Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Aksonal büyüme koni çöküşü ve erken amiloid β sonuç kültürlü fare nöronlar içinde görüntülenmesi

Published: October 30, 2018 doi: 10.3791/58229
Automatic Translation
1
1Division of Neuromedical Science, Institute of Natural Medicine, University of Toyama

Summary

Burada amiloid-β (Aβ) beyindeki erken etkilerini araştırmak için bir protokol sunulmuştur. Bu Aβ clathrin aracılı endositoz ve aksonal büyüme koniler çöküşü indükler gösterir. İletişim kuralı erken etkileri Aβ aksonal büyüme koniler okumak yararlı ve Alzheimer hastalığı önleme kolaylaştırabilir.

Abstract

Amiloid-β (Aβ) bellek bozuklukları Alzheimer hastalığı içinde (Ah) neden olur. Tedavi gösterilen rağmen reklam hastaların beynindeki Aβ düzeyleri azaltmak için bunlar hafıza fonksiyonları geliştirmek değil. Bellek bozuklukları görünümünü önce beyinde Aβ toplar beri Aβ hedefleme zaten bellek açıkları sergileyen reklam hastaları tedavi etmek için verimsiz olabilir. Bu nedenle, aşağı akım Aβ birikimi nedeniyle sinyal reklam geliştirme önce engellenmelidir. Aβ aksonal dejenerasyon, nöronal ağlar ve bellek bozuklukları kesintiye uğraması için önde gelen neden olmaktadır. Aβ toksisite mekanizmalar üzerinde birçok çalışma olmasına rağmen kaynak Aβ toksisitesi bilinmemektedir. Kaynağını belirlemeye yardımcı olması için mikroskopi, gen transfection ve canlı hücre tarafından Aβ kültürlü nöronların aksonal büyüme koni içinde neden erken değişiklikleri öğrenmek için Imaging kullanan yeni bir iletişim kuralı öneriyoruz. Bu iletişim kuralı Aβ endositoz inhibisyonu Aβ toksisite engel olduğunu gösteren clathrin aracılı endositoz büyüme koni çöküntü, takip aksonal büyüme koni içinde indüklenen saptandı. Bu iletişim kuralı Aβ erken etkileri okumak yararlı olacaktır ve daha verimli ve önleyici reklam tedavi neden olabilir.

Introduction

Amiloid-β (Aβ) mevduat Alzheimer hastalığı (Ah) hastalarda beyin bulunur ve nöronal ağlar, bozabilir reklam1 bellek bozuklukları2,3,4' e giden kritik bir nedeni olarak kabul edilir. Birçok klinik ilaç adaylarının etkili amiloid-β (Aβ) üretim önlemek veya Aβ mevduat kaldırma gösterilmiştir. Ancak, hiçbiri reklam hastalar5işlevinde bellek iyileştirmede başarılı olması. Aβ bellek bozuklukları6başlangıcından önce beyinde yatırılır; Bu nedenle, hastaların beyinlerinin seviyelerinde Aβ azalan sergileri bellek bozuklukları etkisiz olabilir. Aβ ifade preklinik reklam hastalarda mevcuttur; Ancak, bu hastaların nadiren nöronal dejenerasyon ve bellek açıkları6ile mevcut. Aβ ifade ve bellek bozuklukları arasında bir zaman farkı vardır. Bu nedenle, reklam önlenmesi için kritik bir strateji Aβ toksisite reklam, önce bellek açıkları gelişimi erken aşamalarında sinyali engelliyor. Aβ ifade için bir bozulma yol açabilir axon dejenerasyon7,8,9,10,11,12,13, neden olmaktadır. sinir ağları ve bellek işlevinin sürekli bozulma. Birçok çalışma mekanizmaları Aβ toksisite araştırdık; Örneğin, dejenere aksonlar, reklam farelerin beyinlerinin autophagy14artış gösterilmiştir. Kalsinörin harekete geçirmek aksonal dejenerasyon Aβ kaynaklı15olası bir mekanizma olarak bildirilmiştir; Ancak, aksonal dejenerasyon doğrudan tetikleyici bilinmeyen kalır.

Bu çalışmada aksonal sonlar büyüme koniler olarak adlandırılan çöküşü odaklanır. Aksonal büyüme koniler çöküşü aksonal büyüme kovucular, semaphorin-3A ve ephrin-A516,17,18,19,gibi20neden olabilir. Çöküşü gibi distrofik aksonal sonlar hastalar21,22yılında beyinlerinde gözlenmiştir. Ayrıca, büyüme koni işleyen bir başarısızlık aksonal dejenerasyon23sebep olabilir. Ancak, ister Aβ büyüme koni Daralt indükler bilinmemektedir. Bu nedenle, bu çalışmada Aβ erken etkileri kültürlü nöronlar içinde gözlemlemek ve Aβ kaynaklı büyüme koni Daralt araştırmak için yeni bir protokol sunar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm deneyler kılavuzlarınıza uygun olarak bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları Toyama Üniversitesi Sugitani kampüsünde yapılmıştır ve hayvan bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları Sugitani kampüsünde Komitesi tarafından kabul edildi Üniversitesi, Toyama (A2014INM-1, A2017INM-1).

