Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Visualisere cytoskeletale vækst kegle sammenbrud og tidlige Amyloid β effekter i kulturperler mus neuroner

Published: October 30, 2018 doi: 10.3791/58229
Automatic Translation
1
1Division of Neuromedical Science, Institute of Natural Medicine, University of Toyama

Summary

Her præsenteres en protokol til at undersøge de tidlige effekter af amyloid-β (Aβ) i hjernen. Dette viser, at Aβ fremkalder clathrin-medieret endocytose og sammenbrud af cytoskeletale vækst kegler. Protokollen er nyttige i at studere tidlige effekter af Aβ på cytoskeletale vækst kegler og kan lette forebyggelse af Alzheimers sygdom.

Abstract

Amyloid-β (Aβ) forårsager hukommelse funktionshæmninger i Alzheimers sygdom (AD). Selvom terapi har vist sig at reducere Aβ i hjernen hos AD patienter, forbedrer disse ikke hukommelsesfunktioner. Da Aβ aggregater i hjernen før fremkomsten af hukommelse svækkelser, kan målretning Aβ være ineffektivt til behandling af annonce patienter, der allerede udviser hukommelse underskud. Derfor bør downstream signalering på grund af Aβ deposition blokeres før AD udvikling. Aβ inducerer cytoskeletale degeneration, fører til forstyrrelser af neuronal netværk og hukommelse funktionshæmninger. Selvom der er mange undersøgelser om mekanismerne af Aβ toksicitet, kilden til Aβ toksicitet er fortsat ukendt. For at hjælpe med at identificere kilden, foreslår vi en roman protocol, der bruger mikroskopi, gen Transfektion og levende celle imaging for at undersøge tidlige ændringer forårsaget af Aβ i cytoskeletale vækst kogler af kulturperler neuroner. Denne protokol afslørede, at Aβ induceret clathrin-medieret endocytose i cytoskeletale vækst kegler efterfulgt af vækst kegle sammenbrud, demonstrerer, at hæmning af endocytose forhindrer Aβ toksicitet. Denne protokol vil være nyttige i at studere de tidlige effekter af Aβ og kan føre til mere effektive og forebyggende AD behandling.

Introduction

Amyloid-β (Aβ) indlån findes i hjernen hos patienter med Alzheimers sygdom (AD) og betragtes som en afgørende årsag til annonce1 der forstyrrer neuronal netværk, fører til hukommelse nedskrivninger2,3,4. Mange kliniske lægemiddelkandidater har vist sig at effektivt forhindre amyloid-β (Aβ) produktion eller fjerne Aβ-aflejringer. Dog lykkedes ingen forbedring hukommelsesfunktion i AD patienter5. Aβ er allerede deponeret i hjernen før igangsættelsen af hukommelse funktionshæmninger6; Derfor kan faldende Aβ niveauer i hjernen hos patienter udstillende hukommelse funktionsnedsættelser være ineffektive. Aβ deposition er til stede i prækliniske AD patienter; men disse patienter sjældent præsentere med neuronal degeneration og hukommelse underskud6. Der er en tidsforskydning mellem Aβ deposition og hukommelse funktionshæmninger. Derfor en kritisk strategi for forebyggelse af AD blokering Aβ toksicitet signalering i de tidlige stadier af Annoncen, før udviklingen af hukommelse underskud. Aβ deposition inducerer axon degeneration7,8,9,10,11,12,13, hvilket kan føre til en afbrydelse af neurale netværk og permanent svækkelse af hukommelsesfunktion. Mange studier har undersøgt mekanismerne i Aβ toksicitet; for eksempel, har de degenererede axoner af annonce mus hjerner vist sig at har øget autophagy14. Calcineurin aktivering er blevet rapporteret som en mulig mekanisme af Aβ-induceret cytoskeletale degeneration15; men den direkte udløsende faktor for cytoskeletale degeneration forbliver ukendt.

Denne undersøgelse fokuserer på sammenbruddet af cytoskeletale endelser kaldet vækst kegler. Sammenbruddet af cytoskeletale vækst kegler kan være forårsaget af cytoskeletale vækst afskrækningsmidler, såsom semaphorin 3A og ephrin-A516,17,18,19,20. Sammenbrud-lignende dystrofe cytoskeletale endelser er blevet observeret i hjernen hos AD patienter21,22. Derudover kan manglende vækst kegle funktion provokere cytoskeletale degeneration23. Men det er uvist om Aβ inducerer vækst kegle sammenbrud. Derfor, denne undersøgelse præsenterer en roman protokol for at observere de tidlige effekter af Aβ i kulturperler neuroner og undersøge Aβ-induceret vækst kegle sammenbrud.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne for pleje og brugen af forsøgsdyr ved de Sugitani Campus i University Toyama og blev godkendt af Udvalget for Animal Care og brugen af forsøgsdyr ved de Sugitani Campus af den Universitet af Toyama (A2014INM-1, A2017INM-1).

