Summary
Wir beschreiben ein Protokoll zur Atherosklerose in die Aortenwurzel von ApoE- / - Mäusen gefüttert mit einem atherogenen Diät durch eine kontinuierliche Freisetzung von Aldosteron zu induzieren. Methoden zur Charakterisierung von Plaque Zusammensetzung werden ebenfalls beschrieben.
Abstract
Atherosklerose ist aufgrund einer chronischen Entzündungsreaktion beeinflussen Gefäßendothels und wird durch verschiedene Faktoren wie Bluthochdruck, Fettstoffwechselstörungen und Diabetes gefördert. Bisher gibt es Beweise für eine Rolle für zirkulierenden Aldosteron als Risikofaktor für die Entwicklung von Herz-Kreislauf-Krankheit zu unterstützen. Transgenen Mausmodellen wurden erstellt, um die zellulären und molekularen Prozesse, die zu Arteriosklerose führen zu studieren. In diesem Manuskript beschreiben wir eine Protokoll, die nutzt die Vorteile der kontinuierlichen Infusion von Aldosteron bei ApoE- / - Mäusen und erzeugt arteriosklerotische Plaques in der Aortenwurzel nach 4 Wochen der Behandlung. Wir zeigen daher eine Methode zur Quantifizierung und Charakterisierung von atherosklerotischen Läsionen auf der Ebene der Aortenwurzel. Der Mehrwert der Aldosteron-Infusion wird durch die Generation der reich an Lipiden und Entzündungszellen atherosklerotische Läsionen nach 4-wöchiger Behandlung dargestellt. Wir beschreiben ausführlich die befleckenden Verfahren zur Quantifizierung der Lipid- und Makrophagen Inhalt innerhalb der Plakette. Insbesondere in diesem Protokoll führen wir Herzen im OAT Nachweisbarkeit von Antigenen von Interesse zu bewahren die Antigenität von Herzgewebe Gewebe einbetten. Analyse der Plaque-Phänotyp ist einen gültigen Ansatz, die Pathophysiologie der Atherosklerose-Entwicklung zu studieren und um neue pharmakologische Targets für die Entwicklung von Anti-atherogenen Drogen zu identifizieren.
Introduction
Arteriosklerose ist eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität weltweit1. Es zeichnet sich durch eine chronische entzündliche Zustand, wo Blutgefäße infiltriert werden durch Lipide und Leukozyten, die die Bildung von atherosklerotischen Plaques zu bestimmen. Die Mehrheit der akuten kardialen Ereignissen sind verbunden mit thrombotischen Ereignissen durch Plaque-Ruptur. Plaques anfällig für Bruch "anfällig" definiert werden und zeichnen sich durch erhöhte Infiltration von Pro-inflammatorischen Leukozyten, einem nekrotischen Kern und eine dünne fibröse Kappe2. In den letzten Jahrzehnten haben klinische und experimentelle Studien der komplexen Pathophysiologie der Erkrankung geklärt. Verschiedenen Tiermodellen werden verwendet, um die molekularen Mechanismen der Induktion von Atherosklerose3zu untersuchen. Die Maus ist derzeit die am häufigsten verwendeten Arten, Atherosklerose trotz einiger artspezifische Unterschiede in der Pathophysiologie im Vergleich zu Menschen zu studieren. Insbesondere zirkulierenden Cholesterin von High-Density-Lipoproteine (mit antiatherogenic Eigenschaften) in Mausmodellen besteht hauptsächlich während beim Menschen zirkulierenden Cholesterin vor allem als Low-Density-Lipoproteine (LDL) transportiert wird wahrscheinlich Vertretung der Hauptgrund, warum Wildtyp Mäusen nicht spontan Atherosklerose4entwickeln. Wildtyp-Mäusen sind darüber hinaus in der Regel resistent gegen die Aufnahme von Cholesterin aus der Nahrung, während Menschen rund 50 % des diätetischen Cholesterins4aufnehmen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden mehrere gentechnisch veränderte Mausmodelle generiert. Apolipoprotein E-defizienten Maus (ApoE−/−) und LDL-Rezeptor-defizienten Maus (LDLr−/−) sind weit verbreitet. Eine fettreiche cholesterinreichen Diät ApoE−/− Mäuse entwickeln Plaque mehr schnell im Vergleich zu LDLr−/−Mäuse, und aus diesem Grund ist die Verwendung von ApoE−/− Mäuse weiter verbreitet als die LDLr−/−Mäuse5,6. Die ApoE−/− Mäuse Läsionen in jedem Stadium der Arteriosklerose zu entwickeln und sind vergleichbar mit denen bei Menschen beobachtet, obwohl Maus Plaketten keine instabile Phänotyp7zeigen. In der Regel ApoE−/− Mäuse entwickeln spontan Atherosklerose und dieser Prozess wird beschleunigt, mit einem westlichen Diät3. Die Schwere der Atherosklerose kann auf der Ebene der Carotis, pulmonale, Femur- und Brachiocephalic Arterie und die Aortenwurzel6ausgewertet werden. Insbesondere stellt die Aortenwurzel einen anatomischen Ort anfällig für atherosklerotische Läsionen bei Mäusen zu entwickeln. Aus diesem Grund ist es üblich, die Bildung von atherosklerotischen Plaques in dieser Region zu bewerten.
Mehrere Studien haben gezeigt, dass Aldosteron in der Entwicklung von Atherosklerose8,9,10beteiligt ist. Aldosteron-Infusion bei ApoE−/− Mäusen eine atherogenen Diät gefüttert beschleunigt die Entwicklung von atherosklerotischen Läsionen Aortenwurzel induzierende entzündet und lipidreichen Plaque-Bildung-10.
Zusammenfassend lässt sich sagen beschreiben wir ein Protokoll einschließlich Aldosteron Infusion, atherogenen Ernährung Fütterung, Einbettung von Herzen Gewebe, Quantifizierung und Charakterisierung von atherosklerotischen Läsionen in ApoE- / - Mäusen. Dieses Verfahren fördert eine effiziente Bildung von entzündeten, lipidreichen arteriosklerotische Plaques und stellt ein wertvolles Modell für die Untersuchung der Atherogenese.
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Protocol
Die Studie wurde vom italienischen National Institute of Health Care und Nutzung Ausschüsse, Autorisierung Nr. 493/2016-PR. Alle Verfahren wurden gemäß den Richtlinien der Europäischen Gemeinschaft für den Einsatz von Versuchstieren durchgeführt (EU-Richtlinie 2010/63/UE).
Hinweis: Subkutane Implantation des osmotischen Minipump mit Fahrzeug (Äthanol in Kochsalzlösung) oder Aldosteron (240 µg · kg-1 · d-1) in 8-10 Woche-alten männlichen Mäusen unzulänglich für das ApoE -gen. Im Allgemeinen, 8-10 Wochen-alte männliche ApoE−/− Mäuse wiegen ca. 25-26 g.
(1) Auflösung Aldosteron
- 5 mg Aldosteron Pulver in 1 mL absolutes Ethanol auflösen.
- 68.3 µL Kochsalzlösung 56,7 µL Aldosteron (gelöst in Ethanol) hinzufügen, um eine Konzentration von 2,27 µg zu erhalten / µL. füllen die gesamte osmotische Minipumps komplett mit 125 µL dieser Lösung (maximale Kapazität jeder Minipump ist 125 µL).
- Verwenden Sie einen Minipump Durchfluss von 0,11 µL/h; Daher 2.64 µL der Lösung veröffentlicht alle 24 Std. geben jeder Maus etwa 6 µg · d-1 von Aldosteron für 28 Tage.
(2) osmotischen Pumpe Befüllen und Implantation
Hinweis: Pumpen werden in zwei getrennten Teilen geliefert: der Hauptteil der Pumpe und der Durchflussregler.
- Füllen und die OP-Handschuhe mit Minipumps zu behandeln.
Hinweis: Hautöle können die Leistung des Minipumps stören. Die folgenden Schritte sollten in einem sterilen Laminar-Flow-Abzug durchgeführt werden. - Legen Sie die Füllung Schlauch (im Lieferumfang der Minipumps) auf eine 1 mL Spritze und erarbeiten Sie die Aldosteron-Lösung oder Fahrzeug.
Hinweis: Es ist wichtig zu vermeiden, dass Luft in die Spritze beim Absaugen von Lösungen aus der Tube, die Bildung von Luftblasen in der Pumpe zu verhindern. - Legen Sie die Füllung Schlauch durch das Loch am oberen Rand der Minipump, bis es nicht weiter gehen kann (Abbildung 1A-1 b). Langsam füllen der Pumpe mit dem Aldosteron oder Fahrzeug. Beachten Sie den dunklen Schatten im Inneren der Pumpe unter Angabe des Flüssigkeitsspiegels. Sehen Sie sich diese Ebene steigen zusammen mit der Zapfsäule.
- Befüllpumpe steigt eine Perle von Flüssigkeit aus dem Pumpenkörper zu stoppen.
- Sorgfältig entfernen Sie den Füllung-Schlauch und stecken Sie den Durchflussregler in den Körper des Minipump (Abbildung 1). Stellen Sie sicher, dass der Regler fest gegen den Pumpenkörper sitzt. Verlassen Sie die gefüllten osmotischen Pumpen in ein Becherglas mit steriler Kochsalzlösung bei 37 ° C für bis zu 24 h vor der Implantation in der Maus (Priming-Verfahren).
- Führen Sie Operation in eine desinfizierte Bereich mit 70 % Ethanol, die Asepsis fördert.
- 1-3 Tropfen am Schnitt Standort von Bupivacain 0,25 % und Betäuben Sie das Tier mit 3 % Isofluran zu. Schalten Sie das Gas Versorgung und Durchflussmessers auf 500-1000 mL/min Platz das Tier in der Induktion Kammer und Dichtung oben. Schalten Sie den Verdampfer, 5 % Isofluran und überwachen Sie die Maus bis Liegerad.
- Schalten Sie das System um das Nosecone fließen. Entfernen Sie das Tier aus der Kammer und Position in das Nosecone. In ca. 2-3 Minuten beginnt die Maus zu wecken. Starten Sie neu Gasstrom mit Durchflussmesser mit 100-200 mL/min und der Verdampfer bei 3 % Isofluran.
- Sorgen Sie für ausreichende Tiefe der Narkose vor der Durchführung von Verfahren durch das Pedal Rückzug und palpebrale Reflexe testen. Atmung und Reaktion auf die Stimulation während des Verfahrens zu überwachen und Verdampfer nach Bedarf anpassen.
- Zum Schutz der Hornhaut vor dem Austrocknen durch die Anwendung einer ophthalmologischen Salbe.
- Bereiten Sie das Tier durch Entfernen von Haaren aus der Operationsstelle mit einem Rasiermesser (Abbildung 1). Die üblichen Website für subkutane Implantation von Pumpen ist auf der Rückseite.
- Vorbereiten der Operationsstelle mit Vlies Polstermaterial mit 70 % Isopropylalkohol gesättigt.
- Verwenden Sie ein sauberes und engagierten Leerzeichen (mit 70 % igem Ethanol desinfiziert) und mit einem sterilen Tuch abgedeckt. Setzen Sie die Spitze der Instrumente in einem Glas Bead Sterilisator. Chirurgie mit sterilisierte Instrumente beginnen und Instrumente aseptisch zu behandeln.
- Verwenden, chirurgische Scheren um 0,8-1 cm Schnitt (ca. 2 cm in der Nähe der Rute), wie in Figuren 1E 1F. Pflegen Sie Sterilität durch etwas außerhalb der chirurgischen Raum gewidmet mit sterilen Handschuhen oder Spitzen der Instrumente nicht zu berühren.
- Achten Sie darauf, um nur die Haut, aber nicht das darunter liegende Gewebe zu schneiden. Verwenden Sie einerseits, um Zange, öffnen Sie den Schnitt zu halten. Verwenden Sie hingegen um den Trokar an die Haut zu verteilen, um eine Tasche für die Pumpe von der Rückseite nach oben auf das Schulterblatt (auf der rechten oder linken Seite der Maus) erstellen zu halten.
- Legen Sie die Pumpe in den Schnitt. Schieben Sie die Pumpe komplett in die Tasche (Abbildung 1 H). Es sollte genug Haut frei, schließen Sie die Wunde ohne Spannung oder Dehnung der Haut benötigt. Sobald die Pumpe eingefügt worden ist, Naht des Schnittes mit Chirurgie Draht (Polyglactin 910 mit Naht Größe 6-0)
Hinweis: Der Kopf des Reglers muss auf der Vorderseite der Maus (Abbildung 1) ausgerichtet sein. - Aktuell 10 % Povidon/Jod Salbe mit einem sauberen Wattestäbchen (Abbildung 1I) und halten Sie das Tier auf einer Erwärmung Bühne. Verlassen Sie Mäuse nicht in unbeaufsichtigten, bis sie sternalen liegen erholen. Werten Sie die Flüssigkeitszufuhr Status aus und verwalten Sie 0,5 mL 0,9 % Kochsalzlösung subkutan zu, wenn nötig. Das Tier mit seiner Routine Gehäuse zurück.
- Befolgen Sie die institutionellen Richtlinien für Dokumentation (z. B. eine chirurgische Form füllen Sie mit operativen und postoperativen Informationen, Update-Käfig-Karte mit Verfahren und Datum) und Analgetika (Buprenorphin, 0,05 mg/kg), um postoperative Schmerzen zu lindern und Antibiotika (Enrofloxacin 85 mg/kg), postoperative Infektion zu vermeiden.
- Weiterhin täglich überwachen und untersuchen Sie auf Anzeichen von Schmerzen. Achten Sie darauf, die Wunde ist komplett geschlossen und Minipump bleibt in der subkutanen Tasche. Die Wunde kann geöffnet werden und die Maus kann die Minipump verlieren.
3. die Dissektion des Herzens
- Zum Zeitpunkt des Opfers, Anestethize Mäuse mit 80-100 mg/kg Zoletil intramuskulär verabreicht. Zoletil induziert Tiefe Narkose. Hinweis: sicherstellen Sie, dass Mäuse auf eine ausreichende Tiefe der Narkose vor der Durchführung von Verfahren durch das Testen der Pedal und palpebrale Reflexe sind; Mäuse werden durchblutet werden, während tief narkotisiert. Öffnen Sie die Brusthöhle, mit Schere und Pinzette, durch Ablängen der Rippen seitlich des Brustbeins, mit dem Brustbein in Richtung zum Kopf zurückgezogen wird.
- Durchspülen Sie die Maus über die linke Herzkammer durch Schwerkraft Perfusion System mit 10-15 mL eiskaltes Dulbecco Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und dann mit 40-50 mL 10 % neutral gepuffertem Formalin, das Gefäßsystem zu beheben. Fixierung ist indiziert, wenn die Mäuse kräftige Muskelkontraktionen zeigen und steif.
Hinweis: Die Befestigung erfolgt in 10-20 min. Es ist möglich, die feste Organe und Gewebe zu verwenden, um Immunfluoreszenz oder Immunhistochemie Analysen durchzuführen. Wichtig ist, können solchen festen Geweben für die Genexpression und western Blot Analysen verwendet werden. - Trennen Sie das Herz aus der Aorta durch das Herz mit der Zange halten und Schneiden mit Schere oder einem Skalpellklinge senkrecht zur Achse der Aorta, so nah wie möglich an das Herz, ohne Schaden anzurichten (Abbildung 2A). Verwenden Sie eine Skalpellklinge schneiden quer entlang einer geraden Linie, die die unteren Punkte von den rechten und linken Vorhof (Abb. 2 b) verbindet.
- Füllen Sie den oberen Teil des geschnittenen Herzen (durch die Kavität des Herzens) mit optimale Verbindung (OCT) (Abb. 2D-2E). Legen Sie das Gewebe innerhalb einer Cryosection Kunststoff-Formenbau mit der Achse der Aorta platziert senkrecht auf der Basis der rechteckigen Form und Deckel mit OCT (Abb. 2F). Es darf keine Luftblase gefangen. Wenn jede Blase vorhanden ist, versuchen Sie es an den Rand zu verdrängen.
- Legen Sie eine Metallplatte auf Trockeneis und setzen Sie dann die Form vorsichtig auf (Abbildung 2). Wenn das Office-Anpassungstool weiß wird, wickeln Sie den Schimmel mit Silberfolie und dann speichern bei –80 ° C.
4. Schneiden Abschnitte von der Aortenwurzel
- Festlegen der Kryostat-Maschine bis – 20 ° C. Legen Sie vor dem Schneiden das eingebettete Gewebe und lassen Sie ihn dort für ca. 15 min. auf dieser Temperatur einstellen. Stellen Sie die Probe Halter Temperatur bis-17 ° C (Abb. 3A).
- Legen Sie die gefrorenen Herzblock innerhalb der Kryostat-Maschine zu equilibrate die Temperatur des Blocks der Kryostat (Abb. 3 b) und nehmen Sie die gefrorenen Herzblock aus der Form (Abbildung 3). Schneiden Sie das überschüssige OAT aus dem gefrorenen Block Block Abmessungen, Probenhalter (Abbildung 3D) besser anzupassen.
- Montieren Sie die gefrorenen Herzblock auf Probenhalter mit der linksventrikulären nach außen orientierten (Abbildung 3E-3I) und legen Sie die Probenhalter in der Probe Kopf (Abbildung 3J) orientieren. Stellen Sie die Ausrichtung der Probenhalter Schneiden des Blocks zu ermöglichen, damit die Aortenwurzel senkrecht zur Klinge (Abbildung 3 K) machen.
- Schneiden Sie den Block und Scheiben zu verwerfen, bis die Aortenwurzel erreicht ist (Abbildung 3 L-3N). Sammeln Sie Serienschnitte zu und legen Sie sie auf den Objektträger (Abbildung 3O). Die Aortenwurzel anatomischen Profil unter dem Mikroskop zu überwachen, bis alle 3 Aortenklappen angezeigt werden (Abbildung 3 P-3Q).
- Sammeln Sie Abschnitte bei 10 µm/Fachgruppe Öl Rot O Picro Sirius rote Färbung, und bei 6 µm/Fachgruppe MAC3 Färbung (Abbildung 3R). Sammeln um 6-8 Folien (für jedes Herz) bis eines der drei Ventile verschwindet oder nicht mehr intakt ist.
5. Immunohistochemistry
Hinweis: Alle Färbung Schritte in den folgenden Protokollen gemeldet sind im Glas Coplin färbeküvetten durchgeführt.
-
Rote O Ölfleck für neutrale Fette
- Beheben Sie Abschnitte in 70 mL Formaldehyd 37 % für 5 min. Waschen auch in Leitungswasser zu und tupfen Sie überschüssiges Wasser.
- Verdünnen Sie 48 mL Öl Rot O (0,5 % Isopropanol) in 32 mL destilliertem Wasser Öl Rot O erhalten 0,3 %.
- Färben Sie Abschnitte in 70 mL Öl rot o 0,3 % für 10 min. Waschen Abschnitte in Leitungswasser für 10 Minuten.
- Fleck für 1 min in 70 mL von Mayers Hämatoxylin. Waschen Sie Abschnitte im Leitungswasser für 1 min.
- Tauchen Sie Abschnitte in 70 mL 0,5 % Lithiumcarbonat. In Leitungswasser für 1 min waschen.
- Montieren Sie Abschnitte mit einer wässrigen Montage Medium und Capture Bilder mit einer digitalen Kamera montiert auf einem Lichtmikroskop.
-
Picro Sirius rot färben für Kollagen
- 10 µm eingefroren Abschnitte schneiden und montieren in der Unterseite der Folie.
- Abschnitte in 70 mL Aceton für 5 min, Lufttrocknen und spülen Sie kurz in destilliertem Wasser zu beheben.
- Platzieren Sie Abschnitte in 70 mL 0,2 % Phosphomolybdic Säure für 5 min kurz in destilliertem Wasser spülen.
- Legen Sie Abschnitte in 70 mL 0,1 % Picro Sirius Lösung für 90 min. Spülen einmal mit 70 mL 0,01 N HCl. verwerfen Lösung.
- Ort in 70 mL 0,01 N HCl für 2 min. Spülen kurz in destilliertem Wasser. An der Luft trocknen.
- Kurz in 70 mL 70 % igem Ethanol statt.
- Wenn es vollständig getrocknet, in 70 mL clearing Agent Terpene Ursprungs aufgelegt und mit Poly (Butyl Methacrylat -co-methylmethacrylat) basierte Montage Medium und Capture Bilder mit einer digitalen Kamera montiert auf einem Lichtmikroskop.
Hinweis: Die Vorteile der Picro Sirius rote Färbung gehört, dass es möglich ist, den Typ zu unterscheiden I (Dicke Fasern, Gelb-Orange Doppelbrechung) und Typ III (dünne Fasern, grüner Doppelbrechung) Kollagen Glasfasernetze durch polarisierte Lichtmikroskopie11 .
-
Mac3 Fleck für Makrophagen Färbung
- 6 µm eingefroren Abschnitte schneiden und montieren in der Unterseite der Folie.
- Abschnitte in 70 mL kaltem Aceton für 5 min. Tauchen in 70 mL PBS für 2 min zu beheben.
- Mit einer Pipette, Deckprofile mit 1 % des Sodium Dodecyl sulfat-Lösung (SDS) und inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur (RT) für Antigen-Retrieval. Tauchen Sie in 70 mL PBS für 5 Minuten.
- Mit einer Pipette, die Scheiben mit 0,3 % Wasserstoffperoxid für 20 min. Waschen in 70 mL PBS 3 Mal für 5 min abdecken.
- Verwenden Sie Avidin-Biotin-komplexe (ABC)-HRP-Kit für die folgenden Schritte.
- Mit einer Pipette, blockieren Sie Abschnitte im normalen Kaninchen-Serum bei Raumtemperatur für 20 min. Nicht abspülen.
- Mit MAC3 verfärben (1: 300) für 90 min. bei RT. Wash in 70 mL PBS 3 Mal für 5 Minuten.
- Färben Sie mit weiterführenden biotinylierte Anti-Ratte IgG (1: 200) für 45 min bei RT. Spülen mit 70 mL PBS 3 Mal für 5 Minuten.
- Sollte in den Kapiteln mit Kaninchen IgG ABC für 30 min bei RT. Spülen mit 30 mL PBS 3 Mal für 5 Minuten.
- Decken Sie die Abschnitte mit 3-amino-9-Ethylcarbazole (AEC) für 10 min. Spülen mit 70 mL destilliertes Wasser für 10-mal.
- Fleck für 1 min in 70 mL von Mayers Hämatoxylin. Waschen Sie Abschnitte im Leitungswasser für 1 min.
- Tauchen Sie Abschnitte in 70 mL 0,5 % Lithiumcarbonat. In Leitungswasser für 1 min waschen.
- Montieren Sie Abschnitte mit einer wässrigen Montage Medium und Capture Bilder mit einer digitalen Kamera montiert auf einem Lichtmikroskop.
(6) Bildanalyse von atherosklerotischen Läsionen in Aortenwurzel Abschnitte
Hinweis: Aortenwurzel Abschnitte gebeizt mit Öl Rot O oder MAC3 oder eines Antikörpers von Interesse können mittels geeigneter Software (Angabe in Tabelle of Materials) analysiert werden. Total Pixel Färbung positiv für die Komponente von Interesse ist auf die Gesamtfläche der Plaque normalisiert. Bilder wurden gesammelt und durch eine Behandlung geblendet Ermittler analysiert.
-
Kalibrierung
- Öffnen Sie Software und wählen Sie dann das Bild (Jpg) analysiert werden.
- Wählen Sie die Home | Erstellen | Schnelle Kalibrierung.
- Richten Sie die Kalibrierung des Bildes durch Ziehen einer Linie entlang der Maßstab des Bildes.
- Speichern Sie das Setup der Kalibrierung.
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Bildanalyse
- Wählen Sie die gespeicherte Setup Kalibrierung aus Menü " Optionen " | Räumlichen Kalibrierung Option.
- Wählen Sie die Kalibrierung | Gelten.
- Wählen Sie das Polygon-Werkzeug Wählen Sie im Menü auf und ziehen Sie den Rand entlang aller atherosklerotischen Läsionen.
- Wählen Sie Die Anzahl/Größe | Typen. Fügen Sie über das Menü und Prozent-Bereich hinzu .
- Anzahl/Größe werden ausgewählte Handbuch und ein neues Fenster öffnen Sie im Menü.
- In diesem Fenster klicken Sie auf die Farbauswahl auf Bild und wählen Sie HSI -Modus.
- Punkt der Maus-Cursor auf die positive Pixel des Markers von Interesse für eine Palette von Farben zu erstellen.
- Klicken Sie auf die Anzahl und den Wert Summe, beobachtet in der Messtisch, gibt den Prozentsatz des Bereichs des Markers (auch ausgedrückt in µm2) in Bezug auf die Gesamtfläche von atherosklerotischen Läsionen.
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Representative Results
In 8-10 Wochen Apo- / - Mäuse wurden Minipumps zur Infusion mit Fahrzeug oder Aldosteron implantiert (Abb. 1E-1I) und eine atherogenen Diät (bereinigte Kalorien Diät 42 % aus Fett) für 4 Wochen gefüttert. Am Ende der Behandlung waren Mäuse eingeschläfert und durchblutet PBS mit 10 % Formalin wie oben beschrieben. Die Aortenwurzel trennte sich von der apikalen Teil des Herzens und war eingebettet im OAT (Abbildung 2). Querschnitte der aortalen Wurzeln waren bereit, für unterschiedliche Färbung mit Hilfe einer Kryostat-Maschine (Abbildung 3).
Atherosklerotischen Plaque Zusammensetzung kann charakterisiert werden durch die Färbung für bestimmte Komponenten, die Plaque Entwicklungsstand zu definieren. Öl Rot O Färbung dient zum Fettgehalt von atherosklerotischen Läsionen zu bestimmen, wie im Schritt 5.1 beschrieben, Picro Sirius rote Färbung wird verwendet, um Kollagen Inhalt zu bestimmen, wie im Schritt 5.2 beschrieben und Mac3 Färbung wird eingesetzt, um Makrophagen Inhalt beschrieben Messen im Schritt 5.3. Nach 4 Wochen der Behandlung mit Aldosteron Mäuse eine deutliche Steigerung im Lipid (Abbildung 4A-4 C) und Makrophagen Inhalt (Abbildung 4-4F) in arteriosklerotische Plaques auf der Aortenwurzel Ebene angezeigt, aber keine Unterschiede in kollagengehalt beobachtet (Abb. 4-4I) verglichen mit Mäusen, die mit dem Fahrzeug behandelt. In der Tat beschleunigt Aldosteron Atherogenesis in diesem Modell, induzierende vaskulären Entzündung aber keine Fibrose (Abbildung 4).
Abbildung 1: Vorbereitung und Implantation von osmotischen Minipump mit Fahrzeug oder Aldosteron. A-B) Schritte, osmotische Minipumps mit Fahrzeug oder Aldosteron zu füllen. C) Schritte, um den Körper der Pumpe mit dem Durchflussregler schließen. D-F) Schritte zum Erstellen von eines Einschnitt für die Implantation der Pumpe auf der Rückseite der Maus. G-ich) Implantation von osmotischen Minipump und der Schnitt nähen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Vorbereitung das Herz und die Aortenwurzel einbetten und schneiden. A-B) das Herz wird entlang einer geraden Linie, die die unteren Punkte des rechten und linken Atriums verbindet quer geschnitten. Der apikale Teil des Herzens wird verarbeitet, um atherosklerotische Läsionen Zusammensetzung in die Aortenwurzel zu quantifizieren. C) die Aortenwurzel aus im Inneren des Herzens. D-E) Füllung der Kavität Herz mit Okt. F) Orientierung des Herzens in einer Form seziert vorausgefüllt mit OCT (mit dem Herzen Hohlraum in Richtung der Unterseite der Form) G) Einfrieren des sezierten Herzens mit OCT in der Form. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. Schneiden der Aortenwurzel mit einem Kryostat Mikrotom. (A) Vorkühlen des Kryostaten und legen Sie die richtige Temperatur für den Maschinen- und Chuck. B-D) Das Solid OCT Block wird aus der Form getrennt und die überschüssige OCT in der Herzgegend entfällt mit einer Klinge. E-ich) Der Block der OCT ist mit flüssigen OCT, auf die Unterstützung fixiert. J-K) Die Unterstützung ist im Futter eingefügt und mit der linksventrikulären nach außen orientiert. L-M) Abschnitt des Blocks bis seziert Herzen vollständig sichtbar ist. N-O) Legen Sie die Stärke auf 10 bzw. 6 µm und sammeln Sie die Scheiben auf dem Glas. P-Q) Überprüfen Sie das Vorhandensein aller drei Ventile unter die Lupe genommen. R) nachfolgende Scheiben gesammelt werden, wie gezeigt, bis ein oder mehrere Ventile nicht mehr eingehalten werden,. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. Quantifizierung der atherosklerotischen Plaque Zusammensetzung Aldosteron - oder Fahrzeug-behandelt ApoE- / -. A-B) repräsentative rot Öl O gebeizt Querschnitte der Aortenwurzel in 8-10 Wochen-alte ApoE- / - Mäuse mit Fahrzeug (A) oder (B) Aldosteron behandelt und eine atherogenen Diät für 4 Wochen gefüttert. C) Quantifizierung der Fettgehalt als Prozentsatz der positiven Färbung/Gesamt Plaque-Bereich. D-E) Vertreter Mac3 gebeizt Querschnitte der Aortenwurzel. F) Quantifizierung der Makrophagen Inhalt als Prozentsatz der positiven Färbung/Gesamt Plaque-Bereich. G-H) Vertreter Picro Sirius rot gebeizt Querschnitte der Aortenwurzel. ich) Quantifizierung der kollagengehalt als Prozentsatz der positiven Färbung/Gesamt Plaque-Bereich. Werte werden ausgedrückt als bedeuten ± Standardfehler bedeuten (SEM; n = 6 für jede Gruppe). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Arteriosklerose ist eine chronische entzündliche Erkrankung, die große und mittlere Schiffe mit Interaktionen zwischen mehreren Zelltypen, wie z. B. Makrophagen, T-Lymphozyten, Endothelzellen und glatten Muskelzellen Zellen1zugeordnet. Trotz der Einschränkungen der murinen atherogenen Modelle gibt es ein großen Körper des Beweises auf den atherosklerotischen Prozess. Diese Modelle haben den Vorteil, schnell generieren experimentelle Kohorten von einem bestimmten Alter und Geschlecht. Mäuse zeigen auch einen definierten und homogenen genetischen Hintergrund.
Die Entwicklung von atherosklerotischen Plaques, beobachtet in Mausmodellen anfällig für Arteriosklerose, erinnert teilweise an Probanden, mit Ausnahme von instabilen Plaques Bildung4beobachtet. Plaque-Ruptur und anschließenden Thrombose, die Hauptursache für Herzinfarkt beim Menschen nicht in murinen atherogenen Modelle beobachtet. In unseren Publikationen zeigten wir, dass die Infusion von Aldosteron zu induzieren, ist nach 4 Wochen eine instabile Plaque Phänotyp bei ApoE- / -Mäusen gefüttert eine HFD-10. In der Tat ist diese Behandlung Plaque, Fettgehalt, und entzündlichen Bereich Ebene der Aortenwurzel mit keinen signifikanten Unterschied im Vergleich zu unbehandelten Mäusen10kollagengehalt steigern können. Beachten ist zeigen diese Mäuse verstärkte Entwicklung der Hypertonie-unabhängige Atherosklerose, angesichts der Tatsache, dass Blutdruck Aldosteron Behandlung10nicht wesentlich verändert wurde.
In der vorliegenden Handschrift zeigen wir im Detail die technische Vorgehensweise zum Einbetten Herzgewebe im Oktober sowie die aufeinander folgenden Schritten, d. h. Aortenwurzel schneiden und Plaque-Analyse. Im Vergleich zu Paraffin, ermöglicht OCT Abschnitt Vorbereitung mit einer hohen Reichweite von dicken (1-100 µm) mit einem Kryostat Mikrotom und minimal Gewebe Verarbeitung. Einschränkungen können auch die Qualität der gefrorenen Gewebe, das die Bildung von Eiskristallen potenziell betroffen ist und subzelluläre Details zu ändern und erzeugen Artefakte nachweisbar von immunohistologische Färbung. In der Tat wird Kryokonservierung gedacht, um besser Antigen und Antigenität erhalten bleibt. Gefrorenes Gewebe erhalten in der Tat, die Struktur der Antigene. Gefrorenes Gewebe Verarbeitung für Immunohistochemistry ermöglicht außerdem die Verwendung von Formalin, die eine giftige und krebserregende Substanz ist zu vermeiden.
Die Aortenwurzel ist relativ einfach, zur histologischen Verarbeitung zu identifizieren. Diese Lokalisation ist ein Goldstandard atherosklerotischen Läsion Entwicklung bei Mäusen anfällig für Arteriosklerose zu studieren. Durch die Analyse dieser bestimmten Region gewonnenen Daten ermöglichen Vergleiche unter den Mäusen, die Zugehörigkeit zu derselben Gruppe oder verschiedenen Versuchsgruppen. In der Tat ist es beim Schneiden von der Aortenwurzel, leicht zu erkennen, eine bestimmte Region gekennzeichnet durch das Vorhandensein aller drei Ventile. Um eine bestimmte Region zu erhalten, empfiehlt es streng besonderes Augenmerk auf mehrere wichtige Schritte bei der Einbettung und schneiden. Es ist wichtig, füllen den Hohlraum des oberen Teils des geschnittenen Herzens mit OCT, die Bildung von Luftblasen im Gewebe zu vermeiden, die die Integrität der Abschnitte gefährden können. Außerdem, um sicherzustellen, dass die Schnittwinkel genau senkrecht auf die Aorta ascendens während schneiden, ist es notwendig, obere geschnittenen Herzen senkrecht auf der unteren Fläche der Gewebe Form richtig zu orientieren. Um intakte Scheiben zu erhalten, sollte die Temperatur des Kryostaten genau bei-20 ° C. In der Tat eine niedrigere Temperatur gefährden die Qualität der Abschnitte (d. h. die Klinge könnte bröckeln die Abschnitte, so dass sie unbrauchbar).
Der Hinweis Wenn die drei Ventile angezeigt werden, empfiehlt es sich, das Gewebe mit verschiedenen Stärken, je nach Art der Analyse zu schneiden, die ausgeführt werden. In der Tat einige Folien verwendet zur Bestimmung der Plaque Progression, während die übrigen Folien für verschiedene Färbungen verwendet werden könnten (zB., Picro Sirius, Mac3, etc..).
Atherosklerotische Läsionen bei Mäusen mit Aldosteron behandelt erscheinen reich an Lipiden und Makrophagen zeichnet sich durch die Verwendung von Öl Rot O (für Lipid Färbung), Mac3 (für Makrophagen Färbung), Sirius rot (für die Färbung des Kollagens) oder andere spezifische Antikörper für interessierender Proteine. Es ist wichtig hervorzuheben, dass OCT einbetten, im Gegensatz zu Paraffin einbetten, vermeidet die Verwendung von organischen Lösungsmitteln, die der Lipidgehalt der Läsionen zu entfernen. Daher Lipid Färbung mit Öl Rot O ist machbar in OCT eingebettet Abschnitte und Fettgehalt von atherosklerotischen Plaques genau quantifiziert werden kann.
Im vorliegenden Manuskript haben wir gezeigt, dass Aldosteron Infusion eine wertvolle Methode zur Förderung der Atherosklerose bei ApoE- / - Mäusen ist. Laut, Aldosteron-Infusion bei ApoE- / - Mäusen ist in der Lage,: 1) erhöhen die Aktivierung von Endothelzellen, dargestellt durch die erhöhte Expression von Molekülen an der Adhäsion und Migration von Monozyten in den frühen Stadien von atherosklerotischen Plaques beteiligt Bildung12,13; und 2) Lipid und Pro-inflammatorischen Makrophagen Inhalt Aortenwurzel Stufe10,13zu erhöhen. Diese Effekte sind nicht durch hämodynamische Effekte von Aldosteron10. Zusammenfassend stellt das vorgeschlagene Protokoll eine gültige Methode zu erzeugen und Atherosklerose bei Mäusen zu charakterisieren; Damit könnten Monitor frühen Stadien der Erkrankung und die Ergebnisse der therapeutischen Intervention und Rehabilitation in der Atherosklerose.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem italienischen Gesundheitsministerium (Ricerca Corrente, GR-2009-1594563 und PE-2011-02347070, M.C)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjusted calories diet (42 % from fat) | Envigo | TD.88137 | atherogenic diet |
| Osmotic minipump with filling tube | Alzet | model 1004 | for continous realase |
| Aldosterone | SIGMA | A9477 | hormone |
| Ethanol | SIGMA | 34852-M | solvent |
| Alchol Preps saturated with 70 % Isopropyl Alcohol | Kendal Webcol | 6818 | Disinfectant |
| Surgery wire (Vicryl 6.0) | Demas | 500004 | surgery |
| 10% Povidone/iodine ointment | Aplicare-Meriden | 52380-0026-1 | Antiseptic |
| Formalin 10% | SIGMA | HT5012 | to fix vascolature |
| Cryomold | Bio-Optica | 07-MP1515 | for embedding |
| O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | for embedding |
| Cryostat | Leica | CM1900 | instrument for sectioning |
| Dulbecco's Phosphat Buffered Saline | Aurogene | AU-L0615-500 | buffer solution |
| Adhesion Slides Polysine | VWR | 631-0107 | microscope glasses |
| Cover Glasses | Bio-Optica | 72015 | cover glasses |
| Formaldehyde 37% | SIGMA | 252549 | solvent |
| Oil Red O solution (0.5 % in isopropanol) | SIGMA | O1391 | staining solution |
| Mayer’s Hematoxylin | SIGMA | MHS32 | staining solution |
| Lithium Carbonate | SIGMA | 62470 | washing buffer |
| Acqueous Mounting Medium | Thermo Scientific | TA-125-AM | mounting solution |
| Acetone | SIGMA | 179124 | solvent |
| Phosphomolybdic acid solution | SIGMA | HT153 | for hystology |
| Direct Red 80 (Picrosirius Red) | SIGMA | 365548 | staining solution |
| Bio Clear (clearing agent of terpene origin) | Bio-Optica | 06-1782D | product for the preparation of histological samples |
| Eukitt Quick Hardening mounting medium (Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | SIGMA | 3989 | mounting solution |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fluka | 71725 | powder |
| Hydrogen Peroxide solution (30 %) | SIGMA | H1009 | solution |
| Vectorstain ABC KIT including: anti-rabbit IgG ABC, normal rabbit serum, Secondary-biotinylated Anti-Rat IgG , | Vector Laboratories | PK-6100 | staining solution |
| 3-amino-9-ethylcarbazole | Vector Laboratories | SK-4200 | staining solution |
| Mac3 antibody | BD Biosciences | 553322 | antibody |
| ImagePro Premier 9 | Media Cybernetics | 050910000-2534 | software to analyze images |
References
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