1. Daralt tahlil

  1. Poli-D-lizin kaplama
    1. 8-şey kültür slaytlar ile 5 μg/mL poli-D-lizin (PDL) 400 μL fosfat tamponlu tuz (PBS) kat ve onları gece 37 ° C'de kuluçkaya.
    2. PDL çözümü kaldırmak ve wells 3 kez distile su ile yıkayın.
  2. Nöron kültürü24
    1. Embriyonik gün 14 (E14) ddY fareler microscissors nöron kültürü % 12 at serum, % 0.6 glikoz ve 2 mM L-glutamin (a orta) içeren ortamda ile gelen taze izole serebral cortices kıyma. Antibiyotik eklemeyin.
      Not: Bu protokol için ddY fare kullanılır. Bu Japonya'da yaygın olarak kullanılan outbred bir yük olduğunu. Bu nöron kültürü iletişim kuralı da sıçan kortikal nöronlar7,25için uygulanabilir.
    2. 87 x g 3 dk de doku santrifüj kapasitesi.
    3. Süpernatant kaldırın. Öyleyse Pelet için 2 mL % 0.05 tripsin ekleyin ve 37 ° C'de 15 dakika kuluçkaya Her 5 dk dokunarak karıştırın.
    4. Orta A ve mix 4 mL dokunarak ekleyin.
    5. 178 x g 3 dk de doku santrifüj kapasitesi.
    6. Süpernatant kaldırmak ve ben ve 0.3 mg/mL soya tripsin inhibitörü 37 ° C'de 15 dakika PBS içinde çözünmüş 600 U/mL DNaz kurcalayarak kuluçkaya Her 5 dk dokunarak karıştırın.
    7. Kuluçka sonra dokunarak 4 mL orta A ve karışımı ekleyin.
    8. 178 x g 3 dk de doku santrifüj kapasitesi.
    9. Süpernatant kaldırma sonra orta A 4 mL ekleyin ve cilalı bir Pasteur pipet kurcalayarak triturate.
    10. 70 µm gözenek boyutu kafes triturated kurcalayarak filtre. Filtrasyon sonra bir hemasitometre hücrelerle yoğunluğunu hesaplamak.
    11. 8-şey kültür hücrelerde 0.8 x 104 hücreleri/iyi orta A ile slayt ve CO2 kuluçka 37 ° C'de % 10 CO2 oksijen atmosfere sahip proje kültür
    12. Kültür 4 h sonra nöronal kültür, % 0.6 glikoz ve 2 mM L-glutamin (orta B) içeren %2 ek bir kültür Orta'ya değiştirin.
      Not: Nöronlar saflığı yaklaşık % 75,26daha önce açıklandığı gibi oldu.
  3. Daralt tahlil27
    1. Ticari olarak elde tam uzunlukta amiloid β1-42 (Aβ1-42) 0,5 mM bir konsantrasyon, distile su içinde dağıtılması ve 37 ° C de 7 gün kuluçkaya. Kuluçka sonra toplanan Aβ1-42 çözüm kullanmak kadar-30 ° C buzlukta saklamak.
      Not: Bu kuluçka toplama ve Aβ27,28,29,30toksisite için gereklidir.
    2. Yeni orta b 100 μL Wells'le nöronal kültürünün 4 gün tedavi sonra 0.5 mikron içeren Aβ1-42 ya da araç çözüm (distile su) 1 h için toplanan.
      Not: Aβ1-42 etkileri doz bağımlı 0,1 5 mikron artmış ve27daha önce açıklandığı gibi 0.5 mikron kadar yükseldi. Aβ1-42 tedavi ne zaman 1 h için nöronal kültür313 gün sonra tarafından benzer sonuçlar görülebilmektedir.
    3. Kültür orta kaldırmak ve nöronlar sıcak tabakta 37 ° C'de 1 h için PBS içinde % 4 Sükroz içeren %4 paraformaldehyde ile sorunu hemen.
    4. Fiksasyon sonra PBS ile 3 kez nöronlar yıkayın ve bir sulu montaj orta ile mount. Montaj orta 4 ° C'de 2 – 4 gündür kuru.
    5. Her şey bir 20 X kuru objektif lens üzerinde ters bir mikroskop ile tüm alanı (7,8 x 9 mm2) yakalama.
    6. Her nöron uzun neurites aşamada 3 veya 4 olarak aksonlar, yukarıda açıklanan32,33sınıflandırmak.
    7. Büyüme koniler aşağıdaki ölçütlere göre sınıflandırmak: 1) aksonal büyüme koni lamellipodia eksik veya 2) den az üç filopodia sahip olarak kabul edilir17daha önce açıklandığı gibi büyüme koniler çöktü.
      Not: Sağlıklı büyüme koniler 0 noktası olarak attı; daraltılmış büyüme koniler 1 puan attı. Puanları hesaplanır çöküşü için her tedavi demek.

