Summary
Microbioreactor 시스템에 다양 한 조건에서 48 병렬 세포 배양의 동시 작업에 대 한 자세한 프로토콜 제공 됩니다. 셀 문화 과정, 수확 및 후속 항 체 titer 분석을 설명 합니다.
Abstract
자동된 눈금 bioreactors (15 mL) 세포 문화 엔지니어를 위한 유용한 도구 수 있습니다. 그들은 잠재적인 프로세스 변화를 최소화 하면서 다양 한 실험 조건의 동시 실행을 촉진 한다. 이 방법의 응용: 심사, 온도 및 pH 변화, 미디어 및 보충 최적화 복제. 또한, 작은 원자로 볼륨에 큰 디자인의 실험 조건의 넓은 범위를 조사에 도움이 되는. 이로써 업스트림 프로세스가 크게 확장 하기 전에 최적화 실험 범위 시간과 경제적인 제약 때문에 더 제한 됩니다. 자동된 미 생물 시스템 전통적인 작은 규모에 비해 다양 한 장점을 쉐이크 플라스 크 또는 회전자 플라스 크 등의 셀 문화 단위를 제공합니다. 그러나, 파일럿 규모 중 프로세스 개발 중요 한 배려는 이러한 이점을 실현 되도록가지고 한다. 관리와 실행, 시스템 높은 수준의 자동화를 사용할 수 있습니다 변수의 높은 숫자 미상의 실행 프로그램 될 수 있다, 샘플링 시간을 줄일 수 있습니다 영양소 분석기 또는 셀 카운터와 통합 될 때. 여기, 현재 자동화 된 미 생물 실험으로 제시 하는 전문가 파생 휴리스틱의 통합 의미 있는 결과 방해 하는 일반적인 함정을 최소화할 수 있습니다. 극단, 여기 배치 원칙을 준수 하는 실패는 비싼 수리를 필요로 하는 장비 손상 발생할 수 있습니다. 또한, microbioreactor 시스템 작은 문화 볼륨 셀 문화 조건의 특성을 어렵게 만들고 있다. 샘플 프로세스에서 일괄 처리 모드 문화에서의 양과 수 운영 볼륨 10 mL가 수로 제한 됩니다. 이 메서드는 혜택 및 미 생물 시스템의 단점을 논의할 예정 이다.
Introduction
단일 클론 항 체 (mAbs) 19751마우스 hybridoma 세포에서 처음 생산 되었다. 이후로, 재조합 단백질 생산의 증가 증가 vivo에서 안전 및 효능2,,34mAbs 인간적으로 자리를 차지 했다. 재조합 형 단백질 생산 프로세스의 대부분 고용 된 그들은 혈 청 자유로운 미디어, 그들의 생산 능력을 타고 난 인간의 비슷한 포스트 번역 상 수정 단백질을 적용할 수 있습니다 용이성에 대 한 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 단백질 그리고 호스트 셀5,6으로 그들의 신뢰성.
수요가, 빠르고 일관 된 품질을 가진 큰 환자 인구에 대 한 제품을 제공 하 성장 하고있다. 경제 혜택 이외 mAbs에 의해 치료 하는 질병의 레 퍼 토리 증가, 면역 질환, 이식 후 합병증, 관절염, 그리고 암7이제 포함. 현대 상업 mAb 생산 라인에 대 한 평균 수율은 일반적으로 5-6 g/L의 범위에서 고5상승 하는. 부분적으로,이 조 세포 공학 및 높은 처리량 bioreactors8를 사용 하 여 향상 된 생산 라인 심사를 통해 성취 되었습니다. 그러나, 단백질 생산에 대부분 증가 처리 개선, 발전을 포함 하 여 미디어 최적화, 셀 문화 조건에에서 고 먹이 전략7,,910기인 되었습니다. 영양 보충 뿐만 아니라 고품질 단백질의 효율적 생산을 위한 뿐만 아니라 적절 한 세포의 성장을 위해 필수적 이다. 또한, 셀 전략 최적화6,11을 먹이 대 한 추가 이해를 필요로 특정 영양소의 화학 량 론 추가 필요 합니다. 전통적인 최적화 방법에는 개별 미디어 구성 요소 적정 및 혼합 디자인 혼합 미디어 포함 됩니다. 그러나, 이러한 방법은 시간이 걸리고, 노동 집약 되며 인간의 오류12,13와 관련 된 위험을 포함.
미디어 최적화 연구 이전 쉐이크 플라스 크와 원료 및 인적 자본 prohibitively 비싼 될 수 있는 1-2 L bioreactors에 의존. Microplates는 또한 사용 하지만이 메서드는 제한 된 확장성을 제공. 또한,이 여전히 미디어 구성 및 먹이 전략14,,1516기인 CQA 가변성을 가린다는 일괄 배치 변화를 소개 하는 여러 시간이 걸리는 실행 해야 합니다. 따라서, 높은 처리량 및 높게 일관 된 병렬 생물 시스템 등장된17,18,,1920에 대 한 필요 합니다.
