Summary
Een gedetailleerd protocol voor de gelijktijdige werking van 48 parallelle celculturen onder uiteenlopende omstandigheden in een systeem van microbioreactor wordt gepresenteerd. Proces van de cultuur van de cel, oogst en latere antilichaam titer analyse worden beschreven.
Abstract
Geautomatiseerde microscale bioreactoren (15 mL) kunnen hierbij een nuttig instrument voor cel cultuur ingenieurs. Ze vergemakkelijken de gelijktijdige uitvoering van een breed scala aan experimentele omstandigheden terwijl het minimaliseren van de potentiële variabiliteit van het proces. Toepassingen van deze benadering zijn onder andere: kloon screening, temperatuur en pH verschuivingen, media en supplement optimalisatie. Bovendien zijn de kleine reactor volumes dat bevorderlijk is voor grote Design of Experiments, die een brede waaier van voorwaarden te onderzoeken. Hierdoor upstream processen aanzienlijk worden geoptimaliseerd voor schaal-up waar experimenten is meer reikwijdte beperkt door tijd en economische beperkingen. Geautomatiseerde microscale bioreactor systems bieden verschillende voordelen ten opzichte van traditionele kleinschalige cel cultuur eenheden, zoals schok kolven of spinner kolven. Echter tijdens de pilot schaal moet proces ontwikkeling aanzienlijk worden gezorgd om ervoor te zorgen dat deze voordelen worden gerealiseerd. Wanneer uitvoert met zorg, het systeem kunt inschakelen hoog niveau automatisering, DOE's met een hoger aantal variabelen uitgevoerd kan worden geprogrammeerd en bemonsteringstijdstip kan verminderen wanneer geïntegreerd met een voedende analyzer of cel teller. Integratie van de deskundige afkomstige heuristiek gepresenteerd hier, met de huidige geautomatiseerde microscale bioreactor experimenten kunt minimaliseren gemeenschappelijke valkuilen die zinvolle resultaten belemmeren. In het uiterste, kan overtreding de beginselen uit hier leiden tot schade van de apparatuur die dure reparaties vereist. Bovendien hebben de systemen microbioreactor kleine cultuur volumes karakterisering van cel kweekomstandigheden bemoeilijken. Het aantal en het bedrag van genomen monsters in-proces in de batch modus cultuur is beperkt als operationele volumes kunnen niet lager zijn dan 10 mL. Deze methode zal bespreken de voordelen en nadelen van microscale bioreactor systemen.
Introduction
Monoclonal antilichamen (mAbs) werden voor het eerst geproduceerd in muis hybridoma cellen in 19751. Sindsdien, heeft een toename van de ontwikkeling van de productie van recombinante eiwitten plaatsgevonden te humaniseren mAbs verhoging in vivo veiligheid en werkzaamheid2,3,4. Allermeest naar de productieprocessen van recombinante eiwitten in Chinese Hamster Ovary (CHO) cellen voor het gemak waarmee ze aangepast voor serum vrije media, hun vermogen worden kunnen om proteïnen met gelijkaardige posttranslationele modificaties aan die van een aangeboren menselijke dienst eiwitten en hun betrouwbaarheid zoals5,6van de cellen van de gastheer.
Vraag groeit product te leveren sneller en voor grotere patiënt populaties met constante kwaliteit. Naast de economische voordelen toeneemt het repertoire van ziekten behandeld door mAbs, waarin nu auto-immune ziekten, na transplantatie complicaties, artritis en kanker7. Gemiddelde opbrengst voor moderne commerciële mAb productielijnen zijn meestal in het bereik van 5-6 g/L en blijven stijgen van5. Dit is ten dele bereikt door CHO cel engineering en verbeterde productielijn screening met behulp van hoge-doorvoer bioreactoren8. Echter zijn de meeste stijgingen van de productie van eiwitten toegeschreven voor het verwerken van verbeteringen, met inbegrip van vorderingen in media optimalisatie, cel kweekomstandigheden, en verbeterde strategieën7,9,10te voeden. Voedingsprofielen suppletie is essentieel niet alleen voor de juiste celgroei maar ook voor efficiënte productie van hoge kwaliteit proteïne. Bovendien vereisen de cellen de stoichiometrische toevoeging van specifieke nutriënten, vereisen extra begrip voor het voederen van strategie optimalisatie6,11. Traditionele optimalisatie methoden omvatten individuele media component titratie en media mengen met mengsel ontwerpen. Deze methoden zijn echter tijdrovend, arbeid-intensieve, en risico's die samenhangen met menselijke fout12,13te betrekken.
Optimalisatie Mediastudies vertrouwde eerder op schudden kolven en 1-2 L bioreactoren die onbetaalbaar in termen van grondstoffen en menselijk kapitaal wellicht. Microplates zijn ook gebruikt, maar deze methoden bieden beperkte schaalbaarheid. Bovendien kunnen nog hiervoor meerdere tijdrovende loopt dat introduceren-charges-variabiliteit die de Kredietkwaliteitsbeoordeling variabiliteit veroorzaakt door media samenstelling en voeding strategie14,15,16 verduistert. Dus de noodzaak voor hoge-doorvoer en zeer consistente parallelle bioreactor systemen naar voren gekomen17,18,19,20.
