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Medicine

Apolipoprotein ई की कमी चूहों में Mineralocorticoid रिसेप्टर्स के सक्रियकरण के माध्यम से Atherosclerotic सजीले टुकड़े की प्रेरण

Published: September 26, 2018 doi: 10.3791/58303
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Laboratory of Cardiovascular Endocrinology, IRCCS San Raffaele Pisana, Rome, Italy, 2Department of Human Sciences and Promotion of the Quality of Life, San Raffaele Roma Open University, Rome, Italy

Summary

हम एक atherogenic आहार के साथ खिलाया चूहों ApoE के महाधमनी रूट में atherosclerosis प्रेरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन, एल्डोस्टेरॉन की एक सतत रिलीज के माध्यम से. पट्टिका संरचना विशेषताएं करने के तरीके भी वर्णित हैं ।

Abstract

Atherosclerosis संवहनी endothelium को प्रभावित करने वाली एक पुरानी भड़काऊ प्रतिक्रिया के कारण है और उच्च रक्तचाप, डिसलिपिडेमिया, और मधुमेह के रूप में कई कारकों द्वारा पदोंनत किया है । तिथि करने के लिए, हृदय रोग के विकास के लिए एक जोखिम कारक के रूप में एल्डोस्टेरॉन घूम के लिए एक भूमिका का समर्थन करने के लिए सबूत है । ट्रांसजेनिक माउस मॉडल atherosclerosis करने के लिए अग्रणी सेलुलर और आणविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए उत्पन्न किया गया है । इस पांडुलिपि में, हम ApoE में एल्डोस्टेरॉन के निरंतर अर्क का लाभ लेता है एक प्रोटोकॉल का वर्णन-/ चूहों और उपचार के 4 सप्ताह के बाद महाधमनी जड़ में atherosclerotic सजीले टुकड़े उत्पन्न करता है. हम इसलिए, महाधमनी रूट स्तर पर ठहराव और atherosclerotic घावों के लक्षण वर्णन के लिए एक विधि वर्णन । एल्डोस्टेरॉन अर्क के जोड़ा मूल्य उपचार के 4 सप्ताह के बाद लिपिड और भड़काऊ कोशिकाओं में अमीर atherosclerotic घावों की पीढ़ी द्वारा प्रतिनिधित्व किया है । हम विस्तार में पट्टिका के भीतर लिपिड और मैक्रोफेज सामग्री यों तो धुंधला प्रक्रियाओं का वर्णन । विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल में, हम दिल के ऊतकों प्रदर्शन-antigenicity कार्डियक ऊतक के संरक्षण के लिए और ब्याज की एंटीजन की पहचान की सुविधा के लिए अक्टूबर में embedding. पट्टिका phenotype का विश्लेषण atherosclerosis विकास के pathophysiology का अध्ययन करने के लिए और विरोधी atherogenic दवाओं के विकास के लिए उपंयास औषधीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए एक वैध दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है ।

Introduction

Atherosclerosis दुनिया भर में मृत्यु दर और रुग्णता के मुख्य कारणों में से एक है1. यह एक पुरानी भड़काऊ राज्य की विशेषता है, जहां रक्त वाहिकाओं लिपिड और ल्यूकोसाइट्स कि atherosclerotic सजीले टुकड़े के गठन का निर्धारण द्वारा घुसपैठ कर रहे हैं । तीव्र हृदय की घटनाओं के बहुमत पट्टिका टूटना के कारण थ्रोम्बोटिक घटनाओं के साथ जुड़े रहे हैं । टूटना करने के लिए प्रवण सजीले टुकड़े परिभाषित कर रहे हैं "कमजोर" और समर्थक भड़काऊ ल्यूकोसाइट्स, एक गल कोर, और एक पतली रेशेदार टोपी2की वृद्धि की घुसपैठ की विशेषता है । पिछले दशकों में नैदानिक और प्रायोगिक अध्ययनों ने रोग के जटिल pathophysiology को स्पष्ट कर दिया है. कई पशु मॉडल atherosclerosis3की प्रेरण में शामिल आणविक तंत्र की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है । वर्तमान में, माउस के सबसे अक्सर इस्तेमाल किया प्रजातियों कुछ प्रजातियों के बावजूद मानव के साथ तुलना में अपनी pathophysiology में मौजूदा मतभेदों को atherosclerosis अध्ययन है । विशेष रूप से, परिसंचारी कोलेस्ट्रॉल मुख्य रूप से उच्च घनत्व लिपो द्वारा निर्मित है (antiatherogenic गुणों के साथ) माउस मॉडल में, जबकि मानव में कोलेस्ट्रॉल परिसंचारी मुख्य रूप से कम घनत्व लिपो के रूप में ले जाया जाता है (एलडीएल), शायद जंगली प्रकार चूहों सहज atherosclerosis4विकसित नहीं है क्यों मुख्य कारण का प्रतिनिधित्व. इसके अलावा, जंगली प्रकार चूहों आम तौर पर आहार से कोलेस्ट्रॉल को अवशोषित करने के लिए प्रतिरोधी रहे हैं, जबकि मनुष्य आहार4कोलेस्ट्रॉल के आसपास ५०% अवशोषित । इन सीमाओं को दूर करने के लिए, कई आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल उत्पंन किया गया है । Apolipoprotein ई – आपुर्ति माउस (ApoE−/−) और एलडीएल रिसेप्टर – आपुर्ति माउस (LDLr−/−) का उपयोग व्यापक रूप से किया जाता है । एक उच्च वसा वाले उच्च कोलेस्ट्रॉल आहार पर, ApoE−/− चूहों में LDLr−/− चूहों की तुलना में अधिक तेजी से पट्टिका का विकास होता है, और इस कारण से, ApoE−/− चूहों का उपयोग LDLr−/−5चूहे,6से भी अधिक बड़े पैमाने पर । ApoE−/− चूहों atherosclerosis के किसी भी चरण में घावों का विकास और मनुष्यों में मनाया उन लोगों के लिए तुलना कर रहे हैं, हालांकि माउस पट्टिकाएं एक अस्थिर phenotype7नहीं दिखा । सामान्यतः ApoE−/− चूहे अनायास ही atherosclerosis का विकास करते है और यह प्रक्रिया पश्चिमी आहार3के साथ तेज होती है । atherosclerosis की गंभीरता का मूल्यांकन मन्या, फुफ्फुसीय, ऊरु और brachiocephalic धमनी, और महाधमनी रूट6के स्तर पर किया जा सकता है । विशेष रूप से, महाधमनी जड़ चूहों में atherosclerotic घावों को विकसित करने के लिए प्रवण एक संरचनात्मक स्थल का प्रतिनिधित्व करता है । इस कारण से, यह आम है इस क्षेत्र में atherosclerotic पट्टिकाओं के गठन का मूल्यांकन करने के लिए अभ्यास ।

कई अध्ययनों से पता चला है कि एल्डोस्टेरॉन atherosclerosis8,9,10के विकास में फंसा है । एल्डोस्टेरॉन इन्फ्यूश़न (ApoE)−/− चूहों से तंग एक atherogenic आहार महाधमनी जड़ atherosclerotic सूजन और लिपिड युक्त पट्टिका गठन10उत्प्रेरण घावों के विकास में तेजी लाती है ।

सारांश में, हम एल्डोस्टेरॉन अर्क सहित एक प्रोटोकॉल का वर्णन, atherogenic आहार खिला, दिल के ऊतकों की embedding, ठहराव और ApoE में atherosclerotic घावों के लक्षण वर्णन-/ चूहों । इस प्रक्रिया में सूजन, लिपिड अमीर atherosclerotic सजीले टुकड़े के एक कुशल गठन को बढ़ावा देता है और atherogenesis के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है ।

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Protocol

अध्ययन इतालवी स्वास्थ्य देखभाल और उपयोग समितियों के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा अनुमोदित किया गया था, प्राधिकरण संख्या 493/ सभी प्रक्रियाओं प्रयोगात्मक पशुओं के उपयोग के लिए यूरोपीय समुदाय के दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया (यूरोपीय निर्देश, 2010/

नोट: आसमाटिक minipump युक्त वाहन का उपचर्म आरोपण (खारा समाधान में इथेनॉल) या एल्डोस्टेरॉन (२४० µ g · kg-1 · d-1) में 8-10 सप्ताह पुराने पुरुष चूहों ApoE जीन के लिए कमी. सामान्य रूप से, 8-10 सप्ताह की आयु वाले पुरुष ApoE−/− चूहों का वजन लगभग 25-26 ग्राम है ।

1. भंग एल्डोस्टेरॉन

  1. भंग 5 निरपेक्ष इथेनॉल के 1 मिलीलीटर में एल्डोस्टेरॉन पाउडर के मिलीग्राम.
  2. एल्डोस्टेरॉन के ५६.७ µ l जोड़ें (इथेनॉल में भंग) के लिए ६८.३ µ एल खारा समाधान के लिए एक एकाग्रता प्राप्त करने के लिए २.२७ µ g/µ l. इस समाधान (प्रत्येक आसमाटिक की अधिकतम क्षमता १२५ minipumps एल) के १२५ µ एल के साथ पूरी तरह से पूरा minipump µ भरें ।
  3. ०.११ µ l/h के एक minipump प्रवाह दर का उपयोग करें; इसलिए २.६४ समाधान के µ l हर 24 ज जारी है. 6 µ के आसपास प्रत्येक माउस दे · एल्डोस्टेरॉन के डी-1 28 दिनों के लिए ।

2. आसमाटिक पम्प भरना और आरोपण

नोट: पंप दो अलग भागों में आपूर्ति कर रहे हैं: पम्प और प्रवाह नियामक के मुख्य शरीर ।

  1. भरने और शल्य दस्ताने का उपयोग कर minipumps संभाल ।
    नोट: त्वचा तेलों minipumps के प्रदर्शन के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं । एक बाँझ लामिना प्रवाह हुड में निम्न चरणों का पालन किया जाना चाहिए ।
  2. भरने ट्यूब संलग्न (minipumps के साथ आपूर्ति की) एक 1 मिलीलीटर सिरिंज के लिए और एल्डोस्टेरॉन समाधान या वाहन आकर्षित ।
    नोट: यह सिरिंज के अंदर हवा दे रही से बचने के लिए महत्वपूर्ण है, जबकि ट्यूब से समाधान aspirating पंप में हवा के बुलबुले के गठन को रोकने के लिए.
  3. minipump के शीर्ष पर छेद के माध्यम से भरने ट्यूब डालें जब तक यह कोई आगे नहीं जा सकते है (आंकड़ा 1a-1 बी) । धीरे एल्डोस्टेरॉन या वाहन के साथ पंप भरें । सूचना पंप के अंदर अंधेरे छाया द्रव स्तर का संकेत है । इस स्तर को भरने पंप के साथ वृद्धि देखो ।
    1. पंप भरने बंद करो जब तरल पदार्थ का एक मनका पंप शरीर से बाहर उगता है ।
  4. फिलिंग ट्यूब को सावधानीपूर्वक निकालें और फ्लोर रेगुलेटर को minipump (figure 1C) के शरीर में डालें । सुनिश्चित करें कि नियामक पंप शरीर के खिलाफ कसकर बैठा है । माउस (भड़काना प्रक्रिया) में आरोपण से पहले अप करने के लिए 24 ज के लिए ३७ ° c पर बाँझ खारा समाधान युक्त एक चोंच में भरे आसमाटिक पंपों को छोड़ दें ।
  5. ७०% इथेनॉल है कि asepsis को बढ़ावा देता है के साथ एक संक्रमित क्षेत्र में शल्य चिकित्सा आचरण ।
  6. ०.२५% bupivacaine के चीरा साइट पर 1-3 बूंदें लागू करें और 3% isoflurane के साथ पशु anesthetize । आपूर्ति गैस चालू करें और flowmeter को 500-1000 मिलीलीटर/इंडक्शन चैंबर में पशु को रखें और ऊपर से सील कर दें । vaporizer को 5% isoflurane पर घुमाएं और माउस को लेटा हुआ तक मॉनिटर करें ।
    1. nosecone करने के लिए प्रवाह करने के लिए सिस्टम स्विच करें । nosecone में कक्ष और स्थिति से पशु निकालें । 2-3 मिनट में चूहा जगाने लगता है । 100-200 मिलीलीटर पर flowmeter के साथ गैस के प्रवाह को पुनः आरंभ/मिनट और vaporizer पर 3% isoflurane ।
    2. संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई पेडल आहरण और palpebral सजगता का परीक्षण करके प्रक्रियाओं के प्रदर्शन से पहले सुनिश्चित करें । श्वसन और प्रक्रिया के दौरान उत्तेजना के लिए प्रतिक्रिया की निगरानी और vaporizer समायोजित के रूप में की जरूरत है ।
    3. एक नेत्र मरहम लगाने से बाहर सुखाने से कॉर्निया की रक्षा ।
  7. एक उस्तरा (चित्रा 1 डी) का उपयोग कर शल्य साइट से बाल निकालकर पशु तैयार करें । चमड़े के नीचे के लिए सामांय साइट पंपों के प्रत्यारोपण के पीछे है ।
  8. बुने हुए पैड सामग्री के साथ शल्य साइट तैयार ७०% isopropyl शराब के साथ संतृप्त ।
  9. एक स्वच्छ और समर्पित अंतरिक्ष का प्रयोग करें (७०% इथेनॉल से संक्रमित) और एक बाँझ कपड़ा के साथ कवर किया । एक गिलास मनका नसबंदी में यंत्रों की नोक रखें. निष्फल उपकरणों के साथ सर्जरी शुरू और उपकरणों aseptically संभाल ।
  10. एक 0.8-1 सेमी चीरा बनाने के लिए सर्जिकल कैंची का प्रयोग करें (चारों ओर 2 सेमी पूंछ के करीब), के रूप में आंकड़े 1E-1F में दिखाया गया है । बाँझ दस्ताने या उपकरणों के सुझावों के साथ शल्य समर्पित अंतरिक्ष के बाहर कुछ भी नहीं छू द्वारा बांझपन बनाए रखने ।
  11. देखभाल केवल त्वचा पर नहीं अंतर्निहित ऊतकों में कटौती करने के लिए ले लो । चीरा खोलने के लिए संदंश को पकड़ने के लिए एक हाथ का प्रयोग करें । दूसरे हाथ का उपयोग करने के लिए trocar पकड़ करने के लिए त्वचा का प्रसार करने के लिए वापस ऊपर की ओर से पंप के लिए एक जेब ब्लेड के लिए बनाने के लिए (सही या माउस के बाईं तरफ) ।
  12. चीरा में पंप डालें. धीरे पंप पूरी तरह से जेब में पुश (आंकड़ा ज) । कोई तनाव या त्वचा की जरूरत खींच के साथ घाव को बंद करने के लिए पर्याप्त त्वचा मुक्त होना चाहिए । एक बार पंप डाला गया है, टांका सर्जरी के तार के साथ चीरा (टांका आकार 6-0 के साथ polyglactin ९१०)
    नोट: नियामक के सिर माउस के सामने की ओर उन्मुख होना चाहिए (चित्रा 1G).
  13. एक साफ झाड़ू (चित्रा 1I) के साथ सामयिक 10% povidone/आयोडीन मरहम लागू करें और एक वार्मिंग की अवस्था पर जानवर रखें । जब तक वे स्टर्नल recumbency ठीक में चूहों छोड़ मत करो । जलयोजन स्थिति का मूल्यांकन करें और ०.९% खारा समाधान के ०.५ मिलीलीटर यदि आवश्यक हो तो चमड़े का प्रशासन । पशु को उसके रुटीन आवास पर लौटा दें ।
  14. प्रलेखन के लिए संस्थागत दिशा निर्देशों का पालन करें (जैसे, ऑपरेटिव और बाद ऑपरेटिव जानकारी के साथ एक शल्य फार्म भरने, प्रक्रिया और तारीख के साथ पिंजरे कार्ड अद्यतन) और एनाल्जेसिक प्रदान (buprenorphine, ०.०५ मिलीग्राम/) के बाद शल्य चिकित्सा दर्द को कम करने और एंटीबायोटिक दवाओं (enrofloxacin ८५ मिलीग्राम/सर्जिकल संक्रमण के बाद से बचने के लिए ।
    1. दैनिक निगरानी जारी रखें और दर्द के लक्षणों की जांच करें । ध्यान दें कि घाव पूरी तरह से बंद है और minipump चमड़े के नीचे की जेब में बनाए रखा है । घाव खुल सकता है और माउस minipump खो सकता है ।

3. दिल का विच्छेदन

  1. बलिदान के समय, Zoletil प्रशासित पेशी के 80-100 मिलीग्राम/किलो के साथ anestethize चूहों । Zoletil गहरी संज्ञाहरण लाती है । नोट: जाँच करें कि चूहों संज्ञाहरण के एक पर्याप्त गहराई में पेडल और palpebral सजगता परीक्षण द्वारा प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करने से पहले कर रहे हैं; चूहों को perfused जबकि गहराई से anesthetized जाएगा. वक्ष गुहा खोलो, कैंची और संदंश का प्रयोग, पसलियों के बाद उरोस्थि को काटने के द्वारा, उरोस्थि के साथ सिर की ओर मुकर जा रहा है ।
  2. Perfuse माउस के माध्यम से छोड़ दिया निलय द्वारा गुरुत्वाकर्षण छिड़काव प्रणाली के साथ 10-15 मिलीलीटर बर्फ कोल्ड Dulbecco की फॉस्फेट buffered खारा समाधान (पंजाब) और फिर के साथ 40-50 मिलीलीटर की 10% की तटस्थ बफर formalin को ठीक करने के लिए vasculature. जब चूहों जोरदार मांसपेशी संकुचन प्रदर्शन और कठोर हो निर्धारण संकेत दिया है ।
    नोट: फिक्सिंग प्रक्रिया 10-20 मिनट में जगह लेता है । यह इम्यूनोफ्लोरेसेंस या immunohistochemistry विश्लेषण करने के लिए तय अंगों और ऊतकों का उपयोग करने के लिए संभव है । महत्वपूर्ण बात यह है कि ऐसे निश्चित ऊतकों का उपयोग जीन अभिव्यक्ति और पाश्चात्य सोख्ता विश्लेषणों के लिए नहीं किया जा सकता ।
  3. संदंश के साथ दिल पकड़ और या तो कैंची या एक स्केलपेल ब्लेड के साथ काटने से दिल महाधमनी से अलग है, सीधा महाधमनी की धुरी के लिए, के रूप में नुकसान (चित्रा 2a) के कारण के बिना दिल के लिए संभव के रूप में बंद । एक स्केलपेल ब्लेड का प्रयोग करें एक सीधी रेखा है कि सही और बाएं atrium (चित्रा बी) के निचले अंक में मिलती है साथ transversely में कटौती ।
  4. (अक्टूबर) (चित्रा 2d-2E) इष्टतम काटने यौगिक के साथ (दिल की गुहा के माध्यम से) खोदी दिल के ऊपरी हिस्से भरें । महाधमनी के अक्ष के साथ एक cryosection प्लास्टिक मोल्ड के भीतर ऊतक रखो आयताकार मोल्ड के आधार पर सीधा रखा और अक्टूबर (चित्रा 2F) के साथ कवर । कोई हवा बुलबुला फंस जाना चाहिए । किसी भी बुलबुले मौजूद है, तो यह बढ़त के लिए विस्थापित करने के लिए प्रयास करें ।
  5. सूखी बर्फ पर एक धातु की थाली प्लेस और फिर ध्यान से मोल्ड डाल पर (चित्रा 2g) । जब अक्टूबर सफेद हो जाता है, चांदी की पंनी के साथ मोल्ड लपेटो और फिर पर स्टोर-८० ° c ।

4. महाधमनी रूट के सेक्शन काटना

  1. cryostat मशीन को – 20 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें । काटने से पहले, जगह एंबेडेड ऊतक और यह लगभग 15 मिनट के लिए इस तापमान को समायोजित करने के लिए छोड़ दें । -17 ° c (चित्रा 3ए) के लिए नमूना धारक तापमान सेट ।
  2. cryostat मशीन के अंदर जमे हुए दिल ब्लॉक प्लेस cryostat (चित्र 3 बी) के लिए है कि ब्लॉक के तापमान equilibrate और मोल्ड से जमे हुए दिल ब्लॉक बाहर ले (चित्रासी) । जमे हुए ब्लॉक से अधिक OCT काट बेहतर नमूना धारक (चित्रा 3 डी) को ब्लॉक आयामों अनुकूलन ।
  3. वेंट्रिकुलर (चित्रा 3E-3I) का सामना करना पड़ के साथ उंमुख नमूना धारक पर जमे हुए दिल ब्लॉक माउंट और सिर (चित्रा 3J) ओरिएंट नमूना में नमूना धारक डालें । नमूना धारक के अभिविन्यास को समायोजित करने के लिए ब्लॉक के काटने की अनुमति के क्रम में महाधमनी जड़ को सीधा करने के लिए ब्लेड (चित्रा 3K) ।
  4. ब्लॉक काटें और स्लाइसें छोड़ें जब तक महाधमनी रूट (चित्रा 3L-3N) तक पहुंच जाता है । धारावाहिक वर्गों लीजिए और उन्हें कांच स्लाइड (चित्रा 3O) पर जगह है । सभी 3 महाधमनी वाल्व प्रकट (चित्रा 3P-3Q) जब तक माइक्रोस्कोप के तहत महाधमनी रूट संरचनात्मक प्रोफ़ाइल की निगरानी ।
  5. तेल लाल हे और Picro Sirius लाल दाग के लिए 10 µm/अनुभाग में वर्गों लीजिए, और MAC3 धुंधला (चित्रा 3R) के लिए 6 µm/ लगभग 6-8 स्लाइड (प्रत्येक दिल के लिए) इकट्ठा तीन वाल्वों में से एक तक गायब हो जाता है या अब और बरकरार नहीं है ।

5. Immunohistochemistry

नोट: सभी धुंधला कदम निंनलिखित प्रोटोकॉल में रिपोर्ट ग्लास Coplin धुंधला जार में प्रदर्शन कर रहे हैं ।

  1. तटस्थ वसा के लिए तेल लाल हे दाग
    1. 5 मिनट के लिए ३७% formaldehyde के ७० मिलीलीटर में वर्गों फिक्स । नल के पानी में अच्छी तरह से धोने और अतिरिक्त पानी बंद दाग ।
    2. आसुत पानी की ३२ मिलीलीटर में तेल लाल ओ (०.५% isopropanol में) के ४८ मिलीलीटर पतला तेल लाल o ०.३% प्राप्त करने के लिए ।
    3. 10 मिनट के लिए नल के पानी में 10 मिनट धोने वर्गों के लिए तेल लाल ओ ०.३% की ७० मिलीलीटर में दाग वर्गों ।
    4. है मेयर Hematoxylin के ७० मिलीलीटर में 1 मिनट के लिए दाग । 1 मिनट के लिए नल के पानी में अनुभाग धो लें ।
    5. ०.५% लिथियम कार्बोनेट के ७० मिलीलीटर में वर्गों विसर्जित कर दिया । 1 मिनट के लिए नल के पानी में धो लें ।
    6. एक जलीय बढ़ते माध्यम के साथ वर्गों माउंट और एक डिजिटल कैमरा एक प्रकाश माइक्रोस्कोप पर घुड़सवार का उपयोग कर छवियों पर कब्जा ।
  2. Picro Sirius कोलेजन के लिए लाल दाग
    1. कट 10 µm जमे हुए वर्गों और स्लाइड के तल में माउंट ।
    2. 5 मिनट, हवा सूखी और आसुत पानी में संक्षेप में कुल्ला के लिए एसीटोन के ७० मिलीलीटर में वर्गों फिक्स ।
    3. 5 मिनट के लिए ०.२% phosphomolybdic एसिड की ७० मिलीलीटर में वर्गों प्लेस । आसुत जल में संक्षेप में कुल्ला ।
    4. ७० एमएल के ०.१% Picro Sirius सॉल्यूशन में अनुभागों को ९० मिनट के लिए रखें । ०.०१ एन एचसीएल के ७० मिलीलीटर के साथ एक बार कुल्ला । समाधान छोड़ें ।
    5. ०.०१ एन एचसीएल के ७० मिलीलीटर में 2 मिनट के लिए जगह आसुत जल में संक्षेप में कुल्ला । हवा शुष्क ।
    6. ७०% इथेनॉल के ७० मिलीलीटर में संक्षेप में जगह है ।
    7. जब पूरी तरह से शुष्क, terpene मूल के समाशोधन एजेंट के ७० मिलीलीटर में जगह है और माउंट (butyl methacrylate-सहमिथाइल methacrylate) आधारित बढ़ते मध्यम और कब्जा छवियों का उपयोग कर एक डिजिटल कैमरा एक प्रकाश माइक्रोस्कोप पर घुड़सवार का उपयोग कर वर्गों पर्वत ।
      नोट: Picro Sirius लाल दाग के लाभों में से एक यह है कि यह संभव है प्रकार मैं (मोटी फाइबर, पीला-नारंगी birefringence) और प्रकार III (पतली फाइबर, हरी birefringence) कोलेजन फाइबर नेटवर्क द्वारा ध्रुवीय प्रकाश माइक्रोस्कोपी11 .
  3. मैक्रोफेज धुंधलाने के लिए Mac3 दाग
    1. कट 6 µm जमे हुए वर्गों और स्लाइड के तल में माउंट ।
    2. 5 मिनट के लिए ठंडा एसीटोन के ७० मिलीलीटर में वर्गों फिक्स 2 मिनट के लिए पंजाब के ७० मिलीलीटर में विसर्जित कर दिया ।
    3. एक पिपेट का प्रयोग, सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) समाधान के 1% के साथ वर्गों को कवर और प्रतिजन के लिए कमरे के तापमान (आरटी) में 5 मिनट के लिए मशीन । 5 मिनट के लिए पंजाब के ७० मिलीलीटर में विसर्जित कर दिया ।
    4. एक पिपेट का प्रयोग, 5 मिनट के लिए 3 बार पंजाब के ७० मिलीलीटर में 20 मिनट के लिए ०.३% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ स्लाइस कवर ।
    5. Avidin-बायोटिन कॉम्प्लेक्स (ABC) का उपयोग करें-निम्न चरणों के लिए एचआरपी किट.
    6. 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सामान्य खरगोश सीरम में एक पिपेट, ब्लॉक वर्गों का उपयोग करना । बंद कुल्ला मत करो ।
    7. MAC3 के साथ दाग (1:300) के लिए ९० min. at RT. 5 मिनट के लिए 3 बार पंजाब के ७० मिलीलीटर में धो लो ।
    8. माध्यमिक के साथ दाग-biotinylated विरोधी चूहा आईजीजी (1:200) आर सी के लिए ४५ मिनट के साथ आरटी में 3 बार 5 मिनट के लिए पंजाब के ७० मिलीलीटर कुल्ला ।
    9. 30 मिनट के लिए आर टी के साथ आईजीजी एबीसी के लिए खरगोश के साथ वर्गों को कवर 5 मिनट के लिए 3 बार पंजाब के 30 मिलीलीटर के साथ कुल्ला ।
    10. 3 अमीनो-9-ethylcarbazole (एईसी) 10 मिनट के लिए आसुत जल के ७० मिलीलीटर के साथ कुल्ला के लिए वर्गों के साथ कवर ।
    11. है मेयर Hematoxylin के ७० मिलीलीटर में 1 मिनट के लिए दाग । 1 मिनट के लिए नल के पानी में अनुभाग धो लें ।
    12. ०.५% लिथियम कार्बोनेट के ७० मिलीलीटर में वर्गों विसर्जित कर दिया । 1 मिनट के लिए नल के पानी में धो लें ।
    13. एक जलीय बढ़ते माध्यम के साथ वर्गों माउंट और एक डिजिटल कैमरा एक प्रकाश माइक्रोस्कोप पर घुड़सवार का उपयोग कर छवियों पर कब्जा ।

6. महाधमनी रूट वर्गों में Atherosclerotic घावों की छवि विश्लेषण

नोट: महाधमनी जड़ तेल लाल हे या MAC3 या ब्याज की एक एंटीबॉडी के साथ दाग वर्गों उपयुक्त सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिकामें संकेत) का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है । कुल पिक्सेल ब्याज के घटक के लिए सकारात्मक धुंधला समग्र पट्टिका क्षेत्र को सामान्यीकृत है । छवियां एकत्र और एक इलाज-अंधा अंवेषक द्वारा विश्लेषण किया गया ।