1. sammenbrud Assay

  1. Poly-D-lysin belægning
    1. Pels 8-godt kultur dias med 400 μL af 5 μg/mL poly-D-lysin (PDL) i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og inkuberes dem ved 37 ° C natten over.
    2. PDL-opløsning og brøndene vaskes 3 gange med destilleret vand.
  2. Neuron kultur24
    1. Hakkekød frisk isolerede cerebral cortex fra embryonale dag 14 (E14) ddY mus med microscissors i neuron næringssubstratet indeholdende 12% hest serum, 0,6% glukose og 2 mM L-glutamin (medium A). Må ikke tilsættes antibiotika.
      Bemærk: I denne protokol, ddY mus er brugt. Dette er en outbred stamme, der almindeligvis anvendes i Japan. Protokollens neuron kultur kan anvendes også til rotte kortikale neuroner7,25.
    2. Der centrifugeres væv ved 87 x g i 3 min.
    3. Fjern supernatanten. Derefter til pellet, der tilsættes 2 mL 0,05% trypsin og Inkuber i 15 min. ved 37° C. Bland ved at trykke på hver 5 min.
    4. Der tilsættes 4 mL medium A og mix ved at trykke.
    5. Der centrifugeres væv ved 178 x g i 3 min.
    6. Fjern supernatanten, og Inkuber væv med 600 U/mL DNase jeg og 0,3 mg/mL soja trypsin hæmmer opløst i PBS for 15 min ved 37 ° C. Bland ved at trykke på hver 5 min.
    7. Efter inkubation, der tilsættes 4 mL medium A og mix ved at trykke.
    8. Der centrifugeres væv ved 178 x g i 3 min.
    9. Efter fjernelse af supernatanten, tilsættes 4 mL medium A og hakkede væv med en poleret Pasteur pipette.
    10. Filtrer triturated væv med en 70 µm pore-størrelse mesh. Efter filtrering, beregne massefylden af celler med en hemocytometer.
    11. Kultur celler i den kultur, 8-godt slide på 0,8 x 104 celler/brønd med medium A og fastholde dem i en CO2 kuvøse med en fugtig atmosfære af 10% CO2 ved 37 ° C.
    12. Efter 4 h i dyrkning, erstatte næringssubstrat til én indeholdende 2% tillæg for neuronal kultur, 0,6% glukose og 2 mM L-glutamin (medium B).
      BEMÆRKNING: Renheden af neuroner var ca 75%, som tidligere beskrevet26.
  3. Sammenbrud assay27
    1. Opløse kommercielt opnået fuld længde amyloid B1-42 (Aβ1-42) i destilleret vand ved en koncentration på 0,5 mM og der inkuberes ved 37 ° C i 7 dage. Efter inkubation, gemme den aggregerede Aβ1-42-løsning i en mellem-30 ° C fryser indtil brug.
      Bemærk: Denne inkubation er nødvendige for sammenlægning og toksicitet af Aβ27,28,29,30.
    2. Efter 4 dage af neuronal kultur, behandle brønde med 100 μL af nye medium B, aggregerede som indeholder 0,5 μM Aβ1-42 eller køretøjet løsning (destilleret vand) i 1 time.
      Bemærk: Virkningerne af Aβ1-42 blev dosis-afhængigt steg fra 0,1 til 5 μM, og toppede på 0,5 μM som tidligere beskrevet27. Lignende resultater ses ved Aβ1-42 behandling for 1 time efter 3 dage af neuronal kultur31.
    3. Fjerne næringssubstratet og straks lave neuroner med 4% PARAFORMALDEHYD indeholdende 4% saccharose i PBS i 1 timer ved 37 ° C på en varm tallerken.
    4. Efter fiksering, vask neuroner 3 gange med PBS og montere dem med en vandig montering medium. Tør montering medium ved 4 ° C i 2-4 dage.
    5. Fange hele området (7,8 x 9 mm2) i hver brønd med en 20 X tør mål linse på en inverteret mikroskop.
    6. Klassificere den længste neurites af hver neuron i Stadium 3 eller 4 som axoner, som tidligere beskrevet32,33.
    7. Klassificere vækst kegler efter følgende kriterier: 1) cytoskeletale vækst kegler mangler lamellipodia eller 2) besidder mindre end tre filopodia betragtes kollapsede vækst kegler, som tidligere beskrevet17.
      Bemærk: Sund vækst kegler er scorede som 0 point; skjulte vækst kegler er scorede som 1 point. Betyde sammenbrud scores er beregnet for hver behandling.