Met de aanzienlijke kosten die zijn gekoppeld aan de werking van traditionele bank-schaal bioreactoren (0.5-5 L), microbioreactors een kostenbesparende alternatief bieden voor de beoordeling van de productie van biologisch afgeleide geneesmiddelen. 21 bench-schaal geroerd-tank bioreactoren zijn betrouwbaar en dichte gegevens via sensorische matrices verstrekken. Controle feedbacksystemen toestaan voor gemakkelijk toezicht op werking. Echter, de montage, kalibratie, schoonmaak, kosten van arbeid, substraat kosten en sterilisatie eisen maken Bank-schaal geroerd-tank bioreactoren duur en arbeidsintensief te bedienen. Shake kolven en microtiterplaat platen verwijderen een aantal van de kosten en problemen in verband met de grotere schaal bioreactoren arbeid, maar deze alternatieven bieden zwakke controle over de verwerking van voorwaarden en produceren van lage dichtheid gegevens, vaak alleen eindpunt metingen. 22
U kunt ook microbioreactors gebruiken een klein volume van het werken om een schaal-downbenadering cellijn en upstream procesontwikkeling. De omvang van microbioreactor experimenten kan leiden tot aanzienlijke afname lopende kosten door lager gebruik van macht, substraat, arbeid, ruimte en hulpprogramma's. 23 Microbioreactors zijn zoals shake kolven in dat ze gemakkelijk zijn te hanteren als gevolg van hun grootte, maar zij de voordelen van traditionele bank-schaal bioreactoren via hun online feedback controle van pH, temperatuur behouden, zuurstof, en zuur/base opgeloste consumptie, alsmede hun realtimegegevens productie van kwaliteitsparameters waaronder uit gassamenstelling. Microbioreactor schaal zorgt voor high-throughput screening vermogen, die nuttig voor de selectie en proces ontwikkeling kloon zijn kan. 24
De geavanceerde Microscale Bioreactor heeft aangetoond dat een effectief instrument voor de karakterisering van het proces van CHO cel cultuur en ontwikkeling18. Hierin een geautomatiseerd ambr15 systeem, bestaande uit 48 microbioreactors parallel, die hebben aangetoond dat vergelijkbaar zijn met klassieke geroerd tank reactoren in schaal studies,25 werd gebruikt op een wijze analoog aan voorafgaande werk dat de media geoptimaliseerd samenstelling voor een cellijn van CHO-DG44 produceren een model chimeer IgG16. De gevolgen van verschillende media voorwaarden voor groei en titer werden vergeleken en geanalyseerd. In deze paper is een algemene richtlijn uit te voeren van het microbioreactor systeem en de analyse van monsters van de ruwe media gepresenteerd.
Protocol
1. zaad trainen expansie
Opmerking: Dit protocol maakt gebruik van 1 mL recombinante DG44 CHO cel voorraden die zijn opgeslagen bij een dichtheid van ~ 3 x 107 cellen/mL. Verdunningen en tijdschema's voor de afzonderlijke CHO cellijnen zal variëren. Groeicurven van de maatregel van de cellijn moet vooraf worden gebruikt en dienovereenkomstig aan te passen. De cellen zijn aanvankelijk ontdooid in shake kolven en later overgeplaatst naar een spinner kolf. Bepaal het aantal shake kolven en spinner kolven die nodig zijn voor het experiment op basis van het aantal microbioreactors dat zal worden uitgevoerd en de doelstelling van zaaien dichtheid.
- Snel ontdooien voorraad vial(s) CHO cellen door het onder te dompelen in een waterbad 37 ° C tot slechts een kleine splinter van ijs blijft. Ontsmetten van de buitenkant van de flacon met 70% ethanol oplossing en een pluisvrije weefsel. Overbrengen naar een kabinet bioveiligheid.
- Resuspendeer de cellen door zachtjes op en neer pipetteren en 1 mL overbrengen in een maatkolf van steriele 125 mL ontlucht schudden met voorverwarmde media 29 mL aangevuld met 8 mM L-glutamine en 1 x penicilline/streptomycine.
Opmerking: Tenzij anders aangegeven, zal de term "media" in dit protocol hierna worden verstaan OptiCHO media. - Plaats schud flask(s) in een incubator gehandhaafd op 37 ° C en 8% CO2. Gebruik een roteerschudapparaat om cellen met een snelheid van 130 rpm doorroeren.
- Controleren van de levensvatbare celdichtheid (VCD) elke dag met behulp van een geautomatiseerde cel tellen apparaat of handmatig met een hemocytometer en de trypan blauwe. Subcultuur (verdund) de cellen 72 uren na inoculatie in verse media (vooraf warm de media tot 37 ° C telkens moet deze worden toegevoegd aan de cellen) zodanig dat het eindvolume 100 mL in een maatkolf van 125 mL spinner is. Incubeer spinner culturen op dezelfde voorwaarden gebruikt voor schudden kolf culturen met een snelheid van 70 rpm.
Opmerking: Na subcultuur moeten de cellen bij een dichtheid van 0,7-1 x 106 cellen/mL. Ervoor zorgen dat definitieve dichtheid niet onder 0,5 x 106 cellen/mL. Subcultuur na 96 uur als de target-celdichtheid voor inoculatie in spinners kan worden bereikt. - Op dag drie (één dag voorafgaand aan het entmateriaal preparaten), vers, voorverwarmde media toevoegen aan spinner-flask(s) te handhaven ≥ 90% levensvatbaarheid. 125 mL totaalvolume niet overschrijden. 6
2. running de automatische microbioreactor systeem
Vereisten: Gebruiker moet de passende opleiding hebben ontvangen van de fabrikant en moet vertrouwd zijn met de veiligheid en de operationele voorwaarden voor het systeem.
- Initialiseren en verbinding maken met mobiele teller
- Initialiseer het systeem besturingssoftware. Alvorens de software te openen, door ervoor te zorgen dat de cel teller (Zie Tabel van materialen) samen met de respectieve software wordt uitgevoerd. De teller van de cel is geïntegreerd met het systeem.
- Communiceren met cel teller externe verbinding alvorens de software te openen. Klik op het pictogram van extern bureaublad en klik op "Connect". Zodra het externe bureaublad is aangesloten, de cel teller software niet openen. Een nieuwe reagens pack installeert, lege de trypan blauwe afval en prime van het systeem.
- Minimaliseren van de externe verbinding en open de software van de micro bioreactor gebruik van een bestaande experiment als een sjabloon voor het maken van een nieuw experiment. Een naam en sla het experiment. Controleer of de geautomatiseerde cel teller is aangesloten onder het tabblad status in de software. De status kan ook worden gecontroleerd op de cel teller software.
- Definiëren van platen en laden van schepen
Opmerking: verwijzen wij u naar Figuur 1 om te oriënteren laden van verbruiksartikelen en reagentia op de cultuur stations en dekken. De klem platen moeten worden gesteriliseerde met autoclaaf op een zwaartekracht cyclus (gebruikt voor vaste stoffen) voorafgaand aan het gebruiken.- Voordat u begint een run, definiëren de platen gebruikt tijdens de run in de mimische sectie van de software. Naam van elke plaat gebruikt en aanwijzen van elke plaat tot een dek op het station van microbioreactor cultuur.
