Summary
En detaljeret protokol for samtidige gennemførelsen af 48 parallelle cellekulturer under varierede forhold i et microbioreactor system er præsenteret. Celle kultur proces, høst og efterfølgende antistof titer analyse er beskrevet.
Abstract
Automatiseret mikroskala bioreaktorer (15 mL) kan være et nyttigt redskab for celle kultur ingeniører. De lette samtidige gennemførelsen af en lang række eksperimentelle betingelser samtidig minimere potentielle proces variabilitet. Anvendelser af denne tilgang omfatter: klone screening, temperatur og pH forskydninger, medier og supplement optimering. Desuden er lille reaktor diskenheder befordrende for store Design af eksperimenter, der undersøger en række betingelser. Dette giver mulighed for opstrøms processer skal optimeres betydeligt før skala-up hvor eksperimenter er mere begrænset i omfang på grund af tid og økonomiske begrænsninger. Automatiseret mikroskala bioreaktor systemer tilbyder forskellige fordele i forhold til traditionelle små celle kultur enheder, såsom ryste kolber eller spinner kolber. Under pilotstørrelse skal proces udvikling betydelige pleje tages til at sikre, at disse fordele er realiseret. Når kører med omhu, systemet kan aktivere højt niveau automation, kan programmeres til at køre DOES med et højere antal variabler og kan reducere prøvetagningstid når de integreres med et næringsstof analyzer eller celle counter. Integration af ekspert-afledte heuristik præsenteres her, med aktuelle automatiseret mikroskala bioreaktor eksperimenter kan minimere fælles faldgruber, der hindrer meningsfulde resultater. I ekstremt, kan undladelse af at overholde de principper, der er lagt ud her føre til udstyr skader som kræver dyre reparationer. Derudover har microbioreactor systemer lille kultur diskenheder vanskeliggør karakterisering af celle kultur betingelser. Antallet og mængden af prøver taget i processen i batch mode kultur begrænses som drift diskenheder ikke kan falde til under 10 mL. Denne metode vil diskutere fordele og ulemper ved individuel bioreaktor systemer.
Introduction
Monoklonale antistoffer (papagøjesyge) blev første gang produceret i mus hybridom celler i 19751. Siden da er sket en stigning i udvikling af rekombinante protein produktion at menneskeliggøre mAbs stigning i vivo sikkerhed og effektivitet2,3,4. De fleste af rekombinante protein produktionsprocesser ansætte kinesisk Hamster ovarie (CHO) celler for den lethed, hvormed de kan tilpasses til serum frie medier, deres evne til at producere proteiner med lignende posttranslationelle modifikationer som en medfødt menneskelig protein og deres pålidelighed som vært celler5,6.
Efterspørgslen er stigende til at levere produktet hurtigere, og for større patientgrupper med ensartet kvalitet. Ud over de økonomiske fordele, er repertoire af sygdomme behandles af mAbs stigende, som nu omfatter autoimmune sygdomme, efter transplantation komplikationer, gigt og kræft7. Gennemsnitlige udbytter for moderne kommercielle mAb produktionslinjer er typisk i intervallet 5-6 g/l og fortsætte med at stige5. Dette er dels opnået gennem CHO celle engineering og forbedret produktionslinje screening ved hjælp af høj overførselshastighed bioreaktorer8. Dog har de fleste stigninger i protein produktion blevet tilskrevet for at behandle forbedringer, herunder fremskridt i media optimering, celle kultur betingelser, og forbedret fodring strategier7,9,10. Næringsstof tilskud er afgørende ikke kun for ordentlig cellevækst men også for effektiv produktion af høj kvalitet protein. Derudover kræver celler støkiometriske tilsætning af specifikke næringsstoffer, som kræver yderligere forståelse for fodring strategi optimering6,11. Traditionelle optimering metoder omfatter individuelle medier komponent titrering og medier blanding med blandingen designs. Men disse metoder er tidskrævende, labor intensiv, og indebærer risici i forbindelse med menneskelige fejl12,13.
Media optimering undersøgelser tidligere påberåbt sig ryste kolber og 1-2 L bioreaktorer, som kan være uoverkommeligt dyre råvarer og menneskelig kapital. Mikroplader er også blevet brugt, men disse metoder giver begrænset skalerbarhed. Dette kan desuden stadig kræve flere tidskrævende kørsler, at indfører batch til batch variationer, som forplumrer den CQA variation forårsaget af medierne sammensætning og fodring strategi14,15,16. Således er behovet for høj overførselshastighed og meget konsekvent parallelle bioreaktor systemer opstået17,18,19,20.
