Summary
Nous présentons ici un protocole détaillé pour faire efficacement des homo - et xénogreffe entre pastèque et gourde, en plus des méthodes de prélèvement d’échantillons de tissus, la génération de données et l’analyse des données, pour l’étude des microARN froid-sensible.
Abstract
MicroARN (miARN) est endogènes petit non-codantes ARN d’environ 20-24 nt, connus pour jouer un rôle important dans le développement de la plante et l’adaptation. Il y a une accumulation preuve montrant que les expressions de certains miARN sont modifiées lorsque la greffe, une pratique agricole couramment utilisée par les agriculteurs pour améliorer la tolérance des cultures aux stress biotiques et abiotiques. La gourde est une culture intrinsèquement résilience climatique par rapport aux nombreux autres cucurbitacées majeures, y compris le melon d’eau, rendant l’un des porte-greffes plus largement utilisés pour le second. La promotion récente de technologies de séquençage haut-débit a fourni de grandes possibilités d’enquêter sur les miARN froid-sensible et leurs contributions aux avantages hétérogreffe ; Pourtant, les procédures expérimentales adéquates sont une condition préalable à cet effet. Nous présentons ici un protocole détaillé pour générer efficacement des homo - et xénogreffe entre le melon d’eau froide-sensibles et la gourde résistant au froid, en plus des méthodes de prélèvement d’échantillons de tissus, la génération de données et l’analyse des données. Les méthodes présentées sont également utiles pour d’autres systèmes de plantes-greffe, d’interroger miRNA règlements sous différentes contraintes environnementales, comme la chaleur, la sécheresse et la salinité.
Introduction
Greffage a longtemps été employé comme une technique agricole pour améliorer la production agricole et la tolérance aux stress biotiques et abiotiques1,2,3. Dans les systèmes heterografting, porte-greffes élites peuvent améliorer l’absorption de l’eau et les nutriments des plantes, renforcer la résistance aux agents pathogènes du sol et limiter les effets négatifs de la toxicité des métaux4,5, qui peuvent conférer les greffons un patrimoine vigueur de la croissance et une tolérance accrue aux stress environnementaux. Dans de nombreux cas, heterografting peut également avoir des répercussions qualités de fruits chez les plantes horticoles, menant à saveur de fruits améliorés et accroissement du contenu liés à la santé des composés6,7. Il a été constaté que le transfert longue distance de phytohormones, ARN, peptides et protéines entre le porte-greffe et le greffon est un mécanisme fondamental modulation de la croissance et le développement de reprogrammation de scion plantes8,9 ,,10. La greffe a été largement utilisée dans les études de signalisation sur de longues distances et le transport en ce qui concerne l’adaptation environnementale11. Expériences de greffes sont particulièrement puissants pour la détection sans ambiguïté des molécules transmises en récepteurs tissulaires ou vasculaire sap et activation ou suppression des cibles moléculaires en raison de la transmission de signal12.
ARN non codant, une grande classe d’ARN qui exercent des fonctions de régulation importantes dans les cellules, ont été signalés à jouer un rôle en facilitant l’adaptation des plantes au stress abiotique13. miARN est endogènes petit non-codantes ARN d’environ 20-24 nt. des études ont révélé le rôle régulateur des miARN dans divers aspects des activités de l’usine, tels que tire la croissance, des latéraux racine formation14,15,16, absorption des éléments nutritifs, le métabolisme de sulfate et homéostasie17et réponses aux stress biotiques et abiotiques insistent sur18. Récemment, l’expression des miARN et leurs gènes cibles étaient liés à la tolérance au stress dans les plants de concombre heterografted19de sel. Dans les greffons intervariety du raisin, les réponses de miRNA expression de contrainte de la sécheresse ont été trouvés à être dépendante de génotype20.
Le développement rapide et diminuant les coûts de la technologie de séquençage haut-débit ont fourni une excellente occasion pour l’étude des règlements de miRNA chez les plantes agronomiques. Pastèque (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.), une récolte importante cucurbitacées cultivées dans le monde entier, est sensible aux basses températures. Calebasse (Lagenaria siceraria [Molina] Standl.) est une climat plus élastique cucurbitacées couramment utilisées par les agriculteurs à la greffe avec la pastèque. L’objectif principal de cette étude est d’établir une norme, efficace et la méthode pratique pour la fabrication de xénogreffe entre la pastèque (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.) et la calebasse (Lagenaria siceraria [Molina] lettre standard). Ce protocole fournit également un schéma expérimental détaillé et méthodes analytiques pour l’étude de la régulation des expressions de miRNA après greffage, qui est utile pour révéler les mécanismes sous-jacents des avantages heterografting.