- Een 24-well plaat gebruiken voor het opladen van de media en plaats op het aangewezen dek van de cultuur-station. Plaats 1 mL en 4 mL pipet tip vakken in de secties, zoals aangegeven in Figuur 1.
- Een 24-well inoculatie plaat op de respectieve dek van de cultuur-station plaatsen. De single-well 1 X fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) plaat op deck 1 plaatsen. Plaats de single-well 1 M NaOH plaat op deck 2 en de 24-well ook plaat op het dek 7 (posities zoals aangegeven in Figuur 1). De dek-nummers worden schematisch weergegeven onder het tabblad "Na te bootsen" in de software.
- Pak de kweekvat (uitgerust met sparger) binnen de veiligheid kabinet kap. Plaats twaalf steriele kweekvat per cultuur station. Plaats gesteriliseerde met autoclaaf klem platen op de bovenkant van de schepen. Ervoor zorgen dat de gaten in de inzetstukken voorziet de stirrers alle geconfronteerd met dezelfde richting voor gemakkelijker plaatsing.
Opmerking: Met behulp van een permanent marker, categoriseren de kweekvat alvorens hen te plaatsen in de cultuur-station om tijd te besparen en te voorkomen dat verwarring ontstaat op het tijdstip van de oogst. - Klem plaat O-ringen zijn het eerste deel tot verslijten na herhaalde autoclaaf, daarom zorgvuldig controleren voordat autoclaaf vóór elk experiment. Houden van een steriele klem plaat als back-up in geval van mislukking van de O-ring wordt aanbevolen.
- Plaats de roer-platen op de top van de klem platen, ervoor te zorgen elke pin veilig is ingevoegd. Beveilig de platen van de klem met de schroeven en de knoppen geboden. Draai de knoppen tot ze hand strak. Draai links en rechts knoppen als alternatief voor zelfs plaatsing van de plaat klem.
Opmerking: Als de klem niet tegen het oppervlak is of als de schroeven aan het eind van de klem plaat ongelijk zijn aangescherpt, zullen de schepen problemen opgelost zuurstof (DO) controle. Als deze aanpassingen het-probleem niet opgelost doen, controleert u de O-ringen als onvolledig afdichting van platen leiden kan tot inefficiënte vergassing van cultuur.
- Uitvoeren van de automatisch Micro Bioreactor Software
Opmerking: gebruik "Processtappen" tabblad bewerken of maken van nieuwe stappen. Stappen moeten afzonderlijk worden geprogrammeerd om te starten en stoppen van een proces. Klik op "Invoegen stap" knop onder het tabblad stappen proces voor het maken van nieuwe stappen of Dubbelklik op een bestaande stap wilt bewerken die stap. De programmastappen zijn onderverdeeld in tien belangrijke secties: opstarten, Media opladen, antischuim toevoeging, / pH Control, achtergrond Base toevoegingen, onderbroken pH, inenting, 5 X Cell Count, 10 X Cell Count, nutriënt Analyzer bemonsterings- en cultuur Station afsluiten. De uitvoering duurt meestal tussen 7-9 dagen wanneer uitvoeren in batchmodus.- Het systeem wordt geïnitialiseerd en controleert op de aanwezigheid van de desbetreffende vaartuigen. Scan de barcode voorzien van de schepen van cultuur. De dezelfde barcode kan worden toegepast voor cultuur stations met lege schepen of vaartuigen die niet wordt gebruikt.
- Het systeem zal beginnen met de ontworpen programma na het controleren van controle, vergassing en andere verbindingen.
Opmerking: De gebruiker kan doorgaan met het programma, zelfs als een fout optreedt, maar dit op risico van de gebruiker en doen als u verdergaat naar voren niet schadelijk is voor het systeem en het experiment niet wordt onderbroken. Bijvoorbeeld, kan vergassing worden uitgeschakeld voor bepaalde schepen niet gebruikt in het experiment dat zal verschijnen als een fout, maar kan worden omzeild.
- Opstarten en Media opladen
- De eerste dag opzetten van het systeem of de media dag opladen is uitgeroepen tot dag 0 van cultuur tijd.
- In de sectie opstarten eerste lading Pipetteer tips, zowel 1 mL en 4 mL tips, zoals geprogrammeerd. Als al geplaatst, klik op Doorgaan. Plaats de media plaat, 1 X PBS, 1 M NaOH, ook plaat, media laden plaat en inoculatie plaat in de aangewezen dekken of, als reeds geplaatst, pers door te gaan naar de volgende stap.
- Als onderdeel van het protocol voor opstarten, beginnen temperatuurregeling en temperatuur ingesteld op 37 ° C. Zet de roeren op 1000 rpm en de DO / pH monitor.
- Vervolgens de media laden programma uit te voeren. De vloeibare handler van de automatische microbioreactor systeem zal afzien van de media van de media-plaat naar de kweekvat zoals toegewezen in het programma. De media toegevoegd is OptiCHO met variërende proces voorwaarden.
Opmerking: Twee putjes van de plaat van een 24-well zijn verplicht te vullen één cultuur bak capaciteit (13 mL), zoals elk putje is alleen geschikt voor 8 mL van de media. Met 7-8 mL in elk putje voorkomen dat tekening lucht wanneer media is wordt gemixt door de vloeibare handler voordat het opladen. - Zodra de media laden wordt gedaan, zal 35 µL van Ex-cel antischuim van de plaat ook worden toegevoegd aan het vaartuig cultuur. Toestaan van 30 minuten voor kweekmedium goed worden gemengd en de optische DO / pH sensoren om gehydrateerd worden.
Opmerking: Dezelfde hoeveelheid antischuim wordt toegevoegd met tussenpozen gedurende de tijd van de cultuur als schuimvorming is gedetecteerd. 6 Foaming gedetecteerd visueel en reactor vaartuigen worden elke dag voor de schuimvorming gecontroleerd wordt. Antischuim is onmiddellijk na detectie toegevoegd. - De DO / pH-control aanstaat dan om te beginnen met bewaking en opname van de doen en de pH van het kweekmedium. Laat de DO om de set-punt van 50%, waarin ten minste 2 uur te bereiken.
- Na evenwichtsinstelling, inschakelen achtergrond basis toevoegingen aan het bereiken van een pH-instelpunt van 7.1 voor alle vaartuigen van de cultuur. Ken en pH's nachts equilibreer worden volledig gehydrateerd toestaan.
