Inductie van atherosclerotische Plaques door activering van Mineralocorticoïden receptoren in apolipoproteïne E-deficiënte muizen

Summary

We beschrijven een protocol om atherosclerose in de aorta hoofdmap van ApoE^{- / -} muizen gevoed met een atherogene dieet, door middel van een continu release van aldosteron. Methoden voor het karakteriseren van de samenstelling van de plaque worden ook beschreven.

Abstract

Atherosclerose is als gevolg van een chronische ontstekingsreactie beïnvloeden vasculaire endotheel en wordt bevorderd door een aantal factoren zoals hypertensie, dyslipidemia en diabetes. Tot op heden is er bewijs ter ondersteuning van een rol voor het circuleren van aldosteron als risicofactor voor de ontwikkeling van hart-en vaatziekten. Transgene muismodellen zijn gegenereerd om te bestuderen van cellulaire en moleculaire processen die leiden tot atherosclerose. In dit manuscript beschrijven we een protocol dat profiteert van continue infusie van aldosteron in ApoE^{- / -} muizen en genereert atherosclerotische plaques in de aorta wortel na 4 weken van de behandeling. Wij daarom illustreren een methode voor de kwantificering en karakterisering van atherosclerotische laesies op de aorta hoofdniveau. De toegevoegde waarde van aldosteron infusie wordt vertegenwoordigd door de generatie van atherosclerotische laesies rijk aan lipide en ontstekingscellen na 4 weken van de behandeling. We beschrijven in detail de kleuring procedures om te kwantificeren lipide en macrofaag inhoud binnen de plaque. Wij voeren in dit protocol, met name hart weefsel-insluiting in LGO om te behouden de antigenicity van cardiale weefsel en vergemakkelijken van detecteerbaarheid van antigenen van belang. Analyse van het fenotype van de plaque vormt een geldige benadering te bestuderen van de pathofysiologie van atherosclerose ontwikkeling en te identificeren van nieuwe farmacologische doelstellingen voor de ontwikkeling van anti-atherogene drugs.

Introduction

Atherosclerose is een van de hoofdoorzaken van mortaliteit en morbiditeit wereldwijd¹. Het wordt gekenmerkt door een chronische inflammatoire staat waar bloedvaten zijn geïnfiltreerd door lipiden en leukocyten die bepalend zijn voor de vorming van atherosclerotische plaques. Het merendeel van de acute cardiale evenementen worden geassocieerd met trombotische gebeurtenissen als gevolg van breuk van de plaque. Gevoelig voor scheuren plaques "kwetsbaar" worden gedefinieerd en worden gekenmerkt door verhoogde infiltratie van pro-inflammatoire leukocyten, een necrotische kern en een dunne vezelig cap². In de laatste decennia, hebben klinische en experimentele studies verduidelijkt de complexe pathofysiologie van de ziekte. Verschillende dierlijke modellen worden gebruikt voor het onderzoeken van de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de inductie van atherosclerose³. De muis is momenteel de meest gebruikte soorten te bestuderen van atherosclerose ondanks sommige soortspecifieke verschillen in de pathofysiologie in vergelijking met de mens. In het bijzonder circuleert cholesterol bestaat voornamelijk door high-density lipoproteins (met antiatherogenic eigenschappen) in muismodellen, terwijl mensen circuleert cholesterol wordt voornamelijk vervoerd als low-density lipoproteins (LDL), waarschijnlijk de belangrijkste reden waarom wild-type muizen geen spontane atherosclerose^{4 ontwikkelen}vertegenwoordigen. Bovendien, wild type muizen in het algemeen resistent zijn tegen het absorberen van cholesterol uit de voeding, overwegende dat mens rond 50% van de dieetcholesterol^{4 absorberen}. Deze beperkingen wilt opheffen, zijn verschillende genetisch gemodificeerde Muismodellen gegenereerd. Apolipoproteïne E-deficiente mouse (ApoE^−/−) en LDL receptor-deficiente mouse (LDLr^−/−) worden veel gebruikt. Op een hoog cholesterolgehalte van vetrijke dieet, ApoE^−/− muizen ontwikkelen plaque meer snel in vergelijking met LDLr^−/−muizen, en om deze reden is het gebruik van ApoE^−/− muizen groter dan die van LDLr^−/−muizen^5,6. De beleidsverklaring^−/− muizen ontwikkelen laesies in elk stadium van atherosclerose en vergelijkbaar zijn met die waargenomen bij de mens, hoewel muis plaques geen een unstable fenotype^{7 vertonen}. In het algemeen ApoE^−/− muizen spontaan ontwikkelen atherosclerose en dit proces wordt versneld met een westerse dieet³. De ernst van atherosclerose kan worden geëvalueerd op het niveau van de halsslagader, pulmonale, femorale slagader van de brachiocephalic en de aorta wortel⁶. In het bijzonder vertegenwoordigt de aorta hoofdmap een anatomische site gevoelig voor het ontwikkelen van atherosclerotische laesies in muizen. Om deze reden is het gebruikelijk om te evalueren van de vorming van atherosclerotische plaques in deze regio.

