Summary
Aquí, presentamos un protocolo para establecer el modelo depresivo de ratón, observar los cambios de comportamiento asociados con el estrés crónico de leve impredecible (CUMS) y evaluar el efecto de la depresión de Xiaoyaosan.
Abstract
Además del uso estandarizado de medicamentos antidepresivos y la psicoterapia, el uso de la medicina tradicional China ha llevado a una mejora general de los pacientes con desorden depresivo importante (MDD). Por lo tanto, el propósito de este estudio fue establecer el modelo depresivo de ratón, observar los cambios de comportamiento asociados con el estrés crónico de leve impredecible (CUMS) y entonces evaluar el efecto de la depresión de Xiaoyaosan. Ratones fueron divididos aleatoriamente en cuatro grupos: un grupo control, grupo modelo, un grupo de tratamiento con Xiaoyaosan y un grupo de tratamiento con fluoxetina. Todos los ratones se mantuvieron individualmente en jaulas, y depresión fue inducida en los ratones exponiéndolas a varias manipulaciones diseñadas de CUMS por 21 días, como se describe en el protocolo. Ratones en el grupo modelo y grupo de control recibieron 0,5 mL de agua destilada, mientras que los ratones en los grupos de tratamiento recibieron ya sea Xiaoyaosan (0,25 g/kg/día) o fluoxetina (2,6 mg/kg/día). Los fármacos utilizados en el estudio recibieron intragástrica durante las tres semanas enteras. Estimar los comportamientos depresivos, una serie de parámetros como el estado de la capa, peso corporal, abren cuenta de prueba de campo, y se registraron puntaje de prueba de preferencia de sacarosa. Análisis de los datos demostraron que comportamientos del modelo ratones cambiaron significativamente compararon con el comportamiento de los ratones del grupo control, que fueron mejoradas por el tratamiento de Xiaoyaosan y fluoxetina. Los resultados actuales demostraron los efectos de la depresión de Xiaoyaosan en los comportamientos de los ratones inducido por CUMS y revelaron que compuestos a partir de la prescripción de Xiaoyaosan pueden ser valioso para tratar la depresión, teniendo en cuenta sus efectos beneficiosos en comportamientos depresivos.
Introduction
MDD es una enfermedad mental crónica, altamente recurrente que presenta con persistente estado de ánimo bajo, depresión, baja autoestima, retraso mental, pérdida de interés, dormir trastornos, tendencias profundamente pesimistas o suicidas; ha causado gran daño a la salud humana y de la estabilización social1. Se ha convertido en una de la principal causa mundial de discapacidad, y puede ser una de las principales causas principales de morbilidad en el 2030 según la Organización Mundial de la salud2,3. Actualmente, la psicoterapia y medicamentos antidepresivos se consideran la primera opción para el tratamiento de MDD. Sin embargo, un enorme número de pacientes diagnosticados con MDD no responde a la terapia o medicación continua, y aparecen como teniendo depresión resistente al tratamiento4.
Xiaoyaosan es un clásico chino compuesto5 que ha sido ampliamente utilizado para tratar enfermedades psicológicas durante miles de años desde la dinastía Song en China6. Está compuesto por 8 hierbas chinas: Radix Bupleuri, Radix Paeoniae Alba, Radix Angelicae Sinensis, Poria, Rhizoma Atractylodis Macrocephalae, Radix Glycyrrhizae, Rhizoma Zingiberis Recens y Herba Menthae. Xiaoyaosan contiene a varios componentes, tiene múltiples objetivos y utiliza varias vías7. Xiaoyaosan comúnmente ha demostrado ser una fórmula segura y efectiva para el tratamiento de diversos trastornos mentales relacionados con enfermedades, y estudios modernos se han centrado también en el mecanismo de la depresión de este compuesto8,9, 10. La patogenia de la MDD es todavía confusa, aunque existen múltiples hipótesis, incluyendo la hipótesis de la monoamina, la hipótesis de receptores de neurotransmisores, la hipótesis de cambio de función neuroendocrina, la hipótesis de anormalidad del sistema inmune, etcetera. Varios estudios han demostrado que el efecto antidepresivo de Xiaoyaosan tiene una conexión con las bases materiales de la anterior hipótesis11,12y se manifiesta de su acción terapéutica como una mejora al depresivo conductas13.
