Summary
Aqui apresenta-se um protocolo para investigar os efeitos iniciais da amiloide-β (Aβ) no cérebro. Isto mostra que Aβ induz endocitose mediada por Clatrina e colapso dos cones de crescimento axonal. O protocolo é útil em estudar os efeitos iniciais de Aβ em cones de crescimento axonal e pode facilitar a prevenção da doença de Alzheimer.
Abstract
Amiloide-β (Aβ) provoca deficiências de memória na doença de Alzheimer (AD). Apesar de terapêutica foram mostrados para reduzir os níveis Aβ no cérebro de pacientes, estas não melhorar as funções de memória. Desde Aβ agrega no cérebro antes do aparecimento de perturbações de memória, alvejando Aβ pode ser ineficiente no tratamento de pacientes que já apresentam défices de memória. Portanto, sinalizando a jusante devido à deposição de Aβ deve ser bloqueado antes do desenvolvimento da AD. Aβ induz a degeneração axonal, levando ao rompimento de redes neuronais e deficiências de memória. Embora existam muitos estudos sobre os mecanismos de toxicidade Aβ, a fonte de toxicidade Aβ permanece desconhecida. Para ajudar a identificar a fonte, propomos um novo protocolo que usa microscopia, transfecção do gene e célula viva de imagem para investigar mudanças adiantadas causadas por Aβ em cones de crescimento axonal de neurônios cultivados. Este protocolo revelou que Aβ induzida por endocitose mediada por Clatrina em cones de crescimento axonal, seguido pelo colapso do cone de crescimento, demonstrando que a inibição da endocitose impede que a toxicidade Aβ. O presente protocolo será útil em estudar os efeitos iniciais de Aβ e pode levar a um tratamento mais eficiente e preventivo AD.
Introduction
Depósitos de amiloide-β (Aβ) são encontrados no cérebro de pacientes com doença de Alzheimer (AD) e são considerados uma causa fundamental de AD1 que disrupt redes neuronais, levando a deficiências de memória2,3,4. Muitos candidatos clínico foram mostrados para prevenir eficazmente a produção amiloide-β (Aβ) ou remover os depósitos Aβ. No entanto, ninguém conseguiu na melhoria da função de memória em pacientes de AD5. Aβ já é depositado no cérebro antes do início da deficiência de memória6; Portanto, diminuindo os níveis Aβ nos cérebros de pacientes exibem deficiência de memória pode ser ineficaz. Deposição de aβ está presente em pacientes pré-clínicos de AD; no entanto, estes pacientes raramente apresentam com neuronal défices degeneração e memória6. Há um desfasamento entre a deposição de Aβ e deficiências de memória. Portanto, uma estratégia fundamental para a prevenção do anúncio está bloqueando a toxicidade Aβ sinalização durante os estágios iniciais do anúncio, antes do desenvolvimento dos défices de memória. Deposição de aβ induz axônio degeneração7,8,9,10,11,12,13, que pode levar a uma ruptura do redes neurais e comprometimento permanente da função de memória. Muitos estudos têm investigado os mecanismos de toxicidade Aβ; por exemplo, os axônios degenerados dos cérebros de ratos de AD foram mostrados para ter aumentado de autofagia14. Ativação de calcineurina tem sido relatada como um possível mecanismo de degeneração axonal induzida por Aβ15; no entanto, o gatilho directo de degeneração axonal permanece desconhecido.
Este estudo enfoca o colapso do axonal terminações chamadas de cones de crescimento. O colapso dos cones de crescimento axonal pode ser causado por repelentes de crescimento axonal, tais como semaforina-3A e ephrin-A516,17,18,19,20. Colapso-como distróficos axonal finais foram observadas no cérebro de pacientes de AD21,22. Além disso, uma falha de funcionamento de cone de crescimento pode provocar degeneração axonal23. No entanto, é desconhecido se Aβ induz o colapso do cone de crescimento. Portanto, este estudo apresenta um novo protocolo para observar os primeiros efeitos de Aβ nos neurônios cultivados e investigar o colapso do cone de crescimento induzido por Aβ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os experimentos foram conduzidos em conformidade com as orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório no Campus da Universidade de Toyama Sugitani e foram aprovados pelo Comitê de cuidado Animal e uso de animais de laboratório no Campus da Sugitani o Universidade de Toyama (A2014INM-1, A2017INM-1).
1. colapso ensaio
- Revestimento de poli-D-lisina
- Casaco slides de cultura 8 poços com 400 μL de 5 μg/mL poli-D-lisina (PDL) em tampão fosfato salino (PBS) e incube-os a 37 ° C durante a noite.