- Onderbroken pH - dag 1 pH Offset
- De volgende dag (aangeduid als dag 1), voeren de onderbroken pH stap waarbij Selecteer cultuur vaartuigen worden geanalyseerd en een verschuiving van de pH-correctie wordt bepaald.
Opmerking: Het aantal vaartuigen van de pH te bemonsteren compenseren de pH is gebruiker bepaald. Een monster van elk vaartuig van de reactor mogelijk niet nodig hebt u een goede representatie van de bioreactor bevolking. - Plaats de monsterhouder buis, platen op aangewezen dekken en laden micro-centrifuge buizen met caps openen en verscholen naast hen. De vloeibare handler zal afzien 600 µL van de cel cultuur vloeistof in de buis zoals toegewezen in het programma.
-
Onmiddellijk verwijderen van de pH van het monster en de maatregel op een voedende bioanalyzer dat is correct gekalibreerd en waarvoor de QCs zijn uitgevoerd (zie hieronder, "Dagelijkse voedingsstoffen en metaboliet analyse").
Opmerking: Monsters worden afzonderlijk uitgevoerd onmiddellijk na het trekken, om te voorkomen dat pH veranderingen als gevolg van blootstelling aan de lucht, zoals ontgassing van CO2 uit het monster pH-veranderingen kan veroorzaken. - Hit "Doorgaan" na elk monster, anders die de volgende stap zal niet geëxecuteerd worden.
- Voer de externe, FLEX-afgeleide pH-waarden in de software, "samenstellen" de offsets voor het bemonsterde schepen automatisch. Handmatig de compensaties voor de vaartuigen van de steekproef verkregen gemiddelde en voer het nummer onder de kolom gebruiker pH offset onder het tabblad "Vaartuig Data". De verschuiving van de gemiddelde zou vervolgens worden toegepast op de alle vaartuigen. Toestaan dat de pH ten slotte op equilibreer gedurende ten minste 2-3 uur, waarna de schepen van cultuur kunnen worden geënt.
- De volgende dag (aangeduid als dag 1), voeren de onderbroken pH stap waarbij Selecteer cultuur vaartuigen worden geanalyseerd en een verschuiving van de pH-correctie wordt bepaald.
- Inoculatie
- Na het meten van VCD, breng gehele inhoud voor spinner-flask(s) in een steriele,-250 mL conische centrifuge buis en pellet cellen door centrifugeren gedurende 10 minuten bij 140 x g bij kamertemperatuur. Decanteren in de oude media en resuspendeer in genoeg verse media zodanig dat de definitieve dichtheid 1 x 106 cellen/mL moet na het entmateriaal toe te voegen aan het schip van de cultuur.
- De zwevende cellen toevoegen in de aangewezen goed van een steriele hardplastic 24-well plaat. Voeg 3 mL van entmateriaal aan elk putje, waarvan 2 mL zal worden verwijderd als entmateriaal voor elk vaartuig van cultuur.
- Plaats de entmateriaal-plaat op het aangewezen dek binnen de kap. Zorg ervoor dat de buitenkant van de plaat hardplastic entmateriaal spray met 70% alcohol alvorens het te plaatsen binnen de kap.
- Cell Counter geautomatiseerde cel tellen met behulp van
- Laat de kweekvat equilibreer gedurende minstens een uur na inoculatie. Na een uur, de 5 X cel graaf stap in het programma worden uitgevoerd. 5 X geeft aan de verdunningsfactor gebruikt om te lezen van de telling van de cel.
Opmerking: 5 X cel tellen wordt in eerste instantie gebruikt wanneer de cellen in de fase van de vertraging. Nadat de cellen hun exponentiële fase bereiken zal de 10 X aantal cellen worden gebruikt. Op basis van de steekproef en de verdunningsmiddel volumes het instrument automatisch accounts voor de verdunningsfactor en de eindwaarde dienovereenkomstig aanpast. - De vloeibare handler wordt eerst 480 µL van 1 X PBS toegevoegd aan de cel teller cup gevolgd door de toevoeging van 120 µL van de cel cultuur vloeistof van het vaartuig van de cultuur. Het aantal cellen is dan lezen met behulp van het prestatiemeteritem geautomatiseerde cel. Deze stap wordt herhaald voor alle vaartuigen.
- Het aantal cellen is de laatste stap voor dag 1 van de tijd van de cultuur. Samen met de gegevens doen en pH de telling van de cel is gegevens (levensvatbare cellen dichtheid en levensvatbaarheid) ook dagelijks geregistreerd door de software.
Opmerking: Reinig de cel teller cup ten minste tweemaal tijdens de duur van de vlucht met 70% IPA om te voorkomen dat verstopping van lijnen. Lijnen en stroom-cel worden automatisch gereinigd na elke cel tellen.
- Laat de kweekvat equilibreer gedurende minstens een uur na inoculatie. Na een uur, de 5 X cel graaf stap in het programma worden uitgevoerd. 5 X geeft aan de verdunningsfactor gebruikt om te lezen van de telling van de cel.
- Onderbroken pH - dag 2 pH Offset
- Op dag 2 van cultuur tijd, herhaalt u de 'Gepauzeerd pH' stap met behulp van kweekvat dan degenen die werden bemonsterd uit tijdens de eerste onderbroken pH-stap.
Opmerking: Meer van de bevolking van het vaartuig voor onderbroken pH bemonstering zorgt voor een betere verschuiving voor correctie van de pH. Vandaar, niet genieten van de dezelfde schepen gebruikt voor onderbroken pH van de vorige dag.
- Op dag 2 van cultuur tijd, herhaalt u de 'Gepauzeerd pH' stap met behulp van kweekvat dan degenen die werden bemonsterd uit tijdens de eerste onderbroken pH-stap.
- Dagelijkse voedingsstoffen en metaboliet analyse
- Monsters zullen worden genomen voor nutriënten analyse van dag 2 van cultuur tot het einde van het experiment en geanalyseerd met behulp van voedingsstoffen bioanalyzer.
- Plaats de monsterhouder buis, platen op aangewezen dekken en laden micro-centrifuge buizen met caps openen en verscholen naast hen. De vloeibare handler zal afzien de cel cultuur vloeistof in de buis zoals toegewezen in het programma.