2. amiloid Beta Immunostaining

  1. Fare kortikal nöronlar 1.2 adımda anlatıldığı gibi 3 gün boyunca kültür.
  2. Tedavi ile toplanan Aβ1-42 (5 mikron) ya da araç CO2 kuluçka 37 ° C'de 4 h için.
  3. Orta çıkarmadan, her şey için PBS içinde % 4 Sükroz içeren %4 paraformaldehyde eşit bir hacmi ekleyin ve 5 min için sıcak tabakta 37 ° C'de kültür korumak.
  4. PBS %4 Sükroz içeren %4 paraformaldehyde 400 μL çözüm yerine ve 1 h için sıcak tabakta 37 ° C'de korumak. Bu fiksasyon Protokolü önceki rapor34güncellenmiştir.
  5. Nöronlar 3 kez PBS ile yıkayın.
  6. % 5 normal keçi serum PBS ile engelleyin.
  7. Nöronlar ile fare Anti-amiloid β immünoglobulin G (IgG) (1:50) ve % 1 sığır serum albümin PBS içinde 4 ° C'de gecede kuluçkaya.
  8. Nöronlar 3 kez PBS ile yıkayın.
  9. Nöronlar bir ikincil antikor (1: 400) Floresan Birleşik ve % 1 sığır serum albümin PBS içinde oda sıcaklığında 2 h için kuluçkaya.
  10. Nöronlar 3 kez PBS ile yıkayın ve bir sulu montaj orta ile mount.
  11. Ters mikroskobunun d. 40 X kuru objektif lens kullanarak floresans görüntüler ve eğik aydınlatmalı parlak alan görüntüleri yakalama

3. aksonal Immunostaining27

  1. 3 kez ile PBS nöronlar 1.3.3. adımda açıklandığı gibi kültürlü nöron fiksasyon sonra yıkayın.
  2. Nöronlar fare anti-tau-1 ile kuluçkaya IgG (1:500), tavşan Anti-Mikrotubul ilişkili protein 2 (MAP2) IgG (1:500) % 5 normal keçi serum ve %0,3 t- octylphenoxypoly-ethoxyethanol içinde PBS gecede 4 ° C'de.
  3. Nöronlar 3 kez PBS ile yıkayın.
  4. İkincil antikorlar (1: 400) Floresan Birleşik ve %0,3 t- octylphenoxypolyethoxyethanol PBS içinde 2 h için oda sıcaklığında nöronlar kuluçkaya.
  5. Nöronlar 3 kez PBS ile yıkayın ve bir sulu montaj orta kullanarak bağlayabilirsiniz.
  6. Floresan ve diferansiyel girişim kontrast (DIC) ters mikroskop A. üzerinde 20 × kuru objektif lens kullanarak çekim

4. canlı hücre27 görüntüleme

  1. Kat cam tabanlı yemekleri ile 500 μL PDL (5 μg/mL), 1.1.1. adımda açıklandığı gibi.
    Not: Bu protokol için ev yemekleri cam tabanlı kullanılmıştır. Piyasada bulunan cam tabanlı yemekleri de canlı görüntüleme için kullanılabilir. Ev yemekleri cam tabanlı aşağıdaki gibi hazırlanan: 1) yol yaklaşık 1.4 mm çapında 35-mm çanak ortasına bir el yumruk ile açın ve 2) silikon ile çanak arka cam coverslip (22 mm çapında) ekleyin.
  2. 1.1.2. adımda açıklandığı gibi plakaları distile su ile yıkama ve kortikal nöronlar, 3 x 104 hücreleri/çanak adım 1.2 açıklandığı gibi orta a cam tabanlı tabak içinde kültür.
  3. Yeni orta B 2 mL ve transferi ile Orta hücre kültürü, 4 gün değiştirdikten sonraki yemek için mikroskop A. koru % 10 CO2 37 ° C'de oksijen bir atmosferde kültür ters

5. endositoz deney

  1. Fare kortikal nöronlar 1.2 adımda anlatıldığı gibi kültür.
  2. Dört gün sonra yeni orta 20 mikron floresans membran sonda 1 dk. için içeren B 100 μL orta yerine.
  3. Pipetting tarafından 1 μL 0,05 mM toplu Aβ1-42 (son 0.5 mikron) veya araç (distile su) çözüm ve karışımı ekleyin. 20 dk için kuluçkaya.
  4. Orta kaldırmak ve wells önceden 37 ° C'ye ısıtılmış oldu iki kez orta B ile yıkayın
  5. Tamir, yıkama ve nöronlar 1.3.3 ve 1.3.4 adımlarda açıklandığı şekilde bağlayın.
  6. Floresan ve petrol objektif lens üzerinde ters mikroskop A. X 63 görüntülerle DIC yakalama
  7. Floresans membran sonda pozitif alan her sağlıklı büyüme koni yoğunluğu bir görüntü yazılımı kullanarak ölçmek.