Le matériel végétal utilisé dans cette étude inclure le cultivar de la pastèque et le landrace gourde. Cultivar de la pastèque est un cultivar commercial à haut rendement mais sensibles aux basses températures. La gourde landrace est un porte-greffe populaire pour greffage avec pastèque, concombre et gourde, en raison de son excellente tolérance des basses températures21.
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Protocol
1. stérilisation et la Germination des semences
- Pour la stérilisation en surface, tremper les graines de la gourde dans un bécher de 500 mL, rempli d’eau à 58 ° C en remuant occasionnellement, jusqu'à ce que la température de l’eau baisse à 40 ° C.
- Pendant ce temps, mettre 3 kg de tourbe dans un sac en nylon et, pour stériliser, autoclave à 120 ° C/0.5 MPa pendant 20 min.
- Gardez le trempage des graines de la gourde pendant 4-5 h plus sous aucune agitation.
- Une fois que l’eau atteigne la température ambiante, rincer les graines 2 x - 3 x avec l’eau distillée.
- Égoutter l’excès d’eau et laisser les graines à germer dans un sac de gaze à 28 ° C dans une chambre de culture dans l’obscurité.
- Après la germination, semer les graines dans des pots en plastique (6 cm de diamètre) remplis de tourbe stérilisée.
- Quand les plantules de Gourde ont développé deux cotylédons aplatis, répétez les étapes 1.1-1.3 avec graines de pastèque.
Remarque : Cette gestion du temps s’assure que les tailles du scion et porte-greffe correspondent bien pour greffage réussi.
2. croissance des semis et greffage
- Pousser les semis dans une chambre de croissance avec un cycle de 16 h /8-h lumière sombre, gardant la température à 28 ° C pendant le jour (lumière) et à 22 ° C pendant la nuit (dark). Irriguer les plants en ajoutant de l’eau 1 x par jour en fin d’après-midi.
- Utilisez la méthode de coupe-greffe22 pour faire xénogreffe lorsque les plantules de la gourde (porte-greffe) sont au un stade vrai-feuilles et les cotylédons de la pastèque (scion) ont fait leur apparition (pas encore aplatis).
- Couper l’hypocotyle des semis melon d’eau à 2-3 cm sous les cotylédons et les feuilles de haut des semis Gourde sur le site immédiatement au-dessus de la vraie.
- Utiliser un cure-dent pour faire un trou dans le haut des semis ajustée de la gourde. Insérez les semis de pastèque taillée dans les trous des semis Gourde pour rendre la xénogreffe.
- Utiliser une méthode similaire tel que présenté à l’étape 2.2 faire homogreffes.
Remarque : Les combinaisons Homo - et heterografting doivent toujours être faits simultanément (Figure 1), qui, dans ce cas, se traduit par ce qui suit : pastèque/Gourde (WB, hétérogreffe), melon/pastèque (WW, homogreffe) et gourde bottle Gourde (BB, homogreffe).
Figure 1 : Illustration des combinaisons de greffe et les structures de greffe-bouture. WB = heterografting de pastèque/bouteille Gourde ; WW = homografting melon/pastèque ; BB = Gourde/bouteille Gourde homo-greffage ; WB-S = feuilles de scion de la xénogreffe gourd pastèque/bouteille échantillonnés ; WB-R = feuilles de porte-greffe de la xénogreffe gourd pastèque/bouteille échantillonnés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
3. postgrafting gestion, traitement par le froid et d’échantillonnage
- Enwrap les plants greffés avec des sacs de polyéthylène transparent pour garder une humidité relativement élevée et de les entretenir pour 7D dans des conditions environnementales des cycles de la sombres de lumière/8 h 16 h, gardant la température à 28 ° C pendant le jour (lumière) et à 22 ° C pendant la nuit (obscurité).
- Découvrez les sacs de polyéthylène transparent sur le 7e jour. Laissez que les plantes poussent pour un autre 7 à 10 jours selon les mêmes conditions.
- Divisez les plants sains uniformes en deux groupes, un pour le traitement par le froid (souligné) et un pour le contrôle (non sollicités). Pour le groupe témoin, laisser les plants dans la même chambre de croissance (à 28 ° C) pendant 48 h supplémentaires, tandis que pour le groupe stress froid, transférer les semis dans une chambre de culture avec une température constante à 6 ° C, avec des conditions de lumière/obscurité tel que décrit à l’étape 2.1.