Med den betydelige udgift forbundet med driften af traditionelle bænkstørrelse bioreaktorer (0,5-5 L), microbioreactors tilbyder en omkostningsbesparende alternativ for vurderingen af produktionen af biologisk fremstillet narkotika. 21 bænkstørrelse rørte tank bioreaktorer er pålidelig og giver tætte data via sensorisk arrays. Feedback kontrolsystemer giver mulighed for nem tilsyn med driften. Dog gør den forsamling, kalibrering, rengøring, lønomkostninger, substrat omkostninger og sterilisation krav bænkstørrelse rørte tank bioreaktorer dyrt og arbejdskrævende at operere. Ryste kolber og mikrotiter plader fjerne nogle af omkostningerne og labor problemer forbundet med større skala bioreaktorer, men disse alternativer giver svage kontrol over forarbejdning betingelser og producere lavdensitet data, ofte kun end-point målinger. 22
Alternativt, microbioreactors udnytte en lille arbejdsgruppe volumen for at give en skala-nede tilgang til cellelinie og upstream procesudvikling. Omfanget af microbioreactor eksperimenter kan signifikant fald løbende omkostninger gennem lavere udnyttelse af magt, substrat, labor, plads og hjælpeprogrammer. 23 Microbioreactors er ligesom ryste kolber, de er nemme at håndtere på grund af deres størrelse, men de bevare fordelene ved traditionelle bænkstørrelse bioreaktorer gennem deres online feedback kontrol af pH, temperatur, opløst ilt og syre/base forbrug samt deres real-time data output af kvalitetsparametre herunder off gas sammensætning. Microbioreactor skala giver mulighed for høj overførselshastighed screening evne, som kan være nyttige for klon udvælgelse og proces udvikling. 24
Avanceret mikroskala bioreaktor har vist sig at være et effektivt redskab til CHO celle kultur proces karakterisering og udvikling18. Heri, en automatiseret ambr15 system, bestående af 48 microbioreactors parallelt, der har vist sig at være sammenlignelig med klassisk rørte tank reaktorer i skala op undersøgelser,25 blev brugt på en måde, der svarer til forudgående arbejde, at optimeret medierne sammensætning til en CHO-DG44 cellelinje producerer en model kimære IgG16. Virkningerne af varierende media betingelser på vækst og titer blev sammenlignet, og analyseret. I dette papir er blevet præsenteret en generel retningslinje at køre i microbioreactor system og analyse af rå medier prøver.
Protocol
1. seed tog ekspansion
Bemærk: Denne protokol bruger 1 mL rekombinante DG44 CHO celle bestande, der er gemt med en tæthed på ~ 3 x 107 celler/mL. Fortyndinger og tidslinjer for individuelle CHO cellelinjer vil variere. Måle vækstkurver af cellelinie bruges på forhånd og justere i overensstemmelse hermed. Cellerne er i første omgang optøet i ryste målekolber og senere overført til en spinner kolbe. Bestem antallet af ryste kolber og spinner kolber behov for eksperimentet baseret på antallet microbioreactors, der vil blive kørt og målet såning tæthed.
- Hurtigt optø stock vial(s) CHO celler ved nedsænkning i et 37 ° C vandbad indtil kun en lille splint af ice resterne. Dekontaminering ydersiden af hætteglasset med 70% ethanol opløsning og en fnugfri serviet. Overfør til et kabinet biosikkerhed.
- Genopslæmmes celler af forsigtigt pipettering op og ned og 1 mL overføres til en steril 125 mL udluftet ryste kolbe indeholdende 29 mL pre varmede media suppleret med 8 mM L-glutamin og 1 x Penicillin/Streptomycin.
Bemærk: Medmindre andet er angivet, defineres udtrykket "medier" i denne protokol herefter som OptiCHO media. - Sted ryste flask(s) i en inkubator vedligeholdes ved 37 ° C og 8% CO2. Bruge en orbitalryster for at agitere celler med en hastighed på 130 rpm.
- Overvåge levedygtige celle tæthed (VCD) hver dag, ved hjælp af en automatiseret celle tælle enhed eller manuelt med en hemocytometer og trypan blå. Subkultur (fortyndet) celler 72 timer efter podning i friske medier (pre varm medier til 37 ° C hver gang det skal føjes til celler) sådan, at det endelige rumfang er 100 mL i en 125 mL spinner kolbe. Inkuber spinner kulturer på de samme betingelser anvendes til ryste kolben kulturer med en hastighed af 70 rpm.
Bemærk: Efter subkultur bør celler med en tæthed på 0,7-1 x 106 celler/mL. Sikre, at endelige tæthed ikke er under 0,5 x 106 celler/mL. Subkultur efter 96 timer hvis mål celle tæthed til podning i spinnere ikke kan nås. - På dag tre (en dag før inokulum præparater), tilføje frisk, pre varmede medier til spinner-flask(s) at opretholde ≥ 90% levedygtighed. Ikke Overskrid 125 mL samlede volumen. 6
2. kører automatiserede microbioreactor system
Forudsætninger: Brugeren skal have modtaget den relevante uddannelse fra producenten og skal være fortrolige med sikkerhed og driftsbetingelser for systemet.
- Initialisering og tilslutning til celle Counter
- Initialisere operativsystem software. Før du åbner softwaren, Sørg for tælleren celle (Se Tabel af materialer) kører sammen med de respektive software. Tælleren celle er integreret med systemet.
- Tilslut til celle counter fjernforbindelse før åbning af softwaren. Klik på remote desktop-ikonet og klik på "Opret forbindelse". Når den sen desktop er tilsluttet, skal du åbne celle counter software. Installere en ny reagens pack, Tom trypan blå affald og prime systemet.
- Minimere fjernforbindelsen og Åbn mikro bioreaktor softwaren ved hjælp af en eksisterende eksperiment som en skabelon til at oprette et nyt eksperiment. Navngive og gemme eksperimentet. Sikre, at tælleren automatiseret celle er forbundet under fanen status i softwaren. Status kan også kontrolleres på celle counter software.
- Definere plader og indlæsning af fartøjer
Bemærk: henvises til figur 1 til at orientere læsning af forbrugsvarer og reagenser på kultur stationer og dæk. Klemme pladerne skal være autoklaveres på en tyngdekraft cyklus (bruges til faste stoffer) før brug.- Før du starter en køre, definere pladerne anvendes under kørsel i afsnittet efterligne i softwaren. Navngive hver plade anvendes og udpeger hver plade til et dæk på microbioreactor kultur station.