전통적인 벤치 스케일 bioreactors의 작동과 관련 된 중요 한 경비 (0.5-5 L), microbioreactors는 마약을 파생 된의 생산을 생물학적으로 평가 대 한 비용 절감 대안을 제공. 21 벤치 규모 흔들 탱크 bioreactors 신뢰할 수 있는 고 감각 배열을 통해 조밀한 데이터를 제공 한다. 피드백 제어 시스템의 쉬운 감시에 대 한 수 있습니다. 그러나, 어셈블리, 교정, 청소, 노동 비용, 기판 비용, 및 살 균 요구 사항을 벤치 규모 흔들 탱크 bioreactors 비싼 및 노동 집약 작동을 확인 합니다. 쉐이크 플라스 크 및 결정 접시 비용의 일부를 제거 하 고 큰 규모 bioreactors와 관련 된 문제를 노동 하지만 이러한 대안 약한 제어 조건 처리를 제공 하 고 낮은 밀도 데이터, 종종 끝점 측정을 생산. 22
또는, microbioreactors 셀 라인 및 업스트림 공정 개발에 대 한 스케일-다운 접근을 제공 하는 작은 작업 볼륨을 사용 합니다. Microbioreactor 실험의 규모 크게 전력, 기판, 노동, 공간, 및 유틸리티의 낮은 활용을 통해 운영 비용을 줄일 수 있습니다. 23 Microbioreactors는 쉐이크 플라스 크 그들은 그들의 크기 때문에 처리 하기 위해 쉽게 하지만 그들은 pH, 온도의 그들의 온라인 피드백 제어를 통해 전통적인 벤치 규모 bioreactors의 장점을 유지 용 존 산소, 및 산/염기 처럼 소비 뿐 아니라 품질 매개 변수 가스 조성에서 포함의 그들의 실시간 데이터 출력. Microbioreactor 규모 높은 처리량 검열 기능, 클론 선택 및 공정 개발에 유용할 수 있습니다. 24
고급 미 생물 조 셀 문화 과정 특성화 및 개발18에 대 한 효과적인 도구가 될 표시 되었습니다. 여기, 자동화 된 ambr15 시스템, 병렬, 클래식 비교할 수 표시 되어 48 microbioreactors 구성 된 연구 최대 규모에서 탱크 원자로 흔들,25 미디어에 최적화 된 사전 작업을 유사한 방식으로 사용 되었다 생산 모델 공상 IgG16조 DG44 셀 라인에 대 한 구성. 성장과 titer에 다양 한 미디어 조건의 효과 비교, 되었고 분석. 이 논문에서는 microbioreactor 시스템 및 원유 미디어 샘플의 분석을 실행 하는 일반적인 지침 제시 하고있다.
Protocol
1. 씨앗 확장 훈련
참고: 이 프로토콜의 밀도에 저장 된 1 mL 재조합 DG44 조 셀 주식을 사용 하 여 ~ 3 × 107 셀/mL. 희석 및 개별 조 셀 라인에 대 한 타임 라인도 달라 집니다. 셀 라인을 미리 사용 하 고 그에 따라 조정의 성장 곡선을 측정 합니다. 셀은 쉐이크 플라스 크로 처음 해 동 이며 나중 스피너 플라스 크로. 쉐이크 플라스 크, 스피너 플라스 크 실험 실행 되는 microbioreactors와 밀도 시드 대상의 수에 따라 필요한 수를 결정 합니다.
- 빠르게 얼음 남아의 작은 은색만까지 37 ° C 물 욕조에 immersing 하 여 재고 vial(s) 조 세포의 해 동. 70% 에탄올 솔루션 및 보풀 조직을 사용 하 여 유리병의 외부 오염을 Biosafety 캐비닛에 전송.
- 다시 부드럽게 위아래로 pipetting으로 세포를 일시 중단 하 고 29 mL 미리 데워 진된 미디어 8 m m L-글루타민 및 1 보충을 포함 살 균 125 mL 발명된 쉐이크 플라스 크를 1 mL를 전송 페니실린/스 x.
참고: 별도로 명시 하지 않는 한 OptiCHO 미디어로이 용어는 "미디어"이 프로토콜에서에 정의 됩니다. - 장소는 37 ° C, 8% CO2에서 유지 관리 하는 인큐베이터에서 flask(s)를 흔들. 130 rpm의 속도에서 세포를 선동 하는 궤도 셰이 커를 사용 합니다.
- 모니터링 가능한 셀 밀도 (VCD) 장치 계산 하는 자동화 된 셀을 사용 하 여 매일 또는 수동으로 hemocytometer 고 trypan 블루. 서브 컬쳐 (희석) 셀 (미리 따뜻한 미디어 37 ° C를 할 때마다 셀에 추가 해야 합니다) 신선한 미디어에서 접종 후 72 시간 마지막 볼륨 125 mL 스피너 플라스 크에서 100ml를. 쉐이크 플라스 크 문화 70 rpm의 속도에서 사용 되는 동일한 조건에서 회전자 문화를 품 어.
참고: 서브 컬쳐, 후 셀 0.7-1 x 106 셀/mL의 조밀도에 이어야 한다. 최종 밀도 106 셀/mL x 0.5 아래를 확인 합니다. Subculture 후 96 h 스피너에 접종에 대 한 대상 셀 밀도 연결할 수 없습니다. - 3 당일 inoculum 준비 전에 (1 일), 신선 하 고, 미리 데워 진 미디어 회전자를 추가-flask(s) ≥ 90% 생존 능력을 유지 하기 위해. 125 mL 전체 볼륨을 초과 하지 마십시오. 6
2. 자동화 된 microbioreactor 시스템 실행
필수 구성 요소: 사용자는 제조업체에서 적절 한 훈련을 받은 합니다 하 고 안전 및 시스템에 대 한 작동 조건에 잘 알고 있어야 합니다.
- 초기화 하 고 셀 카운터로 연결
- 소프트웨어를 운영 하는 시스템을 초기화 합니다. 소프트웨어를 열기 전에 셀 카운터 ( 재료의 표참조) 해당 소프트웨어와 함께 실행 되 고 있는지 확인 합니다. 셀 카운터 시스템으로 통합 된다.
