mobile peut être utile. Si aucune pics ou les pics qui se chevauchent se produisent après 30 min, augmentation de la concentration de l’acétonitrile est utile. Une principale limitation de HPLC est qu’il ne révèle pas la localisation des nanoparticules dans le placenta. Les nanoparticules de plCSA-BP-guidée axées spécifiquement le labyrinthe placentaire dans le placenta de souris11. Ainsi, l’analyse morphologique du placenta est nécessaire.
Il s’agit de la première utilisation de la combinaison de l’imagerie in vivo , HFUS et HPLC pour déterminer l’efficacité de livraison axés sur le placenta, guidé par un peptide. HFUS s’est imposée comme une avancée, non invasive, sûre et en temps réel méthode d’imagerie et a été utilisé avec succès pour l’imagerie à haute résolution du développement embryonnaire de souris17,25,26. Bien que l’imagerie de fluorescence in vivo a été largement utilisé pour visualiser la formation de tumeurs et de métastases chez les souris vivantes27,28,29, il n'a pas encore été utilisée dans l’étude de la délivrance des médicaments placentaire. Comme approche alternative, imagerie de fluorescence in vivo a un net avantage sur HFUS être en mesure de visualiser directement la distribution des nanoparticules injectées par voie intraveineuse à des souris vivantes mais ne peut pas surveiller le développement placentaire et foetal. Par conséquent, nous avons combiné les avantages de la visualisation par imagerie de fluorescence in vivo et ancienne HFUS-la haute résolution, permettant la visualisation des plCSA-BP-guidé INPs en vivo, et permettant à ce dernier en vivo surveillance des effets des plCSA-MNPs sur développement placentaire et foetal et la survie. En outre, HPLC confirmé que plCSA-MNPs ont été spécifiquement livrés aux placentas et n’a pas atteint les fœtus.
Nanomédecine ciblé est une nouveauté dans le domaine des troubles de la grossesse, et importantes nouvelles approches pour libérer spécifiquement les organes maternels des médicaments sont nécessaires pour traiter les troubles de la grossesse à la clinique30. Le système de trois-méthode décrit dans le présent protocole est une combinaison de in vivo décours temporel d’imagerie des nanoparticules ciblant tant les effets correspondants du développement placentaire et foetale, ce qui permet des mesures biochimiques plus précises de la la quantité de médicament dans les tissus afin d’évaluer les outils pour la livraison du placenta ciblés pour le traitement des complications de la grossesse induite par le placenta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
X.F. et B.Z. sont inventeurs sur la demande de brevet PCT/CN2017/108646 soumis par SIAT qui couvre une méthode de livraison de médicaments spécifiques placenta et son application. Tous les autres auteurs déclarent qu’ils n’ont pas des intérêts concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des Sciences naturelles (81771617) et les sciences naturelles Fondation la Province du Guangdong (2016A030313178) attribué à X.F. ; une subvention provenant du Fonds de recherche fondamentale Shenzhen (JCYJ20170413165233512) attribué à X.F ; Développement humain de la National Institutes of Health, sous attribution numéro R01HD088549 et Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health (le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement l’officiel vues de la National Institutes of Health) à N.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD-1 mice | Beijing Vital River | 201 | Female (8-12 week) |
| Insulin syringe | BD | 328421 | for IV injection |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Methotrexate (MTX) | Sigma-Aldrich | V900324 | for nanoparticles synthesis |
| Indocyanine green (ICG) | Sigma-Aldrich | 1340009 | for in vivo imaging |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Hyclone | SH30028.01 | |
| IVIS spectrum instrument | Perkin Elmer | for in vivo imaging | |
| Ultrasound transmission gel | Guanggong | ZC4252418 | for ultrasound imaging |
| Isoflurane | Lunan Pharmaceutical | I0040 | for maintain the anesthesia |
| Depilatory cream | Nair | TMG001 | for removing fur |
| 40 MHz transducer | VisualSonics | MS550S | for ultrasound imaging |
| High-frequency ultrasound imaging system | VisualSonics | Vevo2100 | for ultrasound imaging |
| Avertin | Sigma-Aldrich | T48402 | for anesthesia |
| Syringe pump | Mindray | SK-500III | forcardiac perfusion |
| 0.9% saline solution | Meilunbio | MA0083 | forcardiac perfusion |
| 1.5 mL Polypropylene tubes | AXYGEN | MCT-150-C | |
| -80 °C freezer | Thermo Fisher Scientific | 88600V | |
| Centriguge | Cence | H1650R | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | for precipitating protein |
| Homogenizer | SCIENTZ | SCIENTZ-48 | for homogenizing tissue |
| Syringe filter (0.45 μm) | Millipore | SLHV033RS01 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical | 10019763 | for solving MTX |
| HPLC vials | Waters | 670650620 | for HPLC |
| Potassium phosphate dibasic | Sinopharm Chemical | 20032117 | for HPLC |
| Acetonitrile | JKchemical | 932537 | for HPLC |
| C18 column | Waters | 186003966 | for HPLC |
| HPLC system | Shimadzu | for HPLC |
References
- Rodger, M. A., et al. The Association of Factor V Leiden and Prothrombin Gene Mutation and Placenta-Mediated Pregnancy Complications: A Systematic Review and Meta-analysis of Prospective Cohort Studies. PLOS Medicine. 7 (6), e1000292 (2010).