- Bruge en 24-godt plade til media opladning og sted på den udpegede dækket af kultur station. Sted 1 mL og 4 mL pipette tip kasser i afsnittene som angivet i figur 1.
- Placer en 24-godt podning plade på de respektive dæk af kultur station. Placer single-godt 1 X phosphat bufferet saltvand (PBS) plade på dæk 1. Single-godt 1 M NaOH pladen anbringes på dæk 2 og 24-godt antifoam pladen på dæk 7 (positioner som anført i figur 1). Dæk numre er beregningsmåden vist under fanen "Efterligner" i softwaren.
- Pakke ud de kultur fartøjer (udstyret med sparger) inde i sikkerhed kabinet hætten. Placer tolv sterile kultur fartøjer pr. kultur station. Sted autoklaveres klemme plader på toppen af fartøjer. Sikre at hullerne i skær fastsatte omrørere alle står over for samme retning for lettere placering.
Bemærk: Ved hjælp af en permanent markør, kategorisere kultur fartøjer før du placerer dem i kultur station til at spare tid og undgå forvirring på tidspunktet for høsten. - Klemme plade O-ringe er den første del til at bære efter gentagne autoklavering, derfor nøje kontrollere dem før autoklavering før hvert forsøg. At holde et sterilt klemme plade som back-up i tilfælde af O-ring svigt anbefales.
- Sted rør plader ovenpå klemme plader, sikrer hver pin er sikkert indsat. Sikre klemme plader med skruer og knopper leveres. Stram knapperne, indtil de er hånd stramt. Stramme venstre og højre drejeknapper alternativt for selv placeringen af klemme plade.
Bemærk: Hvis klemmen er ikke flush mod overfladen eller hvis skruer i slutningen af den klemme plade er ujævnt strammet, fartøjerne, der vil opleve opløst ilt (DO) problemer. Hvis disse justeringer ikke kan rette problem, tjekke O-ringe som ufuldstændig lukning af plader kan føre til ineffektive gasning af kultur.
- Kører automatiseret mikro bioreaktor softwaren
Bemærk: brug "Procestrin" fanen for at redigere eller oprette nye skridt. Skridt der skal programmeres individuelt til at starte og stoppe enhver proces. Klik på knappen "Indsæt trin" under fanen proces trin til at oprette nye trin eller dobbeltklik på en eksisterende trin at redigere dette skridt. Programskridt er opdelt i ti store afsnit: opstart, medier opladning, Antifoam tilsætning, / pH kontrol, baggrund Base tilføjelser, pause pH, podning, 5 X celletal, 10 X celletal, næringsstof Analyzer prøveudtagning og kultur Station lukning. Den køre varighed er normalt mellem 7-9 dage når køres i batchtilstand.- Systemet initialiserer og kontrolleres for tilstedeværelse af de relevante fartøjer. Scan stregkoden med kultur fartøjer. Den samme stregkode kan anvendes for kultur stationer med tomme fartøjer eller fartøjer, der ikke bliver brugt.
- Systemet vil begynde med designet program efter kontrol gør kontrol, gasning og andre forbindelser.
Bemærk: Brugeren kan fortsætte med programmet selv hvis en fejl opstår, men gøre det på brugerens risiko og hvis proceduren frem ikke skade systemet og vil ikke afbryde forsøget. For eksempel, kan gasning være slukket for visse fartøjer ikke anvendes i forsøget, som vil dukke op som en fejl, men kan tilsidesættes.
- Opstart og medier opladning
- Den første dag til opsætning af systemet eller medierne opladning dag er udpeget som dag 0 kultur tid.
- Under afsnittet Start første belastning pipette tips, 1 mL og 4 mL, som programmeret. Hvis allerede placeret, klik på Fortsæt. Placer den medier plade, 1 X PBS, 1 M NaOH, antifoam plade, medier opladning og podning plader i de udpegede dæk, eller hvis allerede placeret, presse fortsætte med at flytte til næste trin.
- Som en del af start protokol, begynder temperaturkontrol og Indstil temperaturen til 37 ° C. Tænd omrøring på 1000 rpm og gøre / pH overvåge.
- Næste, Udfør medier opladning program. Flydende handleren af automatiserede microbioreactor system vil give afkald på medierne fra media plade for kultur fartøjer som kortlagt i programmet. Medierne tilføjet er OptiCHO med varierende proces forhold.
Bemærk: To brønde fra en 24-godt plade er forpligtet til at fylde én kultur fartøj til kapacitet (13 mL), som hver brønd kan kun rumme 8 mL af medier. Bruge 7-8 mL i hver brønd til at forhindre tegning luft når medierne blandes af flydende handler inden opladning. - Når media opladning er gjort, tilføjes 35 µL af Ex-celle antifoam fra den antifoam plade til kultur fartøj. Giver 30 minutter til næringssubstratet bliver godt blandet og den optiske / pH sensorer til at blive hydreret.
Bemærk: I samme mængde antifoam tilføjes periodisk hele kultur tid når der skummende opdages. 6 Foaming påvises visuelt, og reaktortanke kontrolleres hver dag for skummende. Antifoam er tilføjet straks ved detektion. - DO / pH kontrol tændes derefter for at starte overvågning og registrering og pH af næringssubstratet. Tillad gør at nå sætpunktet af de 50%, hvilket tager mindst 2 h.
- Efter ækvilibrering, drej på baggrund base Tilføjelser til at opnå en pH sæt punkt 7.1 for alle fartøjer, kultur. Give og pH til blandingen henstår natten over og at være helt hydreret.