- Dégustez les feuilles du greffon et le porte-greffe de greffons (Figure 1). Congeler les échantillons immédiatement dans l’azote liquide et les stocker à-70 ° C jusqu'à l’utilisation.
4. Bibliothèque préparation et séquençage haut débit
- Transférer les échantillons congelés dans un tube de microcentrifuge de 2 mL dans l’azote liquide.
- Ajouter une bille en acier inoxydable (5 mm de diamètre) dans chaque tube contenant des tissus.
- Homogénéiser les tissus à une poudre fine à l’aide d’un homogénéisateur de moulin de perle pour 30 s.
- Pour chaque combinaison de greffage, prendre des quantités égales (0,1 g) de l’échantillon de sol de dix plants et mélangez-les dans un tube à centrifuger 10 mL. Ajouter une quantité appropriée de réactif de chlorhydrate de guanidium (Table des matières) basée sur les suggestions du fabricant correspondant au poids du tissu.
- Supprimer des contaminations de l’ADN génomiques par l’ajout de DNase RNA-libre j’ai 150 U/ml à 37 ° C pendant 1 h.
- Déterminer le total quantité de RNA sur un système d’électrophorèse microcapillaire pour assurer l’intégrité de la RNA numéro > 7.0.
Remarque : Un RIN > 7.0 assure une haute intégrité des échantillons RNA. - Préparer de petites bibliothèques de RNA à l’aide d’une trousse commerciale (Table des matières) selon les instructions du fabricant. Utilisez 1 µg d’ARN total, par exemple pour lancer.
- Décongeler les réactifs de normalisation Bibliothèque et adaptateurs conformément aux directives du fabricant. Ligaturer les petits ARN avec les adaptateurs 5′ et 3′ et éluer et les purifier. Puis, inverse transcrivent la 5′ et 3' ligaturé petits ARN suivant les directives du fabricant.
- Effectuer l’amplification par PCR selon le protocole du fabricant. Évaluer la qualité et la quantité des banques d’ADNc en utilisant un système d’électrophorèse microcapillaire.
- Charge 1 µL d’une bibliothèque de RNA sur un système d’électrophorèse microcapillaire afin d’assurer le RIN > 7.0.
- Séquencer les petites bibliothèques de RNA sur un instrument de séquençage haut débit tel que décrit ailleurs23.
5. miRNA et prédiction de gène cible
- Pour chaque combinaison de greffage, utiliser l’open source UEA sRNA workbench version 2,4-plant24 pour supprimer des séquences de mauvaise qualité et de couper les séquences de l’adaptateur des lectures brutes. Jetez les séquences qui sont plus petits que 18 nt ou plus grand que 32 nt.
- Comparer les séquences « propres » de haute qualité à la base de données open source Rfam 11,0 à reconnaître et à supprimer les lectures des ARNr, ARNt, ARNpno et autres snARN.
- Aligner les lectures restantes et les génomes de référence en utilisant une séquence courte-lecture alignement outil25. Aucune incompatibilité n’est autorisée dans cette étape.
Remarque : L’Assemblée de génome « 97103 » pastèque V126 a été utilisé pour l’alignement avec les lectures de scion et l’assemblage de génome « HZ » Gourde V127 a été utilisé pour les lectures de porte-greffe. - Comparer les lectures restantes contre des miARN matures connues dans l’open source miRBase 22,028. Lectures qui sont homologues à miARN connus sont classés comme miARN conservée.
- Comparer les séquences qui ne parviennent pas à correspondre les précurseurs connus miRNA avec la séquence du génome. L’algorithme de29 MIREAP permet de détecter d’éventuels nouveaux miARN sous paramètres par défaut.
6. differential Expression et analyse Ontology de gène
- Comparer les niveaux d’expression des miARN basé sur leurs chefs en savoir. miARN avec une P-valeur (test exact de Fisher) < 0,05 et une valeur de2 journal absolu > 2 sont censées être exprimés.
- Utiliser un oligonucléotide antisens cible site selection tool (TargetFinder)30 pour prédire le potentiel ARNm complémentaire (gènes cibles de miRNA) pour les miARN différentiellement exprimés selon les paramètres par défaut.
- Utiliser l’ontology de gène (aller) enrichissement outil analytique31 pour révéler l’ontologie de gènes de cible de miRNA (aller) patterns sous une P- valeur seuil de 0,05 pour une signification statistique.
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Representative Results
Figure 2 : phénotypes différents greffons à température ambiante et des conditions de stress froid. (a) ce panneau montre homo - et semis heterografted à température ambiante comme contrôle. (b) ce panneau montre les homo - et heterografted plantules après 48 h de traitement par le froid. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
À l’aide de la méthode décrite, nous avons obtenu un taux de réussite élevé (survie) de 98 % pour les greffes. Phénotypes différents greffons à température ambiante et des conditions de stress froid sont indiquées à la Figure 2. Après 48 h de traitement par le froid, les plantes de pastèque homografted a montré un retard de croissance évidente avec des feuilles flétries jeunes, alors que les plantes homografted de la gourde et la xénogreffe Gourde de pastèque/bouteille montrent une croissance beaucoup plus vigoureuse. Aucun symptôme de dommages ont été observés dans les feuilles de la xénogreffe, qui a même dépassé les plantes homografted Gourde, où les plus faibles de vraies feuilles ont été endommagés. Ces résultats démontrent clairement l’avantage de xénogreffe lorsqu’il a conféré la tolérance au froid.
Petite séquence de RNA des huit bibliothèques ont donné un total de 258 millions de lectures brutes. Après le contrôle de la qualité (QC), un total de 146 millions de lectures correspondant à environ 30 millions de séquences uniques ont été retenus (tableau 1). Basé sur cet ensemble de séquences de sRNA propre, 323 miARN, notamment 10 connues et 313 miARN roman, avaient été prédites de la gourde, et 20 connue et 802 roman miARN ont été prédites de la watermelon.sRNAs de 24 nt compose la plus grande classe de sRNAs à greffer tous les combinaisons, quelle que soit la température de la pièce ou des conditions de stress froid (Figure 3).
| Traitement | Code | Lol lectures | sRNA | |
| Total | Unique | |||
| WW-CK | RAW | 30612962 | ||
| Nettoyer | 19727501 | 3858868 | ||
| Mappé à la génomique | 19059359 | 3777952 | ||
| BB-CK | RAW | 30845546 | ||
| CK | Nettoyer | 16832061 | 3787866 | |
| Mappé à la génomique | 16375142 | 3694388 | ||
| WB-CK-S | RAW | 39492123 | ||
| Nettoyer | 26783053 | 6319473 | ||
| Mappé à la génomique | 25919944 | 6132389 | ||
| WB-CK-R | RAW | 23763619 | ||
| Nettoyer | 10187791 | 1784447 | ||
| Mappé à la génomique | 8946929 | 1537867 | ||
| WW-CL | RAW | 27557577 | ||
| Nettoyer | 17879038 | 3336242 | ||
| Mappé à la génomique | 17153763 | 3259960 | ||
| BB-CL | RAW | 29780991 | ||
| Nettoyer | 13342206 | 3235570 | ||
| Froide | Mappé à la génomique | 12949972 | 3164329 | |
| WB-CL-S | RAW | 45708415 | ||
| Nettoyer | 23071845 | 4310276 | ||
| Mappé à la génomique | 22363113 | 4224166 | ||
| WB-CL-R | RAW | 30585408 | ||
| Nettoyer | 19029266 | 3541729 | ||
| Mappé à la génomique | 17364239 | 3196106 | ||
Tableau 1 : Statistiques de petits ARN dans les différents greffons à température ambiante ou sous traitement par le froid.
Figure 3 : distribution de la taille de la sRNA lit dans les différents greffons. (a) ce panneau montre que la distribution de la taille de la sRNA lit xénogreffe sous contrôle ou des conditions de froid. (b) ce panneau montre que la distribution de la taille de la sRNA lit dans homogreffes sous contrôle ou des conditions de froid. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Sur un 48 h de traitement par le froid, 30 et 268 miARN ont été en amont et réprimés, respectivement, dans les feuilles du scion dans la xénogreffe. C’était en contraste avec les résultats dans les feuilles de porte-greffe, où 31 et seulement 12 miARN était en amont et réprimés, respectivement (Figure 4). Dans les homogreffes melon/pastèque, miRNAs 64 et 83 ont été en amont et réprimés, respectivement. Dans les homogreffes de calebasse Gourde/bouteille, ces chiffres étaient de 30 et 28. Apparemment, heterografting a causé une reprogrammation profonde des expressions miRNA. Analyses de GO-enrichissement des gènes cible putatif de l’expression différentielle miARN déterminé les termes enrichis dans la scion de la xénogreffe, GO 78 avec 40 classé dans les processus biologiques, 2 en composants cellulaires et 36 en fonctions moléculaires (Figure 5). Nous avons trouvé que GO connu plusieurs termes/voies liés aux stress abiotiques/biotiques résistance et transduction de signal, par exemple, le processus catabolique de chitine (aller : 0006030, allez : 0006032), voie de signalisation activés par l’éthylène (aller : 0009873), polyamine processus de biosynthèse (GO : 0006596) et la transduction du signal par la phosphorylation des protéines (aller : 0009755), ont été impliqués. Combinées, nos résultats suggèrent que la diminution de l’expression des miARN, en ajustant l’abondance des transcriptions de leurs gènes cibles, peut représenter un mécanisme important qui sous-tend la meilleure tolérance au froid. Dans les pastèque/bouteille Gourde greffes, l’hétérogreffe en soi a un impact significatif sur les patrons de miRNA qui forment les avantages de la greffe.
Figure 4 : comparaison des schémas de miARN en amont et réprimés en réponse au stress dû au froid dans les différents greffons. WB-S = feuilles de scion de la xénogreffe gourd pastèque/bouteille échantillonnés ; WB-R = feuilles de porte-greffe de la xénogreffe gourd pastèque/bouteille échantillonnés ; WW = les homogreffes melon/pastèque ; BB = les homogreffes de calebasse Gourde/bouteille. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : aller à des analyses d’enrichissement des gènes cibles présumées des miARN différentiellement exprimés dans la scion laisse de xénogreffe lors de stress dû au froid. WB-CL-S = feuilles de scion de la xénogreffe Gourde de pastèque/bouteille sous traitement par le froid ; WB-CK-S = feuilles de scion de la xénogreffe Gourde de pastèque/bouteille à température ambiante. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Dans ce protocole, nous décrit en détail une méthode très efficace et reproductible pour faire homo - et xénogreffe entre la pastèque et la gourde. Cette méthode, ne nécessitant aucun équipement spécifique, est très facile à utiliser et a généralement un taux de survie très élevé de greffage. La méthode peut également être utilisée pour faire des greffes d’autres cucurbitacées, comme entre pastèque, concombre et citrouille.
Il est à noter que la taille relative (âge) du porte-greffe et scion est essentielle pour faire une greffe réussie (étape 2.2 du protocole). Nous avons observé que, si le porte-greffe utilisé était trop important par rapport à la scion, l’union de la greffe a été plus difficile pour former parce que la tige du scion a été quelque peu évidée. Basés sur notre précédente des données protéomiques31, l’inclusion du scion des greffés et porte-greffe des greffés sous forme de contrôles est fortement déconseillée (étape 2.3 du protocole), car alors, l’impact du greffage des blessures peut être en grande partie éliminé.
Ce protocole prévoit également un schéma expérimental détaillé et procédures expérimentales spécifiques pour l’étude de l’abondance des miARN dans le système de heterografting. Cette méthode sera également utile pour les études dans d’autres systèmes de plantes-greffons pour révéler les mécanismes de régulation des appels locaux et interurbains miRNA. Dans les Résultats de représentant, nous rapportons les modifications de l’expression de seulement local miARN dans la scion ou porte-greffe en réponse à une basse température. Accumulation de rapports ont mis en évidence l’implication de longue distance petite transmission RNA dans les changements phénotypiques liés au greffage. Le protocole présenté ici, qui combine les méthodes d’analyse de données greffage et haut débit, peut également servir pour miRNA analyse de transmission entre le greffon et le porte-greffe. Le principe de différenciation miARN transmises de miARN local repose sur leur similarité de séquence avec les génomes de référence (c'est-à-dire, un miRNA dans la scion qui est plus comme le génome de porte-greffe est considéré comme devant être transférés de porte-greffe, et vice versa).
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer. Les données de séquençage ARN petites sont déposées dans la GenBank sous le numéro SRP136842.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31772191), le projet de recherche d’intérêt Public dans la Province du Zhejiang (2017C 32027), la clé Science projet de sélection végétale dans le Zhejiang (2016C 02051) et le Programme National pour le Support de Top-Notch jeunes professionnels (à P.X.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| RNA-free DNase I | Takara | D2270A | |
| Truseq Small RNA sample prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| 2100 Bionalyser | Agilent | 5067 | |
| DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| UEA sRNA workbench 2.4-plant version (software) | NA | NA | http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/ |
| Rfam 11.0 database (website) | NA | NA | http://rfam.janelia.org |
| miRBase 22.0 (website) | NA | NA | http://www.mirbase.org/ |
| MIREAP(software) | NA | NA | https://sourceforge.net/projects/mireap/ |
| TargetFinder (software) | NA | NA | http://targetfinder.org/ |
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