Verschillende studies hebben aangetoond dat aldosteron is betrokken bij de ontwikkeling van atherosclerose^8,9,10. Aldosteron infusie in ApoE^−/− muizen gevoed een atherogene dieet versnelt de ontwikkeling van atherosclerotische laesies aorta wortel ontstoken en lipide-rijke plaque vorming¹⁰inducerende.

In samenvatting beschrijven we een protocol met inbegrip van aldosteron infusie, atherogene dieet voeding, inbedding van hart weefsels, kwantificering en karakterisering van atherosclerotische laesies in ApoE^{- / -} muizen. Deze procedure bevordert een efficiënte vorming van ontstoken, lipide-rijke atherosclerotische plaques en een waardevol model voor de studie van atherogenese vertegenwoordigt.

Protocol

De studie werd goedgekeurd door de Italiaanse nationale instituten van de gezondheidszorg en gebruik commissies, nummer 493/2016-PR. van de vergunning Alle procedures werden uitgevoerd per de richtsnoeren van de Europese Gemeenschap voor het gebruik van proefdieren (Europese richtlijn 2010/63/UE).

Opmerking: Onderhuidse implantatie van osmotische minipomp met voertuig (ethanol in zoutoplossing) of aldosteron (240 µg · kg^-1 · d^-1) in 8-10 week-oude mannelijke muizen tekort voor het ApoE -gen. In algemeen, 8-10 week-oude mannelijke^−/− muizen voor het ApoE Weeg ongeveer 25-26 g.

1. ontbinding van aldosteron

1. Los 5 mg van aldosteron poeder in 1 mL absolute ethanol.
2. Voeg 56.7 µL van aldosteron (opgelost in ethanol) naar 68,3 µL van zoutoplossing om het verkrijgen van een concentratie van 2.27 µg / µL. Vul de hele osmotische minipumps compleet met 125 µL van deze oplossing (maximale capaciteit van elke minipomp is 125 µL).
3. Gebruik van een minipomp debiet van 0.11 µL/h; Daarom 2.64 µL van de oplossing wordt vrijgegeven elke 24 h. geven elk muis rond 6 µg · d^-1 van aldosteron gedurende 28 dagen.

2. osmotische pomp vullen en implantatie

Opmerking: Pompen worden geleverd in twee aparte delen: de hoofdmacht van de pomp en de regulator van de stroom.

1. Vul in en verwerken van de minipumps met behulp van chirurgische handschoenen.
   Opmerking: Huid oliën kunnen interfereren met de prestaties van minipumps. De volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een steriele laminaire flow kap.
2. De buis van de vulling (meegeleverd met de minipumps) hechten aan een spuit van 1 mL en de aldosteron oplossing of het voertuig opstellen.
   Opmerking: Het is belangrijk om te voorkomen dat de lucht in de spuit laten terwijl zuigen oplossingen uit de buis om te voorkomen dat de vorming van luchtbellen in de pomp.
3. Invoegen van de vulling buis door het gat aan de bovenkant van de minipomp totdat het niet verder kan gaan (figuur 1A-1B). Langzaam vullen de pomp met de aldosteron of voertuig. Merk op de donkere schaduw binnen de pomp die aangeeft het vloeistofniveau. Bekijk dit niveau opkomst samen met de pomp vullen.
   1. Stop de pomp vullen wanneer een kraal van de vloeistof uit het lichaam van de pomp stijgt.
4. Zorgvuldig verwijderen van de buis van de vulling en de stroom regulator invoegen in de hoofdtekst van de minipomp (Figuur 1 c). Zorg ervoor dat de regelgever strak tegen het lichaam van de pomp zit. Laat de gevulde osmotische pompen in een bekerglas van steriele zoutoplossing bij 37 ° C gedurende maximaal 24 uur voordat de innesteling in de muis (priming procedure).
5. Het gedrag van chirurgie in een gedesinfecteerde ruimte met 70% ethanol die asepsis bevordert.
6. 1-3 druppels op incisie site van 0,25% bupivacaine toepassen en anesthetize van het dier met 3% Isofluraan. Zet de levering gas en de debietmeter ingesteld op 500-1000 mL/min. plaats het dier in de zaal van de inductie en de bovenkant verzegelen. Zet de vaporizer aan 5% Isofluraan en controleren de muis totdat ligfiets.
   1. Zet het systeem stroom naar de neuskegel. Verwijder het dier uit de kamer en de positie in de neuskegel. In 2-3 minuten begint de muis te ontwaken. Start opnieuw de gasstroom met de debietmeter op 100-200 mL/min en de vaporisator op 3% Isofluraan.
   2. Zorgen voor voldoende diepte van anesthesie voorafgaand aan het uitvoeren van de procedures door te testen pedaal terugtrekking en de ooglidreflex reflexen. Volgen van de ademhaling en de respons op stimulatie tijdens de procedure en vaporizer naar wens aanpassen.
   3. Het hoornvlies te beschermen tegen uitdrogen door een oogheelkundige zalf toe te passen.
7. Bereid het dier door het verwijderen van haren uit de chirurgische site met behulp van een scheermes (Figuur 1 d). De gebruikelijke site voor onderhuidse implantatie van pompen bevindt zich aan de achterkant.
8. De chirurgische site voorbereiden met vlies pad materiaal verzadigd met 70% isopropyl alcohol.
9. Gebruik een schone en toegewijde ruimte (ontsmet met 70% ethanol) en bedekt met een steriele draperen. Plaats het uiteinde van de instrumenten in een glazen kraal sterilisator. Operatie beginnen met gesteriliseerde instrumenten en instrumenten aseptisch behandelen.
10. Heelkundige schaar gebruiken om een 0,8-1 cm incisie ongeveer 2 cm (dicht bij de staart), zoals in cijfers 1E-1F. Steriliteit handhaven door om het even wat buiten de chirurgische toegewijde ruimte met steriele handschoenen of tips van instrumenten niet aan te raken.
11. Zorg voor het snijden van alleen de huid maar niet de onderliggende weefsels. Gebruik één hand te houden van de verlostang om te openen de incisie. Gebruik de andere kant te houden van de trocar te verspreiden van de huid om te maken een zak voor de pomp vanaf de achterkant naar boven naar het schouderblad (op de linker- of rechterkant van de muis).
12. Plaats de pomp in de incisie. Voorzichtig duw de pomp helemaal in de zak (Figuur 1 H). Er moet genoeg huid vrij om te sluiten van de wond met geen spanning of uitrekken van de huid nodig. Zodra de pomp is ingevoegd, suture de incisie met chirurgie draad (polyglactin 910 met hechtdraad grootte 6-0)
    Opmerking: Het hoofd van de regulator moeten worden gericht op de voorzijde van de muis (figuur 1G).
13. Toepassen van actuele 10% Povidon/jodium zalf met een schoon doekje (figuur 1I) en houden van het dier op een opwarming van de aarde podium. Laat muizen niet in zonder toezicht, totdat ze sternale ligcomfort herstellen. De hydratatie status evalueren en beheren van 0,5 mL zoutoplossing 0,9% subcutaan indien nodig. Het dier terug naar haar routine huisvesting.
14. Institutionele richtsnoeren voor de documentatie (bijvoorbeeld een chirurgische formulier invullen met de operatieve en post-operatieve informatie update kooi kaart met procedure en datum) en het verstrekken van pijnstillers (buprenorfine, 0,05 mg/kg) om na chirurgische pijn te verminderen en antibiotica (enrofloxacin 85 mg/kg) om te voorkomen dat na chirurgische infectie.
    1. Blijven van de dagelijkse monitoring en onderzoek op tekenen van pijn. Aandacht dat wond volledig gesloten is en minipomp is gehandhaafd in de subcutane zak. De wond wordt geopend en de muis kan verliezen de minipomp.

3. dissectie van het hart

1. Op het moment van opoffering, anestethize muizen met 80-100 mg/kg Zoletil intramuscularly beheerd. Zoletil induceert diepe anesthesie. Opmerking: Controleer of muizen op een voldoende diepte van anesthesie voorafgaand aan het uitvoeren van de procedures zijn door het testen van de pedaal en de ooglidreflex reflexen; Muizen zullen worden geperfundeerd terwijl diep verdoofd. Open de borstholte, schaar en pincet, via lateraal snijden van de ribben aan het borstbeen, met het borstbeen richting het hoofd wordt ingetrokken.
2. Perfuse muis via het linkerventrikel door zwaartekracht perfusie systeem met 10-15 mL van de ijskoude Dulbecco fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en vervolgens met 40-50 mL 10% van de neutrale gebufferde formaline te lossen van de therapieën. Fixatie wordt aangegeven wanneer de muizen krachtige spiersamentrekkingen exposeren en stijf worden.
   Opmerking: De vaststelling proces vindt plaats in 10-20 min. Het is mogelijk om het gebruik van de vaste organen en weefsels immunofluorescentie of immunohistochemistry analyses uit te voeren. Nog belangrijker is, worden dergelijke vaste weefsels niet gebruikt voor de expressie van genen en westelijke bevlekkende analyses.
3. Het hart van de aorta scheiden door het hart met de pincet en knippen met een schaar of een mes scalpel, loodrecht op de as van de aorta, zo dicht mogelijk bij het hart zonder schade (figuur 2A). Gebruik een scalpel mes te snijden dwars langs een rechte lijn die toetreedt de lagere punten van het rechter en linker atrium (figuur 2B tot).
4. Vul het bovenste gedeelte van het verdeelde hart (via de holte van het hart) met optimale scherpe compound (OCT) (figuur 2D-2E). Zet het weefsel binnen een cryosection plastic mal met de as van de aorta loodrecht geplaatst aan de basis van de rechthoekige schimmel en bedek met OCT (figuur 2F). Moet er geen luchtbel gevangen. Als een zeepbel aanwezig is, probeer te verplaatsen naar de rand.
5. Plaatsen van een metalen plaat op droog ijs en zet dan zorgvuldig de schimmel op (Figuur 2 g). Wanneer de LGO wit wordt, wikkel de schimmel met zilver folie en sla bij –80 ° C.

4. Snij secties van de aorta wortel

1. De cryostaat machine ingesteld op –20 ° C. Voor het snijden, plaatst u de ingesloten weefsel en daar laat het gedurende ongeveer 15 minuten aan te passen aan deze temperatuur. Het specimen houder temperatuur instellen tot-17 ° C (figuur 3A).
2. Plaats de bevroren hartblok binnen de cryostaat machine equilibreer de temperatuur van het blok met die van de cryostaat (figuur 3B) en nemen het diepgevroren blok van het hart van de mal (Figuur 3 c). Knip de overtollige LGO van het diepgevroren blok beter aanpassen van de afmetingen van het blok aan de monsterhouder (figuur 3D).
3. Monteren van het diepgevroren blok van het hart op de monsterhouder met de ventriculaire tegenoverliggende naar buiten gerichte (figuur 3E-3I) en de monsterhouder invoegen in het model kunt u hoofd (figuur 3J). Aanpassen van de oriëntatie van de monsterhouder te snijden van het blok staan zodat de aorta wortel loodrecht op het blad (Figuur 3 K).
4. Knip het blok en segmenten verwijderen totdat de aorta wortel is bereikt (Figuur 3 L-3N). Verzamelen van seriële secties en leg ze op de glazen dia's (figuur 3O). De aorta wortel anatomische profiel onder de Microscoop volgen totdat alle 3 aorta kranen weergegeven (Figuur 3 P-3Q).
5. Verzamelen van secties op 10 µm/sectie voor olie Red O en Picro Sirius rode vlekken, en op 6 µm/sectie voor MAC3 kleuring (figuur 3R). Verzamelen rond 6-8 dia's (voor elke hart) tot een van de drie kleppen verdwijnt of is niet meer intact.

5. Immunohistochemistry

Opmerking: Alle kleuring stappen gemeld in de volgende protocollen zijn uitgevoerd in glas Coplin kleuring potten.

1. Olie rood O vlek voor neutrale vetten
   1. Los van de secties in 70 mL van 37% formaldehyde gedurende 5 minuten wassen goed in leidingwater en vlek uit overtollig water.
   2. 48 mL olie Red O (0,5% in isopropanol) verdund in 32 mL gedestilleerd water te verkrijgen olie Red O 0,3%.
   3. Vlek secties in 70 mL van olie Red O 0,3% voor 10 min. Wash secties in leidingwater voor 10 min.
   4. Vlek voor 1 min in 70 mL van Mayers Haematoxyline. Wassen secties in leidingwater voor 1 min.
   5. Secties in 70 mL van 0,5% Lithiumcarbonaat onderdompelen. Wassen in leidingwater voor 1 min.
   6. Mount secties met een waterige montage medium en vangt beelden met behulp van een digitale camera gemonteerd op een lichte Microscoop.
2. Picro Sirius rode vlek voor collageen
   1. Knip 10 µm bevroren secties en monteren in de bodem van de dia.
   2. Fix secties in 70 mL aceton voor 5 min, droge lucht en spoeling kort in gedestilleerd water.
   3. Plaats secties in 70 mL 0,2% phosphomolybdic zuur voor 5 min. spoelen kort in gedestilleerd water.
   4. Plaats secties in 70 mL 0,1% Picro Sirius oplossing voor 90 min. één keer spoelen met 70 mL 0,01 N HCl. Gooi oplossing.
   5. Plaats in 70 mL 0,01 N HCl voor 2 min. spoelen kort in gedestilleerd water. Droge lucht.
   6. Plaats kort in 70 mL 70% ethanol.
   7. Wanneer volledig droog is, plaats in 70 mL van clearing agent van terpeen oorsprong en bevestig secties met behulp van poly (butyl methacrylaat -co-methyl methacrylaat) op basis van montage medium en vangt beelden met behulp van een digitale camera gemonteerd op een lichte Microscoop.
      Opmerking: Een van de voordelen van de Picro Sirius rode kleuring is dat het mogelijk is te onderscheiden van het Type I (dikke vezels, geel-oranje op dubbele breking) en Type III (dunne vezels, groene dubbele breking) collageen vezels netwerken door gepolariseerde de lichte microscopie van¹¹ .
3. Mac3 vlek voor Macrophage kleuring
   1. Snijd 6 µm bevroren secties en monteren in de bodem van de dia.
   2. Fix secties in 70 mL koude aceton voor 5 min. Immerse in 70 mL PBS gedurende 2 minuten.
   3. Met behulp van een precisiepipet, cover secties met 1% van het natrium dodecyl sulfaat (SDS) oplossing en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) voor het ophalen van het antigeen. Dompel onder in 70 mL PBS voor 5 min.
   4. Met behulp van een precisiepipet, dekken de plakjes met 0,3% waterstofperoxide voor 20 min. Wash in 70 mL PBS 3 keer voor 5 min.
   5. Gebruik van Avidin-Biotine complexen (ABC)-HRP Kit voor de volgende stappen uit.
   6. Met behulp van een precisiepipet, blokkeren secties in normaal konijnenserum bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Niet af te spoelen.
   7. Vlek met MAC3 (1:300) voor 90 min. op RT. Wash in 70 mL PBS 3 keer voor 5 min.
   8. Vlek met secundaire-biotinyleerd anti-Rat IgG (1:200) voor 45 min op RT. spoelen met 70 mL PBS 3 keer voor 5 min.
   9. Dekking van de secties met konijn IgG ABC voor 30 min op RT. spoelen met 30 mL PBS 3 keer voor 5 min.
   10. Dekking van de secties met 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) gedurende 10 minuten spoelen met 70 mL gedestilleerd water voor 10 keer.
   11. Vlek voor 1 min in 70 mL van Mayers Haematoxyline. Wassen secties in leidingwater voor 1 min.
   12. Secties in 70 mL van 0,5% onderdompelen Lithiumcarbonaat. Wassen in leidingwater voor 1 min.
   13. Mount secties met een waterige montage medium en vangt beelden met behulp van een digitale camera gemonteerd op een lichte Microscoop.

6. beeldanalyse van atherosclerotische laesies in de aorta Root secties

Opmerking: Aorta wortel secties gekleurd met olie Red O of MAC3 of een antilichaam van belang kunnen worden geanalyseerd met behulp van de juiste software (aangegeven in de Tabel van de materialen). Totaal aantal pixels kleuring positief voor het onderdeel van belang is genormaliseerd naar de totale oppervlakte van de plaque. Beelden werden verzameld en geanalyseerd door een onderzoeker behandeling-verblind.

1. Kalibratie
   1. Open software en selecteer vervolgens de afbeelding (in jpg) te analyseren.
   2. Selecteer de Home | Maken | Snelle kalibratie.
   3. De kalibratie van de afbeelding instellen door een streep langs de bar van de schaal van de afbeelding.
   4. Sla de setup van kalibratie.
2. Beeldanalyse
   1. Selecteer de opgeslagen instelling kalibratie optiemenu | Ruimtelijke kalibratie optie.
   2. Selecteer kalibratie | Van toepassing.
   3. Selecteer het gereedschap Veelhoek op het menu selecteren en teken de omtrek langs alle atherosclerotische laesies.
   4. Kies Aantal/maat | Typen. Vanuit het Menu toevoegen vlakdiagram en Vlakdiagram procent.
   5. In menu van de Graaf/grootte , wordt selecteert u Manual en een nieuw venster geopend.
   6. Vanuit dit venster klikt u op het gereedschap kleur op afbeelding kiezen en selecteer HSI mode.
   7. Wijs de muiscursor op de positieve pixels van de markering van belang om een bereik van kleuren te maken.
   8. Klik op tellen en de waarde som, waargenomen in de Meting tabelgeeft het percentage aan van het gebied van de markering (eveneens uitgedrukt in µm²) met betrekking tot de totale oppervlakte van atherosclerotische laesies.

Representative Results

In 8-10 weken Apo^{- / -} muizen, minipumps werden geïmplanteerd om te doordringen met voertuig of aldosteron (figuur 1E-1I) en gevoed een atherogene dieet (aangepaste calorieën dieet 42% uit vet) voor 4 weken. Aan het einde van de behandeling, waren muizen euthanized en geperfundeerd met PBS en 10% formaline zoals hierboven beschreven. De aorta wortel was gescheiden van het apicale gedeelte van het hart en is ingebed in de OCT (Figuur 2). Doorsneden van de aorta wortels waren voorbereid op verschillende kleuring met behulp van een machine van de cryostaat (Figuur 3).

Atherosclerotische plaque samenstelling kan worden gekarakteriseerd door de kleuring voor specifieke onderdelen, waarin de fase van de ontwikkeling van plaque. Olie Red O kleuring wordt gebruikt om te bepalen van vetgehalte van atherosclerotische laesies, zoals beschreven in stap 5.1, Picro Sirius rode kleuring wordt gebruikt om te bepalen van collageen inhoud, zoals beschreven in stap 5.2 en Mac3 kleuring wordt gebruikt voor het meten van de macrofaag inhoud beschreven in stap 5.3. Na 4 weken van de behandeling met aldosteron, muizen een stijging in lipide (figuur 4A-4 C) en macrofaag inhoud (Figuur 4 d-4F) in atherosclerotische plaques op de aorta hoofdniveau weergegeven, maar waren geen verschillen waargenomen in collageen inhoud (Figuur 4 g-4I) in vergelijking met muizen die behandeld met het voertuig. Inderdaad, aldosteron versneld atherogenese in dit model inducerende vasculaire ontsteking maar niet fibrose (Figuur 4).

Figuur 1. Voorbereiding en implantatie van osmotische minipomp met voertuig of aldosteron. A-B) stappen te vullen osmotische minipumps met voertuig of aldosteron. C) stappen om te sluiten van het lichaam van de pomp met de toezichthouder van de stroom. D-F) Stappen voor het maken van een incisie voor de inplanting van de pomp op de achterkant van de muis. G-ik) Implantatie van osmotische minipomp en hechten van de snede. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2. Voorbereiden op het hart en de aorta wortel insluiten en segmenteren. A-B) het hart is dwars snijdt langs een rechte lijn die toetreedt de lagere punten van het rechter en linker atrium tot. Het apicaal deel van het hart wordt verwerkt om te kwantificeren van atherosclerotische laesies samenstelling in de aorta root. C) de aorta root vanuit binnen het hart. D-E) Vullen van het hart holte met oktober F) oriëntatie van het ontleed hart in een mal vooraf gevuld met OCT (met het hart holte in de richting van de bodem van schimmel) G) bevriezing van het ontleed hart met LGO in de mal. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3. Afdelen van aorta root gebruikend microtome cryostaat. A) vooraf afkoelen van de cryostaat en instellen van de juiste temperatuur van de machine en chuck. B-D) De solid OCT blok wordt gescheiden van de schimmel en de overtollige LGO rond het hart wordt geëlimineerd met behulp van een mes. E-ik) Het blok van LGO is vastgesteld, met behulp van vloeibare LGO, op de steun. J-K) De steun is geplaatst in de chuck en gericht met de ventriculaire tegenoverliggende naar buiten. L-M) Het gedeelte van het blok totdat het ontleed hart volledig is blootgesteld. N-O) De dikte ingesteld op 10 en/of 6 µm en verzamelen van de segmenten op het glas. P-Q) Controleer de aanwezigheid van alle drie kleppen onder de Microscoop. R) opeenvolgende segmenten worden verzameld, zoals getoond, totdat een of meer kleppen niet meer worden nageleefd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4. Kwantificering van atherosclerotische plaque samenstelling in aldosteron - of voertuig-testgroep ApoE^{- / -}. A-B) vertegenwoordiger rode olie O gekleurd kruissecties van aorta root in 8-10 week-oude ApoE^{- / -} muizen behandeld met voertuig (A) of aldosteron (B) en gevoed een atherogene dieet voor 4 weken. C) kwantificering van vetgehalte als percentage van de positieve kleuring/totaal plaque. D-E) Vertegenwoordiger Mac3 gekleurd kruissecties van aorta root. F) kwantificering van macrofaag inhoud als percentage van de positieve kleuring/totaal plaque. G-H) Vertegenwoordiger Picro Sirius rood gekleurd kruissecties van aorta root. ik) kwantificering van collageen inhoud als een percentage van positieve kleuring/totaal plaque. Waarden worden uitgedrukt als bedoel ± standaardafwijking betekenen (SEM; n = 6 voor elke groep). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Atherosclerose is een chronische inflammatoire aandoening die is gekoppeld aan grote en middelgrote schepen met interacties tussen meerdere celtypen, zoals macrofagen, T-lymfocyten, endotheliale cellen en vlotte spier cellen¹. Ondanks de beperkingen van lymfkliertest atherogene modellen is een groot lichaam van bewijsmateriaal op de atherosclerotische proces beschikbaar. Deze modellen hebben het voordeel van snel genereren van experimentele cohorten van een bepaalde leeftijd en geslacht. Muizen ook weergeven een gedefinieerd en homogene genetische achtergrond.

De ontwikkeling van atherosclerotische plaques, waargenomen in muismodellen vatbaar voor atherosclerose, gedeeltelijk is vergelijkbaar met die bij menselijke proefpersonen, met uitzondering van unstable plaques vorming⁴waargenomen. Plaque breuk en latere trombose, de belangrijkste oorzaak van myocardinfarct bij de mens, wordt niet waargenomen in lymfkliertest atherogene modellen. In onze recente artikels, we toonden dat infusie van aldosteron is in staat om te bewegen, na 4 weken, een fenotype unstable plaque in ApoE^{- / -}muizen gevoed een HFD¹⁰. Deze behandeling is in feite kunnen verhogen van plaque gebied, vetgehalte en inflammatoire gebied in de aorta hoofddirectory, met geen significant verschil in collageen inhoud in vergelijking met onbehandelde muizen¹⁰. Van de nota tonen deze muizen toegenomen ontwikkeling van hypertensie-onafhankelijke atherosclerose, gezien het feit dat de bloeddruk niet aanzienlijk is gewijzigd door aldosteron behandeling¹⁰.

In het huidige manuscript illustreren we in detail de technische procedure voor het insluiten van het hartweefsel in LGO, alsmede de opeenvolgende stappen, dat wil zeggen, aorta wortel segmenteren en plaque analyse. Vergeleken met paraffine, kunt OCT sectie voorbereiding met een hoog aantal diktes (1-100 µm) met een cryostaat microtoom en verwerking van de minimale weefsel. Beperkingen kunnen omvatten de kwaliteit van bevroren weefsel, dat is mogelijk beïnvloed door de vorming van ijskristallen subcellular details wijzigen en genereren artefacten aantoonbaar door immunohistological kleuring. Inderdaad, cryopreservatie wordt gedacht aan het antigeen en antigenicity beter behouden. In feite, behouden bevroren weefsels de structuur van antigenen. Voorts staat bevroren weefsel verwerking voor immunohistochemistry het gebruik van formaline, oftewel een giftige en kankerverwekkende stof te vermijden.

De aorta wortel is een relatief eenvoudig te identificeren voor histologisch verwerking site. Deze anatomische site is een gouden standaard om te studeren van atherosclerotische laesies ontwikkeling in muizen vatbaar voor atherosclerose. Gegevens die zijn verkregen door de analyse van deze specifieke regio kunnen muizen die behoren tot de zelfde groep of tot verschillende experimentele groepen met elkaar vergeleken. In feite, tijdens het segmenteren van de aorta wortel, is het eenvoudig te herkennen van een bepaalde regio, gekenmerkt door de aanwezigheid van alle drie kleppen. Met het oog op een dergelijke een specifieke regio, is het strikt aanbevolen om bijzondere aandacht besteden aan verschillende kritische stappen tijdens insluiten en segmenteren. Het is belangrijk te vullen van de holte van het bovenste gedeelte van het verdeelde hart met LGO om te voorkomen dat de vorming van luchtbellen in het weefsel dat de integriteit van de secties in gevaar kan brengen. Bovendien, om ervoor te zorgen dat de scherpe hoek precies loodrecht op de oplopende aorta tijdens afdelen, er moet goed oriënteren de bovenste verdeelde hart loodrecht op het oppervlak van de bodem van de mal van het weefsel. Met het oog op een intact segmenten, moet de temperatuur van de cryostaat precies bij-20 ° C. In feite, gevaar een lagere temperatuur de kwaliteit van secties (dat wil zeggen, het mes zou kunnen afbrokkelen de secties, waardoor ze onbruikbaar).

Van de nota, wanneer de drie kleppen worden weergegeven, is het raadzaam te snijden het weefsel met verschillende diktes, afhankelijk van het type van de analyse die zal worden uitgevoerd. In feite, sommige dia's zal worden gebruikt voor de bepaling van de progressie van de plaque, terwijl de overige dia's kunnen worden gebruikt voor verschillende technieken (dwz., Picro Sirius, Mac3, enz.).

Atherosclerotische laesies in muizen behandeld met aldosteron verschijnen rijk aan lipide en macrofagen gekenmerkt door het gebruik van olie Red O (voor het lipide kleuring), Mac3 (voor macrophage kleuring), Sirius rood (voor de kleuring van collageen) of andere specifieke antilichamen tegen proteïnen van belang. Het is belangrijk om te benadrukken dat het insluiten van OCT, in tegenstelling tot paraffine insluiten, vermijdt het gebruik van organische oplosmiddelen die verwijderen van het vetgehalte van de laesies. Daarom, lipide kleuring met olie Red O is haalbaar in OCT-ingebedde secties en vetgehalte van atherosclerotische plaques precies kan worden gekwantificeerd.

In het huidige manuscript toonden we dat aldosteron infusie een waardevolle methode is om atherosclerose in ApoE^{- / -} muizen te bevorderen. In fact, aldosteron infusie in ApoE^{- / -} muizen vermag: 1) vergroten van de activering van endotheliale cellen, zoals blijkt uit de verhoogde expressie van moleculen die betrokken zijn bij de hechting en de migratie van monocyten in de vroege stadia van atherosclerotische plaque vorming^12,13; en 2) verhogen lipide en pro-inflammatoire macrofagen inhoud op aorta wortel niveau^10,13. Deze effecten zijn niet te wijten aan de hemodynamische effecten van aldosteron¹⁰.  Kortom, vertegenwoordigt het voorgestelde protocol een geldige methode voor het genereren en karakteriseren van atherosclerose in muizen; Dit kan helpen monitor vroege stadia van de ziekte en de resultaten van therapeutische interventie en de wederopbouw in atherosclerose.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjusted calories diet (42 % from fat)	Envigo	TD.88137	atherogenic diet
Osmotic minipump with filling tube	Alzet	model 1004	for continous realase
Aldosterone	SIGMA	A9477	hormone
Ethanol	SIGMA	34852-M	solvent
Alchol Preps saturated with 70 % Isopropyl Alcohol	Kendal Webcol	6818	Disinfectant
Surgery wire (Vicryl 6.0)	Demas	500004	surgery
10% Povidone/iodine ointment	Aplicare-Meriden	52380-0026-1	Antiseptic
Formalin 10%	SIGMA	HT5012	to fix vascolature
Cryomold	Bio-Optica	07-MP1515	for embedding
O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583	for embedding
Cryostat	Leica	CM1900	instrument for sectioning
Dulbecco's Phosphat Buffered Saline	Aurogene	AU-L0615-500	buffer solution
Adhesion Slides Polysine	VWR	631-0107	microscope glasses
Cover Glasses	Bio-Optica	72015	cover glasses
Formaldehyde 37%	SIGMA	252549	solvent
Oil Red O solution (0.5 % in isopropanol)	SIGMA	O1391	staining solution
Mayer’s Hematoxylin	SIGMA	MHS32	staining solution
Lithium Carbonate	SIGMA	62470	washing buffer
Acqueous Mounting Medium	Thermo Scientific	TA-125-AM	mounting solution
Acetone	SIGMA	179124	solvent
Phosphomolybdic acid solution	SIGMA	HT153	for hystology
Direct Red 80 (Picrosirius Red)	SIGMA	365548	staining solution
Bio Clear (clearing agent of terpene origin)	Bio-Optica	06-1782D	product for the preparation of histological samples
Eukitt Quick Hardening mounting medium (Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate)	SIGMA	3989	mounting solution
Sodium Dodecyl Sulfate	Fluka	71725	powder
Hydrogen Peroxide solution (30 %)	SIGMA	H1009	solution
Vectorstain ABC KIT including: anti-rabbit IgG ABC, normal rabbit serum, Secondary-biotinylated Anti-Rat IgG ,	Vector Laboratories	PK-6100	staining solution
3-amino-9-ethylcarbazole	Vector Laboratories	SK-4200	staining solution
Mac3 antibody	BD Biosciences	553322	antibody
ImagePro Premier 9	Media Cybernetics	050910000-2534	software to analyze images