Opmerking: Voor de eerste is paar dagen (2-4 dagen) de hoeveelheid monster genomen uit de cultuur-vaartuig 300 µL. Dit wordt verdund met 300 µL van 1 X PBS afgeleverd door de vloeibare handler. Dit wordt gedaan om te besparen van het volume van de cultuur en het niveau verhinderen dropping lager dan 10 mL. Bovendien, vallen nutriënten waarden voor de eerste paar dagen na verdunning binnen het instrument detectiebereik. - Leg de monsters in de lade van de analysator om de nutriënten analyses uit te voeren.
Opmerking: Bevriezen van monsters die niet op dezelfde dag zal worden geanalyseerd.
- Systeem afsluiten
- Voor het verbreken van de run, schakelt u eerst de temperatuurregeling, gevolgd door de agitatie. Ten tweede, het stoppen van de DO / pH-control en achtergrond base toevoegingen. Ten derde, het stoppen van alle andere besturingselementen. Tot slot, stoppen de Systeemmonitor.
- Schroef de klem los en roer platen en kweekvat verwijderen. Reinig de binnenkant van de cultuur-station met een pluisvrij doekje. Plaats de drogen platen op het station van cultuur en schroef ze in.
Opmerking: Drogen cyclus is vereist voor de gekoelde versie van het systeem en is niet noodzakelijk voor de standaard versie van het systeem. - De 2 uur drogen cyclus op het programma uitvoeren. Schoon de platen van de klem met behulp van ultrazuiver water gevolgd door 70% isopropylalcohol (IPA) te verwijderen mogelijk verkorte vloeistof in de regels. Spoelen met lucht te verwijderen van alle resterende vloeistof.
- Klik op "Stop" in de bioreactor software eens de drogen cyclus is voltooid.
3. cel cultuur oogst
- De cel cultuur vloeistof overdracht van de schepen van de reactor- and -pellet cellen bij 1,962 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Giet het supernatant. Met behulp van een 0,22 µm PVDF filter steriel filter de gedecanteerde cel cultuur vloeistof.
- Aliquot 1 mL van de vloeistof steriel cel cultuur in 1,5 mL Eppendorf buizen voor de analyse van de titer. Opslaan van de buizen 1 mL bij-20 ° C. Zuiveren van de rest van de geoogste cel cultuur vloeistof met behulp van snelle proteïne vloeistofchromatografie systeem. 6
4. meten van IgG Titers
Opmerking: Dit is een vluchtig overzicht van het uitvoeren en analyseren van monsters met behulp van de proteinA biosensor systeem. Alle assay parameters ( bijvoorbeeld temperatuur, lees tijd, rpm, etc. ) moet empirisch vastgesteld voor elk type monster.
- Zet op het systeem en laat de lamp om op te warmen voor ten minste 1 h. verwijderen monsters uit diepvries te ontdooien en equilibreer tot kamertemperatuur.
- In de systeemsoftware te gebruiken, stelt u de temperatuur van de plaat op 26 ° C. Geniet vooraf het aantal EiwitA tips om te worden gebruikt in de monstermatrix (bijvoorbeeld cel media) voor ten minste 30 minuten.
Opmerking: De optimale temperatuur moet empirisch worden bepaald. Een temperatuur van 26 ° C wordt hier gebruikt te minimaliseren monster verdamping tijdens langere tijden van de analyse en het instrument om te houden van een consistente temperatuur (doordat enkele graden boven de omgevingstemperatuur). Monsters moeten worden vooraf equilibrated tot de temperatuur van de gekozen assay voorafgaand aan de meting door de monster-plaat aan het broeden in het werkgebied van de steekproef voor ≥ 10 minuten. - Bouwen van een eiwit standaard curve met behulp van de dezelfde antilichaam geconcentreerd tot 10 mg/mL en serieel Verdun in de monstermatrix (d.w.z. media) in het bereik dat moet worden opgespoord.
Opmerking: Het is belangrijk om het verkrijgen van een hoge concentratie van antilichaam aan matrixeffecten wegens verdunning te minimaliseren, maar het is ook belangrijk om niet over het concentreren van het antilichaam en aggregatie induceren. Uitvoeren van een standaard curve van in-plaat voor elke steekproef plaat is beter. Minimaal, moet een positieve controle worden gebruikt om de rekening voor tip-naar-tip en plaat-to-plate variabiliteit. Een nieuwe standaard curve moet worden gegenereerd voor elke nieuwe partij van eiwitten een tips gebruikt. - Ontwerpen van de monster-plaat (voor een voorbeeld, Zie Figuur 2). In een EiwitA kan assay die gebruikmaakt van de regeneratie, maximaal 80 monsters worden geanalyseerd, met inbegrip van monsters van de onbekende cultuur, normen en controles. Voor elke plaat geanalyseerd, zal een enkele EiwitA tip voor het meten van maximaal 10 monsters over de plaat (kolommen 1-10), met een regeneratie tussen elk monster worden gebruikt.
Opmerking: Het is aanbevolen dat de hele eerste rij van de plaat (rij A) gebruikt worden als negatieve controle en verwijzing. In de hier besproken bepaling, worden rijen B en C gebruikt voor de twee positieve controles; een op de onderste en één voor één de bovengrens van de lineaire respons. Dit zorgt ervoor dat elke tip maatregelen negatieve en positieve controles voor het analyseren van monsters. Deze opzet vereenvoudigt ook aftrekken van de verwijzing in de analysesoftware. De resterende putten worden vervolgens gebruikt voor de onbekende monsters. Als er een gat van het monster in een van de rijen, moet er een matrix in dat goed om te voorkomen dat het drogen van de tip (d.w.z. Wells A2 via G2 hebben monster terwijl H2 niet. H2 zorgen bevat monstermatrix zodat de tip doet niet uitdrogen alvorens om te proeven van H3). Tot slot, niet uitlaat tips met behulp van een ingesteld op het analyseren van meerdere platen. Gebruik een nieuwe, wordt niet-geregenereerd set voor elke plaat aanbevolen. - Voorbereiding van monsters voor analyse door het voorzichtig mengen, hetzij door inversie of pipetteren, gevolgd door een puls spin te verzamelen van de steekproef aan de onderkant van de buis. Voor geconcentreerde monsters, maakt u aangewezen verdunning wordt gerepliceerd door verder verdunnen in monstermatrix.