2. amyloid β immunfarvning

  1. Kultur mus kortikale neuroner for 3 dage, som beskrevet i trin 1.2.
  2. Behandling med aggregerede Aβ1-42 (5 μM) eller køretøj i 4 timer ved 37 ° C i en CO2 inkubator.
  3. Uden at fjerne mediet, tilføje et lige saa stort volumen af 4% PARAFORMALDEHYD indeholdende 4% saccharose i PBS i hvert hul, og bevare kultur ved 37 ° C på en varmeplade i 5 min.
  4. Udskifte løsningen med 400 μL af 4% PARAFORMALDEHYD indeholdende 4% saccharose i PBS, og opretholde ved 37 ° C på varmepladen for 1 h. Denne fiksering protokollen blev ændret fra en tidligere rapport34.
  5. Vask neuroner 3 gange med PBS.
  6. Blokere med 5% normal ged serum i PBS.
  7. Inkuber neuroner med musen anti-amyloid β immunoglobulin G (IgG) (1:50) og 1% bovint serumalbumin i PBS ved 4 ° C natten over.
  8. Vask neuroner 3 gange med PBS.
  9. Inkuber neuroner med fluorescens-konjugeret sekundær antistof (1: 400) og 1% bovint serumalbumin i PBS ved stuetemperatur i 2 timer.
  10. Vaske neuroner 3 gange med PBS og montere dem med en vandig montering medium.
  11. Billedtagning fluorescens og lysfelt billeder med skrå belysning ved hjælp af en 40 X tør mål linse på inverteret mikroskop B.

3. cytoskeletale immunfarvning27

  1. Vask neuroner 3 gange med PBS efter kulturperler neuron fiksering, som beskrevet i trin 1.3.3.
  2. Inkuber neuroner med musen anti-tau-1 IgG (1: 500), kanin anti-mikrotubulus forbundet protein 2 (MAP2) IgG (1: 500) i 5% normal ged serum og 0,3% t- octylphenoxypoly-ethoxyethanol i PBS ved 4 ° C natten over.
  3. Vask neuroner 3 gange med PBS.
  4. Inkuber neuroner med fluorescens-konjugeret sekundære antistoffer (1: 400) og 0,3% t- octylphenoxypolyethoxyethanol i PBS ved stuetemperatur i 2 timer.
  5. Vaske neuroner 3 gange med PBS, og montere ved hjælp af en vandig montering medium.
  6. Fange fluorescens og differential interferens kontrast (DIC) billeder ved hjælp af en 20 × tør mål linse på inverteret mikroskop A.

4. levende celle Imaging27

  1. Coat glas-baserede retter med 500 μL af PDL (5 μg/mL), som beskrevet i trin 1.1.1.
    Bemærk: I denne protokol, hjemmelavet glas-baserede retter blev brugt. Kommercielt tilgængelige glas-baserede retter kan også bruges til live imaging. Hjemmelavet glas-baserede retter blev tilberedt som følger: 1) lave et hul ca 1,4 mm i diameter i midten af en 35-mm skål med en hånd punch, og 2) Vedhæft et glas coverslip (diameter på 22 mm) på bagsiden af fadet med silikone.
  2. Vaske pladerne med destilleret vand, som beskrevet i trin 1.1.2 og kultur de kortikale neuroner i glas-baserede parabol på 3 x 104 celler/parabol med medium A, som beskrevet i trin 1.2.
  3. Efter 4 dage i cellekultur, erstatte mediet med 2 mL nyt medium B, og overdragelsen inverteret parabol til mikroskop A. Bevar kultur i en fugtig atmosfære af 10% CO2 ved 37 ° C.

5. endocytose eksperiment

  1. Kultur mus kortikale neuroner, som beskrevet i trin 1.2.
  2. Fire dage senere, erstatte mediet med 100 μL af nye medium B indeholdende 20 μM fluorescens membran sonden for 1 min.
  3. Tilføj 1 μL af 0,05 mM aggregerede Aβ1-42 (endelige 0,5 μM) eller køretøj (destilleret vand) løsning og mix af pipettering. Inkuber i 20 min.
  4. Fjern mediet og brøndene vaskes to gange med medium B, der har været præ opvarmet til 37 ° C.
  5. Fix, vaske, og montere neuronerne som beskrevet i trin 1.3.3 og 1.3.4.
  6. Fange fluorescerende og DIC billeder med en 63 X olie mål linse på inverteret mikroskop A.
  7. Kvantificere tætheden af fluorescens membran sonde-positive område i hver sund vækst kegle ved hjælp af en afbildning software.