Por otra parte, con la prevalencia de la depresión, la sociedad moderna ha sufrido reducciones en la fuerza de trabajo, jubilaciones anticipadas y costosos tratamientos14. Tratamiento costoso necesita atención médica estricta, que significa una gama de aumento de los costos médico y previsión precisa de precisos resultados indeseables, así como efectos secundarios15. La hierba China Xiaoyaosan tiene componentes accesibles, efectos únicos y leves efectos secundarios. Su aplicación puede jugar un papel en la reducción de la carga del tratamiento médico moderno. Por lo tanto, para proporcionar una base más teórica a la aplicación de Xiaoyaosan, una terapia alternativa clínica debe ofrecerse para el tratamiento de la depresión, la incidencia de que aumenta año tras año y debe mejorar la salud humana al mismo tiempo. Este papel describe un protocolo que implica el uso de Xiaoyaosan para prevenir los comportamientos depresivos, estableciendo el modelo depresivo del ratón. La prueba de campo abierto y prueba de preferencia de sacarosa fueron utilizados para verificar los efectos antidepresivos de la Xiaoyaosan.
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Protocol
Este protocolo fue aprobado por el Comité de ética Animal de la Universidad de Beijing de Medicina China y estaba de acuerdo con todas las pautas para el cuidado y uso de animales de laboratorio de China. No hubo ninguna situación de muerte accidental durante el procedimiento experimental, y no animales debían ser sacrificados en este estudio.
1. preparación de medicamentos para el experimento
Nota: Las hierbas chinas fueron compradas y luego authenticadas por Dr. B. Liu de la Universidad de Beijing de Medicina China. Xiaoyaosan contiene los siguientes medicamentos chinos tradicionales ocho en una proporción de 6:6:6:6:3:6:2:2: Radix Angelicae Sinensis, Radix Paeoniae Alba, Poria, Radix Bupleuri, Radix Glycyrrhizae, Rhizoma Atractylodis Macrocephalae, Herba Menthae y Rhizoma Zingiberis Recens.
- Preparar Xiaoyaosan como se describió anteriormente16.
Nota: Se extrajeron estos compuestos en la sala de preparación de Medicina China del Hospital de amistad China-Japón, y el rendimiento de la extracción fue de 18.8%. - Verificar la calidad de Xiaoyaosan de alto rendimiento cromatografía líquida-espectrometría de análisis (LC-MS/MS)17.
2. preparación de ratones para el procedimiento Experimental
Nota: Para el procedimiento experimental, 60 saludables ratones machos de la C57BL/6J de 12 semanas de edad se seleccionaron, con cada ratón pesa entre 18 y 22 g.
- Mantener los ratones individualmente en jaulas en un típico cuarto animales de laboratorio Free de patógeno específico (SPF) (22 ± 1 ° C, ciclo de 12 h/12 h luz/oscuridad, humedad relativa: 30 – 40%) una semana antes del procedimiento CUMS.
- Dividir todos los ratones, al azar, un grupo de control, un grupo de modelo, un grupo de tratamiento de Xiaoyaosan o un grupo de tratamiento de fluoxetina según su peso corporal. Cada grupo tiene 15 ratones.
- Antes de la iniciación de la experiencia, número de los ratones de cada grupo en su cola con una pluma de marca.
- Todos los ratones con una prueba de preferencia de sacarosa de cinco días de prueba (consulte el paso 5) y una prueba de campo abierto (consulte el paso 6).