Opmerking: Het lineaire bereik van bindende voor een antilichaam voor eiwit een bio-laag interferometrie (BLI) metingen zal variëren door zowel het antilichaam, assay voorwaarden en matrix. Dit moet empirisch vooraf worden bepaald om adequate steekproef verdunningen worden gebruikt. - Monster van de 96-wells-platen zo dicht bij mogelijk tijd assay voor te bereiden. Zorgen er geen luchtbellen in om het even welk van de putten. Het verwijderen van luchtbellen met een schone pipette uiteinde of door middel van centrifugeren.
- Plaat in het systeem laden en uitvoeren van de test met behulp van de standaard "Hoge gevoeligheid Assay met Regeneration" in de Data-acquisitie software. Analyseren met HT Data-analyse software.
Opmerking: Als de platen zijn tevoren als gevolg van beperkingen worden voorbereid, zegel veilig met film ter voorkoming van verdamping. Afhankelijk van de verwachte titers wellicht overname tarieven en tijden worden aangepast. Raadpleeg de handleiding voor begeleiding. - Met behulp van de Data-analyse software, referentie aftrekken en bereken de concentratie van de onbekende monsters met behulp van standaard curve en de functie van de eerste helling (IS) met een lineaire point-to-point passen.
Representative Results
Monitoring van kritische procesparameters en andere cel cultuur parameters gedurende de celculturen operatie is een belangrijk aspect in bioprocessing. De teller van de cel en nutriënten analyzer werden gebruikt om het kwantificeren van vijf kenmerken die kenmerkend zijn voor celgroei, nutriënt verbruik en bijproduct vorming. De cel graven zijn dagelijks verkregen voor alle cultuuromstandigheden. De gemiddelde levensvatbare cellen dichtheden en viabilities zijn zoals te zien in Figuur 3 samen met hun ±1 SD-interval. De voedingsstoffen en bijproduct profielen worden ook weergegeven met het interval van de SD ±1 via de stationaire fase van de culturen. De helling van dit profiel vertegenwoordigt de gemiddelde glucose en glutamine consumptie, en lactaat productie, tarieven. Over het geheel genomen, deze resultaten tonen aan dat de haalbaarheid van het toezicht op deze kenmerken in het systeem van de microbioreactor; Naast de mogelijkheid van het microbioreactor-systeem om deze parameters binnen een krappe bereik.
De totale productiviteit van de celculturen werd gekwantificeerd aan de hand van een proteinA biosensor systeem nadat de geoogste cel voedingsbodems werd aangenomen door een 0,22 micron PVDF filter. De specifieke productiviteit per cel varieerden van 0.87 pg/cel-d tot 1,15 pg/cel-d zoals te zien in Figuur 4. Gebaseerd op deze resultaten een breed scala van voorwaarden kan worden onderzocht om te selecteren van media samenstelling en voederen van strategieën die maximaliseren van de hoeveelheid eiwit geproduceerd voor een minimale investering in experimentele procedures.
Figuur 1 : Lay-out van het systeem van de microbioreactor met 4 cultuur stations (CS) met 12 reactor schepen elke. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Voorbeeld monster plaat set-up voor een fundamentele kwantificatie met regeneratie experiment op het systeem van de biosensor proteinA. rij 1 (rode "R") is gereserveerd voor referentiemonster (d.w.z. matrix afwezig analyt); rij 2 (Aquamarijn) is een set van normen (concentraties zijn in µg/mL); rijen 3 en 4 (oranje) bestaan uit sets van lage en hoge positieve controles ("PL" en "PH", respectievelijk); rijen 5 t/m 10 (paars) bevatten onbekende monsters; rijen 11 en 12 (grijs) zijn programma-standaard posities voor regeneratie ("R") en neutralisatie ("N") buffers. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : een) gemiddelde dichtheid en levensvatbaarheid profielen van levensvatbare cellen boven de leeftijd van een partij. ± 1 SD wordt ook weergegeven om aan te geven de strakke controle van celgroei in de microbioreactor systemen. b) gemiddelde voedingsprofiel voor glucose en glutamine, evenals het gemiddelde bijproduct profiel voor lactaat. ± 1 SD wordt ook weergegeven om aan te geven van strakke controle over de samenstelling van de media in de microbioreactor systemen. (N = 3, alle voorwaarden zijn uitgevoerd in drievoud). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Vertegenwoordiger Boxplot van gemiddelde specifieke productiviteit van de verschillende media voorwaarden. (N = 3, alle voorwaarden werden uitgevoerd in drievoud) Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Het geautomatiseerde micro bioreactor systeem goed functioneert en efficiënt impliceert de tijdige uitvoering van meerdere geautomatiseerde stappen. Een van de belangrijkste onderdelen van de exploitatie van het systeem is de programmering van de software. Als er een fout optreedt tijdens het schrijven van het programma, zal er ernstige fouten in het experiment dat leiden onverwachte wijzigingen in het proces tot kan, voederen van strategie, bemonsteringsstrategie of kwaliteit van het eindproduct die de bevindingen van de studie vervalt mogelijk. Een ander belangrijk aspect van het runnen van het systeem is te plaatsen en draai de plaat klem correct om te zorgen voor een goede controle van de. De meest voorkomende aanwijzing dat de plaat klem ongelijk heeft aangescherpt is onverwachte variaties in metingen voor vaartuigen 1, 6, 7 en 12 (hoek reactor schepen). Over het geheel genomen geeft instabiliteit een versoepeling van de pakkingen in de zuigleiding van gas in de klem platen. Dit scenario kan belemmeren de instelpunt bereiken. Een andere gemeenschappelijke valkuil te vermijden wanneer een experiment starten de cellen laat zitten te lang tijdens de inoculatie stap, waardoor ze te regelen. Minder tijd bij de cellen zitten, schaadt de minder kans er is dat geleidelijk lager entmateriaal cel graven chronologisch worden toegevoegd aan de reactor vaartuigen die aanzienlijke vooroordeel dat onbewust ertoe kunnen bewegen studieresultaten. Het is beter om te enten in meerdere fasen, d.w.z. Inoculeer elke cultuur station na elkaar met pauze stappen tussenin zodat de cellen zitten niet in de inoculatie plaat langer dan 15 minuten.