6. Gene Transfection

  1. Kortikal nöronlar 1.2. adımda açıklandığı şekilde hazırlayın. 1.2.1-1.2.10 adımları tamamladıktan sonra 178 x g 3 dk de nöronların santrifüj kapasitesi.
  2. Süpernatant kaldırmak için Ca2 +4 mL ekleyin-ücretsiz ve Mg2 +-Hanks dengeli tuz solüsyonu (CMF-HBSS) ücretsiz ve mix pipetting tarafından.
  3. 178 x g 3 dk de hücreleri santrifüj kapasitesi.
  4. Süpernatant kaldırmak, 4 mL CMF-HBSS ve pipetting tarafından karıştırın. Daha sonra hücre yoğunluğu 1.2.10 adımda anlatıldığı gibi hesaplayın.
  5. 5 x 106 hücreler bir 1,5 mL tüp ve 1 dk. için 1,677 x g, santrifüj aktarın.
  6. Süpernatant kaldırmak, transfection çözüm eki ile 100 μL ve EGFP veya EGFP-AP180 C-terminus kodlama DNA plazmid 3 μg ekleyin ve pipetting tarafından mix.
  7. Yukarıdaki çözüm (adım 6,6) sertifikalı bir küvet aktarmak ve üreticinin protokole göre bir electroporator ile transfect.
  8. Hemen transfection sonra orta A 500 μL küvet ekleyin ve sertifikalı bir pipet ile 1.5 mL tüp çözüm aktarmak. Daha sonra hücre yoğunluğu 1.2.10 adımda anlatıldığı gibi hesaplayın.
  9. 0.8 x 104 hücreleri/iyi, bir 8-şey kültür slayda hücrelerde 1.2.11 ve 1.2.12 adımlarda açıklandığı gibi kültür.
  10. Hücre kültürü, 4 gün sonra bir çöküş tahlil 1.3 adımda anlatıldığı gibi gerçekleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kuluçka Aβ1-42 toksik formları27,28,30,35üretmek için ihtiyaç vardı çünkü bu protokol için kullanmadan, 7 gün için 37 ° C'de Aβ1-42 inkübe. Bu kuluçka sonra Aβ toplanan formları (Şekil 1A) tespit edildi. Bu Aβ1-42 benzer kuluçka Aβ36fibriller şeklinde üretilen bildirilmiştir. Bu toplanan Aβ1-42 ile tedavi sonra immunostaining bir antikor için toksik oligomer Aβ35,37 ile gerçekleştirilmiş ve olumlu boyama kültürlü nöronlar (Şekil 1B) tespit edildi. Yukarıdaki göz önüne alındığında, bu kuluçka Protokolü Aβ toksik formları üretir.

Birkaç gün Aβ maruz kaldıktan sonra aksonal dejenerasyon indüksiyon için gerekli idi. Aksonal dejenerasyon öncesi olaylar belirsiz kalır. Bu nedenle, bu iletişim kuralı daha mekanizmaları dahil anlamak için geliştirilmiştir. Bu iletişim kuralını kullanan, Aβ tedavi tarafından indüklenen erken olayları analiz edildi. Kortikal nöronlar 4 gündür kültürlü. Kültürlü nöronlar içinde en uzun neurites akson tespit edilmiştir; Bunlar aksonal marker, tau-1 ve dendritik işaretçiyi MAP2 için negatif immunostaining için pozitif immunostaining tarafından teyit edildi (Şekil 2). Araç tedavi 1 saat sonra büyüme koni lamellipodia yaymak ve birkaç filopodia işlenen vardı. Bunlar sağlıklı büyüme koniler olarak tespit edilmiştir. Diğer taraftan, 1 h Aβ1-42 tedavi hiçbir lamellipodia veya filopodia geliştirilen küçülmüş büyüme koni için yol açtı. Bunlar daraltılmış büyüme koniler olarak tespit edilmiştir. Daralt puanları 1.3.7 adımda anlatıldığı gibi hesaplanır. Büyüme koniler şekilleri belli iken, onlar analiz elendi. Aβ1-42 tedavi Daralt puanı, artan aksonal büyüme Daralt, araç tedavi büyüme koniler27Daralt puanı karşılaştırıldığında karşılık gelen önemli bir artış yol açtı.

Aksonal büyüme koni Aβ1-42 (Şekil 3) ile işlemden önce ve sonra tespit edildi. Hücreleri oksijen atmosferini 37 ° C'de % 10 CO2 ters mikroskopla saklanır Görüntüleri her 5 dk ele geçirildi. Şekil 3' te gösterildiği gibi 21 ve 26 min Aβ1-42 tedaviden sonra arasında büyüme koniler çöktü. Büyüme koniler onlar sağlıklı şekilleri için herhangi bir tedavi öncesinde 1 h korumak değil Eğer canlı hücre Imaging dışlandı.

Aβ1-42-tedavinin erken etkilerini görselleştirmek için endositoz endositoz inhibitörleri Aβ1 42 bağlı büyüme-koni Daralt27engelleyebilir çünkü bu analizi, odak noktası olarak kullanılmıştır. Endositoz ile floresan membran probe görselleştirildiği (i.e., plazma membran için bağlar ve kendiliğinden endocytosed bir floresan boya). Bir önceki çalışmada büyüme koniler 20 dk sonra Aβ1-42-tedavi27daralmıyor gösterdi; Bu nedenle, sağlıklı büyüme koni hücreleri 20 dk sonra Imaging araç veya Aβ1-42-tedavi edilen içinde DIC tarafından seçildi. Aβ1-42-tedavi çok sayıda floresan membran sonda pozitif puncta büyüme koni (Şekil 4) gözlendi. Floresans membran sonda pozitif puncta büyüme koni içinde yoğunluğu önemli ölçüde artış27oldu. Bu o Aβ1 42 bağlı büyüme koni endositoz Daralt önce oluşur göstermektedir.