- 소프트웨어를 열기 전에 셀 카운터 원격 연결에 연결 합니다. 원격 데스크톱 아이콘을 클릭 하 고 "연결"을 클릭 원격 데스크톱 연결 되 면 셀 카운터 소프트웨어를 엽니다. 새로운 시 약 팩, 빈 trypan 블루 낭비와 프라임 시스템을 설치 합니다.
- 원격 연결을 최소화 하 고 새로운 실험을 만들려면 서식 파일로 기존 실험을 사용 하 여 마이크로 생물 소프트웨어를 엽니다. 이름 하 고 실험을 저장 합니다. 자동된 셀 카운터는 소프트웨어의 상태 탭에서 연결 되어 있는지 확인 합니다. 상태 셀 카운터 소프트웨어에 또한 확인할 수 있습니다.
- 접시를 정의 하 고 혈관을 로드
참고: 오리엔트의 소모품 및 시 약 문화 방송국 및 데크 로드를 그림 1 을 참조 하십시오. 클램프 플레이트 중력 (고체 재료 사용) 하는 주기 전에 사용에서 압력가 마로 소독 해야 합니다.- 실행을 시작 하기 전에 소프트웨어의 모방 섹션에서 실행 하는 동안 사용 하는 접시를 정의 합니다. 이름을 각 접시를 사용 하 고 microbioreactor 문화 역에 갑판에 각 접시를 지정.
- 미디어 충전을 위한 24-잘 접시를 사용 하 고 문화 역의 지정 된 갑판에 배치. 장소 1 mL 및 4 mL 피펫으로 팁 상자 섹션에서 그림 1에 표시 된 대로 합니다.
- 문화 역의 각각 갑판에 24-잘 접종 접시를 놓습니다. 갑판 1에 단일 잘 1x 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 접시를 놓습니다. 갑판 2에 24-잘 소포 접시 갑판 7 (위치 그림 1에 표시 된 대로)에 단일 잘 1m NaOH 접시를 놓습니다. 갑판 수 다이어그램 소프트웨어에 "모방" 탭 아래 표시 됩니다.
- 안전 캐비닛 후드 안쪽 (sparger 장착) 문화 배를 풀으십시오. 문화 역 당 12 살 균 문화 배를 배치 합니다. 장소 압력가 혈관 위에 접시를 클램프. 모든 교 반기에 대 한 제공 하는 삽입 구멍 쉽게 배치를 위해 같은 방향으로 얼굴을 확인 합니다.
참고: 영구 마커를 사용 하 여 시간을 절약 하 고 수확의 때에 혼동을 피하기 위해 문화 역에 그들을 배치 하기 전에 문화 혈관을 분류할 수 있습니다. - 클램프 플레이트 O-링 반복된 압력가 마로 소독 후 착용, 따라서 신중 하 게 각 실험 전에 압력가 마로 소독 전에 그들을 검사를 첫 번째 부분입니다. O-ring 실패 백업으로 메 마른 클램프 플레이트를 유지 하는 것이 좋습니다.
- 클램프 플레이트 위에 저 어 접시, 안전 하 게 삽입 됩니다 각 핀을 확보. 클램프 플레이트 나사와 손잡이 제공 보안. 그들은 손으로 꽉 때까지 손잡이 조입니다. 또는 왼쪽 및 오른쪽 손잡이 조여 클램프 플레이트도 배치.
참고: 클램프는 표면에 대 한 플러시 또는 클램프 플레이트의 끝에 나사 하지 강화 균등 하 게 혈관 용 존 산소 (DO) 제어 문제를 경험할 것 이다. 이러한 조정 할 문제를 해결 하지 않는 경우 확인 O-링으로 접시의 불완전 한 씰링 문화의 비효율적 가스 이어질 수 있습니다.
- 자동화 된 마이크로 생물 소프트웨어 실행
참고: 사용 단계 "프로세스" 탭을 편집 하거나 새로운 단계. 단계는 개별적으로 시작 하 고 모든 프로세스를 중지할 프로그램 될 필요가 있다. 프로세스 단계 탭을 새 단계를 만들거나 편집 하는 단계를 기존 단계를 두 번 클릭에서 "삽입 단계" 버튼을 클릭 합니다. 프로그램 단계 10 개의 주요 섹션으로 분할 된다: 미디어 충전, 시동, 소포 제 추가, 마 / pH 제어, 배경 자료 추가, 일시 중지 된 pH, 접종, 5 X 셀 수, 10 X 셀 카운트, 영양소 분석기 샘플링 및 문화 역 종료. 실행된 기간 때 일괄 처리 모드에서 실행 하는 7-9 일 사이 보통 이다.- 시스템 초기화 하 고 적절 한 혈관의 존재에 대 한 확인 합니다. 문화 배와 함께 제공 된 바코드를 스캔. 빈 선박 또는 선박을 사용 하지 않는 문화 방송국에 대 한 동일한 바코드를 적용할 수 있습니다.
- 시스템도 제어, 가스 및 다른 연결을 확인 한 후 설계 된 프로그램으로 시작 됩니다.
참고: 경우에 오류가 발생 합니다, 하지만 사용자의 위험 하 고 계속 앞으로 시스템에는 영향을 주지 않습니다 실험을 방해 하지 것입니다에 사용자 프로그램을 진행할 수 있습니다. 예를 들어 가스 특정 혈관 오류가 표시 됩니다 하지만 무시 될 수 있는 실험에 사용 하지 해제 되어 수 있습니다.
- 시작 및 미디어 충전
- 첫 날 설정 시스템 또는 하루를 충전 하는 미디어 문화 시간의 하루 0으로 지정 됩니다.