- Rodger, M. A., et al. Inherited thrombophilia and pregnancy complications revisited. Obstetrics & Gynecology. 112 (2 Pt 1), 320-324 (2008).
- Brenner, B., Aharon, A. Thrombophilia and adverse pregnancy outcome. Clinics in Perinatology. 34 (4), 527-541 (2007).
- Fisk, N. M., McKee, M., Atun, R. Relative and absolute addressability of global disease burden in maternal and perinatal health by investment in R&D. Tropical Medicine & International Health. 16 (6), 662-668 (2011).
- Fisk, N. M., Atun, R. Market failure and the poverty of new drugs in maternal health. PLOS Medicine. 5 (1), e22 (2008).
- Kaitu'u-Lino, T. uJ., et al. Targeted nanoparticle delivery of doxorubicin into placental tissues to treat ectopic pregnancies. Endocrinology. 154 (2), 911-919 (2013).
- King, A., et al. Tumor-homing peptides as tools for targeted delivery of payloads to the placenta. Science Advances. 2 (5), e1600349 (2016).
- Beards, F., Jones, L. E., Charnock, J., Forbes, K., Harris, L. K. Placental Homing Peptide-microRNA Inhibitor Conjugates for Targeted Enhancement of Intrinsic Placental Growth Signaling. Theranostics. 7 (11), 2940-2955 (2017).
- Cureton, N., et al. Selective Targeting of a Novel Vasodilator to the Uterine Vasculature to Treat Impaired Uteroplacental Perfusion in Pregnancy. Theranostics. 7 (15), 3715-3731 (2017).
- Paul, J. W., et al. Drug delivery to the human and mouse uterus using immunoliposomes targeted to the oxytocin receptor. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 216 (3), e281-e283 (2017).
- Zhang, B., et al. Placenta-specific drug delivery by trophoblast-targeted nanoparticles in mice. Theranostics. 8 (10), 2765-2781 (2018).
- Fan, X., et al. Noninvasive monitoring of placenta-specific transgene expression by bioluminescence imaging. PloS One. 6 (1), e16348 (2011).
- Murata, M., Tahara, K., Takeuchi, H. Real-time in vivo imaging of surface-modified liposomes to evaluate their behavior after pulmonary administration. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (1), 115-119 (2014).
- Ito, A., et al. New whole-body multimodality imaging of gastric cancer peritoneal metastasis combining fluorescence imaging with ICG-labeled antibody and MRI in mice. Gastric Cancer. 17 (3), 497-507 (2014).
- Mazza, M., et al. Liposome-Indocyanine Green Nanoprobes for Optical Labeling and Tracking of Human Mesenchymal Stem Cells Post-Transplantation In Vivo. Advanced Healthcare Materials. 6 (21), (2017).
- Greco, A., et al. High frequency ultrasound for in vivo pregnancy diagnosis and staging of placental and fetal development in mice. PloS One. 8 (10), e77205 (2013).
- Spurney, C. F., Leatherbury, L., Lo, C. W. High-frequency ultrasound database profiling growth, development, and cardiovascular function in C57BL/6J mouse fetuses. Journal of the American Society of Echocardiography. 17 (8), 893-900 (2004).
- Zhang, B., et al. Synthesis and characterization of placental chondroitin sulfate A (plCSA) -targeting lipid-polymer nanoparticles. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Beeton, C., Chandy, K. G. Isolation of mononuclear cells from the central nervous system of rats with EAE. Journal of Visualized Experiments. (10), 527 (2007).
- Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology. 20 (3), 180-193 (2005).
- Frangioni, J. V. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 626-634 (2003).
- Flores, L. E., Hildebrandt, T. B., Kuhl, A. A., Drews, B. Early detection and staging of spontaneous embryo resorption by ultrasound biomicroscopy in murine pregnancy. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 38 (2014).
- Khankin, E. V., Hacker, M. R., Zelop, C. M., Karumanchi, S. A., Rana, S. Intravital high-frequency ultrasonography to evaluate cardiovascular and uteroplacental blood flow in mouse pregnancy. Pregnancy Hypertension. 2 (2), 84-92 (2012).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatric Research. 60 (1), 14-21 (2006).
- Pallares, P., Gonzalez-Bulnes, A. Non-invasive ultrasonographic characterization of phenotypic changes during embryo development in non-anesthetized mice of different genotypes. Theriogenology. 70 (1), 44-52 (2008).
- Parvani, J. G., Gujrati, M. D., Mack, M. A., Schiemann, W. P., Lu, Z. -R. Silencing β3 integrin by targeted ECO/siRNA nanoparticles inhibits EMT and metastasis of triple-negative breast cancer. Cancer Research. 75 (11), 2316-2325 (2015).
- Zhang, B., et al. Targeted delivery of doxorubicin by CSA-binding nanoparticles for choriocarcinoma treatment. Drug Delivery. 25 (1), 461-471 (2018).
- Jenkins, D. E., et al. Bioluminescent imaging (BLI) to improve and refine traditional murine models of tumor growth and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 20 (8), 733-744 (2003).
- Keelan, J. A., Leong, J. W., Ho, D., Iyer, K. S. Therapeutic and safety considerations of nanoparticle-mediated drug delivery in pregnancy. Nanomedicine. 10 (14), 2229-2247 (2015).