Betreffende dagelijks gebruik, behoud van de steriliteit is van vitaal belang. Hoewel het systeem in een biologische veiligheidskast, is steriliteit niet gegarandeerd als gevolg van frequente verkeer in en uit de motorkap. Daarom moet alles wat er in de kap met 70% IPA worden gespoten. Ten tweede, het is essentieel om ervoor te zorgen dat minimale schuimvorming tijdens de cultuur optreedt; media kunnen verstoppen vergassing en uitlaat lijnen, wat leidt tot schade van de klem plaat en zelfs kernonderdelen hieronder. Preventieve anti-schuim toevoeging stappen zijn essentieel in elk micro bioreactor programma ontwerp. In het geval van een "schuim uit" het zou zinvol zijn te volgen van de fabrikanten protocol reiniging en kan voorkomen dat permanente schade van klem platen. Als alternatief kan gebruik van vaartuigen van niet-sparged zinvol zijn voor lagere cel dichtheid of wanneer uitgevoerd in de batchmodus, omdat hogere oppervlakte volumeverhouding in staat efficiënt zuurstof zelfs met het ontbreken van een sparger stelt. Vaartuigen van niet-sparged kunnen niet echter nuttig voor hoge dichtheid of perfusie celculturen zoals de hoofd ruimte niet volstaat om gelijke tred houden met de toenemende consumptie van zuurstof culturen.
Er zijn tal van voordelen geboden door het microbioreactor systeem, omdat hierdoor meerdere gecontroleerde culturen in parallel op kleine schaal met meer controle dan schudden kolven moeten worden uitgevoerd. 17 daarom, het systeem vergemakkelijkt de uitvoering van studies, DoEs, hoge doorvoer kloon studies en studies van de transfectie screening. Geautomatiseerde vloeibare behandeling vermindert ook analist-naar-analist variabiliteit terwijl het tegelijkertijd het minimaliseren van vervelende en tijdrovende arbeid voor geschoold personeel. Hoewel er verschillende voordelen aan het systeem zijn, zijn er verscheidene belangrijke nadelen die u moeten overwegen. Ten eerste, het volume van een cultuur van 15 mL aanzienlijk beperkt in-process bemonsterings- en materiaal van de laatste oogst- en meerdere alternatieve kleinschalige bioreactoren (tot 500 mL) recent beschikbaar zijn gekomen. Een recente vooruitgang op het systeem is de integratie van de geautomatiseerde microscale bioreactor met de BioProfile FLEX 2 analyzer uit Nova biomedische, die de in proces-sampling probleem matigt doordat monstervolume p.a. cel dichtheid en voedingsstoffen . Voordelen kunnen zijn snelle setup en vrijwel geen schoonmaak leidt tot exploitatiebesparingen, maar de kosten van de beschikbare eenheden te worden overwogen voor de lange termijn projecten, als het kan duurder zijn om te kopen van de eenheden dan de herbruikbare conventionele systemen.
De methode die in dit Groenboek besproken is vooral geschikt voor de cultuur van de cel van batch-modus, maar afhankelijk van de behoeften van de gebruiker kan worden gewijzigd. Elk station cultuur heeft onafhankelijke controle van de temperatuur, terwijl Ken en pH kunnen worden gevarieerd op het niveau van individuele reactor vaartuigen. Sartorius biedt ook DoE planningssoftware speciaal ontworpen voor het toestaan van experimenten te worden aangepast voor de micro bioreactor systeem. Grote schaal DoE studies met de nieuwe DoE-software geleverd door de fabrikant kunnen helpen in de media en aanvulling van optimalisatie. Hoewel hier niet gebruikt, kunt het systeem van de microbioreactor ook fed-batch studies. Het systeem is nog niet geoptimaliseerd voor perfusie celculturen. Echter zijn er beperkte onderzoeken en proeven om na te bootsen perfusie cel cultuur operatie in het huidige systeem van de micro bioreactor. 26 deze methode kan worden aangepast voor het nabootsen van hoge dichtheid perfusie culturen door cel regelen. Door het variëren van de hoogte waaraan het pipet wordt ingevoegd in de reactor en door het optimaliseren van beslechting tijd, kunnen de media worden weggenomen en aangevuld naar spiegel overvloed modus van cultuur. Er zijn nieuwe producten in deze ontwikkeling gebied dat beter dan het systeem hier gepresenteerd werkt als perfusie modus van cultuur is gewenst.
Kortom, deze studie toont het gebruik van geautomatiseerde micro-bioreactoren en bijbehorende analytische voor CHO cel cultuur operaties te produceren en te karakteriseren van een model IgG1 Monoclonal antilichaam. Het benadrukt de rol van de kleine schaal micro-bioreactoren in Bioprocestechnologie productie en hun impact op de ontwikkeling van cel cultuur en media screening. Hoewel er vele voordelen aan het gebruik van een systeem van geautomatiseerde kleinschalige, om het volledig realiseren hun voordelen verwerken begrip en analytische karakterisering is absoluut noodzakelijk. Deze studie biedt de gebruiker met een richtsnoer voor het gebruik van een systeem van geautomatiseerde microscale reactor, die kan worden ontwikkeld en verbeterd per individuele onderzoeksbehoeften.
Disclosures
Disclaimer: Deze publicatie weerspiegelt de mening van de auteur en moet niet worden opgevat om FDA weergaven of beleid te vertegenwoordigen.