- 시작 섹션에서 첫 번째 부하 피펫으로 팁, 1 mL 및 4 mL 팁, 프로그래밍. 이미 배치, 클릭 계속. 미디어 접시, 1 X PBS, 1m NaOH, 소포 플레이트, 미디어 충전 플레이트와 접종 플레이트 지정 된 갑판에 놓거나, 이미 배치, 보도 다음 단계로 이동 하려면 계속.
- 시동 프로토콜의 일환으로, 온도 제어를 시작 하 고 37 ° c 온도 설정 1000 rpm 및 마 교에 전환 / pH 모니터.
- 다음으로, 충전 프로그램 미디어를 실행 합니다. 자동화 된 microbioreactor 시스템의 액체 처리기 미디어 접시에서 미디어 프로그램에 매핑된 문화 배를 분배 합니다. 미디어 추가 프로세스 조건 다양 한 OptiCHO입니다.
참고: 24 잘 플레이트에서 두 개의 우물은로 각 잘만 미디어의 8 mL를 수용할 수 있는 용량 (13 mL), 한 문화 그릇을 채우기 위해 필요 합니다. 각 잘에서 7-8 mL를 사용 하 여 미디어 충전 전에 액체 처리기에 의해 혼합 되는 드로잉 공기를 방지 하기 위해. - 미디어 충전 완료 되 면, 문화 선박 35 µ L의 전 셀 소포 제 소포 접시에서 추가 됩니다. 문화 매체를 잘 혼합 하 고는 광학에 대 일 분 / 화 수를 pH 센서.
참고: 같은 양의 소포 제는 거품 검출 될 때 문화 시간 내내 간헐적으로 추가 됩니다. 6 발포 시각적으로 감지 하 고 반응 기 배 거품에 대 한 매일 체크. 소포 제는 검출 시 즉시 추가 됩니다. - 할 / pH 제어 다음 모니터링 및 녹음 할 및 문화 매체의 pH를 시작으로 전환. 50%는 적어도 2 h의 세트 포인트에 도달 할을 수 있습니다.
- 할 평형, 후 대, 모든 문화 7.1의 pH 세트 포인트를 달성 하기 위해 배경 기본 추가 설정. 마와 pH 하룻밤 equilibrate을 완전히 수 화 될 수 있습니다.
- 일시 중지 된 pH-pH 1 일 오프셋
- (일 1로 표시 됨) 다음 날 실행 일시 중지 된 pH 단계에 의하여 선택 혈관 문화 분석 및 pH 보정 오프셋 결정 됩니다.
참고: PH를 오프셋에 대 한 샘플링을 pH 혈관의 수는 결정 하는 사용자. 모든 원자로 용기에서 샘플 생물 인구의 좋은 표현 해야 하는 경우에, 필요 하지 않을 수 있습니다. - 샘플 튜브 홀더 플레이트 지정 된 갑판에 놓고 부하 마이크로 원심 튜브 뚜껑 열고 옆에 자리 잡고. 액체 처리기 프로그램에 매핑된 튜브에 세포 문화 액체의 600 µ L을 분배 됩니다.
-
샘플 및 측정 pH 영양소 bioanalyzer 제대로 보정은 고를 QCs 실행 되었습니다 (아래, "매일 영양소 및 대사 산물 분석" 참조)에 즉시 제거.
참고: 샘플 직후, pH 변화를 일으킬 수 있습니다 샘플에서 CO2 의 기체 제거로 공기에 노출 때문에 pH 변화를 피하기 위해 개별적으로 실행 됩니다. - 각 샘플, 그렇지 않으면 다음 단계는 실행 되지 것입니다 후 "계속"을 누르십시오.
- "컴파일" 샘플링 된 선박에 대 한 오프셋 자동으로 소프트웨어에 외부, 플렉스 파생 된 pH 값을 입력 합니다. 수동으로 얻은 샘플 용기에 대 한 오프셋을 평균 하 고 "선박 데이터" 탭에서 사용자 전화 오프셋된 열 아래 번호를 입력 합니다. 평균 오프셋 다음 모든 선박에 적용 됩니다. PH 문화 혈관 주사 될 수 후 적어도 2-3 시간 동안 equilibrate를 허용 한다.
- (일 1로 표시 됨) 다음 날 실행 일시 중지 된 pH 단계에 의하여 선택 혈관 문화 분석 및 pH 보정 오프셋 결정 됩니다.
- 접종
- VCD를 측정 후 회전자의 전체 내용을 전송-flask(s)는 살 균, 250 mL 원뿔 원심 분리기 튜브와 펠 릿 세포로 실 온에서 140 x g에서 10 분 동안 centrifuging 여. 오래 된 미디어를 가만히 따르다와 최종 밀도 문화 선박에는 inoculum을 추가한 후 1 x 106 셀/mL 해야 되도록 충분 한 신선한 미디어에 다시 일시 중단.
- 살 균 lidded 24-잘 접시의 지정으로 정지 셀을 추가 합니다. 2 mL inoculum 각 문화 선박에 대 한으로 제거 될 것 이다 각 음에 inoculum 3 mL를 추가 합니다.
- 후드 안에 지정 된 갑판에 inoculum 접시를 놓습니다. 후드 안에 그것을 배치 하기 전에 70% 알코올로 lidded inoculum 플레이트의 외부를 스프레이 있는지 확인 합니다.
- 셀 카운터 자동 셀 사용 하 여 계산
- 접종을 한 후 적어도 한 시간에 대 한 equilibrate 문화 배 하자. 한 시간 후, 프로그램을 사용 하 여 셀 수 단계 X 5을 실행 합니다. 5 X 셀 카운트를 읽는 데 사용 되는 희석 요소를 나타냅니다.