6. gen Transfektion

  1. Forberede kortikale neuroner, som beskrevet i trin 1.2. Når du har fuldført trin 1.2.1 til 1.2.10, centrifugeres neuroner ved 178 x g i 3 min.
  2. Fjern supernatanten, tilsættes 4 mL af Ca2 +-gratis og Mg2 +-gratis Hanks' afbalanceret saltopløsning (CMF-HBSS), og bland af pipettering.
  3. Der centrifugeres celler ved 178 x g i 3 min.
  4. Fjern supernatanten, tilsættes 4 mL af CMF-HBSS og mix af pipettering. Næste, beregne celle tæthed, som beskrevet i trin 1.2.10.
  5. Overføre 5 x 106 celler til en 1,5 mL rør og centrifugeres ved 1,677 x g i 1 min.
  6. Fjern supernatanten, Tilsæt 100 μL af Transfektion løsning med tillægget og 3 μg af DNA plasmid kodning EGFP eller EGFP-AP180 C-terminus og mix af pipettering.
  7. Overføre ovenstående løsning (trin 6.6) til en certificeret kuvette og transfect med en electroporator efter producentens protokol.
  8. Umiddelbart efter Transfektion, tilsæt 500 μL af medium A i kuvette og opløsningen overføres til en 1,5 mL rør med en certificeret pipette. Næste, beregne celle tæthed, som beskrevet i trin 1.2.10.
  9. Kultur celler i en 8-godt kultur dias på 0,8 x 104 celler/brønd, som beskrevet i trin 1.2.11 og 1.2.12.
  10. Efter 4 dage i cellekultur, udføre et sammenbrud analyse som beskrevet i trin 1.3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne protokol, var Aβ1-42 inkuberes ved 37 ° C i 7 dage før brug, fordi inkubation af Aβ1-42 var nødvendig for at producere giftige former27,28,30,35. Efter denne inkubation blev aggregerede former for Aβ observeret (figur 1A). Det er blevet rapporteret, at lignende inkubation af Aβ1-42 produceret fibril form af Aβ36. Efter behandling med denne aggregerede Aβ1-42, immunfarvning med et antistof til den giftige oligomer af Aβ35,37 blev udført og positive farvning blev opdaget på kulturperler neuroner (figur 1B). I betragtning af ovenstående producerer protokollens inkubation de giftige former for Aβ.

Flere dage var nødvendige for induktion af cytoskeletale degeneration efter Aβ eksponering. Hændelser inden cytoskeletale degeneration er uklare. Denne protokol har derfor været udviklet for yderligere at forstå de involverede mekanismer. Ved hjælp af denne protokol, blev de tidlige fænomener induceret af Aβ behandling analyseret. Kortikale neuroner var kulturperler i 4 dage. De længste neurites i kulturperler neuroner blev identificeret som axoner; disse blev bekræftet af positive immunfarvning for cytoskeletale markør, tau-1 og negative immunfarvning for dendritiske markør, MAP2 (figur 2). Efter 1 time af køretøjet behandling, havde vækst kegler spredt lamellipodia og behandles flere filopodia. Disse blev identificeret som sund vækst kegler. Omvendt 1 h af Aβ1-42 behandling førte til indskrumpet vækst kegler, som udviklede ingen lamellipodia eller filopodia. Disse blev identificeret som kollapsede vækst kegler. Sammenbrud scoringer blev beregnet som beskrevet i trin 1.3.7. Når figurer af vækst kegler var uklare, blev de elimineret fra analysen. Aβ1-42 behandling førte til en betydelig stigning i sammenbrud score, svarende til øget cytoskeletale vækst sammenbrud, i forhold til sammenbrud score af køretøjet-behandlede vækst kegler27.

Cytoskeletale vækst kegler blev observeret før og efter behandling med Aβ1-42 (figur 3). Celler blev opretholdt i den omvendte mikroskop med en fugtig atmosfære af 10% CO2 ved 37 ° C. Billeder blev taget til fange hver 5 min. Som vist i figur 3, kollapsede vækst kegler mellem 21 og 26 min. efter Aβ1-42 behandling. Vækst kegler blev udelukket fra levende celle imaging hvis de ikke beholder deres sunde form for 1 time forud for enhver behandling.

For at visualisere de tidlige effekter af Aβ1-42-behandling, blev endocytose brugt som fokus for denne analyse, fordi endocytose hæmmere kan blokere Aβ1-42-induceret vækst-kegle sammenbrud27. Endocytose blev visualiseret med et fluorescens membran sonden (dvs.., et fluorescerende farvestof, der bindes til plasma membraner og er spontant endocytosed). En tidligere undersøgelse viste, at vækst kegler ikke sammenbrud på 20 min efter Aβ1-42-behandling27; Derfor blev sund vækst kegler udvalgt af DIC imaging i køretøj - eller Aβ1-42-behandlede celler efter 20 min. Efter Aβ1-42-behandling, talrige fluorescerende membran sonde-positive puncta blev observeret i vækst kegle (figur 4). Tætheden af fluorescens membran sonde-positive puncta i vækst kegler var signifikant øget27. Dette tyder på, at Aβ1-42-induceret vækst kegle endocytose opstår før sammenbrud.