- Remover a solução PDL e lavar os poços 3 vezes com água destilada.
- Neurônio cultura24
- Mince recém isoladas córtices cerebral de embrionárias dia 14 (E14) ddY os ratos com micro-tesouras em meio de cultura de neurônio que contém 12% de soro de cavalo, 0,6% de glicose e 2 mM L-glutamina (meio A). Não adicione antibióticos.
Nota: No presente protocolo, o papá rato é usado. Esta é uma tensão outbred comumente usada no Japão. Este protocolo de cultura de neurônio pode ser também aplicado para rato neurônios corticais7,25. - Centrifugue os tecidos a 87 x g, durante 3 min.
- Remova o sobrenadante. Em seguida ao pellet, adicionar 2 mL de tripsina 0,05% e incube por 15 min a 37° C. Misture, tocando a cada 5 min.
- Adicione 4 mL de A médio e a mistura batendo.
- Centrifugue os tecidos a 178 x g, durante 3 min.
- Remover o sobrenadante e incube-os tecidos com 600 U/mL DNase I e inibidor de tripsina de soja de 0,3 mg/mL dissolvidos em PBS por 15 min a 37 ° C. Misture, tocando a cada 5 min.
- Após a incubação, adicione 4 mL de A médio e a mistura batendo.
- Centrifugue os tecidos a 178 x g, durante 3 min.
- Depois de retirar o sobrenadante, adicionar 4 mL de meio A e triture os tecidos com uma pipeta Pasteur polido.
- Filtre os tecidos triturados com uma malha de tamanho de poro de 70 µm. Após filtração, calcule a densidade de células com um hemocytometer.
- Cultura das células em cultura 8 poços deslize em 0,8 x 104 células/poço com médio A e mantêm-los numa incubadora de CO2 com um ambiente umidificado de 10% CO2 a 37 ° C.
- Após 4h de cultivo, substitua o meio de cultura para um suplemento contendo de 2% para cultura neuronal, 0,6% de glicose e 2 mM L-glutamina (médio B).
Nota: A pureza dos neurônios foi aproximadamente 75%, conforme descrito anteriormente,26.
- Mince recém isoladas córtices cerebral de embrionárias dia 14 (E14) ddY os ratos com micro-tesouras em meio de cultura de neurônio que contém 12% de soro de cavalo, 0,6% de glicose e 2 mM L-glutamina (meio A). Não adicione antibióticos.
- Colapso do ensaio27
- Dissolver obtidos comercialmente completos amiloide β1-42 (Aβ1-42) em água destilada a uma concentração de 0,5 mM e incubar a 37 ° C por 7 dias. Após a incubação, armazene a solução Aβ1-42 agregada em um freezer-30 ° C até o uso.
Nota: Esta incubação é necessária para agregação e toxicidade de Aβ27,28,29,30. - Após 4 dias de cultura neuronal, tratar os poços com 100 μL de Nova B média, contendo 0,5 μM agregados solução Aβ1-42 ou veículo (água destilada) por 1h.
Nota: Efeitos de Aβ1-42 foram dose-dependente aumentou de 0,1 a 5 μM e atingiu um pico de 0.5 μM, conforme descrito anteriormente,27. Resultados semelhantes podem ser observados quando por Aβ1-42 tratamento por 1h após 3 dias de cultura neuronal31. - Remover o meio de cultura e corrigir imediatamente os neurônios com paraformaldeído 4% com 4% de sacarose em PBS durante 1 h a 37 ° C em uma chapa quente.
- Após a fixação, lave os neurônios 3 vezes com PBS e montá-los com um meio de montagem aquoso. Seca o meio de montagem a 4 ° C por 2 – 4 dias.
- Capture toda a área (7,8 x 9 mm2) de cada poço com uma 20 X seco lente objetiva em um microscópio invertido.
- Classifica os neuritos mais longos de cada neurônio no estágio 3 ou 4 como axônios, como descrito anteriormente,32,33.
- Classificar os cones de crescimento, de acordo com os seguintes critérios: cones de crescimento 1) axonal falta lamellipodia ou 2) possuindo menos de três filopodia são considerados recolhido cones de crescimento, conforme descrito anteriormente,17.
Nota: Cones de crescimento saudável são marcados como 0 ponto; cones de crescimento recolhido são marcados como 1 ponto. Quer dizer colapso escores são calculados para cada tratamento.
- Dissolver obtidos comercialmente completos amiloide β1-42 (Aβ1-42) em água destilada a uma concentração de 0,5 mM e incubar a 37 ° C por 7 dias. Após a incubação, armazene a solução Aβ1-42 agregada em um freezer-30 ° C até o uso.
2. amiloide β imunocoloração
- Neurônios corticais rato de cultura por 3 dias, conforme descrito na etapa 1.2.
- Tratar com agregados Aβ1-42 (5 μM) ou veículo por 4 h a 37 ° C numa incubadora de CO2 .
- Sem retirar o meio, adicionar um volume igual de paraformaldeído 4% com 4% de sacarose em PBS a cada poço e manter a cultura a 37 ° C em uma chapa quente por 5 min.
- Substitua a solução 400 μL de paraformaldeído 4% com 4% de sacarose em PBS e manter a 37 ° C, o prato quente por 1h. Este protocolo de fixação foi modificado de um anterior relatório34.
- Lave os neurônios 3 vezes com PBS.
- Bloco com 5% de soro de cabra normal em PBS.
- Incube os neurônios com imunoglobulina antiamilóide β de rato G (IgG) (01:50) e 1% albumina de soro bovino em PBS a 4 ° C durante a noite.
- Lave os neurônios 3 vezes com PBS.
- Incube os neurônios com um anticorpo secundário conjugado fluorescência (1: 400) e 1% albumina de soro bovino em PBS em temperatura ambiente por 2 h.
- Lave os neurônios 3 vezes com PBS e montá-los com um meio de montagem aquoso.
- Capturar imagens de fluorescência e campo claro com iluminação oblíqua usando uma lente objetiva seco X 40 em microscópio invertido B.
3. axonal Immunostaining27
- Lave os neurônios 3 vezes com PBS após a fixação do neurônio culta, conforme descrito na etapa 1.3.3.
- Incubar os neurônios com rato anti tau-1 IgG (1: 500), proteína associada de coelho anti-microtubule 2 (MAP2) (1: 500) de IgG no soro de cabra normal de 5% e 0,3% t- octylphenoxypoly-etoxietanol em PBS a 4 ° C durante a noite.
- Lave os neurônios 3 vezes com PBS.
- Incube os neurônios com anticorpos secundarios conjugados a fluorescência (1: 400) e 0,3% t- octylphenoxypolyethoxyethanol, em PBS em temperatura ambiente por 2 h.
- Lave os neurônios 3 vezes com PBS e montagem utilizando um meio de montagem aquoso.
- Capturar imagens de contraste (DIC) de interferência de fluorescência e diferencial usando uma lente objetiva seca de 20 × no microscópio invertido A.
4. célula de imagem27 ao vivo
- Revestimento de pratos à base de vidro com 500 μL de PDL (5 μg/mL), conforme descrito na etapa 1.1.1.
Nota: No presente protocolo, foram utilizados pratos caseiros à base de vidro. Comercialmente disponíveis pratos à base de vidro também podem ser usados para a geração de imagens ao vivo. Pratos caseiros à base de vidro foram preparados como segue: 1) fazer um buraco de aproximadamente 1,4 mm de diâmetro no centro de um prato de 35 mm com um soco da mão e 2) anexar uma lamela de vidro (diâmetro de 22 mm) na parte de trás do prato com silicone. - Lavar as placas com água destilada, conforme descrito na etapa 1.1.2 e cultura os neurônios corticais no prato com base em vidro em 3 x 104 células/prato com A média, como descrito na etapa 1.2.
- Após 4 dias de cultura de células, substitua o meio com 2 mL de meio novo B e transferência o prato para microscópio invertido r. Maintain a cultura em um ambiente umidificado de 10% CO2 a 37 ° C.
5. endocitose experimento
- Cultura os neurônios corticais do mouse, conforme descrito na etapa 1.2.
- Quatro dias depois, substitua o medium com 100 μL de novo meio B contendo 20 sonda de membrana de fluorescência μM por 1 min.
- Adicione 1 μL de 0.05 mM agregados Aβ1-42 (final 0,5 μM) ou solução de veículo (água destilada) e misture por pipetagem. Incube durante 20 min.
- Remover o meio e lavar os poços duas vezes com médio B que tenha sido previamente aquecido a 37 ° C.
- Corrigir, lavar e montar os neurônios conforme descrito nas etapas 1.3.3 e 1.3.4.
- Capturar o fluorescente e DIC imagens com um 63 X lente objetiva de óleo no microscópio invertido A.
- Quantificar a densidade da área de sonda-positivo da membrana de fluorescência em cada cone de crescimento saudável, usando um software de imagem.
6. Gene Transfection
- Prepare os neurônios corticais conforme descrito na etapa 1.2. Depois de concluir as etapas 1.2.1 para 1.2.10, centrifugue os neurônios a 178 x g, durante 3 min.
- Retire o sobrenadante, adicione 4 mL de Ca2 +-gratuito e Mg2 +-livre solução salina equilibrada de Hanks (CMF-HBSS) e misture por pipetagem.
- Centrifugar as células a 178 x g, durante 3 min.
- Remover o sobrenadante, adicione 4 mL de CMF-HBSS e misture por pipetagem. Em seguida, calcule a densidade de células, conforme descrito na etapa 1.2.10.
- Transferi 5 x 106 células para um tubo de 1,5 mL e centrifugar 1.677 x g por 1 min.
- Remover o sobrenadante, adicionar 100 μL de solução de transfecção com suplemento e 3 μg de Plasmideo DNA codificação EGFP ou EGFP-AP180 C-terminal e misture por pipetagem.
- Transferir a solução acima (passo 6.6) para uma cubeta certificada e transfect com um electroporator, de acordo com o protocolo do fabricante.
- Imediatamente após a transfeccao, adicionar 500 μL de médio A para a cubeta e transferir a solução para um tubo de 1,5 mL com uma pipeta certificada. Em seguida, calcule a densidade de células, conforme descrito na etapa 1.2.10.
- Cultura de células em um slide de cultura 8 poços em 0,8 x 104 células/poço, conforme descrito nas etapas 1.2.11 e 1.2.12.
- Após 4 dias de cultura celular, realizar um ensaio de colapso, conforme descrito na etapa 1.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neste protocolo, Aβ1-42 foi incubada a 37 ° C por 7 dias antes do uso, porque a incubação de Aβ1-42 era necessária para a produção de formas tóxicas27,28,30,35. Após esta incubação, formas agregadas de Aβ foram observadas (figura 1A). Tem sido relatado que a incubação semelhante de Aβ1-42 produzido forma fibrila de Aβ36. Após o tratamento com este agregado Aβ1-42, imunocoloração com um anticorpo para o tóxico oligómero de Aβ35,37 foi realizada e coloração positiva foi detectada em neurônios cultivados (figura 1B). Tendo em conta o acima exposto, o presente protocolo de incubação produz as formas tóxicas de Aβ.
Vários dias foram necessários para a indução de degeneração axonal após exposição Aβ. Os eventos antes da degeneração axonal permanecem obscuros. Portanto, este protocolo foi desenvolvido para entender melhor os mecanismos envolvidos. Usando este protocolo, foram analisados os fenômenos precoce induzidos por tratamento de Aβ. Neurônios corticais foram cultivados por 4 dias. Os mais longos neuritos nos neurônios cultivados foram identificados como axônios; Estas foram confirmadas por imunocoloração positiva para o marcador axonal, tau-1 e imunocoloração negativa para o marcador dendrítica, MAP2 (Figura 2). Após 1 h de tratamento do veículo, cones de crescimento tinham espalhar lamellipodia e processadas várias filopodia. Estes foram identificados como cones de crescimento saudável. Inversamente, a 1h de tratamento Aβ1-42 levou a cones de crescimento encolhidos, que se desenvolveu sem lamellipodia ou filopodia. Estes foram identificados como cones de crescimento colapsado. Golo de colapso foram calculados conforme descrito na etapa 1.3.7. Quando as formas de cones de crescimento não eram claras, eles foram eliminados da análise. Aβ1-42 tratamento levou a um aumento significativo na pontuação do colapso, correspondente a aumentou o colapso de crescimento axonal, quando comparado com o placar de colapso de crescimento tratados com veículo cones27.
Cones de crescimento axonal foram observadas antes e após o tratamento com Aβ1-42 (Figura 3). As células foram mantidas no microscópio invertido com um ambiente umidificado de 10% CO2 a 37 ° C. Imagens foram capturadas a cada 5 min. Como mostrado na Figura 3, cones de crescimento desabou entre 21 e 26 min após tratamento Aβ1-42. Cones de crescimento foram excluídos da célula viva imaging se não retêm sua forma saudável por 1h antes de qualquer tratamento.
Para visualizar os efeitos iniciais da Aβ1-42-tratamento, endocitose foi usado como o foco desta análise, porque inibidores de endocitose podem bloquear Aβ1-42-induzido crescimento-cone colapso27. Endocitose foi visualizado com uma sonda de membrana de fluorescência (i. e., uma tintura fluorescente que vincula a membranas de plasma e espontaneamente é endocytosed). Um estudo anterior mostrou que os cones de crescimento não colapso durante 20 min depois Aβ1-42-tratamento27; Portanto, cones de crescimento saudável foram selecionados por DIC de imagem no veículo ou Aβ1-42-tratada células depois de 20 min. Após Aβ1-42-tratamento, observaram-se numerosos membrana fluorescente partitura de sonda-positivo do cone de crescimento (Figura 4). A densidade da partitura de sonda-positivo de membrana de fluorescência em cones de crescimento foi significativamente aumentada27. Isto sugere que endocitose de cone de crescimento Aβ1-42-induzida ocorre antes do colapso.
Para confirmar o papel de endocitose, um plasmídeo de DNA codificação EGFP-AP180 C-terminal foi transfectado em neurônios corticais culturas. Células expressando o AP180 C-terminal seletivamente inibiam endocitose mediada por Clatrina38,39. Se a expressão EGFP foi observada para o corpo celular de neurônio, AP180 C-terminal foi considerado ser expressa o cone de crescimento axonal do neurônio. Transfecção de AP180 C-terminal bloqueado Aβ1-42-induzido crescimento cone colapso (Figura 5)27.
Figura 1 : Incubação da Β1-42 agrega Aβ. (A) Aβ1-42 foi dissolvido em água destilada a uma concentração de 0,5 mM e incubadas a 37 ° C por 7 dias (após a incubação) ou armazenado a-30 ° C sem incubação (sem incubação). Cada solução Aβ foi diluída a 0,1 mM; Então, 10 μL de cada solução diluída foi cair nas corrediças de vidro e cobertos com lamelas. Imagens de Bright-campo com iluminação oblíqua foram capturadas usando microscópio invertido escala B. barra = 20 μm. (B) tratamento de agregados Aβ1-42 ou veículo em neurônios cultivados por 4h. Após o tratamento, os neurônios eram fixas e immunostained para oligômeros tóxicos de Aβ. Imagens de fluorescência (vermelho) e imagens do brilhante-campo com iluminação oblíqua (cinza) são mostradas. Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : A Colapso do cone de crescimento axonal β1-42-induzido. Após Aβ1-42 - ou veículo-tratamento, neurônios foram corrigidos e immunostained para tau-1 (vermelho) e do microtubule proteína associada 2 (MAP2, verde). São mostradas imagens de contraste (DIC) de interferência de fluorescência e diferencial. Vista ampliada das regiões de interesse (ROI, retângulos) é mostrada abaixo suas imagens correspondentes. Branco barras de escala = 50 μm; preto com barras de escala = 10 μm. Esta figura foi modificada de Kuboyama et al, 201527. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Viver a imagem latente da pilha antes e após A Tratamento de β1-42. Após 4 dias de cultura, as células foram transferidas para um microscópio invertido e DIC imagens foram capturadas cada 5 min. lapso de tempo imagens são mostradas. Os dígitos representam minutos: segundos após a aplicação de agregados Aβ1-42 (concentração final, 0.5 μM). Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Vinte minutos da Tratamento de β1-42 induzida por endocitose. Neurônios corticais foram cultivados por 4 dias e tratadocom com uma sonda de membrana de fluorescência. Então, os neurônios foram tratados por 20 min com Aβ1-42 ou veículo. São mostradas imagens de fluorescência dos cones de crescimento. As linhas pontilhadas amarelas representam os contornos dos cones de crescimento. Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Expressão de C-AP180 terminal bloqueia Aβ1-42-induzido colapso. Quatro dias depois de Transfeccao de EGFP (A, B) ou EGFP-AP180 C-terminal (C, D); Aβ1-42 (B, D) ou veículo (A, C) foi adicionado para neurônios corticais para 1 h. DIC (painéis superiores) e são mostradas imagens de fluorescência (painéis de fundo). As setas indicam os cones de crescimento. Barras de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O protocolo descrito neste estudo permitiu a observação de fenômenos precoce em cones de crescimento axonal após tratamento Aβ1-42. Aβ1-42 induzida por endocitose em cones de crescimento axonal dentro de 20 min, e colapso do cone de crescimento foi observado dentro de 1 h de tratamento. Esta endocitose era provavelmente mediada por Clatrina. Usando este protocolo, a inibição de endocitose mediada por Clatrina foi confirmada para evitar o colapso do cone de crescimento Aβ1-42-induzido e degeneração axonal em neurônios cultivados27. Além disso, a inibição de endocitose mediada por Clatrina atenuadas degeneração axonal Aβ1-42-induzido e os défices de memória na vivo27. Estes resultados indicam que endocitose mediada por Clatrina é uma avenida promissora terapêutica para prevenção de AD.