3. inducción de la depresión en ratones
Nota: Para inducir a la depresión, los ratones del grupo modelo y dos grupos de tratamiento experimentaron CUMS para 21 días18. El plan se puede cambiar según la situación práctica, pero se debe respetar el principio de que el mismo factor estresante no puede utilizarse continuamente.
-
Exponga los ratones diariamente a dos de los siguientes siete estresores días consecutivos 2119. Nuestro plan de modelado está diseñada como sigue:
- El lunes, exponer ratones con carencia de alimentos (vacía la alimentación de cada jaula durante 24 h, 8:00 a 8:00) y privación de agua (quitar la botella de consumición de cada jaula durante 24 h, 8:00 a 8:00).
- El martes, exponer ratones con tensión de seguridad (refrene ratones en una bañera de plástico pequeña para 3 h, 8:00 a 11:00) y jaulas vacías (quitar el acolchado en cada jaula para h 11, 8:00 a 19:00 p.m.).
- El miércoles, exponer ratones en jaulas húmedas y sucias (Vierta el agua en cada jaula y mantenga mojado durante 24 h, 8:00 a 8:00) y jaulas (poner cinco ratones en una jaula durante 24 h, 8:00 a 8:00 a.m.).
- El jueves, exponer ratones con estrés de moderación y piscina helada20,21 (fuerza cada ratón para nadar en un acuario de cristal con agua con hielo durante 5 minutos).
- El viernes, exponer ratones en jaulas húmedas y sucias y la carencia de alimentos.
- El sábado, exponer ratones con estrés de moderación y llenos jaulas.
- El domingo, exponer ratones jaulas vacías y piscina helada.
- Grabar el escudo estatal y el peso corporal semanalmente hasta el final del modelado (día 21). Calcular la puntuación total del estado de capa como la suma de puntuaciones de siete partes diferentes del cuerpo: cabeza, cuello, dorsal capa, capa ventral, patas delanteras, la cola y las patas traseras. Una puntuación de uno indica una capa bien cuidada, y una puntuación de cero indica una capa desarreglado22.
- Realizar una prueba de preferencia de cinco días de sacarosa (véase paso 5) y una prueba de campo abierto (consulte el paso 6) al final del experimento.
4. administración de Xiaoyaosan
Nota: La dosis de Xiaoyaosan (0,25 g/kg/día) fue seleccionado sobre la base de su eficacia satisfactoria como se describió previamente9.
- Durante el experimento, utilizar agua destilada para preparar las suspensiones Xiaoyaosan y fluoxetina y asegúrese de utilizar de inmediato.
- Dar 0.5 mL de agua destilada a los ratones en el grupo control y grupo modelo administración intragástrica cada día antes de modelado. Mientras tanto, dan Xiaoyaosan (0,25 g/kg/día) o fluoxetina (2,6 mg/kg/día) a los ratones en los dos grupos de tratamiento.
5. Test de preferencia de sacarosa
Nota: No hay privación de agua o alimentos se aplicó antes de la prueba. El protocolo fue realizado como previamente divulgados23.
- En los dos primeros días, la casa los ratones individualmente con dos botellas llenados con agua del grifo.
- En los próximos dos días, dan los ratones dos botellas llenan con solución de sacarosa al 1%.
- El último día, dan los ratones dos botellas para 24 h, uno con agua del grifo y el otro con solución de sacarosa al 1%. Para eliminar una preferencia del lado de los ratones en comportamiento de beber, cambiar la posición de las dos botellas después de 12 h.
- Registrar el volumen (mL) de agua y la solución de sacarosa consumida. Calcular la preferencia de sacarosa como se indica a continuación: preferencia de sacarosa (%) = sacarosa total consumo de consumo de líquido x 100%.
6. campo prueba
- Realizar la prueba de campo abierto en una sala tenuemente iluminada y tranquila con una cuatro negro mate caja de madera. El suelo se dividen en 25 cuadrados iguales por líneas azules.
- Limpie la caja de campo abierto con 5% de alcohol antes del acceso de cada ratón. Luego, coloque el ratón en el centro del campo abierto suavemente.
- Suspender una alta definición digital cámara aproximadamente 200 cm sobre el campo y registrar el comportamiento de cada ratón durante 5 minutos.
- Evaluar el vídeo del comportamiento de ratones por el software de sistema de seguimiento de video y grabar los datos del total funcionamiento distancia y número de entradas en la zona centro.
- Analizar los datos de la distancia total se movió y número de entradas en la zona central de software estadístico.
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Representative Results
Tenga en cuenta que los resultados hayan sido publicados previamente por el Dr. Ding Xiu Fang, et al. 18
Los datos se expresaron como media ± error estándar de la media (SEM). Un ANOVA de una vía o una prueba no paramétrica fue utilizada para datos generales basados en la normalidad y la prueba de homogeneidad de varianza. La prueba LSD se utilizó para las comparaciones entre grupos. Además, el proceso de medición repetida del modelo lineal general (GLM) fue utilizado para llevar a cabo una vía análisis ANOVA para datos repetidos (puntuación de la capa y el peso corporal), y se adoptó un proceso de análisis multivariante de la varianza para hacer comparaciones entre grupos en cada momento punto (método de LSD).
El estado físico de los ratones inducido por CUMS
Después de la exposición de ratones a tres semanas de corridas para la inducción de la depresión, se indujo una distrofia progresiva del estado de la capa en el grupo de modelos; la distrofia no presentó después de dos semanas de estrés, pero empeoró en el final del procedimiento CUMS (tres semanas) y la puntuación de capa disminuyó significativamente en comparación con la del grupo control (F (3, 56) = 25.08, p = 0.000). El estado de la capa de los ratones fue mejorado notablemente después del tratamiento continuo con Xiaoyaosan o fluoxetina en comparación con el grupo modelo (F (3, 56) = 25.08, ambos p = 0,001, Figura 1a). Según los datos de peso corporal semanal de cada grupo, se puso de manifiesto una reducción significativa en el peso corporal por la tercera semana (F (3, 56) = 16.149, p = 0.000, Figura 1b), mientras que el tratamiento Xiaoyaosan o fluoxetina aumentó significativamente el cuerpo peso comparado con el grupo modelo (F (3, 56) = 16.149, ambos p = 0,001).
La prueba de preferencia de sacarosa
Antes de la exposición de estrés, ratones en todos los grupos tenían una preferencia similar de sacarosa (condición de línea de base, Figura 2a). Sin embargo, se observó una significativa caída en la preferencia de la sacarosa después de tres semanas del procedimiento estrés en grupo modelo (F (3, 56) = 41.379, p = 0.000, figura 2b). Tratamiento Xiaoyaosan y fluoxetina efectivamente revirtió estos cambios y aumentado la preferencia de sacarosa, en comparación con el grupo modelo (F (3, 56) = 41.379, ambos p = 0.000).
La prueba de campo abierto
Antes de la exposición de estrés, todos los ratones exhibieron un estado similar de comportamiento (las condiciones iniciales. Figura 2C y 2d). Sin embargo, después de estrés exposición durante tres semanas, la distancia total en cinco minutos significativamente diferían entre los grupos. La distancia total movida por ratones en el grupo modelo fue significativamente menor (F (3, 56) = 4.216, p = 0.003, figura 2f) que la del grupo control. Además, el número de entradas en la zona central también fue significativamente diferente entre los grupos. El número de entradas en la zona central del grupo modelo disminuyó significativamente (F (3, 56) = 2.809, p = 0.013, figura 2e) en comparación con el grupo de control. Tratamiento de fluoxetina prevenir estos cambios en la tendencia de locomoción y mejoró significativamente la distancia total y el número de entradas en la zona central (F (3, 56) = 4.216, p = 0,029; F (3, 56) = 2.809, p = 0.004). También se observó un fenómeno similar en el grupo de tratamiento de Xiaoyaosan (F (3, 56) = 4.216, p = 0,014; F (3, 56) = 2.809, p = 0,029).
Figura 1 : Efectos de Xiaoyaosan sobre los cambios inducidos por la CUMS en estado físico ratones. Estado de la capa de los ratones (a) y (b) se midió peso corporal semanal durante el período de estrés. Los datos se expresaron como la media ± SEM, n = 15 por grupo. ** p < 0.001 versus control; ΔΔ p < 0.001 versus el modelo. Esta figura ha sido modificada de Ding, et al. 18 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Efectos de Xiaoyaosan en comportamientos depresivos inducidos por CUMS. Se llevó a cabo una batería de pruebas de comportamiento, y se midieron los siguientes parámetros: preferencia de sacarosa (a, b), el número de entradas en la zona centro (c, e) y la distancia total movido (actividad locomotriz) (d, f). Los datos se expresaron como la media ± SEM, n = 15 por grupo. * p < 0.05, *p < 0.01 y *p < 0.001 versus control; Δ p < 0.05 ΔΔp < 0.01 y ΔΔΔp < 0.001 versus modelo. Esta figura ha sido modificada de Ding, et al. 18 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El modelo CUMS utilizado en este estudio es un método común para establecer el modelo de diátesis de estrés de depresión24. Más manifestaciones de la CUMS pueden restaurarse por antidepresivos, lo que indicaron que este método de modelo tiene una fuerte validez predictiva25. Por este método, animales reciben estímulos estresantes impredecibles crónica y síntomas principales de la depresión mayor, como menor lugar preferencia acondicionado, anhedonia y comportamientos visuales emoción26. Aquí, en este protocolo, el uso continuo de Xiaoyaosan o fluoxetina puede mejorar los comportamientos depresivos de ratones inducido por CUMS modelo según los resultados obtenidos en el experimento; la fluoxetina es un medicamento de control positivo para probar el efecto de la intervención de Xiaoyaosan.
Puntuación de la evaluación de la capa, a diferencia de los campos prueba, forzó la prueba de natación, o novedad suprimió prueba, la alimentación es una medida que no se asocia con la depresión en seres humanos, pero es el método más común, confiable y validado para el modelo depresivo de ratón27. En el presente estudio, una distrofia progresiva del estado de capa en el grupo modelo fue inducida y no presentó después de dos semanas de estrés pero empeoró en el final del procedimiento CUMS (tres semanas), mientras que el peso corporal no fue significativamente diferente entre los grupos después de una semana de la exposición de estrés. Sin embargo, la diferencia de peso corporal en cada grupo comenzó a emerger después de modelado durante dos semanas, lo que conduce a una disminución posterior al final de tres semanas. Los resultados indican que estos cambios en el estado físico de los ratones inducido por CUMS podrían revertirse por el tratamiento Xiaoyaosan y fluoxetina, lo que sugiere que el Xiaoyaosan podría mejorar los Estados físicos de los ratones deprimidos.
Para validar el modelo de la CUMS y verificar el efecto del compuesto utilizado en el presente Protocolo, una prueba de preferencia de sacarosa y una prueba de campo abierto fueron utilizados para determinar los posibles comportamientos depresivos en ratones inducidos por CUMS. La reducción de la anhedonia en la preferencia de la sacarosa se utilizó para evaluar el estado depresivo en los roedores, mientras que la prueba de campo abierto, como una prueba psicologica animal, comúnmente se utiliza para evaluar la función del aparato locomotor y emocionalidad de roedores28. El resultado mostró que 3 semanas de estrés exposición tenía una influencia obvia en la preferencia de sacarosa de los ratones, y la anhedonia fue invertida por tratamientos de la Xiaoyaosan y la fluoxetina. La prueba de campo abierto se utiliza comúnmente para evaluar función locomotriz y emocionalidad en el laboratorio animales29. En este estudio, se utilizó para analizar comportamientos depresivos. Los resultados de la prueba de campo mostraron que la distancia total movida por los ratones en el grupo modelo fue significativamente menor que la del grupo control. Además, el número de entradas en la zona central por el grupo de modelos de ratones fue significativamente más bajo que el grupo de tratamiento de los ratones, que sugirió que ratones inducido por CUMS muestran comportamientos depresivos. El estudio también mostró que Xiaoyaosan y fluoxetina podrían mejorar los cambios presentados en la prueba de campo abierto.
De acuerdo con los resultados similares en estudios anteriores, este trabajo demostró que corre provoca una disminución en el consumo de sacarosa y actividad locomotora. El uso continuo de Xiaoyaosan era eficaz para la prevención y el tratamiento de la depresión inducida por CUMS en ratones. Muchos estudios han examinado la depresión, una comprensión avanzada de un modelo animal puede ser la clave para aclarar el mecanismo de depresión30. El método CUMS que se describe en este protocolo con eficacia puede mostrar el estado de depresión de los ratones. A diferencia del estrés crónico leve (CMS) o inmovilización crónica estrés (CIS) método31,32, el punto clave de CUMS radica en la selección de factores estresantes impredecibles y la aplicación racional de evaluación de modelo. Para confirmar aún más el método y el resultado que se muestra en el presente Protocolo, trabajo futuro debe incluir la selección de los más estresantes y métodos de evaluación para el método de la CUMS y la detección de los efectos a largo plazo de Xiaoyaosan de 28 a 48 días de corridas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por subvenciones de la Fundación de Ciencias naturales nacionales de China (no. 81630104; no. 81473597) y los fondos de Investigación Fundamental para las universidades centrales (Nº 2018-JYBZZ-XS005). El protocolo y los resultados demostrados en este trabajo origina el artículo Participación de normalizado Glial fibrilar ácida expresión de proteínas en el hipocampo en Antidepressant-Like efectos de Xiaoyaosan en ratones crónicamente destacó por Dr. Ding de Xiu Fang, et al.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chinese Herbs | Tongrentang (Bozhou, AnHui) Decoction Pieces Limited Company | - | The drugs were extracted by the Chinese medicine preparation room of the China-Japan Friendship Hospital, distilled water was used to prepare the suspension of Xiaoyaosan, and the dose was 0.25 g/kg/d. |
| Fluoxetine | PATHEON FRANCE | 5545A | The distilled water was used to prepare the suspension of fluoxetine, and the dose 2.6 mg/kg/d. |
| C57BL/6j mice | Beijing Vital River of the Charles River Company | SCXK 2011-0004 | 60 healthy male C57BL/6J mice aged 12 weeks were purchased from Beijing Vital River of the Charles River Company. |
| Mouse cage | Styling Biotechnology | 34853016 | 318×202×135 mm |
| Distilled Water | - | - | The water was used througout the experiment. |
| Sucrose | Sigma | - | The sucrose was used in the sucrose preference test to prepare 1% sucrose solution. |
| ACS-2EAS Electronic Balance | Beijing Hengzhongheng Electronic Technology Co., Ltd. | - | It was used to weigh the avoirdupois of mice at different stages. |
| Wooden Black Lusterless Box | - | - | (40 cm x 40 cm x 15 cm), divided into 25 equal squares by blue lines. |
| WV-CP470 Camera | Panasonic, Japan | - | A HD digital camera which was used for recording the whole process of the open field test. |
| Etho Vision 3.0 Software | Noldus, Wageningen, Holland | - | A video-tracking system which was used to evaluate the locomotor function and emotionality of mice. |
| SPSS Statistics 21.0 Software | IBM | - | SPSS 21.0 software was used to analyze the data, one-way ANOVA or non-parametric test was used for general data based on normality test and homogeneity test for variance, and LSD method was adopted for the comparisons between groups. |
| Graphpad Prism 6.0 Software | Graphpad Software,Inc.USA | - | Graphpad Prism 6.0 software was used to draw statistical graphs. |
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