Acknowledgments
De auteurs bedank Scott Lute voor de analytische ondersteuning die zij verstrekt. Gedeeltelijke interne financiering en steun voor dit werk werd verzorgd door de CDER kritieke pad programma (CA #1-13). Dit project werd gedeeltelijk ondersteund door een benoeming tot de stage/deelname onderzoeksprogramma op de Office van de producten van de biotechnologie, de Amerikaanse Food and Drug Administration, beheerd door het Oak Ridge Instituut voor wetenschap en onderwijs door middel van een Interagency overeenkomst tussen het Amerikaanse ministerie van energie en FDA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO DG44 Cell Line | Invitrogen | A1100001 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius | 001-2804 | automated micro bioreactor |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors - Sparged | Sartorius | 001-2B80 | |
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0040 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0039 | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius | A-0038 | |
| 1 Well plates | Sartorius | A-0068 | |
| Vi-Cell XR cell counter | Beckman Coulter | 731050 | automated cell counter |
| EX-CELL Antifoam (gamma irradiated) | Sigma-Aldrich | 59920C-1B | |
| CD OptiCHO AGT Medium | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning | 25-005-CV | |
| 100X Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-001-CI | |
| 125 mL F-Bottom Shake Flasks (Sterile, Vented) | Fisher Scientific | PBV12-5 | |
| 125 mL glass Spinner Flasks | Corning Life Sciences Glass | 4500-125 | |
| 250 mL PP Conical Centrifuge Tubes (Sterile) | Nalgene (Thermo Scientific) | 376814 | |
| TC20 Automated Cell Counter | BioRad Laboratories, Inc. | 1450103 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 10x PBS | Corning | 46-013-CM | |
| BioProfile FLEX Analyzer | Nova Biomedical | 49418 | Nutrient Analyzer |
| Octet Red 96 | Pall FortéBio | 99-0042 | Protein A Biosensor |
| Protein A Dip and Read Biosensors | Pall FortéBio | 18-5010 | |
| Polypropylene 96-well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black | Greiner Bio-One | 655209 |
References
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495-497 (1975).
- Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Current Opinion in Pharmacology. 12 (5), 615-622 (2012).
- Jakobovits, A. Production of fully human antibodies by transgenic mice. Current Opinion in Biotechnology. 6 (5), 561-566 (1995).
- Maksimenko, O. G., Deykin, A. V., Khodarovich, Y. M., Georgiev, P. G. Use of Transgenic Animals in Biotechnology: Prospects and Problems. Acta Naturae. 5 (1), 33-46 (2013).
- Jayapal, K. P., Wlaschin, K. F., Hu, W., Yap, M. G. Recombinant protein therapeutics from CHO cells-20 years and counting. Chemical Engineering Progress. 103 (10), 40 (2007).
- Velugula-Yellela, S. R., et al. Impact of media and antifoam selection on monoclonal antibody production and quality using a high throughput micro-bioreactor system. Biotechnology Progress. , (2017).
- Foltz, I. N., Karow, M., Wasserman, S. M. Evolution and Emergence of Therapeutic Monoclonal Antibodies. Circulation. 127 (22), 2222-2230 (2013).
- Kondragunta, B., Drew, J. L., Brorson, K. A., Moreira, A. R., Rao, G. Advances in clone selection using high-throughput bioreactors. Biotechnology Progress. 26 (4), 1095-1103 (2010).
- Altamirano, C., Paredes, C., Cairo, J., Godia, F. Improvement of CHO cell culture medium formulation: simultaneous substitution of glucose and glutamine. Biotechnology Progress. 16 (1), 69-75 (2000).
- Selvarasu, S., et al. Combined in silico modeling and metabolomics analysis to characterize fed-batch CHO cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 109 (6), 1415-1429 (2012).
- Seth, G., Ozturk, S., Zhang, C. Cell Culture Bioprocess Engineering. Hu, W. -S. , Wei-Shou Hu. Ch. 4 97-126 (2012).
- McKeehan, W. M. K., Ham, R. The Growth Requirements of Vertebrate Cells In vitro. Ham, R., Waymouth, C., Chapple, P. , Ch. 223 223-243 (1981).
- Jordan, M., et al. Cell culture medium improvement by rigorous shuffling of components using media blending. Cytotechnology. 65 (1), 31-40 (2013).
- Castro, P. M. L., Hayter, P. M., Ison, A. P., Bull, A. T. Application of a statistical design to the optimization of culture medium for recombinant interferon-gamma production by Chinese hamster ovary cells. Applied Microbiology and Biotechnology. 38 (1), 84-90 (1992).
- Liu, C. -H., Chu, I. M., Hwang, S. -M. Factorial designs combined with the steepest ascent method to optimize serum-free media for CHO cells. Enzyme and Microbial Technology. 28 (4-5), 314-321 (2001).
- Parampalli, A., et al. Developement of serum-free media in CHO-DG44 cells using a central composite statistical design. Cytotechnology. 54 (1), 57-68 (2007).
- Hsu, W. -T., Aulakh, R. P., Traul, D. L., Yuk, I. H. Advanced microscale bioreactor system: a representative scale-down model for bench-top bioreactors. Cytotechnology. 64 (6), 667-678 (2012).
- Janakiraman, V., Kwiatkowski, C., Kshirsagar, R., Ryll, T., Huang, Y. -M. Application of high-throughput mini-bioreactor system for systematic scale-down modeling, process characterization, and control strategy development. Biotechnology Progress. 31 (6), 1623-1632 (2015).
- Kim, B. J., Diao, J., Shuler, M. L. Mini-scale bioprocessing systems for highly parallel animal cell cultures. Biotechnology Progress. 28 (3), 595-607 (2012).
- Legmann, R., et al. A predictive high-throughput scale-down model of monoclonal antibody production in CHO cells. Biotechnology and Bioengineering. 104 (6), 1107-1120 (2009).
- Schäpper, D., Alam, M. N. H. Z., Szita, N., Lantz, A. E., Gernaey, K. V. Application of microbioreactors in fermentation process development: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 395 (3), 679-695 (2009).
- Hegab, H. M., ElMekawy, A., Stakenborg, T. Review of microfluidic microbioreactor technology for high-throughput submerged microbiological cultivation. Biomicrofluidics. 7 (2), 021502 (2013).
- Rameez, S., Mostafa, S. S., Miller, C., Shukla, A. A. High-throughput miniaturized bioreactors for cell culture process development: Reproducibility, scalability, and control. Biotechnology Progress. 30 (3), 718-727 (2014).
- Xu, P., et al. Characterization of TAP Ambr 250 disposable bioreactors, as a reliable scale-down model for biologics process development. Biotechnology Progress. 33 (2), 478-489 (2017).
- Delouvroy, F., et al. Evaluation of the advanced micro-scale bioreactor (ambr™) as a highthroughput tool for cell culture process development. BMC Proceedings. 7 (6), 1-3 (2013).
- Kelly, W., et al. Optimizing performance of semi-continuous cell culture in an ambr15 microbioreactor using dynamic flux balance modeling. Biotechnology Progress. , (2017).