참고: 5 X 셀 카운트 사용 됩니다 처음 셀 지연 단계에 있을 때. 셀 그들의 지 수 단계에 도달 후 세포 수 X 10이 사용 됩니다. 샘플 및 희석제 볼륨 악기 자동으로 희석 비율을 차지 하 고 최종 값을 적절 하 게 조정을 기반으로 합니다. - 액체 처리기는 먼저 문화 선박에서 셀 문화 액체의 120 µ L의 추가 의해 따라 셀 카운터 컵 1 X PBS의 480 µ L를 추가 합니다. 셀 수 다음 자동된 셀 카운터를 사용 하 여 읽기. 이 단계는 모든 선박에 대 한 반복 됩니다.
- 세포 수의 문화 시간 1 일에 대 한 마지막 단계입니다. DO 및 pH 데이터 셀 카운트 데이터 (가능한 셀 밀도 생존)는 소프트웨어에 의해 매일 기록 또한.
참고: 셀 카운터 컵 라인의 막힘을 방지 하기 위해 70 %IPA 실행 기간 동안 두 번 이상 청소. 라인 및 흐름 셀 모든 셀 카운트 후 자동으로 청소 됩니다.
- 접종을 한 후 적어도 한 시간에 대 한 equilibrate 문화 배 하자. 한 시간 후, 프로그램을 사용 하 여 셀 수 단계 X 5을 실행 합니다. 5 X 셀 카운트를 읽는 데 사용 되는 희석 요소를 나타냅니다.
- 일시 중지 된 pH-하루 2 pH 오프셋
- 하루에 2 시간 문화, 초기 일시 중지 된 pH 단계에서 샘플링 된 이외의 문화 혈관을 사용 하 여 "전화 일시 중지" 단계를 반복 합니다.
참고: 일시 중지 된 pH에 대 한 선박 인구의 더 샘플링 pH 보정을 위한 더 나은 오프셋을 제공 합니다. 따라서, 전날에서 일시 중지 된 pH 사용 같은 혈관을 샘플링 하지.
- 하루에 2 시간 문화, 초기 일시 중지 된 pH 단계에서 샘플링 된 이외의 문화 혈관을 사용 하 여 "전화 일시 중지" 단계를 반복 합니다.
- 매일 영양소 및 대사 산물 분석
- 샘플과 연결 됩니다 영양소 분석 문화의 주 2에서 실험의 끝까지 영양소 bioanalyzer를 사용 하 여 분석.
- 샘플 튜브 홀더 플레이트 지정 된 갑판에 놓고 부하 마이크로 원심 튜브 뚜껑 열고 옆에 자리 잡고. 액체 처리기 프로그램에 매핑된 튜브에 세포 문화 유체를 분배 됩니다.
참고: 초기에 대 한 한 일 2-4) 문화 선박에서 가져온 샘플의 금액은 300 µ L. 이것은 액체 처리기에서 적절 하 게 1 X PBS의 300 µ L로 희석. 이 문화 볼륨을 절약 하 고 10 mL 아래 떨어지는 수준을 방지 위해 수행 됩니다. 또한, 처음 몇 일 동안 영양 가치 희석 후 악기 감지 범위 내에서을. - 영양 분석을 수행 하기 위해 분석기 트레이에 샘플을 놓습니다.
참고: 같은 날에 분석 되지 않을 것 이다 어떤 샘플을 동결.
- 시스템 종료
- 실행을 종료, 먼저 해제 뒤에 교 반 온도 제어. 둘째, 마 중지 / pH 제어 및 배경 자료 추가. 셋째, 다른 모든 컨트롤을 중지 합니다. 마지막으로, 시스템 모니터를 중지 합니다.
- 클램프 나사와 플레이트를 저 어 문화 혈관을 제거. 보풀이 지우기와 문화 역의 내부를 청소 합니다. 문화 역에 건조 접시를 놓고에 그들 스크류.
참고: 건조 주기는 시스템의 냉각된 버전에 대 한 필요 하며 시스템의 표준 버전에 대 한 필요 하지 않습니다. - 프로그램에 2 시간 건조 사이클을 실행 합니다. 깨끗 한 초순 수를 사용 하 여 클램프 플레이트 뒤 70% 이소프로필 알코올 (IPA) 라인에서 가능한 압축 된 액체를 제거 하. 잔여 액체를 제거 하는 공기를 가진 플러시.
- 생물 소프트웨어를 한 번에 "정지"에 클릭 건조 주기 완료 되었습니다.
3. 세포 문화 수확
- 원자로 용기에서 셀 문화 유체를 전송 및 실 온에서 5 분 동안 1,962 x g에서 세포를 작은.
- 상쾌한을 가만히 따르다. 0.22 μ m PVDF 필터 살 균 필터 decanted 셀 문화 유체를 사용 하 여.
- 1.5 mL를 무 균 세포 문화 액체의 aliquot 1 mL Eppendorf 튜브 titer 분석 합니다. -20 ° c.에 1 mL 튜브를 저장 고속 단백질 액체 크로마토그래피 시스템을 사용 하 여 수확된 셀 문화 액체의 나머지를 정화. 6
4. 측정 IgG Titers
참고: 이것은 실행 하 고 proteinA 바이오 센서 시스템을 사용 하 여 샘플 분석의 간단한 개요입니다. 모든 시험의 매개 변수 ( 예: 온도, 읽기 시간, rpm, 등 )을 각 샘플 형식에 대 한 경험적으로 결정 해야 합니다.
- 허용 해 동 하 여 실내 온도에 equilibrate 냉장고에서 적어도 1 h. 제거 샘플에 대 한 워밍업 램프 및 시스템을 켭니다.
- 시스템 소프트웨어에서 접시 온도 26 ° c.를 설정 미리 담가 단백질 팁 데 사용할 샘플 매트릭스 (예: 셀 미디어)에 적어도 30 분의 수 있습니다.