- Midlertidigt afbrudt pH - dag 1 pH forskydning
- Den næste dag (markeret som dag 1), udføre trinnet standset pH hvorved Vælg kultur fartøjer er analyseret og en pH korrektion offset bestemmes.
Bemærk: Antallet af pH fartøjer skal udtages til modpostering af pH er brugeren bestemmes. En prøve fra hvert reaktortanken må ikke være nødvendig, hvis du har en god repræsentation af befolkningens bioreaktor. - Placer røret prøveholderen plader på udpegede dæk og belastning mikro centrifugeglas med caps åbne og skjules ved siden af dem. Flydende handleren vil undvære 600 µL af celle kultur væske ind i røret, som kortlagt i programmet.
-
Straks fjerne prøve og måle pH på et næringsstof bioanalyzer der har været korrekt kalibreret og som er blevet kørt QCs, (se nedenfor, "Daglige næringsstof og metabolitten analyse").
Bemærk: Prøver køres individuelt, umiddelbart efter tegning, for at undgå pH-ændringer som følge af udsættelse for luft, da afgasning af CO2 fra prøven kan forårsage pH-ændringer. - Hit "fortsætte" efter hver prøve, ellers det næste skridt ikke vil blive udført.
- Angiv de eksterne, FLEX-afledte pH værdier i software, "kompilering" forskydningerne for de stikprøveudvalgte fartøjer automatisk. Manuelt gennemsnitlig forskydningerne opnået for eksempel fartøjer og indtaste nummeret under brugeren pH offset kolonne under fanen "Fartøj Data". Den gennemsnitlige offset ville derefter anvendes for alle fartøjer. Tillad pH til blandingen henstår i mindst 2-3 timer, hvorefter kultur fartøjer kan podes.
- Den næste dag (markeret som dag 1), udføre trinnet standset pH hvorved Vælg kultur fartøjer er analyseret og en pH korrektion offset bestemmes.
- Podning
- Efter måling VCD, overføre hele indholdet af spinner-flask(s) i en steril, 250 mL konisk centrifugeglas tube og pellet celler ved centrifugering i 10 min på 140 x g ved stuetemperatur. Dekanteres de gamle medier og genopslæmmes i nok friske medier Sådan, at den endelige tæthed bør være 1 x 106 celler/mL efter tilsætning af inokulum kultur fartøj.
- Tilføje suspenderede cellerne i det angivne godt af en steril låg 24-godt plade. Tilføj 3 mL af inokulum til hver brønd, hvoraf 2 mL vil blive fjernet som inokulat for hvert fartøj, kultur.
- Inokulum pladen anbringes på den udpegede dæk inde i hætten. Sørg for at spray ydersiden af låg inokulum plade med 70% alkohol før du placerer det inde i hætten.
- Celle optælling ved hjælp af automatiseret celle Counter
- Efter podning, lade kultur fartøjer Blandingen henstår i mindst en time. Efter en time, skal du udføre 5 X celle tælle skridt i programmet. 5 X angiver fortyndingsfaktoren bruges til at læse celletal.
Bemærk: 5 X celletal bruges først når cellerne er i den mellemliggende fase. Efter cellerne nå deres eksponentiel fase bruges 10 X celletal. Baseret på prøve- og fortynder diskenheder apparatet automatisk tegner sig for fortyndingsfaktoren og justerer den endelige værdi i overensstemmelse hermed. - Den flydende handler først tilføjer 480 µL 1 X PBS til celle counter cup efterfulgt af tilsætning af 120 µL af celle kultur væske fra kultur fartøj. Celletal derefter læses ved hjælp af automatiserede celle counter. Dette skridt gentages for alle fartøjer.
- Celletal er det sidste skridt til dag 1 i forbindelse med kultur. Sammen med og pH data celletal er data (levedygtige celle tæthed og levedygtighed) også indspillet dagligt af softwaren.
Bemærk: Ren celle counter cup mindst to gange i løbet af køre med 70% IPA til at forhindre tilstopning af linjer. Linjer og flow-cellen rengøres automatisk efter hver celletal.
- Efter podning, lade kultur fartøjer Blandingen henstår i mindst en time. Efter en time, skal du udføre 5 X celle tælle skridt i programmet. 5 X angiver fortyndingsfaktoren bruges til at læse celletal.
- Midlertidigt afbrudt pH - dag 2 pH forskydning
- På dag 2 af tid, kultur, Gentag trinnet "Standsede pH" ved hjælp af kultur fartøjer end dem, der blev udtaget fra under trinnet indledende standset pH.
Bemærk: Prøveudtagning flere af befolkningens fartøj til midlertidigt afbrudt pH vil give en bedre forskydning for pH korrektion. Derfor, ikke prøve de samme fartøjer, der anvendes til midlertidigt afbrudt pH fra den foregående dag.
- På dag 2 af tid, kultur, Gentag trinnet "Standsede pH" ved hjælp af kultur fartøjer end dem, der blev udtaget fra under trinnet indledende standset pH.
- Daglige næringsstof og metabolitten analyse
- Prøver vil blive taget for næringsstofanalyse fra dag 2 af kultur i slutningen af forsøget og analyseret ved hjælp af næringsstof bioanalyzer.
- Placer røret prøveholderen plader på udpegede dæk og belastning mikro centrifugeglas med caps åbne og skjules ved siden af dem. Flydende handleren vil undvære celle kultur væske ind i røret, som kortlagt i programmet.
Bemærk: For første er par dage (dage 2-4) mængden af prøve udtaget fra kultur fartøj 300 µL. Dette er fortyndet med 300 µL 1 X PBS udleveres af flydende handleren. Dette er gjort for at bevare kultur volumen og forhindre, at niveauet falder under 10 mL. Derudover falder næringsstof værdier for de første par dage inden for rækkevidden instrument efter fortynding. - Placer prøverne i bakken analyzer til at udføre den næringsstofanalyse.
Bemærk: Fryse eventuelle prøver, der ikke vil blive analyseret på samme dag.
- Lukning af systemet
- For at afslutte Kør, skal du først deaktivere temperaturkontrol efterfulgt af agitation. Andet stop DO / pH kontrol og baggrunden base tilføjelser. For det tredje stop alle andre kontrolelementer. Endelig stoppe Systemovervågning.
- Skru klemmen og rør plader og fjerne kultur fartøjer. Rengøre indersiden af kultur station med en fnugfri serviet. Placer de tørring plader på kultur station og skrue dem i.
Bemærk: Tørring cyklus er påkrævet for den afkølede version af systemet og er ikke nødvendigt for standardversionen af systemet. - Effektuere den 2 timers tørring cyklus på programmet. Ren efterfulgt klemme plader ved hjælp af ultrarent vand af 70% isopropylalkohol (IPA) at fjerne mulige kondenseret væske i linjerne. Skyl med luft til at fjerne enhver resterende væske.
- Klik på "Stop" i bioreaktor softwaren en gang tørring cyklussen er færdig.
3. celle kultur høst
- Overføre celle kultur væske fra reaktoren fartøjer og pellet celler på 1,962 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Dekanteres. Ved hjælp af et 0,22 µm PVDF sterile Datofilter dekanterede celle kultur væske.
- Alikvot 1 mL sterilt celle kultur væske ind i 1,5 mL Eppendorf-rør giver en titer analyse. Gemme 1 mL rør ved-20 ° C. Rense resten af den høstede celle kultur væske ved hjælp af hurtig protein Væskekromatografisk system. 6
4. måling af IgG Titers
Bemærk: Dette er en summarisk oversigt over løb og analysere prøver ved hjælp af proteinA biosensor system. Alle assay parametre ( f.eks. temperatur, Læs tid, rpm, etc. ) skal bestemmes empirisk for hver prøvetype.
- Tænd for systemet og tillade lampe til at varme op til mindst 1 h. Fjern prøver fra fryseren til tø og reagensglasset stuetemperatur.
- I systemet Indstil software, plade temperaturen til 26 ° C. Pre sættetid antallet af Protein A tips til at blive brugt i prøvematrixen (f.eks. cell media) til mindst 30 minutter.
Bemærk: Den optimale temperatur skal bestemmes empirisk. En temperatur på 26 ° C bruges her til at minimere prøve fordampning under længere analyse gange og tillade instrument til at holde en ensartet temperatur (ved at være adskillige grader over den omgivende temperatur). Prøver skal være præ afbalancerede til den valgte assay temperatur før måling af inkubere prøve plade på prøve scenen for ≥ 10 minutter. - Opbygge en protein standardkurve ved hjælp af den samme antistof koncentreret til 10 mg/mL og seriefremstillede fortyndes i prøvematrixen (dvs. medier) i det område, der skal påvises.
Bemærk: Det er vigtigt at opnå en høj koncentration af antistof mod minimere matrixeffekter på grund af fortynding, men det er også vigtigt at ikke over koncentrere antistoffet og inducerer sammenlægning. Kører en i-plade Standardkurven for hver prøve plade er at foretrække. Minimalt, skal positiv kontrol anvendes til at redegøre for spids til spids og plade til plade variabilitet. En ny standardkurven skal oprettes for hver ny masse protein en tips anvendes. - Designe prøve plade (for eksempel, se figur 2). I et protein A kan assay, der bruger regenerering, op til 80 prøver analyseres, som omfatter ukendt kultur prøver, standarder og kontroller. For hver plade, analyseret, vil en enkelt protein A tip blive brugt til at måle op til 10 prøver på tværs af plade (kolonne 1-10), med en fornyelse cyklus i mellem hver prøve.
Bemærk: Det anbefales, at den hele første række plade (linje A) bruges som negativ kontrol og reference. I analysen behandles her, bruges rækker B og C til to positive kontroller; en på nederst og én på den øvre grænse for den lineære svar. Dette sikrer, at hvert tip måler negative og positive kontroller før analysere prøver. Dette set-up forenkler reference subtraktion i analyse software. De resterende brønde anvendes derefter til ukendte prøver. Hvis der er en prøve hul i en af rækkerne, der skal være en matrix i at nå for at forhindre udtørring af spidsen (dvs. Wells A2 gennem G2 har prøve mens H2 ikke. Sikre H2 indeholder prøvematrixen for at sikre aflæsse ikke tørre ud inden vi går videre til at prøve H3). Endelig ikke udstødning tips ved hjælp af et sæt til at analysere flere plader. Bruger en ny, er ikke-regenereret sæt for hver plade anbefalet. - Forberede prøver til analyse af forsigtigt blanding, enten ved inversion eller pipettering, efterfulgt af en pulse spin at indsamle prøven i bunden af røret. For koncentreret prøver, skal du oprette passende fortynding replikater af fortynding i prøvematrixen.
Bemærk: Det lineære område af bindende for et antistof for protein en bio-lag interferometri (BLI) målinger vil variere af både antistof, assay betingelser og matrix. Dette bør afgøres empirisk på forhånd at sikre passende prøve fortyndinger anvendes. - Forberede 96-godt prøve plader så tæt på assay tid som muligt. Sikre, at der er ingen luftbobler i nogen af brøndene. Fjerne luftbobler med en ren pipette spids eller ved centrifugering.
- Læg pladen ind i systemet og køre assay benytter standarden "Høj følsomhed Assay med regenerering" i datafangst software. Analysere ved hjælp af HT dataanalyse software.
Bemærk: Hvis pladerne er at være forberedt i god tid på grund af begrænsninger, forsegle sikkert med film at forhindre fordampning. Erhvervelse priser og tider afhængig af forventede titers muligvis justeres. Se i brugervejledningen til den vejledning. - Ved hjælp af dataanalyse software, reference subtrahere og beregne koncentrationen af de ukendte prøver ved hjælp af standardkurven og funktionen indledende hældning (IS) med en lineær point-to-point passer.
Representative Results
Overvåge kritiske parametre og andre celle kultur parametre i hele cellekulturer operation er et vigtigt aspekt i diagnostikprodukter. Celle counter og næringsstof analyzer blev brugt til at kvantificere fem attributter, der karakteriserer cellevækst, næringsstof forbrug og biprodukt dannelse. Celle tæller blev fremstillet dagligt for alle kultur betingelser. Den gennemsnitlige levedygtige celle tætheder og viabilities er som det ses i figur 3 sammen med deres ±1 SD interval. Næringsstof og biprodukt profiler vises også med ±1 SD interval gennem den stationære fase kulturer. Hældningen af denne profil repræsenterer den gennemsnitlige glukose og glutamin forbrug og laktat produktion, priser. Samlet, disse resultater viser gennemførligheden af overvågning disse attributter i microbioreactor systemet. og kapacitet af microbioreactor systemet til at opretholde disse parametre, inden for en stram vifte.
Den samlede produktivitet i cellekulturer var kvantificeres ved hjælp af en proteinA biosensor system efter høstede celle Kulturmedier blev vedtaget gennem et 0,22 micron PVDF filter. Den specifikke produktivitet pr. celle varierede fra 0.87 pg/celle-d til 1,15 pg/celle-d som det ses i figur 4. Baseret på disse resultater kan blive undersøgt en lang række betingelser for at vælge medier sammensætning og foderstrategier, at Maksimer mængden af protein produceret for en minimal investering i eksperimentelle procedurer.
Figur 1 : Layout af microbioreactor systemet med 4 kultur stationer (CS) at have 12 reaktortanke hver. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Eksempel prøve plade set-up for en grundlæggende kvantitering med regenerering eksperiment på proteinA biosensor system. række 1 (rød "R") er forbeholdt referenceprøve (dvs. matrix fraværende analysand); række 2 (aquamarine) er et sæt af standarder (koncentrationer er i µg/mL); rækker 3 og 4 (orange) er sæt af lave og høje positive kontroller ("PL" og "PH," henholdsvis); rækker 5-10 (lilla) indeholder ukendte prøver; rækker 11 og 12 (grey) er program-standard positioner for regenerering ("R") og neutralisering ("N") buffere. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : en) gennemsnitlig levedygtige celle tæthed og levedygtighed profiler over en alder af en batch. ± 1 SD er også vist at angive stram kontrol af cellevækst i microbioreactor systemer. b) gennemsnitlige ernæringsprofil for glucose samt glutamin og den gennemsnitlige biprodukt profil for laktat. ± 1 SD er også vist at angive stram kontrol over medierne sammensætning i microbioreactor systemer. (N = 3, alle betingelser blev kørt i tre eksemplarer). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Repræsentative box-plot af gennemsnitlige specifikke produktiviteten af de forskellige medier betingelser. (N = 3, alle betingelser blev kørt i tre eksemplarer) Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Kører automatiseret mikro bioreaktor systemet ordentligt og omfatter effektivt rettidig gennemførelse af flere automatiserede trin. En af de vigtigste dele af kører systemet programmeringssoftware. Hvis der er nogen fejl under skrivning af programmet, vil der være alvorlige fejl i det eksperiment, der kan medføre uventede ændringer i den proces, fodring strategi, prøvetagningsmetode eller endelige produktkvalitet, som kan medføre, at resultaterne af undersøgelsen. Et andet vigtigt aspekt af kører systemet er at placere og stramme klemme plade korrekt for at sikre ordentlig kontrol. Den mest almindelige betegnelse at klemme plade har strammet ujævnt er uventet variationer i målinger for fartøjer på 1, 6, 7 og 12 (hjørne reaktortanke). Samlede angiver ustabilitet en lempelse af pakninger på fjorden gasledninger i klemme plader. Dette scenario kan hindre, at nå sætpunkt. En anden fælles faldgrube at undgå, når du starter et eksperiment er at lade cellerne sidder for længe under trinnet podning, forårsager dem til at slå sig ned. Jo mindre tid cellerne bruger mødet, skader jo mindre chance er at gradvist lavere inokulum celletal er tilføjet kronologisk reaktoren fartøjer, som kan fremkalde betydelige bias, uforvarende undersøgelsens resultater. Det er bedre at podes i flere faser, podes dvs hver kultur station efter hinanden med pause trin i mellem så cellerne ikke sidder i podning plade i mere end 15 minutter.
Vedrørende den daglige brug, vedligeholdelse af steriliteten er afgørende. Selv om systemet er i en biologisk sikkerhed kabinet, sterilitet ikke er sikret på grund af hyppige bevægelse ind og ud af hætten. Derfor skal alt, der går i hætten sprøjtes med 70% IPA. For det andet er det vigtigt at sikre, at minimal skumdannelse opstår under kultur; medierne kan tilstoppe gasning og udstødning linjer, fører til skader på klemme plade og endda grundlæggende komponenter nedenfor. Forebyggende anti-skum tilføjelse trin er afgørende i enhver mikro bioreaktor programdesign. I tilfælde af en "skum ud af" det ville være gavnligt at følge producenter rengøring protokol og kan forhindre permanent beskadigelse af klemme plader. Alternativt, brug af ikke-sparged fartøjer kan være gavnligt for lavere celle tætheder eller, når der køres i batchtilstand, som højere overflade til volumen-forholdet muliggør effektiv ilt selv med manglen på en sparger. Ikke-sparged fartøjer kan dog ikke være nyttigt for høj cellekulturer tæthed eller perfusion som hoved rummet er utilstrækkelig til at holde med kulturer stigende forbrug af ilt.
Der er mange fordele, som microbioreactor systemet, da det giver flere kontrollerede kulturer skal køres parallelt på en lille skala med større kontrol end ryste kolber. 17 derfor, systemet letter gennemførelsen af screening studies, gør, høje overførselshastighed klon undersøgelser og Transfektion undersøgelser. Automatiseret flydende håndtering reducerer også analytiker til analytiker variabilitet og samtidig minimere trættende og tidskrævende arbejde for uddannet personale. Mens der er flere fordele ved systemet, er der flere vigtige ulemper, der bør overvejes. Først, en kultur volumen på 15 mL væsentligt begrænser i proces prøvetagning og sidste høst materiale og flere alternative små bioreaktorer (op til 500 mL) har for nylig blevet tilgængelige. En nylig avancement til systemet er integrationen af den automatiserede mikroskala bioreaktor med BioProfile FLEX 2 analyzer fra Nova biomedicinsk, der afbøder i processen-prøvetagning spørgsmålet ved at reducere sample volumen for celle tæthed og næringsstof analyse . Fordele kan omfatte hurtig opsætning og stort set ingen rengøring førende driftsmæssige besparelser, men omkostningerne ved engangs enheder bør overvejes for lange sigt projekter, som det kan være dyrere at købe enheder end de genanvendelige konventionelle systemer.
Metoden drøftet i dette papir er primært egnet til batch mode cellekultur, men kan ændres alt efter behov af brugeren. Hver kultur station har uafhængig kontrol af temperatur, mens og pH kan varieres på niveau med individuelle reaktortanke. Sartorius tilbyder også DoE planlægning software designet specielt til at tillade eksperimenter til at være skræddersyet til mikro bioreaktor system. Storstilet DoE undersøgelser ved hjælp af den nye DoE software leveret af fabrikanten kan hjælpe i medier og supplere optimering. Selv om ikke bruges her, microbioreactor systemet også giver mulighed for fed-batch undersøgelser. Systemet har ikke endnu blevet optimeret til perfusion cellekulturer. Der har imidlertid været begrænsede undersøgelser og forsøg at efterligne perfusion celle kultur operation i det nuværende mikro bioreaktor system. 26 denne metode kan ændres til at efterligne højdensitet perfusion kulturer af celle afregning. Ved at variere højden som pipette er indsat i reaktoren og ved at optimere bilægge tid kan medierne fjernet og genopfyldes til spejl overfloden tilstand af kultur. Der er nye produkter i denne udvikling område, der kan fungere bedre end systemet præsenteres her evt perfusion tilstand af kultur.
I Resumé, denne undersøgelse viser brugen af automatiseret mikro-bioreaktorer og tilhørende analytiske for CHO celle kultur operationer til at producere og karakterisere en model IgG1 monoklonalt antistof. Det fremhæver rollespil små micro-bioreaktorer i bioproces fremstilling og deres indvirkning på celle kultur udvikling og medier screening. Mens der er mange fordele ved at bruge en automatiseret lille skala system, for at fuldt ud for at realisere deres fordele behandle forståelse og analytiske karakterisering er bydende nødvendigt. Denne undersøgelse giver brugeren med en retningslinje for ved hjælp af en automatiseret mikroskala reaktor system, der kan være udviklet og forbedret pr. individuel forskningsbehov.
Disclosures
Disclaimer: Denne publikation afspejler synspunkter af forfatteren og skal ikke fortolkes til at repræsentere FDAS synspunkter eller politikker.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Scott Lute for den analytiske støtten. Delvis interne finansiering og støtte til dette arbejde blev leveret af CDER kritisk sti Program (CA #1-13). Dette projekt blev delvist understøttet af en udnævnelse til programmet praktik/forskning deltagelse på kontoret af bioteknologiske produkter, US Food and Drug Administration, administreret af Oak Ridge Institut for videnskab og uddannelse gennem en tværinstitutionelle aftale mellem den amerikanske Department of Energy og FDA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO DG44 Cell Line | Invitrogen | A1100001 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius | 001-2804 | automated micro bioreactor |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors - Sparged | Sartorius | 001-2B80 | |
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0040 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0039 | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius | A-0038 | |
| 1 Well plates | Sartorius | A-0068 | |
| Vi-Cell XR cell counter | Beckman Coulter | 731050 | automated cell counter |
| EX-CELL Antifoam (gamma irradiated) | Sigma-Aldrich | 59920C-1B | |
| CD OptiCHO AGT Medium | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning | 25-005-CV | |
| 100X Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-001-CI | |
| 125 mL F-Bottom Shake Flasks (Sterile, Vented) | Fisher Scientific | PBV12-5 | |
| 125 mL glass Spinner Flasks | Corning Life Sciences Glass | 4500-125 | |
| 250 mL PP Conical Centrifuge Tubes (Sterile) | Nalgene (Thermo Scientific) | 376814 | |
| TC20 Automated Cell Counter | BioRad Laboratories, Inc. | 1450103 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 10x PBS | Corning | 46-013-CM | |
| BioProfile FLEX Analyzer | Nova Biomedical | 49418 | Nutrient Analyzer |
| Octet Red 96 | Pall FortéBio | 99-0042 | Protein A Biosensor |
| Protein A Dip and Read Biosensors | Pall FortéBio | 18-5010 | |
| Polypropylene 96-well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black | Greiner Bio-One | 655209 |
References
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495-497 (1975).
- Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Current Opinion in Pharmacology. 12 (5), 615-622 (2012).
- Jakobovits, A. Production of fully human antibodies by transgenic mice. Current Opinion in Biotechnology. 6 (5), 561-566 (1995).
- Maksimenko, O. G., Deykin, A. V., Khodarovich, Y. M., Georgiev, P. G. Use of Transgenic Animals in Biotechnology: Prospects and Problems. Acta Naturae. 5 (1), 33-46 (2013).
- Jayapal, K. P., Wlaschin, K. F., Hu, W., Yap, M. G. Recombinant protein therapeutics from CHO cells-20 years and counting. Chemical Engineering Progress. 103 (10), 40 (2007).
- Velugula-Yellela, S. R., et al. Impact of media and antifoam selection on monoclonal antibody production and quality using a high throughput micro-bioreactor system. Biotechnology Progress. , (2017).
- Foltz, I. N., Karow, M., Wasserman, S. M. Evolution and Emergence of Therapeutic Monoclonal Antibodies. Circulation. 127 (22), 2222-2230 (2013).
- Kondragunta, B., Drew, J. L., Brorson, K. A., Moreira, A. R., Rao, G. Advances in clone selection using high-throughput bioreactors. Biotechnology Progress. 26 (4), 1095-1103 (2010).
- Altamirano, C., Paredes, C., Cairo, J., Godia, F. Improvement of CHO cell culture medium formulation: simultaneous substitution of glucose and glutamine. Biotechnology Progress. 16 (1), 69-75 (2000).
- Selvarasu, S., et al. Combined in silico modeling and metabolomics analysis to characterize fed-batch CHO cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 109 (6), 1415-1429 (2012).
- Seth, G., Ozturk, S., Zhang, C. Cell Culture Bioprocess Engineering. Hu, W. -S. , Wei-Shou Hu. Ch. 4 97-126 (2012).
- McKeehan, W. M. K., Ham, R. The Growth Requirements of Vertebrate Cells In vitro. Ham, R., Waymouth, C., Chapple, P. , Ch. 223 223-243 (1981).
- Jordan, M., et al. Cell culture medium improvement by rigorous shuffling of components using media blending. Cytotechnology. 65 (1), 31-40 (2013).
- Castro, P. M. L., Hayter, P. M., Ison, A. P., Bull, A. T. Application of a statistical design to the optimization of culture medium for recombinant interferon-gamma production by Chinese hamster ovary cells. Applied Microbiology and Biotechnology. 38 (1), 84-90 (1992).
- Liu, C. -H., Chu, I. M., Hwang, S. -M. Factorial designs combined with the steepest ascent method to optimize serum-free media for CHO cells. Enzyme and Microbial Technology. 28 (4-5), 314-321 (2001).
- Parampalli, A., et al. Developement of serum-free media in CHO-DG44 cells using a central composite statistical design. Cytotechnology. 54 (1), 57-68 (2007).
- Hsu, W. -T., Aulakh, R. P., Traul, D. L., Yuk, I. H. Advanced microscale bioreactor system: a representative scale-down model for bench-top bioreactors. Cytotechnology. 64 (6), 667-678 (2012).
- Janakiraman, V., Kwiatkowski, C., Kshirsagar, R., Ryll, T., Huang, Y. -M. Application of high-throughput mini-bioreactor system for systematic scale-down modeling, process characterization, and control strategy development. Biotechnology Progress. 31 (6), 1623-1632 (2015).
- Kim, B. J., Diao, J., Shuler, M. L. Mini-scale bioprocessing systems for highly parallel animal cell cultures. Biotechnology Progress. 28 (3), 595-607 (2012).
- Legmann, R., et al. A predictive high-throughput scale-down model of monoclonal antibody production in CHO cells. Biotechnology and Bioengineering. 104 (6), 1107-1120 (2009).
- Schäpper, D., Alam, M. N. H. Z., Szita, N., Lantz, A. E., Gernaey, K. V. Application of microbioreactors in fermentation process development: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 395 (3), 679-695 (2009).
- Hegab, H. M., ElMekawy, A., Stakenborg, T. Review of microfluidic microbioreactor technology for high-throughput submerged microbiological cultivation. Biomicrofluidics. 7 (2), 021502 (2013).
- Rameez, S., Mostafa, S. S., Miller, C., Shukla, A. A. High-throughput miniaturized bioreactors for cell culture process development: Reproducibility, scalability, and control. Biotechnology Progress. 30 (3), 718-727 (2014).
- Xu, P., et al. Characterization of TAP Ambr 250 disposable bioreactors, as a reliable scale-down model for biologics process development. Biotechnology Progress. 33 (2), 478-489 (2017).
- Delouvroy, F., et al. Evaluation of the advanced micro-scale bioreactor (ambr™) as a highthroughput tool for cell culture process development. BMC Proceedings. 7 (6), 1-3 (2013).
- Kelly, W., et al. Optimizing performance of semi-continuous cell culture in an ambr15 microbioreactor using dynamic flux balance modeling. Biotechnology Progress. , (2017).