For at bekræfte rollen af endocytose, var en DNA plasmid kodning EGFP-AP180 C-terminus transfekteret i kulturperler kortikale neuroner. Celler, der udtrykker AP180 C-terminus selektivt hæmmede clathrin-medieret endocytose38,39. Hvis EGFP udtryk blev observeret på cellen organ i neuron, AP180 C-terminus blev anset for at være udtrykt ved den cytoskeletale vækst kegle af neuron. Transfektion af AP180 C-terminus blokeret Aβ1-42-induceret vækst kegle sammenbrud (figur 5)27.

Figure 1
Figur 1 : Inkubation af A B1-42 aggregater Aβ. (A) Aβ1-42 var opløses i destilleret vand ved en koncentration på 0,5 mM og inkuberes ved 37 ° C i 7 dage (efter inkubation) eller opbevares ved-30 ° C uden inkubation (ingen inkubation). Hver Aβ løsning blev fortyndet til 0.1 mM; derefter var 10 μL af hver fortyndede opløsning faldet på glas dias og dækket med coverslips. Bright-feltet billeder med skrå belysning blev fanget ved hjælp af inverteret mikroskop B. skala bar = 20 μm. (B) samlet Aβ1-42 eller køretøjet behandling på kulturperler neuroner for 4 h. Efter behandling, neuronerne var faste og immunostained for giftige Aβ oligomerer. Fluorescens billeder (rød) og lysfelt billeder med skrå belysning (grå) er vist. Skalalinjen = 20 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : A B1-42-induceret cytoskeletale vækst kegle sammenbrud. Efter Aβ1-42 - eller køretøj-behandling, neuroner var faste og immunostained for tau-1 (rød) og mikrotubulus forbundet protein 2 (MAP2, grøn). Fluorescens og differential interferens kontrast (DIC) billeder vises. Forstørrede visninger af regioner af interesse (ROI, rektangler) er vist under deres tilsvarende billeder. Hvid skala barer = 50 μm; sort skala barer = 10 μm. Dette tal er blevet ændret fra Kuboyama et al, 201527. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Levende celle imaging før og efter A B1-42 behandling. Efter 4 dage i kultur, cellerne blev overført til en inverteret mikroskop og DIC billeder blev taget til fange hver 5 min. Time-lapse billeder vises. Cifrene repræsenterer minutter: sekunder efter anvendelsen af aggregerede Aβ1-42 (endelig koncentration, 0,5 μM). Skalalinjen = 10 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Tyve minutter af A B1-42 behandling induceret endocytose. Kortikale neuroner var kulturperler i 4 dage og behandlet med en fluorescens membran sonde. Derefter, neuroner blev behandlet i 20 min. med Aβ1-42 eller køretøj. Fluorescens billeder af vækst kegler er vist. De gule stiplede linjer repræsenterer konturerne af vækst kegler. Skalalinjen = 10 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Udtryk for AP180-C terminus blokerer Aβ1-42-induceret sammenbrud. Fire dage efter Transfektion af EGFP (A, B) eller EGFP-AP180 C-terminus (C, D); Aβ1-42 (B, D) eller køretøj (A, C) blev føjet til kortikale neuroner for 1 h. DIC (øvre paneler) og fluorescens (bunden paneler) billederne er vist. Pilene indikerer væksten kegler. Skalere barer = 10 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den protokol, der er beskrevet i denne undersøgelse aktiveret observation af tidlige fænomener i cytoskeletale vækst kegler efter Aβ1-42 behandling. Aβ1-42 induceret endocytose i cytoskeletale vækst kegler indenfor 20 min, og vækst kegle sammenbrud blev observeret i 1 h af behandling. Denne endocytose var sandsynligvis medieret af clathrin. Ved hjælp af denne protokol, blev hæmning af clathrin-medieret endocytose bekræftet for at forhindre Aβ1-42-induceret vækst kegle sammenbrud og cytoskeletale degeneration i kulturperler neuroner27. Derudover svækkede hæmning af clathrin-medieret endocytose Aβ1-42-induceret cytoskeletale degeneration og hukommelse underskud i vivo27. Disse resultater viser, at clathrin-medieret endocytose er en lovende terapeutisk avenue til annonce forebyggelse.