참고: 최적의 온도 실험적으로 결정 될 필요가 있다. 26 ° C의 온도 여기 긴 분석 시간 동안 샘플 증발을 최소화 하 고 일관 된 온도 (주위 온도 위에 여러 가지도 되 고)에 의해 개최 악기를 수 있도록 데 사용 됩니다. 선택한 분석 결과 온도 측정 전에 미리 equilibrated ≥ 샘플 무대에 10 분 샘플 접시를 배양 하 여 되어야 샘플 해야 합니다 . - 10 mg/ml 농도 같은 항 체를 사용 하 여 단백질 표준 곡선을 구축 하 고 감지 하는 범위에서 샘플 매트릭스 (즉, 미디어)에 직렬로 희석.
참고: 때문에 희석, 매트릭스 효과 최소화 하기 위해 항 체의 높은 농도 얻기 위해 중요 하지만 그것은 또한 하지 통해 항 체를 집중 하 고 집계를 유도 하는 것이 중요. 각 샘플 접시 접시에 표준 곡선을 실행 하는 것이 좋습니다. 최소한, 긍정적인 컨트롤 팁 팁 및 격판덮개 다양성에 대 한 계정에 사용 해야 합니다. 한 팁 사용 하는 단백질의 각 새로운 많에 대해 생성 해야 합니다 새로운 표준 곡선. - 샘플 접시 디자인 (예를 들어, 참조 하십시오 그림 2). 단백질 A에서에서 분석 결과 80 샘플까지 재생을 사용 하 여 분석할 수 있습니다, 알 수 없는 문화 샘플, 표준, 및 컨트롤을 포함 하. 분석 각 접시, 접시 (열 1-10), 각 샘플 사이의 재생 사이클에 걸쳐 최대 10 샘플을 측정 하 단일 단백질 팁을 사용 됩니다.
참고: 플레이트 (A 행)의 첫 번째 전체 행 부정적인 제어 및 참조로 사용 될 것이 좋습니다. 여기서 설명 하는 분석 결과에 행 B와 C는 2 개의 긍정적인 컨트롤; 사용 낮은 및 선형 응답의 상한에 하나 하나. 이렇게 하면 샘플을 분석 하기 전에 부정과 긍정적인 컨트롤을 측정 하는 각 팁. 이 설정 또한 분석 소프트웨어에서 참조 빼기를 단순화합니다. 나머지 우물은 알 수 없는 샘플에 사용 됩니다. 행 중 하나에서 샘플 간격이 있는 경우에, 거기 행렬에에서 있어야 팁의 건조를 방지 하기 위해 잘 (즉, 웰 스 A2 g 2를 통해 있다 샘플 h 2는 그렇지 않습니다. H2 확인 팁 H3 샘플 진행 하기 전에 밖으로 건조 하지 않고 되도록 샘플 매트릭스를 포함). 마지막으로, 여러 플레이트 분석 설정을 사용 하 여 도움말을 배출 하지 않습니다. 새로운 사용 하 여, 모든 접시에 대 한 비 재생성 설정 것이 좋습니다. - 부드럽게 혼합 하 여 분석에 대 한 샘플을 준비, 반전 또는 pipetting, 여 펄스 스핀 튜브의 하단에 샘플을 수집 하 여 다음. 집중된 샘플, 샘플 매트릭스에 diluting 하 여 적절 한 희석 복제를 만듭니다.
참고: 단백질에 대 한 항 체에 대 한 바인딩의 선형 범위 바이오 계층 간섭계 (BLI) 측정 항 체, 시험 조건, 그리고 매트릭스에 의해 달라 집니다. 이것은 경험적으로 미리 적절 한 샘플 희석 사용 되도록 결정 한다. - 시험 시간에 가까운 샘플 96 잘 접시를 준비 합니다. 우물에 없는 기포 확인. 깨끗 한 피 펫 팁 또는 원심 분리에 의해 기포를 제거 합니다.
- 플레이트 시스템에 로드 하 고 데이터 수집 소프트웨어에 기본 "높은 감도 분석 결과와 재생"을 사용 하 여 분석 결과 실행 합니다. HT 데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여 분석 합니다.
참고: 플레이트 제약으로 인해 미리 준비 될 경우, 증발을 방지 하기 위해 영화와 함께 안전 하 게 밀봉. 예상된 titers 따라 수집 속도 시간 조정 해야 할 수 있습니다. 지도 대 한 설명서를 참조 하십시오. - 데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여 참조 빼기 하 고 맞는 선형 지점간와 표준 곡선 및 초기 기울기 (IS) 기능을 사용 하 여 알 수 없는 샘플의 농도 계산.
Representative Results
중요 한 프로세스 매개 변수 및 셀 문화 작업을 통해 다른 셀 문화 매개 변수를 모니터링 하는 것은 bioprocessing에 중요 한 측면 이다. 셀 카운터와 영양소 분석기는 세포 성장, 영양소 소비 및 부산물 형성 특성 5 특성을 계량 하 사용 되었다. 셀 수는 모든 문화 조건에 대 한 매일 얻은 했다. 평균 실행 가능한 세포 밀도 viabilities는 그들의 ± 1 SD 간격 함께 그림 3 에서 보듯이. 영양소 및 부산물 프로필도 문화의 고정 단계 ± 1 SD 간격으로 표시 됩니다. 이 프로필의 사면 평균 포도 당 및 글루타민 소비 및 젖 산 생산 속도를 나타냅니다. 전반적으로, 이러한 결과 microbioreactor 시스템에서 이러한 특성을 모니터링의 타당성 입증 뿐만 아니라 꽉 범위 내에서 이러한 매개 변수를 유지 하기 위해 microbioreactor 시스템의 기능.