Este protocolo foi desenvolvido de colapso ensaios para repelentes de crescimento axonal, tais como semaforina 3A e ephrin-A516,17,18,19,20. Ensaios de colapso têm sido utilizados em estudos para avaliar o desenvolvimento de redes neuronais. Eu tenho mostrado que este protocolo pode ser aplicado a análises patológicas, particularmente aqueles que envolvem mecanismos de anúncio; no entanto, uma limitação pode ser que aproximadamente 40% dos cones de crescimento recolhido na condição saudável. Esse percentual é maior do que os resultados dos neurônios do gânglio culta raízes dorsais, que são mais comumente usados em colapso ensaios16,17,18,19,20. Portanto, a diferença de tipos de células pode estar ligada às diferenças nas taxas de colapso. Os rácios de colapso encontrados neste estudo foram consistentes com os encontrados em estudos anteriores com a normal culta neurônios corticais40,41. Além disso, Aβ1-42 induzida por níveis semelhantes de colapso do cone de crescimento quando comparado com outros fatores de colapso, como semaforina 3A e ephrin-A527. Portanto, o presente protocolo é válido para a quantificação do colapso do cone de crescimento Aβ1-42-induzido. Este protocolo de fixação é importante para manter a forma de cones de crescimento. Se as células foram fixadas convencionalmente com paraformaldeído 4% à temperatura ambiente, mais cones de crescimento podem ter desmoronado devido ao processo de fixação (dados não mostrados). Alternativamente, glutaraldeído e fixação buffers estão disponíveis para fixação rígida, como descrito anteriormente,42; no entanto, glutaraldeído apresenta autofluorescência, que é um obstáculo significativo para a imagem latente de fluorescência.
Com o mesmo protocolo, um estudo recente mostrou que o extrato de água de Radix Polygalae (raízes de Polygala tenuifolia) inibiu a endocitose Aβ1-42-induzida em neurônios cultivados, impediu a degeneração axonal e reduzir os défices de memória em um modelo do AD31rato transgénico. Um romance candidato para prevenção de AD foi encontrado com este protocolo. Uma combinação de transfecção do gene e imagens de células vivas no presente protocolo pode mostrar os outros eventos celulares encontrados em axônios e seus terminais antes e após o tratamento de Aβ, tais como Ca2 + imagem dinâmica do microtubule e dinâmica de adesão celular, que são declaradamente relacionados a axonal crescimento43,44,45. Este protocolo pode ajudar a revelar mais detalhados mecanismos de toxicidade Aβ e pode ajudar a conduzir para a prevenção e/ou tratamento de AD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
O autor não tem nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi parcialmente financiado por bolsas de investigação de JSPS (KAKENHI 18K 07389), Japão, Takeda Science Foundation, Japão e Kobayashi Pharmaceutical Co., Ltd., Japão.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ddY mice | SLC | ||
| Eight-well culture slide | Falcon | 354108 | |
| poly D lysine | Wako | 168-19041 | |
| Culture medium, Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| house serum | Gibco | 26050-088 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| L-glutamine | Wako | 074-00522 | |
| 0.05% trypsin | Gibco | 25300-054 | |
| DNase I | Worthington | DP | |
| soybean trypsin inhibitor | Gibco | 17075-029 | |
| Filter with 70 µm mesh size, cell strainer | Falcon | 352350 | |
| B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| CO2 incubator | Astec | SCA-165DS | |
| Amyloid β1-42 | Sigma-Aldrich | A9810 | |
| paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| sucrose | Wako | 196-00015 | |
| Aqueous mounting medium, Aqua-Poly/Mount | polysciences | 18606-20 | |
| Inverted microscope A | Carl Zeiss | Axio Observer Z1 | Connected with AxioCam MRm, Heating Unit XL S, CO2 Module S1, and TempModule S1 |
| Objective Plan-Apochromat 20x | Carl Zeiss | 420650-9901 | |
| Objective Plan-Apochromat 63x | Carl Zeiss | 440762-9904 | |
| Objective, CFI Plan Apo Lambda 40X | Nikon | ||
| anti-MAP2 IgG | Abcam | ab32454 | |
| anti-tau-1 IgG | Chemicon | MAB3420 | |
| anti-amyloid β antibody | IBL | 10379 | clone 11A1 |
| normal goat serum | Wako | 143-06561 | |
| bovine serum albumin | Wako | 010-25783 | |
| t-octylphenoxypolyethoxyethanol | Wako | 169-21105 | |
| goat anti-mouse IgG conjugated with AlexaFluor 594 | Invitrogen | A11032 | |
| goat anti-rabbit IgG conjugated with AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| hot plate | NISSIN | NHP-M30N | |
| cover glass | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
| 35 mm dish | IWAKI | 1000-035 | |
| Silicone RTV | Shin-Etsu | KE42T | |
| hand punch | Roper Whitney | No. XX | |
| Fluorescence membrane probe, FM1-43FX | Invitrogen | F35355 | |
| Ca2+- and Mg2+-free Hanks' balanced salt solution | Gibco | 14175-095 | |
| Transfection solution, Nucleofector solution | Lonza | VPG-1001 | |
| Electroporator, Nucleofector I | Amaxa | ||
| Inverted microscope B | Keyence | BZ-X710 | |
| Image software, ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8 (6), 595-608 (2016).
- Dickson, T. C., Vickers, J. C. The morphological phenotype of beta-amyloid plaques and associated neuritic changes in Alzheimer's disease. Neuroscience. 105 (1), 99-107 (2001).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297 (5580), 353-356 (2002).
- Perl, D. P.
- Graham, W. V., Bonito-Oliva, A., Sakmar, T. P. Update on Alzheimer's Disease Therapy and Prevention Strategies. Annual Review of Medicine. 68, 413-430 (2017).
- Jack, C. R. Jr, et al. Hypothetical model of dynamic biomarkers of the Alzheimer's pathological cascade. Lancet Neurology. 9 (1), 119-128 (2010).
- Kuboyama, T., Tohda, C., Komatsu, K. Neuritic regeneration and synaptic reconstruction induced by withanolide A. British Journal of Pharmacology. 144 (7), 961-971 (2005).
- Tohda, C., Urano, T., Umezaki, M., Nemere, I., Kuboyama, T. Diosgenin is an exogenous activator of 1,25D3-MARRS/Pdia3/ERp57 and improves Alzheimer's disease pathologies in 5XFAD mice. Scientific Reports. 2, 535 (2012).
- Jawhar, S., Trawicka, A., Jenneckens, C., Bayer, T. A., Wirths, O. Motor deficits, neuron loss, and reduced anxiety coinciding with axonal degeneration and intraneuronal Abeta aggregation in the 5XFAD mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Aging. 33 (1), e129-e140 (2012).
- Postuma, R. B., et al. Substrate-bound beta-amyloid peptides inhibit cell adhesion and neurite outgrowth in primary neuronal cultures. Journal of Neurochemistry. 74 (3), 1122-1130 (2000).
- Tohda, C., Nakada, R., Urano, T., Okonogi, A., Kuboyama, T. Kamikihi-to (KKT) rescues axonal and synaptic degeneration associated with memory impairment in a mouse model of Alzheimer's disease, 5XFAD. International Journal of Neuroscience. 121 (12), 641-648 (2011).
- Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nature Neuroscience. 7 (11), 1181-1183 (2004).
- Wirths, O., Weis, J., Kayed, R., Saido, T. C., Bayer, T. A. Age-dependent axonal degeneration in an Alzheimer mouse model. Neurobiology of Aging. 28 (11), 1689-1699 (2007).
- Sanchez-Varo, R., et al. Abnormal accumulation of autophagic vesicles correlates with axonal and synaptic pathology in young Alzheimer's mice hippocampus. Acta Neuropathologica. 123 (1), 53-70 (2012).
- Wu, H. Y., et al. Amyloid beta induces the morphological neurodegenerative triad of spine loss, dendritic simplification, and neuritic dystrophies through calcineurin activation. Journal of Neuroscience. 30 (7), 2636-2649 (2010).
- Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32 (6), 1013-1026 (2001).
- Jurney, W. M., Gallo, G., Letourneau, P. C., McLoon, S. C. Rac1-mediated endocytosis during ephrin-A2- and semaphorin 3A-induced growth cone collapse. Journal of Neuroscience. 22 (14), 6019-6028 (2002).
- Luo, Y., Raible, D., Raper, J. A. Collapsin: a protein in brain that induces the collapse and paralysis of neuronal growth cones. Cell. 75 (2), 217-227 (1993).
- Nicol, X., Muzerelle, A., Rio, J. P., Metin, C., Gaspar, P. Requirement of adenylate cyclase 1 for the ephrin-A5-dependent retraction of exuberant retinal axons. Journal of Neuroscience. 26 (3), 862-872 (2006).
- Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436 (7053), 1020-1024 (2005).
- Benes, F. M., Farol, P. A., Majocha, R. E., Marotta, C. A., Bird, E. D. Evidence for axonal loss in regions occupied by senile plaques in Alzheimer cortex. Neuroscience. 42 (3), 651-660 (1991).
- Masliah, E., et al. An antibody against phosphorylated neurofilaments identifies a subset of damaged association axons in Alzheimer's disease. American Journal of Pathology. 142 (3), 871-882 (1993).
- Zhou, F. Q., Snider, W. D. Intracellular control of developmental and regenerative axon growth. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 361 (1473), 1575-1592 (2006).
- Teshigawara, K., et al. A novel compound, denosomin, ameliorates spinal cord injury via axonal growth associated with astrocyte-secreted vimentin. British Journal of Pharmacology. 168 (4), 903-919 (2013).
- Kuboyama, T., Tohda, C., Komatsu, K. Withanoside IV and its active metabolite, sominone, attenuate A beta(25-35)-induced neurodegeneration. European Journal of Neuroscience. 23 (6), 1417-1426 (2006).
- Tanabe, N., Kuboyama, T., Tohda, C. Matrine Directly Activates Extracellular Heat Shock Protein 90, Resulting in Axonal Growth and Functional Recovery in Spinal Cord Injured-Mice. Frontiers in Pharmacology. 9 (446), (2018).
- Kuboyama, T., Lee, Y. A., Nishiko, H., Tohda, C. Inhibition of clathrin-mediated endocytosis prevents amyloid beta-induced axonal damage. Neurobiology of Aging. 36 (5), 1808-1819 (2015).
- Pike, C. J., Walencewicz, A. J., Glabe, C. G., Cotman, C. W. In vitro aging of beta-amyloid protein causes peptide aggregation and neurotoxicity. Brain Research. 563 (1-2), 311-314 (1991).
- Uchida, N., et al. Yokukansan inhibits social isolation-induced aggression and methamphetamine-induced hyperlocomotion in rodents. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 32 (3), 372-375 (2009).
- Pike, C. J., Burdick, D., Walencewicz, A. J., Glabe, C. G., Cotman, C. W. Neurodegeneration induced by beta-amyloid peptides in vitro: the role of peptide assembly state. Journal of Neuroscience. 13 (4), 1676-1687 (1993).
- Kuboyama, T., Hirotsu, K., Arai, T., Yamasaki, H., Tohda, C. Polygalae Radix Extract Prevents Axonal Degeneration and Memory Deficits in a Transgenic Mouse Model of Alzheimer's Disease. Frontiers in Pharmacology. 8, 805 (2017).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).
- Arimura, N., Kaibuchi, K. Neuronal polarity: from extracellular signals to intracellular mechanisms. Nature Reviews: Neuroscience. 8 (3), 194-205 (2007).
- De Felice, F. G., et al. Alzheimer's disease-type neuronal tau hyperphosphorylation induced by A beta oligomers. Neurobiology of Aging. 29 (9), 1334-1347 (2008).
- Izuo, N., et al. Toxicity in Rat Primary Neurons through the Cellular Oxidative Stress Induced by the Turn Formation at Positions 22 and 23 of Aβ42. ACS Chemical Neuroscience. 3 (9), 674-681 (2012).
- Fujiwara, H., et al. Uncaria rhynchophylla, a Chinese medicinal herb, has potent antiaggregation effects on Alzheimer's beta-amyloid proteins. Journal of Neuroscience Research. 84 (2), 427-433 (2006).
- Murakami, K., et al. Monoclonal antibody against the turn of the 42-residue amyloid beta-protein at positions 22 and 23. ACS Chemical Neuroscience. 1 (11), 747-756 (2010).
- Ford, M. G., et al. Simultaneous binding of PtdIns(4,5)P2 and clathrin by AP180 in the nucleation of clathrin lattices on membranes. Science. 291 (5506), 1051-1055 (2001).
- Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance. Neuron. 66 (3), 370-377 (2010).
- Ahmed, G., et al. Draxin inhibits axonal outgrowth through the netrin receptor DCC. Journal of Neuroscience. 31 (39), 14018-14023 (2011).
- Brennaman, L. H., Moss, M. L., Maness, P. F. EphrinA/EphA-induced ectodomain shedding of neural cell adhesion molecule regulates growth cone repulsion through ADAM10 metalloprotease. Journal of Neurochemistry. 128 (2), 267-279 (2014).
- Tojima, T., et al. Attractive axon guidance involves asymmetric membrane transport and exocytosis in the growth cone. Nature Neuroscience. 10 (1), 58-66 (2007).
- Ooashi, N., Futatsugi, A., Yoshihara, F., Mikoshiba, K., Kamiguchi, H. Cell adhesion molecules regulate Ca2+-mediated steering of growth cones via cyclic AMP and ryanodine receptor type 3. Journal of Cell Biology. 170 (7), 1159-1167 (2005).
- Biswas, S., Kalil, K. The Microtubule-Associated Protein Tau Mediates the Organization of Microtubules and Their Dynamic Exploration of Actin-Rich Lamellipodia and Filopodia of Cortical Growth Cones. Journal of Neuroscience. 38 (2), 291-307 (2018).
- Kuboyama, T., et al. Paxillin phosphorylation counteracts proteoglycan-mediated inhibition of axon regeneration. Experimental Neurology. 248, 157-169 (2013).
