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Neuroscience

visualizing Axonal विकास शंकु पतन और जल्दी Amyloid β प्रभाव में कल्चरल माउस न्यूरॉन्स

Published: October 30, 2018 doi: 10.3791/58229
Automatic Translation
1
1Division of Neuromedical Science, Institute of Natural Medicine, University of Toyama

Summary

यहां मस्तिष्क में amyloid-β (Aβ) के प्रारंभिक प्रभावों की जांच करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है । यह पता चलता है कि Aβ clathrin मध्यस्थता endocytosis और axonal विकास शंकु के पतन लाती है । प्रोटोकॉल axonal विकास शंकु पर Aβ के प्रारंभिक प्रभाव का अध्ययन करने में उपयोगी है और अल्जाइमर रोग की रोकथाम की सुविधा हो सकती है ।

Abstract

Amyloid-β (Aβ) अल्जाइमर रोग (AD) में स्मृति हानि का कारण बनता है । हालांकि चिकित्सकीय विज्ञापन रोगियों के दिमाग में Aβ स्तर को कम करने के लिए दिखाया गया है, इन स्मृति कार्यों में सुधार नहीं है । स्मृति विकलांगता की उपस्थिति से पहले मस्तिष्क में Aβ समुच्चय के बाद से, लक्ष्यीकरण Aβ विज्ञापन रोगियों जो पहले से ही स्मृति घाटे प्रदर्शन के इलाज के लिए अक्षम हो सकता है । इसलिए, बहाव Aβ जमाव के कारण संकेत विज्ञापन विकास से पहले अवरुद्ध किया जाना चाहिए । Aβ axonal अध..., न्यूरॉन नेटवर्क और स्मृति हानि के विघटन के लिए अग्रणी लाती है. हालांकि वहां Aβ विषाक्तता के तंत्र पर कई अध्ययन कर रहे हैं, Aβ विषाक्तता के स्रोत अज्ञात रहता है । मदद करने के लिए स्रोत की पहचान, हम एक उपंयास प्रोटोकॉल है कि माइक्रोस्कोप का उपयोग करता है, जीन अभिकर्मक, और जीवित सेल इमेजिंग जल्दी Aβ की वजह से axonal विकास शंकु में कल्चरल न्यूरॉन्स के कारण परिवर्तन की जांच का प्रस्ताव । इस प्रोटोकॉल से पता चला कि Aβ प्रेरित clathrin विकास शंकु पतन के बाद axonal विकास शंकु में मध्यस्थता endocytosis, प्रदर्शन endocytosis की है कि निषेध Aβ विषाक्तता रोकता है । इस प्रोटोकॉल Aβ के प्रारंभिक प्रभाव का अध्ययन करने में उपयोगी हो जाएगा और अधिक कुशल और preventative विज्ञापन उपचार के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।

Introduction

Amyloid-β (Aβ) जमा अल्जाइमर रोग (ad) के साथ रोगियों के मस्तिष्क में पाए जाते हैं और1 विज्ञापन का एक महत्वपूर्ण कारण माना जाता है कि न्यूरॉन नेटवर्क को बाधित, स्मृति हानि के लिए अग्रणी2,3,4. कई नैदानिक दवा उंमीदवारों को प्रभावी ढंग से रोकने के लिए दिखाया गया है amyloid-β (Aβ) उत्पादन या Aβ जमा हटा दें । हालांकि, कोई भी विज्ञापन रोगियों5में स्मृति समारोह में सुधार लाने में सफल रहा है । Aβ पहले से ही मस्तिष्क में जमा है स्मृति दोष6की शुरुआत करने से पहले; इसलिए, स्मृति हानियों का प्रदर्शन रोगियों के दिमाग में Aβ के स्तर को कम करने अप्रभावी हो सकता है । Aβ साठा नैदानिक विज्ञापन रोगियों में मौजूद है; हालांकि, इन रोगियों को शायद ही कभी न्यूरॉन अध-पतन और स्मृति6घाटे के साथ मौजूद. Aβ जमाव और स्मृति हानि के बीच एक समय अंतराल है । इसलिए, विज्ञापन की रोकथाम के लिए एक महत्वपूर्ण रणनीति Aβ विषाक्तता विज्ञापन के प्रारंभिक दौर के दौरान संकेत, स्मृति घाटे के विकास से पहले अवरुद्ध है । Aβ जमाव axon अध: पतन7,8,9,10,11,12,13है, जो एक व्यवधान के लिए नेतृत्व कर सकते है लाती है तंत्रिका नेटवर्क और स्मृति समारोह के स्थाई हानि । कई अध्ययनों से Aβ विषाक्तता के तंत्र की जांच की है; उदाहरण के लिए, विज्ञापन चूहों दिमाग के पतित axons14autophagy वृद्धि हुई है दिखाया गया है । Calcineurin सक्रियण Aβ-प्रेरित axonal अध15के एक संभावित तंत्र के रूप में सूचित किया गया है; हालांकि, axonal अध कि सीधा ट्रिगर अज्ञात रहता है ।

इस अध्ययन axonal अंत विकास शंकु कहा जाता है के पतन पर केंद्रित है । axonal विकास शंकु के पतन जैसे semaphorin-3 ए और ephrin-A516,17,18,19,20के रूप में axonal विकास से बचाने वाली क्रीम की वजह से हो सकता है । पतन अपक्षयी axonal अंत की तरह विज्ञापन रोगियों21,22के दिमाग में मनाया गया है । इसके अतिरिक्त, विकास शंकु कार्य की विफलता axonal अध23भड़काने कर सकते हैं । हालांकि, यह अज्ञात है कि क्या Aβ विकास शंकु पतन लाती है । इसलिए, इस अध्ययन के एक उपंयास प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने के लिए Aβ के प्रारंभिक प्रभाव का निरीक्षण करने के लिए प्रसंस्कृत ंयूरॉंस में और Aβ-प्रेरित विकास शंकु पतन की जांच ।

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Protocol

सभी प्रयोगों की देखभाल और टोयामा विश्वविद्यालय के Sugitani परिसर में प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया और पशु देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के Sugitani परिसर में उपयोग के लिए समिति द्वारा अनुमोदित किया गया यूनिवर्सिटी ऑफ टोयामा (A2014INM-1, A2017INM-1) ।

1. संक्षिप्त परख

  1. पाली-डी-lysine कोटिंग
    1. कोट 8-अच्छी तरह से संस्कृति स्लाइड के साथ ४०० μL के 5 μg/एमएल पाली-डी-lysine (PDL) फॉस्फेट में बफर खारा (पंजाब) और उन्हें ३७ ° c रातोंरात पर मशीन ।
    2. PDL समाधान निकालें और कुएं को आसुत जल से 3 बार धोएं ।
  2. ंयूरॉन संस्कृति24
    1. भ्रूण दिवस 14 (E14) ddY चूहों में microscissors के साथ ंयूरॉन संस्कृति मध्यम से 12% घोड़ा सीरम, ०.६% ग्लूकोज, और 2 मिमी एल-glutamine (मध्यम A) से ताजा पृथक सेरेब्रल cortices कीमा । एंटीबायोटिक्स न डालें ।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में, ddY माउस का उपयोग किया जाता है । यह एक नस्ल आमतौर पर जापान में इस्तेमाल किया तनाव है । इस ंयूरॉन संस्कृति प्रोटोकॉल भी चूहे cortical ंयूरॉंस के लिए आवेदन किया जा सकता है7,25।
    2. 3 मिनट के लिए ८७ x g पर ऊतकों केंद्रापसारक ।
    3. supernatant निकालें । तो गोली के लिए, ०.०५% trypsin के 2 मिलीलीटर जोड़ सकते है और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए मशीन । हर 5 मिनट दोहन द्वारा मिक्स ।
    4. दोहन द्वारा मध्यम एक और मिश्रण के 4 मिलीलीटर जोड़ें ।
    5. 3 मिनट के लिए १७८ x g पर ऊतकों केंद्रापसारक ।
    6. supernatant निकालें, और ६०० U/एमएल DNase मैं और ०.३ मिलीग्राम/एमएल सोयाबीन trypsin अवरोधक के साथ ऊतकों मशीन 15 मिनट के लिए पंजाब में भंग ३७ ° c । हर 5 मिनट दोहन द्वारा मिक्स ।
    7. मशीन के बाद, दोहन से मध्यम एक और मिश्रण के 4 मिलीलीटर जोड़ें ।
    8. 3 मिनट के लिए १७८ x g पर ऊतकों केंद्रापसारक ।
    9. supernatant को हटाने के बाद, मध्यम a के 4 मिलीलीटर जोड़ें और एक पॉलिश पाश्चर पिपेट के साथ ऊतकों को triturate ।
    10. एक ७० µm ताकना आकार मेष के साथ triturated ऊतकों फिल्टर । निस्पंदन के बाद, एक hemocytometer के साथ कोशिकाओं के घनत्व की गणना ।
    11. संस्कृति 8 में ०.८ x 104 कोशिकाओं पर अच्छी तरह से संस्कृति स्लाइड में कोशिकाओं के माध्यम से एक और उंहें बनाए रखने के साथ एक सह2 मशीन में 10% co2 की humidified वातावरण के साथ ३७ ° c ।
    12. संवर्धन के 4 ज के बाद, संस्कृति माध्यम एक ंयूरॉन संस्कृति, ०.६% ग्लूकोज, और 2 मिमी L-glutamine (मध्यम बी) के लिए 2% पूरक शामिल करने की जगह ।
      नोट: न्यूरॉन्स की शुद्धता लगभग ७५% थी, जैसा कि पहले वर्णित26.
  3. संक्षिप्त परख27
    1. भंग वाणिज्यिक पूर्ण लंबाई amyloid β 1-42 (aβ 1-42) आसुत जल में ०.५ मिमी की एकाग्रता में और 7 दिनों के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन । मशीन के बाद, उपयोग जब तक एक-30 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में एकत्रित aβ 1-42 समाधान की दुकान ।
      नोट: यह मशीन Aβ27,28,29,30के एकत्रीकरण और विषाक्तता के लिए आवश्यक है ।
    2. 4 दिनों के बाद, नए माध्यम बी के १०० μL के साथ कुओं का इलाज, 1 एच के लिए ०.५ माइक्रोन एग्रीगेट aβ 1-42 या वाहन समाधान (आसुत जल) युक्त ।
      नोट: aβ 1-42 के प्रभाव थे खुराक-निर्भर ०.१ से 5 माइक्रोन से बढ़ गई, और पहले27वर्णित के रूप में ०.५ माइक्रोन पर नुकीला. इसी तरह के परिणाम देखा जा सकता है जब aβ 1-42 उपचार के लिए 1 ज के लिए 3 दिन के बाद ंयूरॉन संस्कृति31।
    3. संस्कृति माध्यम निकालें और तुरंत 4% सुक्रोज में 1 ज के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली के लिए पंजाब में 4% paraformaldehyde युक्त के साथ ंयूरॉंस को ठीक ।
    4. निर्धारण के बाद, पंजाबियों के साथ ंयूरॉंस 3 बार धोने और उंहें एक जलीय बढ़ते मध्यम के साथ माउंट । 2-4 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ते मध्यम सूखी ।
    5. पूरे क्षेत्र पर कब्जा (७.८ x 9 मिमी2) एक औंधा माइक्रोस्कोप पर एक 20X सूखी उद्देश्य लेंस के साथ एक अच्छी तरह से ।
    6. axons के रूप में 3 या 4 चरण में प्रत्येक ंयूरॉन के सबसे लंबे समय तक neurites वर्गीकृत, के रूप में पहले वर्णित३२,३३।
    7. निंनलिखित मानदंडों के अनुसार विकास शंकु वर्गीकृत: 1) axonal विकास शंकु कमी lamellipodia या 2) से कम तीन filopodia रखने माना जाता है ढह विकास शंकु, के रूप में पहले17वर्णित है ।
      नोट: स्वस्थ विकास शंकु 0 बिंदु के रूप में बनाए जाते हैं; ढह विकास शंकु 1 बिंदु के रूप में रन बनाए हैं । मतलब संक्षिप्त स्कोर प्रत्येक उपचार के लिए गणना कर रहे हैं ।

2. Amyloid β Immunostaining

  1. कल्चर माउस cortical न्यूरॉन्स 3 दिनों के लिए, चरण १.२ में वर्णित के रूप में.
  2. एक सह2 मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस से कम 4 घंटे के लिए एकत्रित aβ 1-42 (5 माइक्रोन) या वाहन के साथ इलाज ।
  3. माध्यम को हटाने के बिना, 4% paraformaldehyde के एक समान मात्रा में पंजाबियों में 4% सुक्रोज युक्त प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ने के लिए, और 5 मिनट के लिए एक गर्म थाली पर ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति को बनाए रखने ।
  4. ४०० μL के साथ समाधान बदलें 4% paraformaldehyde के 4% से युक्त पंजाब में सुक्रोज, और 1 के लिए गर्म प्लेट पर ३७ डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने एच । यह निर्धारण प्रोटोकॉल पिछली रिपोर्ट३४से संशोधित किया गया था ।
  5. न्यूरॉन्स को 3 बार पंजाबियों से धोएं ।
  6. पंजाब में 5% सामांय बकरी सीरम के साथ ब्लॉक ।
  7. माउस के साथ ंयूरॉंस की मशीन एंटी amyloid β immunoglobulin जी (आईजीजी) (1:50) और पंजाब में 1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात.
  8. न्यूरॉन्स को 3 बार पंजाबियों से धोएं ।
  9. एक प्रतिदीप्ति-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (1:400) और 2 एच के लिए कमरे के तापमान पर पंजाब में 1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन के साथ ंयूरॉंस की मशीन ।
  10. पंजाब के साथ ंयूरॉंस 3 बार धो और उंहें एक जलीय बढ़ते मध्यम के साथ माउंट ।
  11. उल्टे माइक्रोस्कोप बी पर एक 40X शुष्क उद्देश्य लेंस का उपयोग करके प्रतिदीप्ति छवियों और परोक्ष रोशनी के साथ उज्ज्वल क्षेत्र छवियों पर कब्जा

3. Axonal Immunostaining27

  1. ंयूरॉंस के साथ 3 बार पंजाब के बाद कल्चरल न्यूरॉन निर्धारण, चरण 1.3.3 में वर्णित के रूप में धो ।
  2. माउस के साथ ंयूरॉंस मशीन विरोधी ताऊ-1 आईजीजी (1:500), खरगोश विरोधी microtubule जुड़े प्रोटीन 2 (MAP2) आईजीजी (1:500) में 5% सामांय बकरी सीरम, और ०.३% टी-octylphenoxypoly-ethoxyethanol में पंजाब भर में 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात ।
  3. न्यूरॉन्स को 3 बार पंजाबियों से धोएं ।
  4. प्रतिदीप्ति-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (1:400) और 2 ज के लिए कमरे के तापमान पर पंजाब में ०.३% टी-octylphenoxypolyethoxyethanol के साथ ंयूरॉंस की मशीन ।
  5. पंजाब के साथ ंयूरॉंस 3 बार धो, और माउंट एक जलीय बढ़ते मध्यम का उपयोग कर ।
  6. प्रतिदीप्ति और विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट (एक 20 × उल्टे माइक्रोस्कोप पर सूखी उद्देश्य लेंस का उपयोग करके) छवियों पर कब्जा

4. लाइव सेल इमेजिंग27

  1. कोट ग्लास आधारित व्यंजन PDL के ५०० μL के साथ (5 μg/एमएल), के रूप में 1.1.1 कदम में वर्णित है ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, घर का बना गिलास आधारित व्यंजन इस्तेमाल किया गया । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ग्लास आधारित व्यंजन भी लाइव इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । घर का बना ग्लास आधारित व्यंजन इस प्रकार के रूप में तैयार किया गया: 1) एक छेद एक हाथ पंच के साथ एक ३५ मिमी पकवान के केंद्र में व्यास में लगभग १.४ मिमी बनाओ, और 2) एक गिलास coverslip (22 मिमी के व्यास) सिलिकॉन के साथ पकवान के पीछे करने के लिए देते हैं ।
  2. आसुत जल के साथ प्लेट धो, के रूप में 1.1.2 चरण में वर्णित है, और संस्कृति ग्लास में cortical ंयूरॉंस पर आधारित डिश 3 x 104 कोशिकाओं/मध्यम A के साथ डिश, के रूप में १.२ कदम में वर्णित है ।
  3. सेल संस्कृति के 4 दिनों के बाद, नए माध्यम बी के 2 मिलीलीटर के साथ माध्यम की जगह है, और औंधा माइक्रोस्कोप के लिए एक डिश हस्तांतरण a. ३७ ° c पर 10% CO2 के एक humidified वातावरण में संस्कृति बनाए रखें ।

5. Endocytosis प्रयोग

  1. १.२ चरण में वर्णित के रूप में Culture माउस cortical न्यूरॉन्स ।
  2. चार दिन बाद, मध्यम की जगह 1 मिनट के लिए 20 माइक्रोन प्रतिदीप्ति झिल्ली जांच युक्त नए माध्यम बी के १०० μL के साथ ।
  3. ०.०५ मिमी एग्रीगेट aβ 1-42 (अंतिम ०.५ माइक्रोन) या वाहन (आसुत जल) समाधान और pipetting द्वारा मिश्रण के 1 μL जोड़ें । 20 मिनट के लिए मशीन ।
  4. मध् यम को निकालें और कुएं को दो बार मध् यम बी से धो लें जो ३७ ° c से पूर्व गरम किया गया हो ।
  5. फिक्स, धो, और कदम 1.3.3 और 1.3.4 में वर्णित के रूप में ंयूरॉंस माउंट ।
  6. एक औंधा माइक्रोस्कोप पर एक 63X तेल उद्देश्य लेंस के साथ फ्लोरोसेंट और डिक छवियों पर कब्जा
  7. प्रतिदीप्ति झिल्ली जांच के घनत्व को बढ़ाता है-एक छवि सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रत्येक स्वस्थ विकास शंकु में सकारात्मक क्षेत्र ।

6. जीन अभिकर्मक

  1. cortical न्यूरॉन्स चरण १.२ में वर्णित के रूप में तैयार करें । 1.2.10 करने के लिए 1.2.1 कदम पूरा करने के बाद, 3 मिनट के लिए १७८ x g पर ंयूरॉंस केंद्रापसारक ।
  2. supernatant निकालें, 2 Ca के 4 मिलीलीटर+मुक्त और2 मिलीग्राम +मुक्त हैंक्स ' संतुलित नमक समाधान (CMF-HBSS), और pipetting द्वारा मिश्रण जोड़ें ।
  3. 3 मिनट के लिए १७८ x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक ।
  4. supernatant निकालें, CMF-HBSS के 4 मिलीलीटर जोड़ें, और pipetting द्वारा मिश्रण । अगले, कोशिका घनत्व की गणना, के रूप में चरण 1.2.10 में वर्णित है ।
  5. स्थानांतरण 5 x 106 एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए कोशिकाओं और 1 मिनट के लिए १,६७७ x g पर केंद्रापसारक ।
  6. supernatant निकालें, पूरक के साथ अभिकर्मक समाधान के १०० μL जोड़ें और डीएनए के 3 μg प्लाज्मिड एन्कोडिंग EGFP या EGFP-AP180 सी-टर्मिनस, और pipetting द्वारा मिक्स.
  7. ऊपर समाधान (चरण ६.६) के लिए एक प्रमाणित cuvette और एक electroporator के साथ transfect, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार स्थानांतरण ।
  8. अभिकर्मक के तुरंत बाद, cuvette में मध्यम के ५०० μL जोड़ें और एक प्रमाणित पिपेट के साथ एक १.५ एमएल ट्यूब के लिए समाधान हस्तांतरण । अगले, कोशिका घनत्व की गणना, के रूप में चरण 1.2.10 में वर्णित है ।
  9. संस्कृति एक 8-well कल्चर स्लाइड में ०.८ x 104 कक्ष में कक्ष/ठीक है, के रूप में चरणों 1.2.11 और 1.2.12 में वर्णित है ।
  10. सेल संस्कृति के 4 दिनों के बाद, एक पतन परख प्रदर्शन के रूप में १.३ कदम में वर्णित है ।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल में, aβ 1-42 का उपयोग करने से पहले 7 दिनों के लिए ३७ ° c पर मशीन था, क्योंकि aβ 1-42 की मशीन विषाक्त रूपों के उत्पादन के लिए आवश्यक था27,28,30,३५। इस मशीन के बाद, Aβ के एकत्रित रूपों (चित्र 1a) मनाया गया । यह बताया गया है कि Aβ 1-42 की इसी तरह की मशीन३६Aβ के फाइब्रिल फार्म का उत्पादन किया । इस एकत्रित Aβ 1-42 के साथ उपचार के बाद, Aβ३५,३७ के विषाक्त oligomer के लिए एक एंटीबॉडी के साथ immunostaining प्रदर्शन किया गया था, और सकारात्मक धुंधला कल्चरल न्यूरॉन्स (आंकड़ा 1b) पर पाया गया । इसके बाद के संस्करण पर विचार, इस मशीन प्रोटोकॉल Aβ के विषाक्त रूपों का उत्पादन ।

कई दिनों Aβ जोखिम के बाद axonal अध की प्रेरण के लिए आवश्यक थे । axonal अध कि पहले के घटनाक्रम अस्पष्ट रहते हैं । इसलिए, इस प्रोटोकॉल को और अधिक शामिल तंत्र को समझने के लिए विकसित किया गया है । इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, जल्दी Aβ उपचार द्वारा प्रेरित घटनाएं विश्लेषण किया गया । Cortical न्यूरॉन्स 4 दिनों के लिए कल्चर्ड थे. सबसे लंबे समय तक neurites में कल्चरल न्यूरॉन्स की पहचान axons के रूप में की गई; इन axonal मार्कर, ताऊ-1, और वृक्ष मार्कर, MAP2 (चित्रा 2) के लिए नकारात्मक immunostaining के लिए सकारात्मक immunostaining द्वारा पुष्टि की गई । वाहन उपचार के 1 ज के बाद, विकास शंकु lamellipodia फैला था और कई filopodia संसाधित । ये स्वस्थ विकास शंकु के रूप में पहचाने गए । इसके विपरीत, aβ 1-42 उपचार के 1 ज सिकुड़ा विकास शंकु, जो कोई lamellipodia या filopodia विकसित करने के लिए नेतृत्व किया । ये ढह विकास शंकु के रूप में पहचान की गई । चरण 1.3.7 में वर्णित के रूप में संक्षिप्त स्कोर परिकलित किए गए थे । जब विकास शंकु के आकार अस्पष्ट थे, वे विश्लेषण से सफाया कर दिया गया । aβ 1-42 उपचार पतन स्कोर में एक महत्वपूर्ण वृद्धि करने के लिए नेतृत्व, इसी वृद्धि हुई axonal वृद्धि पतन, जब वाहन के पतन स्कोर की तुलना में विकास शंकु27।

Axonal विकास शंकु पहले और aβ 1-42 (चित्रा 3) के साथ उपचार के बाद मनाया गया । कोशिकाओं ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10% CO2 के एक humidified वातावरण के साथ औंधा माइक्रोस्कोप में बनाए रखा गया था । छवियां हर 5 मिनट पर कब्जा कर लिया गया । के रूप में चित्रा 3में दिखाया गया है, विकास शंकु aβ 1-42 उपचार के बाद 21 और 26 मिनट के बीच ढह गई । विकास शंकु लाइव सेल इमेजिंग से बाहर रखा गया था अगर वे 1 के लिए अपने स्वस्थ आकार बनाए रखने नहीं किया था किसी भी उपचार से पहले एच ।

aβ 1-42-उपचार के प्रारंभिक प्रभाव कल्पना करने के लिए, endocytosis इस विश्लेषण के ध्यान के रूप में इस्तेमाल किया गया था, क्योंकि endocytosis अवरोधकों aβ 1-42 प्रेरित विकास-शंकु पतन27ब्लॉक कर सकते हैं । Endocytosis एक प्रतिदीप्ति झिल्ली की जांच के साथ कल्पना की थी (यानी, एक फ्लोरोसेंट डाई कि प्लाज्मा झिल्ली को बांधता है और सहज endocytosed है) । पिछले एक अध्ययन से पता चला है कि विकास शंकु aβ 1-42 के बाद 20 मिनट में पतन नहीं-27उपचार; इसलिए, स्वस्थ विकास शंकु वाहन में डिक इमेजिंग द्वारा चयनित-या aβ 1-42-20 मिनट के बाद कोशिकाओं का इलाज किया गया । निंनलिखित aβ 1-42-उपचार, कई फ्लोरोसेंट झिल्ली जांच-सकारात्मक puncta वृद्धि शंकु (चित्रा 4) में मनाया गया । प्रतिदीप्ति झिल्ली की सघनता जांच-ग्रोथ कोन में पॉजिटिव puncta27को काफी बढ़ गई । यह पता चलता है कि aβ 1-42 प्रेरित विकास शंकु endocytosis पतन से पहले होता है ।

endocytosis की भूमिका की पुष्टि करने के लिए, एक डीएनए प्लाज्मिड एन्कोडिंग EGFP-AP180 सी-टर्मिनस को कल्चरल transfected न्यूरॉन्स में cortical किया गया था. कोशिकाओं AP180 सी-टर्मिनस चुनिंदा बाधित clathrin-मध्यस्थता endocytosis३८,३९व्यक्त । यदि EGFP अभिव्यक्ति ंयूरॉन में कोशिका शरीर पर मनाया गया था, AP180 सी-टर्मिनस के axonal वृद्धि शंकु पर व्यक्त करने के लिए विचार किया गया था ंयूरॉन । अभिकर्मक AP180 सी-टर्मिनस अवरुद्ध aβ 1-42-प्रेरित विकास शंकु पतन (चित्रा 5)27.

Figure 1
चित्रा 1 : एक की मशीन β 1-42 समुच्चय Aβ. (क) aβ 1-42 आसुत जल में ०.५ मिमी की एकाग्रता में भंग कर दिया गया था और 7 दिनों के लिए ३७ ° c पर मशीन (गर्मी के बाद), या में संग्रहित-30 ° c (कोई मशीन) के बिना । प्रत्येक Aβ समाधान ०.१ mM करने के लिए पतला था; फिर, प्रत्येक पतला समाधान के 10 μL ग्लास स्लाइड पर गिरा दिया और coverslips के साथ कवर किया गया था । चमकीला-परोक्ष रोशनी के साथ क्षेत्र छवियों औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कब्जा कर लिया गया B. स्केल बार = 20 माइक्रोन । (ख) 4 ज के लिए प्रसंस्कृत न्यूरॉन्स पर समेकित aβ 1-42 या वाहन उपचार. उपचार के बाद, न्यूरॉन्स तय किए गए और विषाक्त Aβ oligomers के लिए immunostained. प्रतिदीप्ति छवियों (लाल) और परोक्ष रोशनी (ग्रे) के साथ उज्ज्वल क्षेत्र छवियों को दिखाया जाता है । स्केल बार = 20 माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : ए β 1-42-प्रेरित axonal विकास शंकु पतन । aβ 1-42-या वाहन-उपचार के बाद, न्यूरॉन्स तय किए गए और ताऊ के लिए immunostained-1 (लाल) और microtubule जुड़े प्रोटीन 2 (MAP2, हरा). प्रतिदीप्ति और विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट (उद्योग) छवियां दिखाई जाती हैं । ब्याज के क्षेत्रों के बढ़ाया विचार (रॉय, आयतों) उनके इसी छवियों के नीचे दिखाए जाते हैं । सफेद पैमाने सलाखों = ५० माइक्रोन; काले पैमाने सलाखों = 10 माइक्रोन । यह आंकड़ा Kuboyama एट अल, २०१५27से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : लाइव सेल इमेजिंग से पहले और एक के बाद β 1-42 उपचार. संस्कृति के 4 दिनों के बाद, कोशिकाओं को एक औंधा खुर्दबीन और उद्योग के लिए स्थानांतरित किया गया छवियों हर 5 मिनट पर कब्जा कर लिया गया था । समय-चूक छवियों को दिखाया जाता है । अंक मिनट: एग्रीगेट aβ 1-42 (अंतिम एकाग्रता, ०.५ माइक्रोन) के आवेदन के बाद सेकंड का प्रतिनिधित्व करते हैं । स्केल बार = 10 माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : एक के बीस मिनट β 1-42 उपचार प्रेरित endocytosis. Cortical न्यूरॉन्स 4 दिनों के लिए प्रसंस्कृत थे और एक प्रतिदीप्ति झिल्ली जांच के साथ इलाज किया. फिर, न्यूरॉन्स aβ 1-42 या वाहन के साथ 20 मिनट के लिए इलाज किया गया. प्रतिदीप्ति विकास शंकु के चित्र दिखाए जाते हैं । पीला बिंदीदार रेखाएं विकास शंकु की रूपरेखा का प्रतिनिधित्व करते हैं । स्केल बार = 10 माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : AP180 की अभिव्यक्ति-C टर्मिनस ब्लॉक aβ 1-42-प्रेरित पतन । EGFP (ए, बी) या EGFP-AP180 c-टर्मिनस (c, D) के अभिकर्मक के चार दिन बाद; aβ 1-42 (बी, डी) या वाहन (ए, सी) 1 एच के लिए cortical न्यूरॉन्स जोड़ा गया था (ऊपरी पैनलों) और प्रतिदीप्ति (नीचे पैनलों) छवियों को दिखाया जाता है. तीर वृद्धि शंकु संकेत मिलता है । स्केल बार्स = 10 माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस अध्ययन में वर्णित प्रोटोकॉल aβ 1-42 उपचार के बाद axonal विकास शंकु में जल्दी घटना के अवलोकन सक्षम होना चाहिए । aβ 1-42 20 मिनट के भीतर axonal विकास शंकु में प्रेरित endocytosis, और विकास शंकु पतन उपचार के 1 ज के भीतर मनाया गया । इस endocytosis शायद clathrin ने मध्यस्थता की थी. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, clathrin के निषेध-मध्यस्थता endocytosis aβ 1-42-प्रेरित विकास शंकु पतन और axonal अध... में उत्पादन को रोकने के लिए पुष्टि की गई है न्यूरॉन्स27. इसके अतिरिक्त, clathrin के निषेध-मध्यस्थता endocytosis तनु aβ 1-42-प्रेरित axonal अध-पतन और vivo27में स्मृति घाटे । इन परिणामों से संकेत मिलता है कि clathrin मध्यस्थता endocytosis विज्ञापन की रोकथाम के लिए एक होनहार चिकित्सकीय एवेंयू है ।

इस प्रोटोकॉल इस तरह के semaphorin 3 ए और ephrin-A516,17,18,19,20के रूप में axonal विकास से बचाने वाली क्रीम के लिए पतन परख से विकसित किया गया था । पतन परख अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है ंयूरॉंस नेटवर्क के विकास का आकलन । मुझे पता चला है कि इस प्रोटोकॉल रोग विश्लेषण करने के लिए लागू किया जा सकता है, विशेष रूप से विज्ञापन के तंत्र को शामिल उन; हालांकि, एक सीमा है कि लगभग ४०% के विकास शंकु स्वस्थ हालत में ढह हो सकता है । यह प्रतिशत अधिक सामांयतः पतन परख16,17,18,19,20में प्रयोग किया जाता है जो कल्चरल पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रंथि न्यूरॉन्स, से परिणामों से अधिक है । इसलिए, कक्ष प्रकार में अंतर संक्षिप्त अनुपात में अंतर करने के लिए लिंक किया जा सकता है । पतन इस अध्ययन में पाया अनुपात सामांय cortical ंयूरॉंस४०,४१के साथ पिछले अध्ययन में पाया उन लोगों के साथ संगत थे । इसके अलावा, aβ 1-42 ऐसे semaphorin 3 ए और ephrin-A527के रूप में अंय पतन कारकों, के साथ तुलना में जब विकास शंकु पतन के समान स्तर प्रेरित । इसलिए, इस प्रोटोकॉल aβ 1-42-प्रेरित विकास शंकु पतन के ठहराव के लिए मांय है । यह निर्धारण प्रोटोकॉल विकास शंकु के आकार को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है । यदि कोशिकाओं को परंपरागत रूप से कमरे के तापमान पर 4% paraformaldehyde के साथ तय किया गया, और अधिक वृद्धि शंकु निर्धारण प्रक्रिया के कारण ढह सकता है (डेटा नहीं दिखाया गया है) । वैकल्पिक रूप से, glutaraldehyde और निर्धारण बफ़र्स कठोर निर्धारण के लिए उपलब्ध हैं, के रूप में पहले वर्णित४२; हालांकि, glutaraldehyde प्रदर्श autofluorescence, जो प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा है ।

एक ही प्रोटोकॉल के साथ हाल के एक अध्ययन से पता चला है कि मूलांक Polygalae से पानी निकालने ( Polygala tenuifoliaकी जड़ें) aβ 1-42-प्रेरित endocytosis में प्रसंस्कृत ंयूरॉंस में बाधा, axonal अध कि रोक दिया, और एक में कम स्मृति घाटे 31विज्ञापन के ट्रांसजेनिक माउस मॉडल । विज्ञापन की रोकथाम के लिए एक उपंयास उंमीदवार इस प्रोटोकॉल के साथ पाया गया है । इस प्रोटोकॉल में जीन अभिकर्मक और लाइव सेल इमेजिंग का एक संयोजन अंय सेलुलर घटनाओं axons में पाया और उनके टर्मिनलों से पहले और Aβ उपचार के बाद, जैसे Ca2 + इमेजिंग, microtubule गतिशीलता, और सेल आसंजन गतिशीलता है, जो कथित तौर पर axonal वृद्धि४३,४४,४५से संबंधित हैं । इस प्रोटोकॉल Aβ विषाक्तता के और अधिक विस्तृत तंत्र प्रकट मदद कर सकते है और रोकथाम के लिए सीसा और/

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Disclosures

लेखक का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम आंशिक रूप से JSPS (KAKENHI 18K07389), जापान, टाकेडा विज्ञान फाउंडेशन, जापान, और इस्सा फार्मास्युटिकल कं, लिमिटेड, जापान से अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ddY mice SLC
Eight-well culture slide Falcon 354108
poly D lysine Wako 168-19041
Culture medium, Neurobasal medium Gibco 21103-049
house serum Gibco 26050-088
glucose Wako 049-31165
L-glutamine Wako 074-00522
0.05% trypsin Gibco 25300-054
DNase I Worthington DP
soybean trypsin inhibitor Gibco 17075-029
Filter with 70 µm mesh size, cell strainer Falcon 352350
B-27 supplement Gibco 17504-044
CO2 incubator Astec SCA-165DS
Amyloid β1-42 Sigma-Aldrich A9810
paraformaldehyde Wako 162-16065
sucrose  Wako 196-00015
Aqueous mounting medium, Aqua-Poly/Mount polysciences 18606-20
Inverted microscope A Carl Zeiss Axio Observer Z1  Connected with AxioCam MRm, Heating Unit XL S, CO2 Module S1, and TempModule S1
Objective Plan-Apochromat 20x Carl Zeiss 420650-9901
Objective Plan-Apochromat 63x Carl Zeiss 440762-9904
Objective, CFI Plan Apo Lambda 40X Nikon
anti-MAP2 IgG Abcam ab32454
anti-tau-1 IgG Chemicon MAB3420
anti-amyloid β antibody IBL 10379 clone 11A1
normal goat serum Wako 143-06561
bovine serum albumin Wako 010-25783
t-octylphenoxypolyethoxyethanol Wako 169-21105
goat anti-mouse IgG conjugated with AlexaFluor 594 Invitrogen A11032
goat anti-rabbit IgG conjugated with AlexaFluor 488 Invitrogen A11029
hot plate NISSIN NHP-M30N
cover glass Fisher Scientific 12-545-85
35 mm dish IWAKI 1000-035
Silicone RTV Shin-Etsu KE42T
hand punch Roper Whitney No. XX
Fluorescence membrane probe, FM1-43FX Invitrogen F35355
Ca2+- and Mg2+-free Hanks' balanced salt solution Gibco 14175-095
Transfection solution, Nucleofector solution Lonza VPG-1001
Electroporator, Nucleofector I Amaxa
Inverted microscope B Keyence BZ-X710
Image software, ImageJ NIH https://imagej.nih.gov/ij/

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तंत्रिका विज्ञान अंक १४० Amyloid β axon विकास कोन पतन endocytosis लाइव सेल इमेजिंग
visualizing Axonal विकास शंकु पतन और जल्दी Amyloid β प्रभाव में कल्चरल माउस न्यूरॉन्स
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Kuboyama, T. Visualizing Axonal… More

Kuboyama, T. Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid β Effects in Cultured Mouse Neurons. J. Vis. Exp. (140), e58229, doi:10.3791/58229 (2018).

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