세포 배양의 총 생산성 수확된 세포 배양 0.22 미크론 PVDF 필터를 통해 전달 된 후 proteinA 바이오 센서 시스템을 사용 하 여 정량 했다. 1.15 pg/셀-d 그림 4에서 보듯이 0.87 pg/셀 차원에서 원거리 셀 당 특정 생산성. 기반으로 이러한 결과에 다양 한 조건 미디어 구성 선택 조사 수 및 실험 절차에 대 한 최소한의 투자에 대 한 생산 단백질의 양을 최대화 하는 전략을 먹이.
그림 1 : 4 문화 방송국 (CS) 12 반응 기 배는 데 microbioreactor 시스템의 레이아웃. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : ProteinA 바이오 센서 시스템에 재생 실험으로 기본적인 정량에 대 한 예제 샘플 접시 설정. 행 1 (빨간 "R") 참조 샘플 (즉, 매트릭스 분석 결 석); 예약 행 2 (아쿠아 마린)는 표준 (µ g/ml에서 농도); 3, 4 (오렌지) 행은 낮고 높은 긍정적인 컨트롤 집합 ("PL" 및 "PH" 각각); 알 수 없는 샘플;를 포함 하는 행 5-10 (보라색) 행 11 및 12 (그레이)는 재생 ("R") 및 중화 ("N") 버퍼에 대 한 프로그램 기본 위치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 :: 는) 가능한 셀 밀도 생존 프로필 나이 일괄 처리의 평균. ± 1 SD microbioreactor 시스템에서 세포 성장의 꽉 컨트롤을 나타내기 위해 표시 됩니다. b) 평균 영양소 프로 파일 젖 산에 대 한 평균 부산물 프로필 뿐만 아니라 포도 당 그리고 글루타민. ± 1 SD microbioreactor 시스템에서 미디어 구성 이상 꽉 컨트롤을 나타내기 위해 표시 됩니다. (N = 3, 모든 조건은 실행 되었습니다 3 중에서). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 는 다양 한 미디어의 평균 특정 생산성의 대표적인 상자 그림. (N = 3, 모든 조건은 실행 했다 3 중) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
자동화 된 마이크로 생물 시스템을 제대로 실행 하 고 효율적으로 여러 자동화 단계의 적시 실행을 포함 한다. 실행 하는 시스템의 가장 중요 한 부분 중 하나는 소프트웨어를 프로그래밍입니다. 프로그램을 작성 하는 동안 어떤 오류가 있는 경우에 전략, 샘플링 전략, 또는 최종 제품의 품질 연구의 결과 무효화할 수 있는 먹이 과정에서 예기치 않게 변경 될 수 있습니다 실험에서 심각한 오류가 있을. 배치 하 고 적절 한 할 제어 되도록 클램프 플레이트를 제대로 강화 시스템을 실행의 또 다른 중요 한 측면이입니다. 가장 일반적인 표시는 클램프 플레이트는 강화 하지 균등 하 게 할 측정 대, 1, 6, 7, 12 (코너 원자로 용기)에 예기치 않은 변화입니다. 전반적인 할 불안정 클램프 플레이트에 가스 입구 라인에 가스 켓을 완화 하는 나타냅니다. 이 시나리오는 할 세트 포인트에 도달 방해 수 있습니다. 셀 시키는 실험을 시작 하는 경우를 피하기 위해 또 다른 일반적인 함정이 그들 침전을 일으키는 접종 단계 동안 너무 오래 앉아. 셀 앉아, 지출 적은 시간 점차적으로 낮은 inoculum 셀 카운트는 무의식적으로 중요 한 바이어스를 일으킬 수 있는 반응 기 배를 시간순으로 추가 적은 기회 연구 결과 harms. 그것은 여러 단계에서 접종을 더 나은, 즉, 접종 한 다른 일시 중지 단계와 각 문화 역 사이 셀은 15 분 이상 접종 플레이트에 앉아 하지.
일상적인 사용, 무 균 유지에 관여 하는 것은 중요 합니다. 시스템 생물학 안전 장은 비록 불 임 후드와 자주 운동으로 인해 보장 되지 않습니다. 따라서, 후드에서 일어나는 모든 70 %IPA 살포 해야 합니다. 둘째, 그것을 최소한의 거품 발생 합니다 문화; 위해 필수적입니다. 미디어는 가스 덩어리 하 고 배기 라인, 클램프 플레이트와 아래도 핵심 부품의 손상으로 이어지는 수 있습니다. 예방 방지 거품 추가 단계는 어떤 마이크로 생물 프로그램 설계에 중요 합니다. 밖으로 "거품"의 경우 그것은 프로토콜 청소 제조 업체에 따라 도움이 될 것 이라고 하 고 클램프 플레이트의 영구적인 손상을 방지할 수 있습니다. 또는 비 sparged 선박의 사용 볼륨 비율에 더 높은 표면은 sparger의 부족으로도 효율적인 산소 수로 일괄 처리 모드에서 실행할 때 또는 낮은 세포 밀도 대 한 도움이 될 수 있습니다. 그러나, 비 sparged 배 않을 수 있습니다 높은 세포 밀도 또는 관류 문화에 대 한 유용한 머리 공간 성장 하는 산소의 소비 문화 유지 하기에 충분 하지 않습니다.
여러 제어 문화 제어 플라스 크를 흔들어 보다 작은 규모에서 병렬로 실행 되도록 하면 microbioreactor 시스템에서 제공 하는 수많은 이점이 있다. 17 그러므로 시스템 연구, 않는, 높은 처리량 복제 연구와 transfection 연구 심사의 실행을 촉진 한다. 자동된 액체 처리 또한 동시에 훈련 된 인원에 대 한 지루한과 시간 집중적인 노동 최소화 하면서 애 널 리스트 분석 가변성을 감소 시킨다. 시스템에 여러 이점이 있다, 하는 동안 고려해 야 하는 몇 가지 주요 단점이 있다. 첫째, 15 mL의 문화 볼륨 크게 제한 프로세스에서 샘플링 및 최종 수확 소재, 그리고 여러 다른 작은 규모 bioreactors (최대 500 mL) 최근에 제공 되. 시스템에 한 최근 전진은 자동된 미 생물 세포 밀도 및 영양소 분석에 대 한 샘플 볼륨을 줄여에 프로세스 샘플링 문제를 완화 하는 노바 생물에서 BioProfile 플렉스 2 분석기와의 통합 . 혜택 포함할 수 빠른 설치 및 운영 비용 절감, 아니 거의 청소 선도 costlier 재사용 가능한 기존의 시스템 보다 단위를 구입 하는 것으로 긴 기간 프로젝트에 대 한 일회용 단위 비용을 고려 한다.
이 문서에서 설명 하는 방법은 주로 배치 모드 세포 배양에 적합 하지만 사용자의 요구에 따라 수정할 수 있습니다. 각 문화 역은 온도 독립적으로 제어 및 pH 개별 원자로 혈관의 수준에서 변화 될 수 있습니다. 사토리는 또한 마이크로 생물 반응 기 시스템에 대 한 맞게 될 실험 수 있도록 특별히 설계 된 소프트웨어를 계획 하는 암컷을 제공 합니다. 대규모 DoE 연구는 제조업체에서 제공 하는 새로운 DoE 소프트웨어를 사용 하 여 미디어에 도움이 하 고 최적화를 보충 수 있습니다. 여기 사용 하지, microbioreactor 시스템 또한 먹이 배치 연구 수 있습니다. 시스템은 되지 아직 최적화 되었습니다 관류 세포 배양에 대 한. 그러나, 제한 된 연구와 실험을 현재 마이크로 생물 반응 기 시스템에서 관류 셀 문화 작업을 모방 되었습니다. 26 이 메서드는 셀 정착 하 여 고밀도 관류 문화를 모방 하기 위해 수정할 수 있습니다. 높이 피펫으로 원자로 삽입 되는 변화 및 안정화 시간을 최적화 하 여, 미디어 제거 고 문화의 거울 풍부 모드를 보충 수 있습니다. 이 개발 지역 문화의 관류 모드를 원하는 경우 여기에 제시 된 시스템 보다 더 나은 작동 하지 않을 수 있는 새로운 제품 있다.
요약 하자면,이 연구는 자동화 된 마이크로-생물 반응 기의 사용 방법을 보여 줍니다와 조 셀 문화 작업을 생성 하 고 모델 IgG1 단일 클로 널 항 체의 특성에 대 한 분석 관련. 그것은 작은 규모 마이크로-생물 반응 기 재생을 역할 bioprocess 제조 및 세포 문화 개발 및 미디어 심사에 미치는 영향을 강조 한다. 자동화 된 작은 규모의 시스템을 사용 하 여 많은 이점이 있다, 그러나 완벽 하 게 실현 하기 위해 그들의 혜택 처리 이해 하 고 분석 특성은 필수적입니다. 이 연구 개발 하 고 개별 연구 요구 당 개선 될 수 있는 자동화 된 미 반응 기 시스템을 사용 하기 위한 지침을 사용자를 제공 합니다.
Disclosures
면책 조항:이 게시는 저자의 의견을 반영 하 고 FDA의 전망 또는 정책을 해석 되어서는 안 됩니다.
Acknowledgments
저자 스콧 류 그들이 제공 하는 분석 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 일부 내부 자금 및이 작업에 대 한 지원을 CDER 중요 경로 프로그램 (CA #1-13)에 의해 제공 되었다. 이 프로젝트는 생명 공학 제품의 사무실, 미국 식품 및 의약품 안전 청, 과학을 통해 교육에 대 한 오크 리 지 연구소에 의해 관리 인턴/연구 참여 프로그램에는 약속에 의해 부분적으로 지원 한 미국 에너지 부와 FDA 간에 부처간 합의.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO DG44 Cell Line | Invitrogen | A1100001 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius | 001-2804 | automated micro bioreactor |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors - Sparged | Sartorius | 001-2B80 | |
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0040 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0039 | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius | A-0038 | |
| 1 Well plates | Sartorius | A-0068 | |
| Vi-Cell XR cell counter | Beckman Coulter | 731050 | automated cell counter |
| EX-CELL Antifoam (gamma irradiated) | Sigma-Aldrich | 59920C-1B | |
| CD OptiCHO AGT Medium | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning | 25-005-CV | |
| 100X Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-001-CI | |
| 125 mL F-Bottom Shake Flasks (Sterile, Vented) | Fisher Scientific | PBV12-5 | |
| 125 mL glass Spinner Flasks | Corning Life Sciences Glass | 4500-125 | |
| 250 mL PP Conical Centrifuge Tubes (Sterile) | Nalgene (Thermo Scientific) | 376814 | |
| TC20 Automated Cell Counter | BioRad Laboratories, Inc. | 1450103 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 10x PBS | Corning | 46-013-CM | |
| BioProfile FLEX Analyzer | Nova Biomedical | 49418 | Nutrient Analyzer |
| Octet Red 96 | Pall FortéBio | 99-0042 | Protein A Biosensor |
| Protein A Dip and Read Biosensors | Pall FortéBio | 18-5010 | |
| Polypropylene 96-well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black | Greiner Bio-One | 655209 |
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