Endositoz rolü onaylamak için EGFP-AP180 C-terminus kodlama bir DNA plazmid kültürlü kortikal nöronların transfected. AP180 C-terminus seçmeli olarak ifade hücreleri clathrin aracılı endositoz38,39inhibe. EGFP ifade nöron hücre vücutta gözlenen, AP180 C-terminus nöron aksonal büyüme Koni'de ifade kabul edildi. Transfection AP180 C-terminus, Aβ1-42-indüklenen büyüme koni Daralt (Şekil 5)27engelledi.

Figure 1
Resim 1 : A kuluçka Β1-42 toplar Aβ. (A)Aβ1-42 0,5 mM bir konsantrasyon, distile su içinde çözünmüş ve 7 gün (kuluçka sonra) için 37 ° C'de inkübe veya kuluçka (kuluçka) olmadan-30 ° C'de depolanan. Her Aβ çözüm için 0,1 mM düşürülmüştü; o zaman, seyreltilmiş çözeltinin her 10 μL cam slaytlar üzerine düştü ve coverslips ile kaplı. Eğik aydınlatmalı parlak-alan görüntüleri ters mikroskop B. ölçek kullanarak yakalanan edildi çubuk = 20 mikron. (B) tedavisi için 4 h kültürlü nöronlar üzerinde toplanan Aβ1-42 ya da araç. Tedavi, nöronlar sabit ve toksik Aβ reaksiyonlar için immunostained. Floresan (kırmızı) görüntüleri ve alan parlak görüntüler eğik aydınlatma (gri) ile gösterilir. Ölçek çubuğu 20 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : A Β1 42 indüklenen aksonal büyüme koni Daralt. Sonra Aβ1-42 - veya araç-tedavi, nöronlar tespit edildi ve immunostained tau-1 (kırmızı) ve Mikrotubul ilişkili protein 2 (MAP2, yeşil). Floresan ve diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntüleri gösterilir. Faiz (yatırım getirisi, dikdörtgenler) bölgelerinden büyütülmüş sayısı karşılık gelen görüntüleri gösterilmiştir. Beyaz ölçek çubukları 50 mikron; = siyah ölçek çubukları 10 mikron =. Bu rakam üzerinden Kuboyama ark, 201527değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Hücre görüntüleme önce ve sonra A live Β1-42 tedavisi. Kültür 4 gün sonra hücre için ters bir mikroskop transfer edildi ve DIC görüntüleri Yakalanan edildi her 5 dk. hızlandırılmış görüntü gösterilir. Basamak toplanan Aβ1-42 (son konsantrasyonu, 0.5 mikron) uygulamadan sonra dakika: saniye temsil eder. Ölçek çubuğu 10 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : A yirmi dakika Β1-42 tedavi indüklenen endositoz. Kortikal nöronlar 4 gündür kültürlü ve floresan membran sonda ile tedavi. O zaman, nöronlar için 20 min Aβ1-42 ya da araç ile tedavi edildi. Büyüme koniler floresans görüntüleri gösterilir. Sarı noktalı çizgiler büyüme koniler anahatlarını gösterir. Ölçek çubuğu 10 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : AP180-C terminus ifade engeller Aβ1-42-indüklenen Daralt. Dört gün sonra transfection EGFP (A, B) veya EGFP-AP180 C-terminus (C, D); Aβ1-42 (B, D) ya da araç (A, C) 1 h. DIC (üst panelleri) için kortikal nöronlar eklendi ve floresan (alt paneller) görüntüleri gösterilir. Oklar büyüme koni gösterir. Ölçek çubukları 10 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çalışmada açıklanan protokol aksonal büyüme koniler erken olayları gözlem Aβ1-42 tedaviden sonra etkin. Aβ1-42 endositoz aksonal büyüme koni içinde 20 dk içinde indüklenen ve büyüme koni Daralt tedavinin içinde 1 h gözlendi. Bu endositoz muhtemelen clathrin tarafından aracılık. Bu iletişim kuralını kullanarak, clathrin-aracılı endositoz inhibisyonu Aβ1 42 bağlı büyüme koni çöküşü ve kültürlü nöronlar27aksonal dejenerasyon önlemek için doğrulandı. Ayrıca, clathrin-aracılı endositoz inhibisyonu Aβ1-42-indüklenen aksonal dejenerasyon ve bellek açıkları vivo içinde27zayıflatılmış. Bu sonuçlar bu clathrin aracılı endositoz reklam önleme için umut verici bir terapötik cadde belirtin.

Bu iletişim kuralı geliştirilmiştir deneyleri aksonal büyüme kovucular, 3A ve ephrin-A516,17,18,19,20semaphorin gibi için daraltma. Daralt deneyleri nöronal ağlar gelişimi değerlendirme çalışmalarında kullanılmıştır. Bu iletişim kuralı patolojik analizleri için özellikle de reklam mekanizmaları içeren uygulanabilir göstermiştir; Ancak, bir sınırlama büyüme koniler yaklaşık % 40 ın sağlıklı durumuna daraltılmış olabilir. Bu yüzde, daha yaygın olarak kullanılan kültürlü dorsal kök gangliyon nöronlar sonuçlarından deneyleri16,17,18,19,20daraltmak daha yüksektir. Bu nedenle, hücre tipleri arasındaki farkı Daralt oranları farklılıkları bağlantılı. Bu çalışmada bulundu Daralt oranları normal kültürlü kortikal nöronlar40,41ile önceki çalışmalarda bulunanlar ile tutarlı edildi. Ayrıca, Aβ1-42 3A ve ephrin-A527semaphorin gibi diğer Daralt faktörler ile karşılaştırıldığında büyüme koni çöküşün benzer düzeyde indüklenen. Bu nedenle, bu iletişim kuralını Aβ1 42 bağlı büyüme koni Daralt miktar için geçerlidir. Bu fiksasyon Protokolü büyüme koni şeklini korumak önemlidir. Eğer hücreleri geleneksel oda sıcaklığında %4 paraformaldehyde ile sabit, daha fazla büyüme koniler fiksasyon yordam (veri gösterilmez) nedeniyle çökmüş olabilir. Alternatif olarak, oxazolidin ve fiksasyon arabellekleri yukarıda açıklanan42rijit fiksasyonu için kullanılabilir; Ancak, oxazolidin autofluorescence, floresans görüntüleme için önemli bir engeli olan sergiler.

Aynı iletişim kuralını ile yapılan bir çalışmada Radix Polygalae ( Polygala tenuifoliaköklerinin) su ayıklamak Aβ1-42-indüklenen endositoz kültürlü nöronlar içinde inhibe, aksonal dejenerasyon engelledi ve bellek açıkları azaltılmış gösterdi bir Reklam31transgenik fare modeli. Reklam önleme için yeni bir aday bu iletişim kuralı ile buldu. Gen transfection ve bu protokol görüntülemede canlı hücre akson ve onların terminalleri Ca2 + görüntüleme, Mikrotubul dynamics ve hücre adezyon dinamikleri, gibi Aβ işlemden önce ve sonra bulunan diğer hücresel olaylar göstermek olabilir hangi Bildirildiğine göre ilgili aksonal büyüme43,44,45vardır. Bu iletişim kuralı Aβ toksisitesi daha ayrıntılı mekanizmaları açığa yardımcı ve önleme ve/veya reklam tedavisinde yol yardımcı olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazar ifşa etmek hiçbir şey vardır.

Acknowledgments

Bu eser kısmen JSP'ler gelen araştırma hibe tarafından desteklenmiştir (KAKENHI 18K 07389), Japonya, Takeda Bilim Vakfı, Japonya ve Kobayashi ilaç Co., Ltd., Japonya.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ddY mice SLC
Eight-well culture slide Falcon 354108
poly D lysine Wako 168-19041
Culture medium, Neurobasal medium Gibco 21103-049
house serum Gibco 26050-088
glucose Wako 049-31165
L-glutamine Wako 074-00522
0.05% trypsin Gibco 25300-054
DNase I Worthington DP
soybean trypsin inhibitor Gibco 17075-029
Filter with 70 µm mesh size, cell strainer Falcon 352350
B-27 supplement Gibco 17504-044
CO2 incubator Astec SCA-165DS
Amyloid β1-42 Sigma-Aldrich A9810
paraformaldehyde Wako 162-16065
sucrose  Wako 196-00015
Aqueous mounting medium, Aqua-Poly/Mount polysciences 18606-20
Inverted microscope A Carl Zeiss Axio Observer Z1  Connected with AxioCam MRm, Heating Unit XL S, CO2 Module S1, and TempModule S1
Objective Plan-Apochromat 20x Carl Zeiss 420650-9901
Objective Plan-Apochromat 63x Carl Zeiss 440762-9904
Objective, CFI Plan Apo Lambda 40X Nikon
anti-MAP2 IgG Abcam ab32454
anti-tau-1 IgG Chemicon MAB3420
anti-amyloid β antibody IBL 10379 clone 11A1
normal goat serum Wako 143-06561
bovine serum albumin Wako 010-25783
t-octylphenoxypolyethoxyethanol Wako 169-21105
goat anti-mouse IgG conjugated with AlexaFluor 594 Invitrogen A11032
goat anti-rabbit IgG conjugated with AlexaFluor 488 Invitrogen A11029
hot plate NISSIN NHP-M30N
cover glass Fisher Scientific 12-545-85
35 mm dish IWAKI 1000-035
Silicone RTV Shin-Etsu KE42T
hand punch Roper Whitney No. XX
Fluorescence membrane probe, FM1-43FX Invitrogen F35355
Ca2+- and Mg2+-free Hanks' balanced salt solution Gibco 14175-095
Transfection solution, Nucleofector solution Lonza VPG-1001
Electroporator, Nucleofector I Amaxa
Inverted microscope B Keyence BZ-X710
Image software, ImageJ NIH https://imagej.nih.gov/ij/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8 (6), 595-608 (2016).
  2. Dickson, T. C., Vickers, J. C. The morphological phenotype of beta-amyloid plaques and associated neuritic changes in Alzheimer's disease. Neuroscience. 105 (1), 99-107 (2001).
  3. Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297 (5580), 353-356 (2002).
  4. Perl, D. P. Neuropathology of Alzheimer's disease. Mount Sinai Journal of Medicine. 77 (1), 32-42 (2010).
  5. Graham, W. V., Bonito-Oliva, A., Sakmar, T. P. Update on Alzheimer's Disease Therapy and Prevention Strategies. Annual Review of Medicine. 68, 413-430 (2017).
  6. Jack, C. R. Jr, et al. Hypothetical model of dynamic biomarkers of the Alzheimer's pathological cascade. Lancet Neurology. 9 (1), 119-128 (2010).
  7. Kuboyama, T., Tohda, C., Komatsu, K. Neuritic regeneration and synaptic reconstruction induced by withanolide A. British Journal of Pharmacology. 144 (7), 961-971 (2005).
  8. Tohda, C., Urano, T., Umezaki, M., Nemere, I., Kuboyama, T. Diosgenin is an exogenous activator of 1,25D3-MARRS/Pdia3/ERp57 and improves Alzheimer's disease pathologies in 5XFAD mice. Scientific Reports. 2, 535 (2012).
  9. Jawhar, S., Trawicka, A., Jenneckens, C., Bayer, T. A., Wirths, O. Motor deficits, neuron loss, and reduced anxiety coinciding with axonal degeneration and intraneuronal Abeta aggregation in the 5XFAD mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Aging. 33 (1), e129-e140 (2012).
  10. Postuma, R. B., et al. Substrate-bound beta-amyloid peptides inhibit cell adhesion and neurite outgrowth in primary neuronal cultures. Journal of Neurochemistry. 74 (3), 1122-1130 (2000).
  11. Tohda, C., Nakada, R., Urano, T., Okonogi, A., Kuboyama, T. Kamikihi-to (KKT) rescues axonal and synaptic degeneration associated with memory impairment in a mouse model of Alzheimer's disease, 5XFAD. International Journal of Neuroscience. 121 (12), 641-648 (2011).
  12. Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nature Neuroscience. 7 (11), 1181-1183 (2004).
  13. Wirths, O., Weis, J., Kayed, R., Saido, T. C., Bayer, T. A. Age-dependent axonal degeneration in an Alzheimer mouse model. Neurobiology of Aging. 28 (11), 1689-1699 (2007).
  14. Sanchez-Varo, R., et al. Abnormal accumulation of autophagic vesicles correlates with axonal and synaptic pathology in young Alzheimer's mice hippocampus. Acta Neuropathologica. 123 (1), 53-70 (2012).
  15. Wu, H. Y., et al. Amyloid beta induces the morphological neurodegenerative triad of spine loss, dendritic simplification, and neuritic dystrophies through calcineurin activation. Journal of Neuroscience. 30 (7), 2636-2649 (2010).
  16. Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32 (6), 1013-1026 (2001).
  17. Jurney, W. M., Gallo, G., Letourneau, P. C., McLoon, S. C. Rac1-mediated endocytosis during ephrin-A2- and semaphorin 3A-induced growth cone collapse. Journal of Neuroscience. 22 (14), 6019-6028 (2002).
  18. Luo, Y., Raible, D., Raper, J. A. Collapsin: a protein in brain that induces the collapse and paralysis of neuronal growth cones. Cell. 75 (2), 217-227 (1993).
  19. Nicol, X., Muzerelle, A., Rio, J. P., Metin, C., Gaspar, P. Requirement of adenylate cyclase 1 for the ephrin-A5-dependent retraction of exuberant retinal axons. Journal of Neuroscience. 26 (3), 862-872 (2006).
  20. Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436 (7053), 1020-1024 (2005).
  21. Benes, F. M., Farol, P. A., Majocha, R. E., Marotta, C. A., Bird, E. D. Evidence for axonal loss in regions occupied by senile plaques in Alzheimer cortex. Neuroscience. 42 (3), 651-660 (1991).
  22. Masliah, E., et al. An antibody against phosphorylated neurofilaments identifies a subset of damaged association axons in Alzheimer's disease. American Journal of Pathology. 142 (3), 871-882 (1993).
  23. Zhou, F. Q., Snider, W. D. Intracellular control of developmental and regenerative axon growth. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 361 (1473), 1575-1592 (2006).
  24. Teshigawara, K., et al. A novel compound, denosomin, ameliorates spinal cord injury via axonal growth associated with astrocyte-secreted vimentin. British Journal of Pharmacology. 168 (4), 903-919 (2013).
  25. Kuboyama, T., Tohda, C., Komatsu, K. Withanoside IV and its active metabolite, sominone, attenuate A beta(25-35)-induced neurodegeneration. European Journal of Neuroscience. 23 (6), 1417-1426 (2006).
  26. Tanabe, N., Kuboyama, T., Tohda, C. Matrine Directly Activates Extracellular Heat Shock Protein 90, Resulting in Axonal Growth and Functional Recovery in Spinal Cord Injured-Mice. Frontiers in Pharmacology. 9 (446), (2018).
  27. Kuboyama, T., Lee, Y. A., Nishiko, H., Tohda, C. Inhibition of clathrin-mediated endocytosis prevents amyloid beta-induced axonal damage. Neurobiology of Aging. 36 (5), 1808-1819 (2015).
  28. Pike, C. J., Walencewicz, A. J., Glabe, C. G., Cotman, C. W. In vitro aging of beta-amyloid protein causes peptide aggregation and neurotoxicity. Brain Research. 563 (1-2), 311-314 (1991).
  29. Uchida, N., et al. Yokukansan inhibits social isolation-induced aggression and methamphetamine-induced hyperlocomotion in rodents. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 32 (3), 372-375 (2009).
  30. Pike, C. J., Burdick, D., Walencewicz, A. J., Glabe, C. G., Cotman, C. W. Neurodegeneration induced by beta-amyloid peptides in vitro: the role of peptide assembly state. Journal of Neuroscience. 13 (4), 1676-1687 (1993).
  31. Kuboyama, T., Hirotsu, K., Arai, T., Yamasaki, H., Tohda, C. Polygalae Radix Extract Prevents Axonal Degeneration and Memory Deficits in a Transgenic Mouse Model of Alzheimer's Disease. Frontiers in Pharmacology. 8, 805 (2017).
  32. Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).
  33. Arimura, N., Kaibuchi, K. Neuronal polarity: from extracellular signals to intracellular mechanisms. Nature Reviews: Neuroscience. 8 (3), 194-205 (2007).
  34. De Felice, F. G., et al. Alzheimer's disease-type neuronal tau hyperphosphorylation induced by A beta oligomers. Neurobiology of Aging. 29 (9), 1334-1347 (2008).
  35. Izuo, N., et al. Toxicity in Rat Primary Neurons through the Cellular Oxidative Stress Induced by the Turn Formation at Positions 22 and 23 of Aβ42. ACS Chemical Neuroscience. 3 (9), 674-681 (2012).
  36. Fujiwara, H., et al. Uncaria rhynchophylla, a Chinese medicinal herb, has potent antiaggregation effects on Alzheimer's beta-amyloid proteins. Journal of Neuroscience Research. 84 (2), 427-433 (2006).
  37. Murakami, K., et al. Monoclonal antibody against the turn of the 42-residue amyloid beta-protein at positions 22 and 23. ACS Chemical Neuroscience. 1 (11), 747-756 (2010).
  38. Ford, M. G., et al. Simultaneous binding of PtdIns(4,5)P2 and clathrin by AP180 in the nucleation of clathrin lattices on membranes. Science. 291 (5506), 1051-1055 (2001).
  39. Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance. Neuron. 66 (3), 370-377 (2010).
  40. Ahmed, G., et al. Draxin inhibits axonal outgrowth through the netrin receptor DCC. Journal of Neuroscience. 31 (39), 14018-14023 (2011).
  41. Brennaman, L. H., Moss, M. L., Maness, P. F. EphrinA/EphA-induced ectodomain shedding of neural cell adhesion molecule regulates growth cone repulsion through ADAM10 metalloprotease. Journal of Neurochemistry. 128 (2), 267-279 (2014).
  42. Tojima, T., et al. Attractive axon guidance involves asymmetric membrane transport and exocytosis in the growth cone. Nature Neuroscience. 10 (1), 58-66 (2007).
  43. Ooashi, N., Futatsugi, A., Yoshihara, F., Mikoshiba, K., Kamiguchi, H. Cell adhesion molecules regulate Ca2+-mediated steering of growth cones via cyclic AMP and ryanodine receptor type 3. Journal of Cell Biology. 170 (7), 1159-1167 (2005).
  44. Biswas, S., Kalil, K. The Microtubule-Associated Protein Tau Mediates the Organization of Microtubules and Their Dynamic Exploration of Actin-Rich Lamellipodia and Filopodia of Cortical Growth Cones. Journal of Neuroscience. 38 (2), 291-307 (2018).
  45. Kuboyama, T., et al. Paxillin phosphorylation counteracts proteoglycan-mediated inhibition of axon regeneration. Experimental Neurology. 248, 157-169 (2013).

Tags

Neuroscience sayı: 140 amiloid β akson büyüme koni Daralt endositoz canlı hücre görüntüleme
Aksonal büyüme koni çöküşü ve erken amiloid β sonuç kültürlü fare nöronlar içinde görüntülenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuboyama, T. Visualizing Axonal… More

Kuboyama, T. Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid β Effects in Cultured Mouse Neurons. J. Vis. Exp. (140), e58229, doi:10.3791/58229 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter