Summary
Burada verimli bir şekilde homo - heterografts karpuz ve kabak şişe, yanı sıra soğuk duyarlı mikroRNA'lar incelenmesi için doku örnekleme, veri oluşturma ve veri analizi yöntemleri arasında hazırlamak için ayrıntılı bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
MikroRNA (miRNAs) küçük RNA'ların yaklaşık 20-24 kodlamayan endojen nt, bitki geliştirme ve uyum önemli rollerde oynamak için bilinir. Bazı miRNAs ifadelerin aşılama zaman değişmiş gösterilen bir biriktirme kanıt biyotik ve abiyotik stres kırpma hoşgörü geliştirmek için çiftçiler tarafından yaygın olarak kullanılan bir tarım uygulamaları. Kabak şişe karpuz da dahil olmak üzere, için ikinci en çok kullanılan anaç birini işleme birçok diğer büyük cucurbits, göre doğal iklim esnek bir üründür. Yüksek işlem hacmi sıralama teknolojileri son gelişme soğuk duyarlı miRNAs ve onların katkıları heterograft avantajları için araştırmak için büyük fırsatlar sağlamıştır; henüz, yeterli deneysel prosedürler bu amaç için bir önkoşuldur. Burada, verimli bir şekilde homo - ve soğuk duyarlı karpuz ve soğuk dayanıklı kabak şişe, yanı sıra doku örnekleme, veri oluşturma ve veri analizi yöntemleri arasında heterografts oluşturmak için ayrıntılı bir iletişim kuralı mevcut. Sunulan yöntemleri Ayrıca miRNA düzenlemeler altında ısı, kuraklık ve tuzluluk gibi çeşitli çevresel streslere sorgulaması için diğer bitki-aşılama sistemleri yararlıdır.
Introduction
Aşılama uzun bir tarımsal Teknik olarak bitkisel üretim ve biyotik ve abiyotik stres1,2,3dayanıklılık geliştirmek için istihdam edilmiştir. Heterografting sistemleri, elit anaç bitkiler su ve besin alımını artırmak, toprak patojenleri direnç güçlendirmek ve Greftler an arttırmak görüşmek metal toksisitesi4,5, olumsuz etkilerini sınırlamak büyüme canlılık ve çevresel stresleri artan tolerans. Birçok durumda, heterografting aynı zamanda bahçecilik bitkiler, geliştirilmiş meyve lezzet ve sağlık ile ilgili bileşikler6,7' nin artan içerik için önde gelen meyve özellikleri etkileyebilir. Bu etki, RNA'ların, peptidler ve proteinler uzun mesafe transferi anaç ve scion arasında büyüme ve Kalkınma "Soy" bitkiler8,9 yeniden programlama oransal temel bir mekanizma olduğunu bulundu ,10. Aşılama yaygın uzun mesafeli sinyal ve ulaşım ile ilgili çevresel adaptasyon11çalışmalarda kullanılmıştır. Aşılama deneyler özellikle doku veya vasküler sap ve harekete geçirmek veya bastırma sinyal iletim12nedeniyle moleküler hedeflerin almayı iletilen molekülleri kesin tespiti için güçlüdür.
Sigara kodlama RNA'lar, önemli düzenleyici fonksiyonları olan hücrelerde sarfetmek RNA'ın büyük bir sınıf abiyotik stres13bitki adaptasyon kolaylaştırıcı bir rol oynamaya bildirilmiştir. miRNAs küçük RNA'ların yaklaşık 20-24 kodlamayan endojen nt. çalışmalar miRNAs bitki faaliyetlerin çeşitli yönlerini düzenleyici rolünü ortaya, bu büyüme, ateş gibi kök oluşumu14,15,16, lateral besin alımı, sülfat metabolizma ve homeostasis17ve yanıt biyotik ve abiyotik18stres. Son zamanlarda, miRNAs ve onların hedef genlerin ifade ile ilgili stres toleransı heterografted salatalık fidan19tuz. Üzüm intervariety Greftler içinde miRNA ifade kuraklık strese yanıt genotip bağımlı20bulundu.
Hızlı bir gelişim ve yüksek işlem hacmi sıralama teknolojinin maliyeti azalan çifçiliği bitkiler yönetmeliğinde miRNA incelenmesi için büyük bir fırsat sağladı. Karpuz (Citrullus lanatus [lanatus.] Mansf.), dünya çapında yetiştirilen bir önemli cucurbit kırpma düşük sıcaklıklara maruz kalabilir. Şişe kabak (kabak siceraria [Molina] Standl.) ile karpuz greft için çiftçiler tarafından yaygın olarak kullanılan bir daha iklim esnek cucurbit var. Çalışmada birincil amacı bir standart, verimli ve heterografts karpuz (Citrullus lanatus [lanatus.] arasında yapmak için uygun yöntem oluşturmaktır Mansf.) ve şişe kabak (kabak siceraria [Molina] Standl). Bu protokolü de detaylı bir deneysel düzeni ve analitik işlemleri aşılama, takip miRNA ifadeleri Yönetmeliği eğitim için heterografting avantajları yatan mekanizmaları ifşa için yararlı olduğu sağlar.
Bu çalışmada kullanılan bitki malzemeleri karpuz çeşidinde ve kabak şişe landrace içerir. Karpuz çeşidinde düşük sıcaklığa duyarlı ama yüksek verim ile ticari bir güçlendirilmiş olduğunu. Kabak şişe landrace karpuz, salatalık ve onun mükemmel toleransı düşük sıcaklıklar21nedeniyle kabak şişe aşılama için popüler bir anaç var.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. tohum sterilizasyon ve çimlenme
- Su sıcaklığı 40 ° C'ye düşünceye kadar ara sıra, karıştırma ile 58 ° c su ile dolu bir 500 mL ölçek kabak şişe tohumlar yüzey sterilizasyon için emmek
- Bu arada, bir naylon torbaya ve, sterilize etmek için turba toprak 3 kg koyun Otoklav bu 120 ° C/0.5 MPa 20 dk için.
- 4-5 h yok karıştırma ile daha fazla kabak şişe Tohum iliklerine kadar tutun.
- Su oda sıcaklığına ulaştığında, tohumlar 2 x - 3 x distile su ile durulayın.
- Fazla suyu drenaj ve tohumları bir gazlı bez torba karanlık bir büyüme odasında 28 ° C'de filiz için izin.
- Çimlenme sonra steril turba toprak ile dolu tohumları plastik kaplar (6 cm çapında) içine ekmek.
- Kabak şişe fidan iki düzleştirilmiş cotyledons geliştirdik adımları 1.1-1.3 karpuz tohumu ile yineleyin.
Not: Bu zaman yönetimi "Soy" ve anaç boyutları de başarılı aşılama için uygun sağlar.
2. fide büyüme ve aşılama
- Sıcaklık 28 ° c (ışık) gündüz ve gece boyunca 22 ° C'de (karanlık) tutmak fidan 16-h ışık /8-h karanlık döngüsü ile büyüme odasında büyümek. Fidan su 1 x bir gün ikindi ekleyerek sulamak.
- Kesme-aşılama yöntemi22 heterografts zaman (anaç) kabak şişe fidan bir true-yaprak aşamada ve karpuz (soy) cotyledons (henüz düzleştirilmiş) ortaya çıkmıştır olun
- 2-3 cm cotyledons aşağıda hypocotyls karpuz fidan kesmek ve üst kabak şişe fidan hemen üstündeki gerçek yerinde bırakır.
- Kesilmiş kabak şişe fidan üst bir delik açmak için bir kürdan kullanın. Kesilmiş karpuz fidan heterografts yapmak için kabak şişe fidan deliklere yerleştirin.
- A benzer yöntem olarak adım 2.2 sunulan homografts olun
Not: Homo - ve heterografting kombinasyonları her zaman aynı anda yapılmalıdır (Şekil 1), hangi, bu durumda, aşağıdaki sonuçları: kabak karpuz/şişe (WB, heterograft), karpuz/karpuz (WW, Homogref) ve kabak şişe /bottle kabak (BB, Homogref).
Şekil 1: greft kombinasyonları ve aşılı bitki yapıları örnek. WB karpuz/şişe kabak heterografting; = WW karpuz/karpuz homografting; = BB kabak şişe/şişe kabağı homo-aşılama; = WB-S "Soy" yaprakları örneklenmiş; karpuz/şişe kabak heterografts = WB-R örneklenmiş karpuz/şişe kabak heterografts yaprakların anaç =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
3. Yönetim, soğuk tedavisi, postgrafting ve örnekleme
- Nispeten yüksek bir nem tutmak ve 16-h ışık/8-h karanlık döngüleri 28 ° c (ışık) gündüz ve sırasında 22 ° c sıcaklık tutmak, çevresel koşullar altında 7 d için proje için Şeffaf Polietilen torbalar ile aşılı fidan enwrap gece (karanlık).
- Şeffaf Polietilen torbalar 7 günde ortaya çıkarmak. İzin aynı altında 7-10 gün ek koşullar için bitkiler büyümek.
- İki grup, soğuk tedavi (vurguladı) diğeri (vurguladı-) denetimi için sağlıklı Tekdüzen fidan bölün. Kontrol grubu için süre soğuk vurguladı grubu için ek bir 48 saat için fidan (28 ° C'de) aynı büyüme odasında bırak, fide adımda anlatıldığı gibi bir büyüme Odası 6 ° C, Açık/Koyu koşulları ile sabit bir sıcaklıkta ile transfer 2.1.
- "Soy" ve anaç yapraklarından Greftler (Şekil 1) örnek. Örnekleri hemen sıvı azot donma ve onları kullanmak kadar-70 ° C'de saklamak.
4. Kütüphane hazırlık ve yüksek işlem hacmi sıralama
- Donmuş numuneler 2 mL microcentrifuge tüp sıvı azot aktarın.
- Paslanmaz çelik boncuk (5 mm çapında) dokular içeren her tüpün ekleyin.
- Boncuk Değirmen homogenizer için 30 kullanarak ince bir toz dokuların homojenize s.
- Aşılama her birleşimi için eşit tutarlar (0,1 g) toprak örneği üzerinden on fidan alıp onları bir 10 mL santrifüj tüpü karıştırın. Üreticinin önerilerini doku ağırlığına karşılık gelen temel guanidium hidroklorid reaktif (Tablo reçetesi) uygun bir miktarda ekleyin.
- Genomik DNA contaminations RNA-Alerjik DNaz ekleyerek kaldırmak ben 150 U/ml 1 h için 37 ° C'de.
- Toplam belirlemek RNA miktarı RNA bütünlüğünü güvenceye almak için bir microcapillary Elektroforez sistemde sayısı > 7.0.
Not: Bir RIN > 7.0 RNA örnekleri yüksek bir bütünlük sağlar. - Küçük RNA kütüphaneler üreticinin yönergeleri doğrultusunda ticari seti (Malzemeler tablo) kullanarak hazırlayın. Örnek başına toplam RNA'ın 1 µg başlatmak için kullanın.
- Tezcan Kütüphane normalleştirme reaktifler ve bağdaştırıcıları üreticinin esaslarına göre. 5've 3'bağdaştırıcıları ile küçük RNA'ların ligate ve elute ve onları arındırmak. Sonra ters uyarlamak 5've 3' tane küçük RNA'lar üreticinin yönergeleri izleyerek.
- PCR güçlendirme üreticinin protokolüne göre gerçekleştirin. Bir microcapillary elektroforez sistemi kullanarak cDNA kütüphanelerin miktar ve kalitesini değerlendirmek.
- Bir RNA, RIN sağlamak için bir microcapillary elektroforez sistemi İnternet üzerinde 1 µL yük > 7.0.
- Başka bir yerde23açıklandığı gibi bir yüksek-den geçerek sıralama cihazda küçük RNA kütüphaneler sıra.
5. miRNA ve hedef Gene tahmin
- Aşılama her birleşim için açık kaynak UEA sRNA tezgah 2.4-bitki sürüm24 kalitesiz dizileri kaldırmak ve adaptör dizileri ham okuma dan kırpmaya kullanın. 18 yaşından küçük olan dizileri silmek nt veya 32 daha büyük nt.
- Yüksek kaliteli "temiz" dizileri tanımak ve okuma rRNA, tRNA, snoRNA ve diğer snRNA kaldırmak için açık kaynak Rfam 11,0 veritabanına karşılaştırın.
- Kısa-okuma sırası hizalama araç25kullanarak başvuru genleri için kalan okuma hizalayın. Hiçbir uyuşmazlığı Bu adımda izin verilir.
Not: Karpuz "97103" genom derleme26 Okunma "Soy" ile uyum için kullanılan V1 ve kabak şişe "HZ" genom derleme V127 Okunma anaç için kullanıldı. - Açık kaynak miRBase 22.028olarak bilinen olgun miRNAs karşı kalan okuma karşılaştırın. Bilinen miRNAs homolog okuma korunmuş miRNAs sınıflandırılır.
- Bilinen miRNA öncüleri genom dizisi ile eşleşecek şekilde başarısız dizileri karşılaştırın. MIREAP29 algoritma varsayılan ayarlar altında potansiyel roman miRNAs algılamak için kullanır.
6. farklı ifade ve gen Ontoloji Analizi
- Onların okuma sayıları dayalı miRNAs ifade düzeyleri karşılaştırın. miRNAs bir P-değeri (Fisher'ın tam testi) < 0,05 ve bir mutlak günlük2 değeri > 2 differentially ifade olarak değerlendirilir.
- Bir antianlamlı oligonükleotid hedef site seçim aracı (TargetFinder)30 potansiyel tamamlayıcı mRNA'ların (miRNA hedef genleri) için varsayılan parametreleri altında differentially ifade miRNAs tahmin etmek için kullanın.
- Gen Ontoloji kullanın (miRNA hedef genlerin Ontoloji (GO) ortaya çıkarmak için zenginleştirme analitik araç31 desenler altında bir Pgidin) - 0,05 istatistiksel anlamlılık için eşik değeri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 2: oda sıcaklığında ve soğuk vurguladı koşulları çeşitli greft fenotipleri. (bir) Bu panel homo - ve heterografted fidan oda sıcaklığında denetimi olarak gösterir. (b) Bu panel soğuk tedavi 48 h sonra homo - ve heterografted fidan gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Açıklanan yöntemi kullanarak, yüksek başarı (hayatta kalma) oranında 98 aşılama için elde edilen. Oda sıcaklığında ve soğuk vurguladı koşulları çeşitli greft fenotipleri Şekil 2' de gösterilmiştir. Soğuk tedavi 48 saat sonra belli büyüme geriliği ile solmuş genç yaprakları, homografted kabak şişe bitki ve karpuz/şişe kabak heterografts çok daha güçlü büyüme sergilenen homografted karpuz bitkiler gösterdi. Hiçbir belirti hasar bile nerede en düşük doğru yaprakları zarar görmüş homografted kabak şişe bitkiler, geride heterografts yapraklarda tespit edildi. Bu sonuçlar açıkça soğuk tolerans veriyor içinde heterografts avantajı gösteriyor.
Küçük RNA sıralama sekiz kütüphanelerin Toplam 258 milyon ham okuma vermiştir. Kalite kontrol (QC) sonra Toplam 146 milyon okur için yaklaşık 30 milyon benzersiz sıraların karşılık gelen edildi (Tablo 1) korunur. Temiz sRNA dizileri bu dizi dayanarak, 323 miRNAs 10 bilinen ve 313 roman miRNAs, dahil olmak üzere, kabak şişe tahmin ve 20 bilinen ve 802 roman miRNAs 24 watermelon.sRNAs tahmin nt yapılmış tüm aşılama, sRNAs en büyük sınıfını kombinasyonları, ne olursa olsun oda sıcaklığında veya soğuk vurguladı koşulları (Şekil 3).
| Tedavi | Kodu | No okur | sRNA | |
| Toplam | Benzersiz | |||
| WW-CK | Ham | 30612962 | ||
| Temiz | 19727501 | 3858868 | ||
| Genomik için eşlenen | 19059359 | 3777952 | ||
| BB-CK | Ham | 30845546 | ||
| CK | Temiz | 16832061 | 3787866 | |
| Genomik için eşlenen | 16375142 | 3694388 | ||
| WB-CK-S | Ham | 39492123 | ||
| Temiz | 26783053 | 6319473 | ||
| Genomik için eşlenen | 25919944 | 6132389 | ||
| WB-CK-R | Ham | 23763619 | ||
| Temiz | 10187791 | 1784447 | ||
| Genomik için eşlenen | 8946929 | 1537867 | ||
| WW-CL | Ham | 27557577 | ||
| Temiz | 17879038 | 3336242 | ||
| Genomik için eşlenen | 17153763 | 3259960 | ||
| BB-CL | Ham | 29780991 | ||
| Temiz | 13342206 | 3235570 | ||
| Soğuk | Genomik için eşlenen | 12949972 | 3164329 | |
| WB-CL-S | Ham | 45708415 | ||
| Temiz | 23071845 | 4310276 | ||
| Genomik için eşlenen | 22363113 | 4224166 | ||
| WB-CL-R | Ham | 30585408 | ||
| Temiz | 19029266 | 3541729 | ||
| Genomik için eşlenen | 17364239 | 3196106 | ||
Tablo 1: İstatistikler küçük RNA'lar çeşitli Greftler oda sıcaklığında veya soğuk tedavi altında.
Şekil 3: boyut dağılımı sRNA okur çeşitli Greftler. (bir) Bu panel sRNA boyutu dağılımı heterografts denetimi veya soğuk koşulları altında okur gösterir. (b) Bu panel sRNA boyutu dağılımı homografts denetimi veya soğuk koşulları altında okur gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Bir 48-h soğuk tedavi, 30 ve 268 miRNAs up - ve downregulated, sırasıyla, "Soy" heterografts içinde yaprakları vardı. Bu anaç, ileride yapraklar sonuçlarına tezat içinde 31 nerede ve sadece 12 miRNAs up - ve downregulated, sırasıyla vardı (Şekil 4). Karpuz/karpuz homografts 64 ve 83 miRNAs up - ve downregulated, sırasıyla idi. Kabak şişe/şişe kabak homografts bu numaraları 30 ve 28 idi. Görünüşe göre heterografting bir derin miRNA ifadeleri yeniden şekillendirmek için nedeni. GO-zenginleştirme analizleri 78 zenginleştirilmiş GO açısından heterografts scion biyolojik süreçlerin gizli 40 ile tanımlanan differentially ifade miRNAs sözde hedef genlerin hücresel bileşenleri ve moleküler işlevlere 36 2 (Şekil 5). Biz birkaç bilinen GO şartları/yollar abiyotik/biyotik stres direnç ve sinyal iletimi için örneğin, kitin katabolik işlemi ilgili bulundu (git: 0006030, git: 0006032), etilen-harekete geçirmek yolu sinyal (git: 0009873), polyamine biyosentetik süreci (GO: 0006596) ve sinyal iletimi protein fosforilasyon tarafından (gidin: 0009755), dahil edildi. Birlikte, bizim sonuç hedef genleri transkript bolluk ayarlama tarafından miRNAs, downregülasyon geliştirilmiş soğuk hoşgörü altında yatan önemli bir mekanizma temsil edebilir öneririz. Karpuz/şişe kabağı greft heterograft başına greft avantajları formu miRNA şekilleri üzerinde önemli bir etkisi vardır.
Şekil 4: up - ve downregulated miRNAs yanıt olarak çeşitli Greftler soğuk stres şekillerinin karşılaştırılması. WB-S "Soy" yaprakları örneklenmiş; karpuz/şişe kabak heterografts = WB-R örneklenmiş; karpuz/şişe kabak heterografts yaprakların anaç = WW karpuz/karpuz homografts; = BB kabak şişe/şişe kabak homografts =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: zenginleştirme analizleri "Soy" differentially ifade miRNAs sözde hedef genlerin bırakır, heterografts soğuk stres üzerine gidin. WB-CL-S = "Soy" yaprakları karpuz/şişe kabak heterografts altında soğuk tedavi; WB-CK-S "Soy" yaprakları karpuz/şişe kabak heterografts oda sıcaklığında =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol için homo - ve heterografts arasında karpuz ve kabak şişe yapmak için son derece verimli ve tekrarlanabilir bir yöntem ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Belirli hiçbir ekipman gerektiren bu yöntem, çok kolay ve genellikle aşılama, çok yüksek sağkalım oranı vardır. Yöntem karpuz, salatalık ve kabak arasında Greftler diğer cucurbits için yapmak için kullanılabilir.
Bu göreli boyutunu (Yaş) anaç ve "Soy" başarılı greft (adım 2.2 Protokolü) yapmak için önemlidir dikkati çekiyor. Biz kullanılan anaç "Soy" için karşılaştırıldığında çok büyük olsaydı, "Soy" kök biraz boş çünkü greft Birliği forma daha zor, gözlendi. Bizim önceki proteomik veri31tarihinde bağlı olarak, kendi kendine aşılı "Soy" ve kendi kendine aşılı anaç dahil denetimler olarak mı (adım 2.3 iletişim kuralı), çünkü önerilir sonra yaralanmalar aşılama etkisi büyük ölçüde ortadan kaldırılabilir.
Heterografting sistemde miRNAs zenginliği soruşturma için bu protokolü de detaylı bir deneysel düzeni ve belirli deneysel yordamlar sağlar. Bu yöntem ayrıca yerel ve şehirlerarası miRNA düzenleme mekanizmaları ortaya çıkarmak için diğer bitki-aşılama sistemlerinde çalışmalar için faydalı olacaktır. Temsilcisi sonuçları, yalnızca yerel miRNAs "Soy" içinde veya yanıt olarak bir düşük sıcaklık anaç ifade değişiklikleri bildirmek. Biriken raporları fenotipik değişiklikler aşılama ile ilgili uzun mesafe küçük RNA iletimde katılımı sermiştir. Aşılama ve yüksek işlem hacmi veri analizi için yöntemini bir araya getiren, burada anlatılan Protokolü "Soy" ve anaç arasında miRNA iletim analiz için de kullanılabilir. Yerel miRNAs gelen farklılaştırıcı iletilen miRNAs prensip başvuru genleri onların sırası benzerlik temel alır (Örneğin, anaç genom anaç aktarılacak kabul edilir gibi daha fazla olan "Soy" içinde miRNA ve tersi).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok. Küçük RNA sıralama veri katılım numarası SRP136842 altında GenBank yatırılır.
Acknowledgments
Bu eser Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31772191), araştırma projesi (2017 C 32027) Zhejiang eyaletinde kamu yararı için anahtar bilim proje bitki ıslahı Zhejiang (2016 C 02051) için ve Ulusal Program tarafından desteklenmiştir Birinci sınıf genç profesyonellere (P.X.) desteği.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| RNA-free DNase I | Takara | D2270A | |
| Truseq Small RNA sample prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| 2100 Bionalyser | Agilent | 5067 | |
| DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| UEA sRNA workbench 2.4-plant version (software) | NA | NA | http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/ |
| Rfam 11.0 database (website) | NA | NA | http://rfam.janelia.org |
| miRBase 22.0 (website) | NA | NA | http://www.mirbase.org/ |
| MIREAP(software) | NA | NA | https://sourceforge.net/projects/mireap/ |
| TargetFinder (software) | NA | NA | http://targetfinder.org/ |
References
- Schwarz, D., Rouphael, Y., Colla, G., Venema, J. H. Grafting as a tool to improve tolerance of vegetables to abiotic stresses: Thermal stress, water stress and organic pollutants. Scientia Horticulturae. 127, 162-171 (2010).
- Li, Y., et al. Mechanisms of tolerance differences in cucumber seedlings grafted on rootstocks with different tolerance to low temperature and weak light stresses. Turkish Journal of Botany. 39 (4), 606-614 (2015).
- Li, C. H., Li, Y. S., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. Dynamic Expression of miRNAs and Their Targets in the Response to Drought Stress of Grafted Cucumber Seedlings. Horticultural Plant Journal. 2 (1), 41-49 (2016).
- Rouphael, Y., Cardarelli, M., Colla, G., Rea, E. Yield, mineral composition, water relations, and water use efficiency of grafted mini-watermelon plants under deficit irrigation. HortScience. 43 (3), 730-736 (2008).
- Savvas, D., et al. Interactive effects of grafting and manganese supply on growth, yield, and nutrient uptake by tomato. HortScience. 44 (7), 1978-1982 (2009).
- Aloni, B., Cohen, R., Karni, L., Aktas, H., Edelstein, M. Hormonal signaling in rootstock-scion interactions. Scientia Horticulturae. 127, 119-126 (2010).
- Rouphael, Y., Caradrelli, M., Rea, E., Colla, G. Improving melon and cucumber photosynthetic activity, mineral composition, and growth performance under salinity stress by grafting onto Cucurbita hybrid rootstocks. Photosynthetica. 50 (2), 180-188 (2012).
- Louws, F. J., Rivard, C. L., Kubota, C. Grafting fruiting vegetables to manage soilborne pathogens, foliar pathogens, arthropods and weeds. Scientia Horticulturae. 127 (2), 127-146 (2010).
- Asins, M. J., et al. Genetic analysis of rootstock-mediated nitrogen (N) uptake and root-to-shoot signalling at contrasting N availabilities in tomato. Plant Science. 263, 94-106 (2017).
- Yin, L. K., et al. Role of protective enzymes in tomato rootstocks to resist root knot nematodes. Acta Horticulturae. 1086 (1086), 213-218 (2015).
- Gaion, L. A., Carvalho, R. F. Long-Distance Signaling: what grafting has revealed? Journal of Plant Growth Regulation. 37 (2), 694-704 (2018).
- Turnbull, C. G. Grafting as a research tool. Plant Developmental Biology. Hennig, L., Köhler, C. , Humana Press. New York City, NY. 11-26 (2010).
- Li, C., et al. Grafting-responsive miRNAs in cucumber and pumpkin seedlings identified by high-throughput sequencing at whole genome level. Physiologia Plantarum. 151 (4), 406-422 (2014).
- Lakhotia, N., et al. Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing. BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).
- Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Bartel, B. MicroRNAs and their regulatory roles in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 19-53 (2006).
- Puzey, J. R., Kramer, E. M. Identification of conserved Aquilegia coerulea microRNAs and their targets. Genetic. 448 (1), 46-56 (2009).
- Matthewman, C. A., et al. miR395 is a general component of the sulfate assimilation regulatory network in Arabidopsis. FEBS Letters. 586 (19), 3242-3248 (2012).
- Ali, E. M., et al. Transmission of RNA silencing signal through grafting confers virus resistance from transgenically silenced tobacco rootstocks to non-transgenic tomato and tobacco scions. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 25 (3), 245-252 (2016).
- Li, Y. S., Li, C. H., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. MicroRNA and target gene responses to salt stress in grafted cucumber seedlings. Acta Physiologiae Plantarum. 38 (2), 1-12 (2016).
- Pagliarani, C., et al. The accumulation of miRNAs differentially modulated by drought stress is affected by grafting in grapevine. Plant Physiology. 173 (4), 2180-2195 (2017).
- Liu, N., Yang, J. H., Guo, S. G., Xu, Y., Zhang, M. F. Genome-wide identification and comparative analysis of conserved and novel microRNAs in grafted watermelon by high-throughput sequencing. PLoS One. 8 (2), e57359 (2013).
- Song, G. Development of 2JC-350 automatic grafting machine with cut grafting method for vegetable seedling. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering. 22 (12), 103-106 (2006).
- Kumar, D., et al. Uncovering leaf rust responsive miRNAs in wheat (triticum aestivum l.) using high-throughput sequencing and prediction of their targets through degradome analysis. Planta. 245 (1), 1-22 (2016).
- Kohli, D., et al. Identification and characterization of wilt and salt stress-responsive microRNAs in chickpea through high-throughput sequencing. PLoS One. 9 (10), e108851 (2014).
- Salzberg, S. L. Computational challenges in next-generation genomics. International Conference on Scientific and Statistical Database Management. ACM. 2, (2013).
- Guo, S. G., et al. The draft genome of watermelon (Citrullus lanatus) and resequencing of 20 diverse accessions. Nature Genetics. 45, 51-58 (2013).
- Wang, Y., et al. Gourdbase: a genome-centered multi-omics database for the bottle gourd (lagenaria siceraria), an economically important cucurbit crop. Scientific Reports. 8 (1), 306 (2018).
- Wang, X. F., Liu, X. S. Systematic Curation of miRBase Annotation Using Integrated Small RNA High-Throughput Sequencing Data for C. elegans and Drosophila. Frontiers in Genetics. 2, 25 (2011).
- Mireap: MicroRNA discovery by deep sequencing. , Available from: http://sourceforge.net/projects/mireap/ (2008).
- Bo, X. C., Wang, S. Q. TargetFinder: a software for antisense oligonucleotide target site selection based on MAST and secondary structures of target mRNA. Bioinformatics. 21 (8), 1401-1402 (2005).
- Tang, H., et al. GOATOOLS: Tools for Gene Ontology. , Available from: https://doi.org/10.5281/zenodo.31628 (2015).
- Wang, L. P., Li, G. J., Wu, X. H., Xu, P. Comparative proteomic analyses provide novel insights into the effects of grafting wound and hetero-grafting per se on bottle gourd. Scientia Horticulturae. 200 (8), 1-6 (2016).