  1. अंशांकन
    1. सॉफ्टवेयर खोलें और फिर छवि (jpg में) का चयन करने के लिए विश्लेषण किया जाएगा ।
    2. घर का चयन करें । बनाएं । त्वरित अंशांकन।
    3. छवि के पैमाने पर पट्टी के साथ एक लाइन ड्राइंग द्वारा छवि के अंशांकन सेट करें ।
    4. अंशांकन का सेटअप सहेजें ।
  2. छवि विश्लेषण
    1. विकल्प मेनू से बचाया सेटअप अंशांकन का चयन करें | स्थानिक अंशांकन विकल्प।
    2. अंशांकन का चयन करें | लागू होते.
    3. का चयन करें मेनू पर बहुभुज उपकरण का चयन करें और सभी atherosclerotic घावों के साथ परिधि आकर्षित ।
    4. चुनें गिनती/ प्रकारआहेत. मेनू से, क्षेत्र और प्रतिशत क्षेत्रजोड़ें ।
    5. गिनती/आकार मेनू से, मैनुअल का चयन करें और एक नई विंडो खुल जाएगा ।
    6. इस विंडो से छवि उपकरण पर रंग उठाओ और चुनें HSI मोड पर क्लिक करें ।
    7. रंग की एक सीमा बनाने के लिए ब्याज की मार्कर के सकारात्मक पिक्सल पर माउस कर्सर बिंदु ।
    8. गणना पर क्लिक करें और मूल्य राशि, माप तालिकामें मनाया, मार्कर के क्षेत्र का प्रतिशत इंगित करता है (भी µm2में व्यक्त) atherosclerotic घावों के कुल क्षेत्र के संबंध में.

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Representative Results

8-10 सप्ताह में एपीओ-/ चूहों, minipumps वाहन या एल्डोस्टेरॉन (चित्रा 1E-1I) के साथ संचार करने के लिए प्रत्यारोपित किया गया और एक atherogenic आहार (वसा से समायोजित कैलोरी आहार ४२%) 4 सप्ताह के लिए खिलाया । उपचार के अंत में, चूहों euthanized और perfused के साथ थे और 10% formalin ऊपर वर्णित के रूप में । महाधमनी जड़ दिल के शिखर हिस्से से अलग हो गया था और अक्टूबर (चित्रा 2) में एंबेडेड था । महाधमनी जड़ों के पार वर्गों एक cryostat मशीन (चित्रा 3) का उपयोग करके अलग धुंधला के लिए तैयार थे ।

Atherosclerotic पट्टिका संरचना विशिष्ट घटकों, जो पट्टिका विकास के चरण को परिभाषित करने के लिए धुंधला के माध्यम से विशेषता हो सकती है । तेल लाल हे दाग के रूप में ५.१ कदम में वर्णित atherosclerotic घावों की लिपिड सामग्री का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है, Picro Sirius लाल दाग ५.२ कदम में वर्णित के रूप में कोलेजन सामग्री का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और Mac3 धुंधला मैक्रोफेज वर्णित सामग्री को मापने के लिए कार्यरत है चरण ५.३ में । एल्डोस्टेरॉन के साथ उपचार के 4 सप्ताह के बाद, चूहों महाधमनी रूट स्तर पर atherosclerotic सजीले टुकड़े में लिपिड (चित्रा 4a-4c) और मैक्रोफेज सामग्री (चित्रा 4d-4F) में एक महत्वपूर्ण वृद्धि प्रदर्शित, लेकिन कोई मतभेद नहीं थे में मनाया कोलेजन सामग्री (चित्रा 4g-4i) वाहन के साथ इलाज चूहों की तुलना में. दरअसल, एल्डोस्टेरॉन इस मॉडल में त्वरित atherogenesis, संवहनी सूजन उत्प्रेरण लेकिन नहीं फाइब्रोसिस (चित्रा 4).

Figure 1
चित्र 1. वाहन या एल्डोस्टेरॉन के साथ आसमाटिक minipump की तैयारी और आरोपण । A-B) वाहन या एल्डोस्टेरॉन के साथ आसमाटिक minipumps को भरने के लिए चरण । ग) प्रवाह नियामक के साथ पंप के शरीर को बंद करने के लिए कदम । डी एफ) कदम माउस की पीठ पर पंप के आरोपण के लिए एक चीरा बनाने के लिए । जी-I) आसमाटिक minipump और चीरा के suturing का आरोपण. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. एंबेडिंग और अनुभागीकरण के लिए दिल और महाधमनी जड़ तैयार करना । a-B) दिल एक सीधी रेखा है कि सही और बाएं atrium के निचले अंक में मिलती है साथ transversely कट जाता है । दिल के शिखर भाग महाधमनी जड़ में atherosclerotic घावों संरचना यों तो मात्रा में संसाधित है । ग) दिल के अंदर से महाधमनी जड़ । डी ई) अक्टूबर एफ के साथ दिल गुहा के भरने ) एक मोल्ड पूर्व में विच्छेदित दिल का उंमुखीकरण (मोल्ड के नीचे की दिशा में दिल गुहा के साथ) जी) मोल्ड में अक्टूबर के साथ विच्छेदित दिल की ठंड । । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. एक cryostat microtome का उपयोग कर महाधमनी जड़ की धारा । एक) cryostat पूर्व शांत और मशीन और चक के लिए सही तापमान निर्धारित किया है । बी डी) ठोस oct ब्लॉक मोल्ड से अलग है और हृदय के आसपास अतिरिक्त OCT एक ब्लेड का उपयोग कर समाप्त हो गया है । ई-I) अक्टूबर के ब्लॉक ठीक है, तरल oct का उपयोग कर, समर्थन पर । जम्मू-कश्मीर) समर्थन चक में डाला और जावक का सामना करना पड़ वेंट्रिकुलर के साथ उंमुख है । एल-एम) खंड को तब तक ब्लॉक करें जब तक कि विदारक हृदय पूरी तरह से सामने न आ जाए । N-O) 10 और/या 6 µm करने के लिए मोटाई सेट और कांच पर स्लाइसें इकट्ठा । P-Q) माइक्रोस्कोप के तहत सभी तीन वाल्व की उपस्थिति की जाँच करें । आर) बाद में स्लाइसें एकत्र कर रहे हैं, के रूप में दिखाया, जब तक एक या अधिक वाल्व अब और नहीं देखा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. ठहराव में atherosclerotic पट्टिका रचना का एल्डोस्टेरॉन-या वाहन-स्वास्थ्यकर्मी ApoE-/ a-B) प्रतिनिधि लाल तेल महाधमनी जड़ के पार वर्गों में 8-10 सप्ताह पुरानी ApoE-/ चूहों वाहन (क) या एल्डोस्टेरॉन (बी) के साथ इलाज किया और 4 सप्ताह के लिए एक atherogenic आहार खिलाया । ग) सकारात्मक धुंधला/कुल पट्टिका क्षेत्र के प्रतिशत के रूप में लिपिड सामग्री के ठहराव । डी ई) प्रतिनिधि Mac3 महाधमनी रूट के दाग पार वर्गों । F) धनात्मक धुंधलान/कुल पट्टिका क्षेत्र के प्रतिशत के रूप में मैक्रोफेज सामग्री का ठहराव । जी एच) प्रतिनिधि Picro Sirius लाल दाग महाधमनी जड़ के पार वर्गों । I) सकारात्मक धुंधला/कुल पट्टिका क्षेत्र के प्रतिशत के रूप में कोलेजन सामग्री के ठहराव । मान मतलब ± मानक त्रुटि अर्थ के रूप में व्यक्त कर रहे है (SEM; n = 6 प्रत्येक समूह के लिए) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

Atherosclerosis बड़े और मध्यम जहाजों के साथ जुड़े एक पुरानी भड़काऊ विकार है, जैसे मैक्रोफेज, टी लिम्फोसाइटों, endothelial कोशिकाओं और चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं1के रूप में कई सेल प्रकार, के बीच बातचीत शामिल है । murine atherogenic मॉडल की सीमाओं के बावजूद, atherosclerotic प्रक्रिया पर सबूत के एक बड़े शरीर उपलब्ध है । इन मॉडलों को तेजी से एक विशिष्ट उंर और लिंग के प्रायोगिक साथियों पैदा करने का लाभ है । चूहे भी एक परिभाषित और सजातीय आनुवंशिक पृष्ठभूमि दिखा ।

atherosclerotic सजीले टुकड़े, माउस atherosclerosis से ग्रस्त मॉडल में मनाया के विकास, आंशिक रूप से जैसा कि मानव विषयों में मनाया, अस्थिर सजीले टुकड़े के गठन के अलावा4। पट्टिका टूटना और बाद में घनास्त्रता, मनुष्यों में रोधगलन का मुख्य कारण murine atherogenic मॉडलों में नहीं मनाया जाता है । हमारे हाल के पत्रों में, हम एल्डोस्टेरॉन के अर्क से पता चला है कि प्रेरित करने में सक्षम है, 4 सप्ताह के बाद, ApoE में एक अस्थिर पट्टिका phenotype-/चूहों एक HFD10खिलाया । वास्तव में, इस उपचार के लिए पट्टिका क्षेत्र में वृद्धि करने में सक्षम है, लिपिड सामग्री, और भड़काऊ क्षेत्र महाधमनी रूट स्तर पर, बिना अनुपचारित चूहों10की तुलना में कोलेजन सामग्री में कोई महत्वपूर्ण अंतर के साथ. ध्यान दें की, इन चूहों उच्च रक्तचाप के विकास को दिखाने-स्वतंत्र atherosclerosis, यह देखते हुए कि रक्तचाप काफी एल्डोस्टेरॉन उपचार द्वारा बदल नहीं था10.

वर्तमान पांडुलिपि में, हम विस्तार से वर्णन के लिए तकनीकी प्रक्रिया OCT में दिल के ऊतकों को एंबेड के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अनुक्रमिक कदम, यानी, महाधमनी जड़ खोदी और पट्टिका विश्लेषण । तेल की तुलना में, अक्टूबर एक cryostat microtome और ंयूनतम ऊतक प्रसंस्करण के साथ मोटाई (1-100 µm) की एक उच्च श्रेणी के साथ अनुभाग तैयारी की अनुमति देता है । सीमाएं जमे हुए ऊतक, जो संभवतः बर्फ क्रिस्टल के गठन से प्रभावित है और उपसेलुलर विवरण बदल सकते है और immunohistological धुंधला द्वारा detectable कलाकृतियों उत्पंन की गुणवत्ता में शामिल हैं । दरअसल, cryopreservation प्रतिजन और antigenicity को बेहतर ढंग से संरक्षित करने के लिए सोचा है । वास्तव में, जमे हुए ऊतकों प्रतिजनों की संरचना की रक्षा । इसके अलावा, immunohistochemistry के लिए जमे हुए ऊतक प्रसंस्करण formalin, जो एक विषाक्त और यलो यौगिक है के उपयोग से बचने के लिए अनुमति देता है ।

महाधमनी रूट एक अपेक्षाकृत ऊतकवैज्ञानिक प्रसंस्करण के लिए पहचान करने के लिए सरल साइट है । यह संरचनात्मक स्थल atherosclerosis से ग्रस्त चूहों में atherosclerotic घावों के विकास का अध्ययन करने के लिए एक सोने का मानक है । इस विशिष्ट क्षेत्र के विश्लेषण द्वारा प्राप्त डेटा एक ही समूह या अलग प्रयोगात्मक समूहों से संबंधित चूहों के बीच तुलना की अनुमति देते हैं । वास्तव में, महाधमनी जड़ के अनुभाग के दौरान, यह एक विशिष्ट सभी तीन वाल्वों की उपस्थिति की विशेषता क्षेत्र पहचान करने के लिए आसान है । इस तरह के एक विशिष्ट क्षेत्र प्राप्त करने के लिए, यह कड़ाई से embedding और अनुभाग के दौरान कई महत्वपूर्ण कदम के लिए विशेष रूप से ध्यान देने की सिफारिश की है । यह महत्वपूर्ण है के लिए अक्टूबर के साथ खोदी दिल के ऊपरी हिस्से की गुहा ऊतक है कि वर्गों की अखंडता समझौता कर सकते में हवा के बुलबुले के गठन से बचने के लिए । इसके अलावा, यह सुनिश्चित करने के लिए कि काटने कोण अनुभाग के दौरान आरोही महाधमनी के लिए बिल्कुल सीधा है, यह ठीक से ऊतक मोल्ड के नीचे की सतह को सीधा ऊपरी खोदी दिल ओरिएंट के लिए आवश्यक है । बरकरार स्लाइस प्राप्त करने के लिए, cryostat का तापमान बिल्कुल-20 डिग्री सेल्सियस पर होना चाहिए । वास्तव में, एक कम तापमान वर्गों की गुणवत्ता से समझौता (यानी, ब्लेड उंहें व्यर्थ बनाने वर्गों उखड़ सकता है) सकता है ।

नोट की, जब तीन वाल्व दिखाई देते हैं, यह विभिंन मोटाई के साथ ऊतक में कटौती की सिफारिश की है, विश्लेषण है कि प्रदर्शन किया जाएगा के प्रकार पर निर्भर करता है । वास्तव में, कुछ स्लाइड पट्टिका प्रगति के निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, जबकि शेष स्लाइड अलग दाग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (यानी, Picro Sirius, Mac3, आदि) ।

एल्डोस्टेरॉन के साथ इलाज चूहों में Atherosclerotic घावों लिपिड में अमीर दिखाई देते हैं और मैक्रोफेज के उपयोग की विशेषता तेल लाल हे (लिपिड धुंधला के लिए), Mac3 (मैक्रोफेज धुंधला के लिए), Sirius लाल (कोलेजन के धुंधला के लिए), या अन्य विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए ब्याज की प्रोटीन । यह महत्वपूर्ण है कि अक्टूबर embedding, तेल embedding के विपरीत, कार्बनिक सॉल्वैंट्स के उपयोग से बचा जाता है कि घावों के लिपिड सामग्री को हटा दें । इसलिए, लिपिड तेल लाल ओ के साथ धुंधला अक्टूबर-एंबेडेड वर्गों और atherosclerotic सजीले टुकड़े की लिपिड सामग्री ठीक quantified जा सकता है में व्यवहार्य है ।

वर्तमान पांडुलिपि में हमें पता चला है कि एल्डोस्टेरॉन इन्फ्यूश़न ApoE-/ चूहों में atherosclerosis को बढ़ावा देने के लिए एक मूल्यवान विधि है । वास्तव में, ApoE में एल्डोस्टेरॉन अर्क-/ चूहों में सक्षम है: 1) endothelial कोशिकाओं के सक्रियण में वृद्धि, के रूप में आसंजन और monocytes के प्रवास में शामिल अणुओं की वृद्धि की अभिव्यक्ति द्वारा दिखाया atherosclerotic पट्टिका के प्रारंभिक दौर में गठन12,13; और 2) महाधमनी रूट स्तर10,13पर लिपिड और समर्थक भड़काऊ मैक्रोफेज सामग्री में वृद्धि । इन प्रभावों एल्डोस्टेरॉन10के hemodynamic प्रभाव के कारण नहीं कर रहे हैं ।  अंत में, प्रस्तावित प्रोटोकॉल एक वैध उत्पंन करने के लिए विधि का प्रतिनिधित्व करता है और चूहों में atherosclerosis की विशेषता; यह रोग और atherosclerosis में चिकित्सीय हस्तक्षेप और पुनर्वास के परिणामों की प्रारंभिक अवस्था की निगरानी में मदद कर सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (Ricerca Corrente, जीआर-2009-1594563 और पीई-2011-02347070 M.C. करने के लिए)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adjusted calories diet (42 % from fat) Envigo TD.88137 atherogenic diet
Osmotic minipump with filling tube Alzet model 1004 for continous realase
Aldosterone SIGMA A9477 hormone
Ethanol SIGMA 34852-M solvent
Alchol Preps saturated with 70 % Isopropyl Alcohol Kendal Webcol 6818 Disinfectant
Surgery wire (Vicryl 6.0) Demas 500004 surgery
10% Povidone/iodine ointment Aplicare-Meriden 52380-0026-1 Antiseptic
Formalin 10% SIGMA HT5012 to fix vascolature
Cryomold Bio-Optica 07-MP1515 for embedding
O.C.T. Compound Sakura Finetek 4583 for embedding
Cryostat Leica CM1900 instrument for sectioning
Dulbecco's Phosphat Buffered Saline Aurogene AU-L0615-500 buffer solution
Adhesion Slides Polysine VWR 631-0107 microscope glasses
Cover Glasses Bio-Optica 72015 cover glasses
Formaldehyde 37% SIGMA 252549 solvent
Oil Red O solution (0.5 % in isopropanol) SIGMA O1391 staining solution
Mayer’s Hematoxylin SIGMA MHS32 staining solution
Lithium Carbonate SIGMA 62470 washing buffer
Acqueous Mounting Medium Thermo Scientific TA-125-AM mounting solution
Acetone SIGMA 179124 solvent
Phosphomolybdic acid solution SIGMA HT153 for hystology
Direct Red 80 (Picrosirius Red) SIGMA 365548 staining solution
Bio Clear (clearing agent of terpene origin) Bio-Optica 06-1782D product for the preparation of histological samples
Eukitt Quick Hardening mounting medium (Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) SIGMA 3989 mounting solution
Sodium Dodecyl Sulfate Fluka 71725 powder
Hydrogen Peroxide solution (30 %) SIGMA H1009 solution
Vectorstain ABC KIT including: anti-rabbit IgG ABC, normal rabbit serum, Secondary-biotinylated Anti-Rat IgG , Vector Laboratories PK-6100 staining solution
3-amino-9-ethylcarbazole Vector Laboratories SK-4200 staining solution
Mac3 antibody BD Biosciences 553322 antibody
ImagePro Premier 9 Media Cybernetics 050910000-2534 software to analyze images

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References

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सेिा अंक १३९ Atherosclerosis एल्डोस्टेरॉन शोथ ApoE-/- महाधमनी जड़ immunohistochemistry
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Marzolla, V., Armani, A., Mammi, C., … More

Marzolla, V., Armani, A., Mammi, C., Feraco, A., Caprio, M. Induction of Atherosclerotic Plaques Through Activation of Mineralocorticoid Receptors in Apolipoprotein E-deficient Mice. J. Vis. Exp. (139), e58303, doi:10.3791/58303 (2018).

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