Denne protokol blev udviklet fra sammenbrud assays til cytoskeletale vækst afskrækningsmidler, såsom semaphorin 3A og ephrin-A516,17,18,19,20. Sammenbruddet-assays har været anvendt i studier vurderer udviklingen af neuronal netværk. Jeg har vist, at denne protokol kan anvendes på patologisk analyser, især dem der involverer mekanismer af AD; en begrænsning kan dog være, at ca. 40% af væksten kegler kollapsede i sund tilstand. Denne procentsats er højere end resultaterne fra kulturperler dorsalrods ganglion neuroner, som er mere almindeligt anvendt i sammenbrud assays16,17,18,19,20. Derfor kan forskellen i celletyper være knyttet til forskelle i sammenbrud nøgletal. Skjul nøgletal fundet i denne undersøgelse var i overensstemmelse med dem, der findes i tidligere undersøgelser med normale kulturperler kortikale neuroner40,41. Desuden induceret Aβ1-42 lignende niveauer af vækst kegle sammenbrud sammenlignet med andre sammenbrud faktorer, såsom semaphorin 3A og ephrin-A527. Derfor, denne protokol gælder for kvantificeringen af Aβ1-42-induceret vækst kegle sammenbrud. Protokollens fiksering er vigtigt at opretholde formen for vækst kegler. Hvis cellerne var konventionelt fast med 4% PARAFORMALDEHYD ved stuetemperatur, mere vækst kegler kan have brudt sammen på grund af proceduren fiksering (data ikke vist). Alternativt, glutaraldehyd og fiksering buffere er tilgængelige for rigid fiksation, som tidligere beskrevet42; dog udstiller glutaraldehyd autofluorescence, som er en væsentlig hindring for fluorescens billeddannelse.

En nylig undersøgelse med den samme protokol viste at vand ekstrakt fra Radix Polygalae (rødder af Polygala tenuifolia) hæmmede Aβ1-42-induceret endocytose i kulturperler neuroner, forhindrede cytoskeletale degeneration og reduceret hukommelse underskud i en transgene musemodel af annonce31. En roman kandidat til annonce forebyggelse er blevet fundet med denne protokol. En kombination af genet Transfektion og levende celle imaging i denne protokol kan vise andre cellulære begivenheder fundet i axoner og deres terminaler, før og efter Aβ behandling, såsom Ca2 + imaging, mikrotubulus dynamik og celle vedhæftning dynamics, som er efter sigende relateret til cytoskeletale vækst43,44,45. Denne protokol kan hjælpe med at afsløre mere detaljerede mekanismer af Aβ toksicitet og kan hjælpe med at lede til forebyggelse og/eller behandling af annonce.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatteren har intet at videregive.

Acknowledgments

Dette arbejde blev delvist støttet af forskningstilskud fra JSP'ER (KAKENHI 18K 07389), Japan, Takeda Science Foundation, Japan og Kobayashi Pharmaceutical Co, Ltd, Japan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ddY mice SLC
Eight-well culture slide Falcon 354108
poly D lysine Wako 168-19041
Culture medium, Neurobasal medium Gibco 21103-049
house serum Gibco 26050-088
glucose Wako 049-31165
L-glutamine Wako 074-00522
0.05% trypsin Gibco 25300-054
DNase I Worthington DP
soybean trypsin inhibitor Gibco 17075-029
Filter with 70 µm mesh size, cell strainer Falcon 352350
B-27 supplement Gibco 17504-044
CO2 incubator Astec SCA-165DS
Amyloid β1-42 Sigma-Aldrich A9810
paraformaldehyde Wako 162-16065
sucrose  Wako 196-00015
Aqueous mounting medium, Aqua-Poly/Mount polysciences 18606-20
Inverted microscope A Carl Zeiss Axio Observer Z1  Connected with AxioCam MRm, Heating Unit XL S, CO2 Module S1, and TempModule S1
Objective Plan-Apochromat 20x Carl Zeiss 420650-9901
Objective Plan-Apochromat 63x Carl Zeiss 440762-9904
Objective, CFI Plan Apo Lambda 40X Nikon
anti-MAP2 IgG Abcam ab32454
anti-tau-1 IgG Chemicon MAB3420
anti-amyloid β antibody IBL 10379 clone 11A1
normal goat serum Wako 143-06561
bovine serum albumin Wako 010-25783
t-octylphenoxypolyethoxyethanol Wako 169-21105
goat anti-mouse IgG conjugated with AlexaFluor 594 Invitrogen A11032
goat anti-rabbit IgG conjugated with AlexaFluor 488 Invitrogen A11029
hot plate NISSIN NHP-M30N
cover glass Fisher Scientific 12-545-85
35 mm dish IWAKI 1000-035
Silicone RTV Shin-Etsu KE42T
hand punch Roper Whitney No. XX
Fluorescence membrane probe, FM1-43FX Invitrogen F35355
Ca2+- and Mg2+-free Hanks' balanced salt solution Gibco 14175-095
Transfection solution, Nucleofector solution Lonza VPG-1001
Electroporator, Nucleofector I Amaxa
Inverted microscope B Keyence BZ-X710
Image software, ImageJ NIH https://imagej.nih.gov/ij/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8 (6), 595-608 (2016).
  2. Dickson, T. C., Vickers, J. C. The morphological phenotype of beta-amyloid plaques and associated neuritic changes in Alzheimer's disease. Neuroscience. 105 (1), 99-107 (2001).
  3. Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297 (5580), 353-356 (2002).
  4. Perl, D. P. Neuropathology of Alzheimer's disease. Mount Sinai Journal of Medicine. 77 (1), 32-42 (2010).
  5. Graham, W. V., Bonito-Oliva, A., Sakmar, T. P. Update on Alzheimer's Disease Therapy and Prevention Strategies. Annual Review of Medicine. 68, 413-430 (2017).
  6. Jack, C. R. Jr, et al. Hypothetical model of dynamic biomarkers of the Alzheimer's pathological cascade. Lancet Neurology. 9 (1), 119-128 (2010).
  7. Kuboyama, T., Tohda, C., Komatsu, K. Neuritic regeneration and synaptic reconstruction induced by withanolide A. British Journal of Pharmacology. 144 (7), 961-971 (2005).
  8. Tohda, C., Urano, T., Umezaki, M., Nemere, I., Kuboyama, T. Diosgenin is an exogenous activator of 1,25D3-MARRS/Pdia3/ERp57 and improves Alzheimer's disease pathologies in 5XFAD mice. Scientific Reports. 2, 535 (2012).
  9. Jawhar, S., Trawicka, A., Jenneckens, C., Bayer, T. A., Wirths, O. Motor deficits, neuron loss, and reduced anxiety coinciding with axonal degeneration and intraneuronal Abeta aggregation in the 5XFAD mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Aging. 33 (1), e129-e140 (2012).
  10. Postuma, R. B., et al. Substrate-bound beta-amyloid peptides inhibit cell adhesion and neurite outgrowth in primary neuronal cultures. Journal of Neurochemistry. 74 (3), 1122-1130 (2000).
  11. Tohda, C., Nakada, R., Urano, T., Okonogi, A., Kuboyama, T. Kamikihi-to (KKT) rescues axonal and synaptic degeneration associated with memory impairment in a mouse model of Alzheimer's disease, 5XFAD. International Journal of Neuroscience. 121 (12), 641-648 (2011).
  12. Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nature Neuroscience. 7 (11), 1181-1183 (2004).
  13. Wirths, O., Weis, J., Kayed, R., Saido, T. C., Bayer, T. A. Age-dependent axonal degeneration in an Alzheimer mouse model. Neurobiology of Aging. 28 (11), 1689-1699 (2007).
  14. Sanchez-Varo, R., et al. Abnormal accumulation of autophagic vesicles correlates with axonal and synaptic pathology in young Alzheimer's mice hippocampus. Acta Neuropathologica. 123 (1), 53-70 (2012).
  15. Wu, H. Y., et al. Amyloid beta induces the morphological neurodegenerative triad of spine loss, dendritic simplification, and neuritic dystrophies through calcineurin activation. Journal of Neuroscience. 30 (7), 2636-2649 (2010).
  16. Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32 (6), 1013-1026 (2001).
  17. Jurney, W. M., Gallo, G., Letourneau, P. C., McLoon, S. C. Rac1-mediated endocytosis during ephrin-A2- and semaphorin 3A-induced growth cone collapse. Journal of Neuroscience. 22 (14), 6019-6028 (2002).
  18. Luo, Y., Raible, D., Raper, J. A. Collapsin: a protein in brain that induces the collapse and paralysis of neuronal growth cones. Cell. 75 (2), 217-227 (1993).
  19. Nicol, X., Muzerelle, A., Rio, J. P., Metin, C., Gaspar, P. Requirement of adenylate cyclase 1 for the ephrin-A5-dependent retraction of exuberant retinal axons. Journal of Neuroscience. 26 (3), 862-872 (2006).
  20. Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436 (7053), 1020-1024 (2005).
  21. Benes, F. M., Farol, P. A., Majocha, R. E., Marotta, C. A., Bird, E. D. Evidence for axonal loss in regions occupied by senile plaques in Alzheimer cortex. Neuroscience. 42 (3), 651-660 (1991).
  22. Masliah, E., et al. An antibody against phosphorylated neurofilaments identifies a subset of damaged association axons in Alzheimer's disease. American Journal of Pathology. 142 (3), 871-882 (1993).
  23. Zhou, F. Q., Snider, W. D. Intracellular control of developmental and regenerative axon growth. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 361 (1473), 1575-1592 (2006).
  24. Teshigawara, K., et al. A novel compound, denosomin, ameliorates spinal cord injury via axonal growth associated with astrocyte-secreted vimentin. British Journal of Pharmacology. 168 (4), 903-919 (2013).
  25. Kuboyama, T., Tohda, C., Komatsu, K. Withanoside IV and its active metabolite, sominone, attenuate A beta(25-35)-induced neurodegeneration. European Journal of Neuroscience. 23 (6), 1417-1426 (2006).
  26. Tanabe, N., Kuboyama, T., Tohda, C. Matrine Directly Activates Extracellular Heat Shock Protein 90, Resulting in Axonal Growth and Functional Recovery in Spinal Cord Injured-Mice. Frontiers in Pharmacology. 9 (446), (2018).
  27. Kuboyama, T., Lee, Y. A., Nishiko, H., Tohda, C. Inhibition of clathrin-mediated endocytosis prevents amyloid beta-induced axonal damage. Neurobiology of Aging. 36 (5), 1808-1819 (2015).
  28. Pike, C. J., Walencewicz, A. J., Glabe, C. G., Cotman, C. W. In vitro aging of beta-amyloid protein causes peptide aggregation and neurotoxicity. Brain Research. 563 (1-2), 311-314 (1991).
  29. Uchida, N., et al. Yokukansan inhibits social isolation-induced aggression and methamphetamine-induced hyperlocomotion in rodents. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 32 (3), 372-375 (2009).
  30. Pike, C. J., Burdick, D., Walencewicz, A. J., Glabe, C. G., Cotman, C. W. Neurodegeneration induced by beta-amyloid peptides in vitro: the role of peptide assembly state. Journal of Neuroscience. 13 (4), 1676-1687 (1993).
  31. Kuboyama, T., Hirotsu, K., Arai, T., Yamasaki, H., Tohda, C. Polygalae Radix Extract Prevents Axonal Degeneration and Memory Deficits in a Transgenic Mouse Model of Alzheimer's Disease. Frontiers in Pharmacology. 8, 805 (2017).
  32. Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).
  33. Arimura, N., Kaibuchi, K. Neuronal polarity: from extracellular signals to intracellular mechanisms. Nature Reviews: Neuroscience. 8 (3), 194-205 (2007).
  34. De Felice, F. G., et al. Alzheimer's disease-type neuronal tau hyperphosphorylation induced by A beta oligomers. Neurobiology of Aging. 29 (9), 1334-1347 (2008).
  35. Izuo, N., et al. Toxicity in Rat Primary Neurons through the Cellular Oxidative Stress Induced by the Turn Formation at Positions 22 and 23 of Aβ42. ACS Chemical Neuroscience. 3 (9), 674-681 (2012).
  36. Fujiwara, H., et al. Uncaria rhynchophylla, a Chinese medicinal herb, has potent antiaggregation effects on Alzheimer's beta-amyloid proteins. Journal of Neuroscience Research. 84 (2), 427-433 (2006).
  37. Murakami, K., et al. Monoclonal antibody against the turn of the 42-residue amyloid beta-protein at positions 22 and 23. ACS Chemical Neuroscience. 1 (11), 747-756 (2010).
  38. Ford, M. G., et al. Simultaneous binding of PtdIns(4,5)P2 and clathrin by AP180 in the nucleation of clathrin lattices on membranes. Science. 291 (5506), 1051-1055 (2001).
  39. Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance. Neuron. 66 (3), 370-377 (2010).
  40. Ahmed, G., et al. Draxin inhibits axonal outgrowth through the netrin receptor DCC. Journal of Neuroscience. 31 (39), 14018-14023 (2011).
  41. Brennaman, L. H., Moss, M. L., Maness, P. F. EphrinA/EphA-induced ectodomain shedding of neural cell adhesion molecule regulates growth cone repulsion through ADAM10 metalloprotease. Journal of Neurochemistry. 128 (2), 267-279 (2014).
  42. Tojima, T., et al. Attractive axon guidance involves asymmetric membrane transport and exocytosis in the growth cone. Nature Neuroscience. 10 (1), 58-66 (2007).
  43. Ooashi, N., Futatsugi, A., Yoshihara, F., Mikoshiba, K., Kamiguchi, H. Cell adhesion molecules regulate Ca2+-mediated steering of growth cones via cyclic AMP and ryanodine receptor type 3. Journal of Cell Biology. 170 (7), 1159-1167 (2005).
  44. Biswas, S., Kalil, K. The Microtubule-Associated Protein Tau Mediates the Organization of Microtubules and Their Dynamic Exploration of Actin-Rich Lamellipodia and Filopodia of Cortical Growth Cones. Journal of Neuroscience. 38 (2), 291-307 (2018).
  45. Kuboyama, T., et al. Paxillin phosphorylation counteracts proteoglycan-mediated inhibition of axon regeneration. Experimental Neurology. 248, 157-169 (2013).

Tags

Neurovidenskab spørgsmål 140 Amyloid β axon vækst kegle kollaps endocytose live celle imaging
Visualisere cytoskeletale vækst kegle sammenbrud og tidlige Amyloid β effekter i kulturperler mus neuroner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuboyama, T. Visualizing Axonal… More

Kuboyama, T. Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid β Effects in Cultured Mouse Neurons. J. Vis. Exp. (140), e58229, doi:10.3791/58229 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter