Summary
Vi beskriver ett protokoll för att framkalla åderförkalkning i aortaroten av ApoE- / - möss som utfodrats med en aterogena diet, genom en kontinuerlig frisättning av aldosteron. Metoder för att karakterisera plack sammansättning beskrivs också.
Abstract
Åderförkalkning beror på en kronisk inflammatorisk reaktion som påverkar vaskulära endotel och främjas av flera faktorer såsom högt blodtryck, höga blodfetter och diabetes. Hittills finns det bevis för att stödja en roll för cirkulerande aldosteron som en riskfaktor för utveckling av hjärt-kärlsjukdom. Transgena musmodeller har genererats för att studera cellulära och molekylära processer som leder till åderförkalkning. I detta manuskript beskriver vi ett protokoll som tar fördel av kontinuerlig infusion av aldosteron i ApoE- / - möss och genererar aterosklerotiska plack i aortaroten efter 4 veckors behandling. Vi, illustrera därför en metod för kvantifiering och karakterisering av aterosklerotiska lesioner på aorta rotnivå. Mervärdet av aldosteron infusion representeras av generationen av aterosklerotiska lesioner rik på lipider och inflammatoriska celler efter 4 veckors behandling. Vi beskriver i detalj färgning procedurerna för att kvantifiera lipid- och makrofag innehåll i placket. Noterbart i detta protokoll utför vi hjärta vävnad-inbäddning i okt för att bevara antigenicitet av hjärtvävnad och underlätta upptäcktsrisken av antigener av intresse. Analys av plack fenotypen representerar en giltig metod att studera patofysiologin bakom åderförkalkning utveckling och identifiera nya farmakologiska mål för utvecklingen av anti aterogena läkemedel.
Introduction
Ateroskleros är en av de främsta orsakerna till dödlighet och sjuklighet i världen1. Det kännetecknas av en kronisk inflammatorisk stat där blodkärlen är infiltrerade av lipider och leukocyter som avgör bildandet av aterosklerotiska plack. Majoriteten av akut hjärtpåverkan är associerade med trombotiska händelser på grund av plack bristning. Plack som är benägna att brista definieras ”utsatta” och kännetecknas av ökad infiltration av pro-inflammatoriska leukocyter, en nekrotisk kärna och en tunna fibrösa cap2. I de sista årtiondena, har kliniska och experimentella studier klargjort den komplicerade patofysiologin av sjukdomen. Flera djurmodeller används för att undersöka de molekylära mekanismerna som är involverade i induktion av åderförkalkning3. Musen är för närvarande de vanligaste arterna att studera ateroskleros trots vissa artspecifika skillnader som finns i dess patofysiologi jämfört med människor. I synnerhet består cirkulerande kolesterol huvudsakligen av high-density lipoprotein (med antiatherogenic egenskaper) i musmodeller, medan hos människa cirkulerande kolesterol är huvudsakligen transporteras som low-density lipoprotein (LDL), förmodligen som representerar den främsta anledningen varför vildtyp möss inte utveckla spontan åderförkalkning4. Vildtyp möss är dessutom generellt resistenta att absorbera kolesterol från kosten, medan människor absorberar omkring 50% av kolesterol4. För att övervinna dessa begränsningar, har flera genetiskt modifierade musmodeller genererats. Apolipoprotein E – bristfällig mus (ApoE−/−) och LDL receptor-deficient mus (receptorn−/−) används allmänt. På en hög fetthalt högt kolesterol diet, ApoE−/− möss utvecklar plack mer snabbt jämfört med receptorn−/−möss, och därför är användningen av ApoE−/− möss vanligare än för receptorn−/−möss5,6. ApoE−/− möss utvecklar lesioner i något skede av åderförkalkning och är jämförbara med de som observerats hos människor, även om musen plack inte visar en instabil fenotyp7. Allmänhet, ApoE−/− möss utvecklar spontant åderförkalkning och denna process påskyndas med en västerländsk kost3. Svårighetsgraden av åderförkalkning kan utvärderas på nivån för halspulsådern, pulmonell, femorala och brachiocephalic artär, och den aortaroten6. Särskilt representerar aortaroten en anatomisk plats som är benägna att utveckla aterosklerotiska lesioner hos möss. Av denna anledning är det vanligt att utvärdera bildandet av aterosklerotiska plack i denna region.
Flera studier har visat att aldosteron är inblandad i utvecklingen av åderförkalkning8,9,10. Aldosteron infusion i ApoE−/− möss ges en aterogena kost accelererar utvecklingen av aortaroten aterosklerotiska lesioner inducerande inflammerad och lipid-rika plack bildning10.
Sammanfattningsvis beskriver vi ett protokoll inklusive aldosteron infusion, aterogena kost utfodring, inbäddning av hjärtat vävnader, kvantifiering och karakterisering av aterosklerotiska lesioner i ApoE- / - möss. Detta förfarande främjar en effektiv bildandet av inflammerade, lipid-rika aterosklerotiska plack och representerar en värdefull modell för studier av aterogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien var godkänd av den italienska nationella institut för hälsa vård och användning kommittéer, tillstånd nummer 493/2016-PR. Alla förfaranden genomfördes per de europeiska riktlinjerna för användning av försöksdjur (europeiska direktiv 2010/63/EU).
Obs: Subkutan implantation av osmotisk minipump som innehåller fordon (etanol i saltlösning) eller aldosteron (240 µg kg-1 · d-1) i 8-10 vecka-gammal hanmöss bristfällig för ApoE -genen. I allmänt, 8-10 vecka-gammal ApoE−/− hanmöss väger omkring 25-26 gram.
1. upplösning av aldosteron
- Lös 5 mg av aldosteron pulver i 1 mL av absolut etanol.
- Lägga till 56,7 µL av aldosteron (löst i etanol) 68,3 µL av saltlösning för att erhålla en koncentration av 2,27 µg / µL. Fyll den hela osmotisk men framförallt minipumpar helt med 125 µL av denna lösning (maximal kapacitet för varje minipump är 125 µL).
- Använda en minipump flödeshastighet på 0.11 µL/h. Därför 2,64 µL av lösningen släpps varje 24 h. ge varje mus runt 6 µg · d-1 av aldosteron i 28 dagar.
2. osmotisk Pump fyllning och Implantation
Obs: Pumpar levereras i två separata delar: huvuddelen av pumpen och flödesregulator.
- Fyll och hantera den men framförallt minipumpar använda kirurgiska handskar.
Obs: Hud oljor kan störa utförandet av men framförallt minipumpar. Följande steg bör utföras i en steril LAF. - Bifoga fyllning röret (levereras med den men framförallt minipumpar) i en 1 mL spruta och dra upp aldosteron lösning eller fordon.
Obs: Det är viktigt att undvika att låta luften inuti sprutan samtidigt aspirera lösningar från röret för att förhindra bildandet av luftbubblor i pumpen. - Infoga fyllning röret genom hålet längst upp i minipump tills det kan gå längre (figur 1A-1B). Långsamt fylla pumpen med aldosteron eller fordon. Märka den mörka skuggan inuti pumpen som visar vätskenivån. Titta på denna nivå uppgång tillsammans med fyllning pumpen.
- Sluta fylla pumpen när en pärla av vätska stiger ur pumphuset.
- Försiktigt bort fyllning röret och infoga flödesregulator i kroppen av minipump (figur 1 c). Kontrollera att regulatorn sitter tätt mot pumphus. Lämna de fyllda osmotisk pumparna i en bägare som innehåller steril koksaltlösning vid 37 ° C i upp till 24 h innan implantation i musen (priming förfarande).
- Genomföra kirurgi i en desinficeras med 70% etanol som främjar asepsis.
- Applicera 1-3 droppar på snitt platsen av 0,25% bupivakain och söva djuret med 3% isofluran. Slå på leverans gasen och flödesmätarens till 500-1000 mL/min. plats djuret i induktion kammaren och tätar toppen. Slå på spridare till 5% isofluran och övervaka musen tills recumbent.
- Switch systemet att flöda till noskon. Ta bort djuret från plenisalen och position i noskon. I 2-3 minuter börjar musen att vakna upp. Starta om gasflödet med flödesmätarens på 100-200 mL/min och spridare på 3% isofluran.
- Säkerställa tillräcklig djup anestesi före utför procedurer genom att testa pedal tillbakadragande och palpebrala reflexer. Övervaka andning och svar på stimulering under förfarandet och justera spridare som behövs.
- Skydda hornhinna från uttorkning genom att tillämpa en oftalmologiska salva.
- Förbereda djuret genom att ta bort hår från operationsområdet med hjälp av en rakkniv (figur 1 d). Den vanliga platsen för subkutan implantation av pumpar är på baksidan.
- Förbereda operationsområdet med nonwoven pad material mättad med 70% isopropylalkohol.
- Använd en ren och dedikerad utrymme (desinficeras med 70% etanol) och täckt med en steril draperi. Placera spetsen på instrumenten i en glas pärla sterilizer. Påbörja operation med steriliserade instrument och hantera instrument aseptiskt.
- Använd kirurgisk sax göra en 0,8-1 cm snitt (ca 2 cm nära svansen), som visas i siffror 1E-1F. Upprätthålla sterilitet genom att inte röra något utanför det kirurgiska dedikerad utrymmet med sterila handskar eller tips av instrument.
- Var noga med för att skära bara huden men inte de underliggande vävnaderna. Använda en hand för att hålla tången att öppna snittet. Använd den andra handen hålla troakaren att sprida huden för att skapa en ficka för pumpen från baksidan uppåt till skulderbladet (på höger eller vänster sida av musen).
- Sätt pumpen i snittet. Tryck försiktigt pumpen helt i fickan (figur 1 H). Det bör finnas tillräckligt huden fri att stänga såret med ingen spänning eller stretching huden behövs. När pumpen har infogats, sutur snittet med kirurgi tråd (polyglactin 910 med sutur storlek 6-0)
Obs: Huvudet av regulatorn måste vara riktad mot framsidan av musen (figur 1 g). - Tillämpa aktuell 10% povidon/iodine salva med en ren bomullstopp (figur 1I) och hålla djuret på en värmande scen. Lämna inte möss i obevakad tills de återställa sternala koordinationsrubbning. Utvärdera vätskestatus och administrera 0,5 mL av 0,9% saltlösning subkutant vid behov. Tillbaka djuret till dess rutin bostäder.
- Följ anvisningar för dokumentation (t.ex. Fyll en kirurgisk form med operativa och postoperativ information, uppdatera buren kort med förfarandet och datum) och ge analgetika (buprenorfin, 0,05 mg/kg) för att minska postoperativ smärta och antibiotika (enrofloxacin 85 mg/kg) att undvika postoperativ infektion.
- Fortsätta att dagligen övervaka och undersöka tecken på smärta. Betala uppmärksamhet att såret är helt stängd och minipump upprätthålls i subkutan fickan. Såret kan öppna och musen kan förlora minipump.
3. dissektion av hjärtat
- Vid tidpunkten för offer, anestethize möss med 80-100 mg/kg av Zoletil som ges intramuskulärt. Zoletil inducerar djup anestesi. Obs: Kontrollera att möss är på en tillräckligt djup av anestesi före utför procedurer genom att testa pedal och palpebrala reflexer; möss kommer vara perfusion medan djupt sövda. Öppna brösthålan, använda sax och pincett, genom att skära revbenen sidled till bröstbenet, med bröstbenet att vara indragen mot huvudet.
- BEGJUTA mus via vänster kammare av gravitation perfusion system med 10-15 mL iskallt Dulbeccos fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) och sedan med 40-50 mL i 10% neutral buffrad formalin fixar kärlsystemet. Fixering är indicerat när möss uppvisar kraftiga muskelsammandragningar och blir stela.
Obs: Fastställande processen sker i 10-20 min. Det är möjligt att använda fasta organ och vävnader för att utföra immunofluorescens eller immunohistokemi analyser. Viktigast av allt, kan inte sådana fasta vävnader användas för genuttryck och western blotting analyser. - Separata hjärtat från aorta genom att hålla hjärtat med tången och klippa med sax eller en skalpell blad, vinkelrätt mot aorta, så nära som möjligt till hjärtat utan att skada (figur 2A) axel. Använd en skalpell kniv för att skära tvären längs en rät linje som ansluter till de lägsta punkterna av höger och vänster förmak (figur 2B).
- Fyll den övre delen av sektionerad hjärtat (genom hålighet i hjärtat) med optimal styckning förening (ULT) (figur 2D-2E). Sätta vävnaden inom en cryosection plast mögel med axeln av aorta placeras vinkelrätt till basen av den rektangulära formen och täck med OCT (figur 2F). Det bör finnas inga luftbubbla instängd. Om någon bubbla är närvarande, försöka tränga undan den till kanten.
- Placera en metallplatta på torris och sedan försiktigt lägga mögel på (figur 2 g). När ULT blir vit, wrap formen med silverfolie och sedan förvaras vid – 80 ° C.
4. skär delar av aortaroten
- Ställ kryostaten machine till – 20 ° C. Innan kapning, placera den inbäddade vävnaden och lämna den där i ca 15 min att anpassa sig till denna temperatur. Ställa in preparatet innehavaren temperaturen till-17 ° C (figur 3A).
- Placera den frysta hjärtblock inuti kryostaten maskinen att temperera temperaturen på blocket att det av kryostaten (figur 3B) och ta ut den frysta hjärtblock från mögel (figur 3 c). Skär den överskjutande OCT från frysta blocket för att bättre anpassa block dimensioner till preparathållaren (figur 3D).
- Montera den frysta hjärtblock på preparathållaren orienterade med ventrikulära riktad utåt (figur 3E-3I) och sätt in preparathållaren i preparatet orientera huvudet (figur 3J). Justera orienteringen för preparathållaren att tillåta styckning av block för att göra aortaroten vinkelrätt mot bladet (figur 3 K).
- Skär blocket och kassera skivor tills aortaroten uppnås (figur 3 L-3N). Samla in följetong sektioner och placera dem på glasskivor (figur 3O). Övervaka aortaroten anatomiska profilen under mikroskopet tills alla 3 aorta ventiler visas (figur 3 P-3Q).
- Samla in avsnitt 10 µm/sektionen för olja röd O och Picro Sirius röd färgning och 6 µm/avsnitt för MAC3 färgning (figur 3R). Samla runt 6-8 bilder (för varje hjärta) tills en av de tre ventilerna försvinner eller är inte längre intakt.
5. immunohistokemi
Obs: Alla färgning steg redovisas i följande protokoll genomförs i glasburkar Coplin färgning.
-
Röd O oljefläck för neutrala fetter
- Fixa avsnitt i 70 mL av 37% formaldehyd i 5 min. Tvätta väl i kranvatten och torka av överflödigt vatten.
- Späd 48 mL olja röd O (0,5% i isopropanol) i 32 mL destillerat vatten för att få olja röd O 0,3%.
- Fläcken sektioner i 70 mL olja röd o 0,3% för 10 min. Tvätta sektioner i kranvatten i 10 min.
- Fläcken för 1 min i 70 mL av Mayers Hematoxylin. Tvätta sektioner i kranvatten i 1 min.
- Sänk ner avsnitt i 70 mL 0,5% litiumkarbonat. Tvätta i vatten i 1 min.
- Montera sektioner med en vattenlösning montering medium och fånga bilder med en digital kamera monterad på ett ljusmikroskop.
-
Picro Sirius röda fläcken för kollagen
- Skär 10 µm fryst sektioner och montera i botten av bilden.
- Fixa avsnitt i 70 mL aceton i 5 min, lufttorka och skölj hastigt i destillerat vatten.
- Placera sektioner i 70 mL 0,2% phosphomolybdic syra för 5 min. Skölj hastigt i destillerat vatten.
- Placera sektioner i 70 mL 0,1% Picro Sirius lösning för 90 min. Skölj en gång med 70 mL 0,01 N HCl. Kassera.
- Plats i 70 mL 0,01 N HCl för 2 min. Skölj kort i destillerat vatten. Lufttorka.
- Plats kort i 70 mL 70% etanol.
- När helt torr, placera i 70 mL clearing agent av terpen ursprung och montera sektioner med poly (butyl form -co-metylmetakrylat) baserat montering medium och fånga bilder med en digital kamera monterad på ett ljusmikroskop.
Obs: En av fördelarna med Picro Sirius röda färgningen är att det är möjligt att skilja typ I (tjocka fibrer, gul-Orange Dubbelbrytning) och typ III (tunna fibrer, grön Dubbelbrytning) kollagen fiber nätverk av polariserat ljusmikroskop11 .
-
Mac3 fläcken för makrofag färgning
- Skär 6 µm fryst sektioner och montera i botten av bilden.
- Fixa avsnitt i 70 mL kall aceton för 5 min. Sänk i 70 mL PBS i 2 min.
- Med pipett täcka delar med 1% sodium dodecyl sulfate (SDS) lösning och inkubera i 5 minuter i rumstemperatur (RT) för antigen retrieval. Uppslukas av 70 mL PBS för 5 min.
- Med pipett täcka skivor med 0,3% väteperoxid för 20 min. tvätta i 70 mL PBS 3 gånger för 5 min.
- Använd metoden-Biotin komplex (ABC)-HRP Kit för följande steg.
- Med pipett blockera sektioner i normalt kaninserum i rumstemperatur i 20 min. Skölj inte ut.
- Fläcken med MAC3 (1:300) för 90 min. vid RT. Wash i 70 mL PBS 3 gånger för 5 min.
- Fläcken med sekundär-biotinylerade anti råtta IgG (1: 200) för 45 min på RT. Skölj med 70 mL PBS 3 gånger för 5 min.
- Täcka avsnitten med kanin IgG ABC för 30 min på RT. Skölj med 30 mL PBS 3 gånger för 5 min.
- Täcka avsnitten med 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) för 10 min. Skölj med 70 mL destillerat vatten för 10 gånger.
- Fläcken för 1 min i 70 mL av Mayers Hematoxylin. Tvätta sektioner i kranvatten i 1 min.
- Fördjupa sektioner i 70 mL 0,5% litiumkarbonat. Tvätta i vatten i 1 min.
- Montera sektioner med en vattenlösning montering medium och fånga bilder med en digital kamera monterad på ett ljusmikroskop.
6. bildanalys av aterosklerotiska lesioner i aortaroten sektioner
Obs: Aortaroten sektioner färgas med Oil Red O eller MAC3 eller en antikropp av intresse kan analyseras med hjälp av lämplig programvara (anges i Tabell för material). Totalt antal bildpunkter färgning positivt för komponenten av intresse är normaliserat till området övergripande plack. Bilder samlades in och analyseras av en behandling-blindad utredare.
-
Kalibrering
- Öppna programvaran och välj sedan bilden (i jpg) analyseras.
- Välj den hem | Skapa | Snabb kalibrering.
- Ställa in kalibreringen av bilden genom att dra en linje längs skalstapeln av bilden.
- Spara inställningen av kalibrering.
-
Bildanalys
- Välj den sparade inställningar kalibreringen menyn alternativ | Rumsliga kalibrering alternativet.
- Välj kalibrering | Tillämpas.
- Välj polygonverktyget på menyn Välj och rita omkretsen längs alla aterosklerotiska lesioner.
- Välj Antal/storlek | Typer. På menyn Lägg till området och Procent.
- Antal/storlek på menyn öppnas Välj Manual och ett nytt fönster.
- Från det här fönstret Klicka på verktyget Välj färg på bilden och välj HSI läge.
- Peka muspekaren på positiva pixlar av marker av intresse att skapa ett utbud av färger.
- Klicka på räkna och värdet summan, observerats i Mätning tabellanger procentandelen av arealen på markören (också uttryckt i µm2) med avseende på den totala arealen av aterosklerotiska lesioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I 8-10 veckor Apo- / - möss, men framförallt minipumpar var inopererad för att ingjuta med fordon eller aldosteron (figur 1E-1I) och matas en aterogena kost (justerade kalorier diet 42% från fett) i 4 veckor. I slutet av behandlingen, var möss avlivas och perfusion med PBS och 10% formalin som beskrivs ovan. Aortaroten skildes från den apikala delen av hjärtat och var inbäddade i okt (figur 2). Tvärsnitt av aorta rötterna var förberedda för olika färgning med hjälp av en kryostaten maskin (figur 3).
Aterosklerotiska plack sammansättning kan karakteriseras genom färgningen för specifika komponenter, som definierar utvecklingsstadiet plack. Olja röd O färgning används för att bestämma fettinnehållet av aterosklerotiska lesioner som beskrivs i steg 5.1, Picro Sirius röd färgning används för att bestämma kollagenhalten som beskrivs i steg 5.2 och Mac3 färgning är anställd att mäta makrofag innehåll beskrivs i steg 5.3. Efter 4 veckors behandling med aldosteron, möss visas en betydande ökning i lipid (figur 4A-4 C) och makrofag innehåll (figur 4 d-4F) i aterosklerotiska plack på nivån aortaroten, men inga skillnader var observerats i kollagenhalten (figur 4 g-4I) jämfört med möss som behandlats med fordonet. Faktiskt, aldosteron accelererade aterogenes i denna modell, förmå vaskulär inflammation men inte fibros (figur 4).
Figur 1. Förberedelser och implantation av osmotisk minipump med fordon eller aldosteron. A-B) steg för att fylla osmotisk men framförallt minipumpar med fordon eller aldosteron. C) steg till nära kroppen av pumpen med en flödesregulator. D-F) Steg för att skapa ett snitt för implantation av pumpen på baksidan av musen. G-jag) Implantation av osmotisk minipump och suturering av snitt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Förbereder hjärta och aortaroten för inbäddning och snittning. A-B) hjärtat skärs tvären längs en rak linje som ansluter till de lägsta punkterna av höger och vänster förmak. Den apikala delen av hjärtat bearbetas för att kvantifiera aterosklerotiska lesioner sammansättning i aortaroten. C) aortaroten från inne i hjärtat. D-E) Fyllning av hjärtat hålrummet med OCT. F) orientering av dissekerade hjärtat i en mögel förfylld med OCT (med hjärtat hålrummet i riktning mot botten av mögel) G) frysning av dissekerade hjärtat med OCT i mögel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Snittning av aortaroten använder en kryostaten mikrotomen. (A) pre cool kryostaten och Ställ in rätt temperatur för maskin och chuck. B-D) Fast OCT block avskiljs från mögel och överflödig ULT runt hjärtat elimineras med hjälp av ett blad. E-jag) Block av OCT är fast, med flytande okt, på stöd. J-K) Stödet är isatt i chucken och orienterade med ventrikulära riktad utåt. L-M) Avsnitt blocket tills dissekerade hjärtat är helt utsatt. N-O) Ange tjocklek 10 eller 6 µm och samla skivor på glaset. P-Q) Kontrollera förekomsten av alla tre ventiler under mikroskopet. R) efterföljande skivor samlas, som visas, tills en eller flera ventiler inte observeras längre. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Kvantifiering av aterosklerotiska plack sammansättning i aldosteron eller fordons-behandlade ApoE- / -. A-B) representativa röd olja O målat tvärsnitt av aortaroten i 8-10 vecka-gamla ApoE- / - möss behandlades med fordon (A) eller aldosteron (B) och ges en aterogena kost i 4 veckor. C) kvantifiering av fetthalten som procentandel av positiv färgning/total plack. D-E) Representant Mac3 målat tvärsnitt av aortaroten. F) kvantifiering av makrofag innehåll som procentandel av positiv färgning/total plack. G-H) Representativ Picro Sirius röd färgade tvärsnitt av aortaroten. jag) kvantifiering av kollagen innehåll som en procentandel av positiv färgning/total plack. Värdena uttrycks som menar ± medelfel menar (SEM; n = 6 för varje grupp). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Åderförkalkning är en kronisk inflammatorisk sjukdom som är associerad med stora och medelstora fartyg som berör samspelet mellan flera celltyper, såsom makrofager, T-lymfocyter, endotelceller och smidig muskel celler1. Trots begränsningarna av murina aterogena modeller finns en stor mängd bevis på den aterosklerotiska processen. Dessa modeller har fördelen att snabbt generera experimentella kohorter av en viss ålder och kön. Möss visar också en avgränsad och homogen genetiska bakgrund.
Utvecklingen av aterosklerotiska plack, observerats i musmodeller benägna att åderförkalkning, delvis liknar som observerats hos försökspersoner, med undantag för instabila plack bildning4. Plack bristning och efterföljande trombos, den främsta orsaken till hjärtinfarkt hos människa har inte observerats i murina aterogena modeller. I våra senaste papper, vi visade att infusion av aldosteron är kunna inducera, efter 4 veckor, en instabila plack fenotyp i ApoE- / -möss matas en HFD10. Denna behandling är i själva verket kunna öka plack område, fetthalten och inflammatoriska området på aortaroten nivå, med ingen signifikant skillnad i kollagen innehåll jämfört med obehandlade möss10. Notera visar dessa möss ökad utveckling av hypertoni-oberoende åderförkalkning, med tanke på att blodtrycket inte var signifikant förändrad av aldosteron behandling10.
I det nuvarande manuskriptet illustrerar vi i detalj det tekniska förfarandet för att bädda in hjärtat vävnaden i okt samt den sekventiella steg, dvs aortaroten snittning och plack analys. Jämfört med paraffin, gör OCT avsnitt beredningen med en hög mängd tjocklekar (1-100 µm) med kryostaten mikrotomen och minimal vävnad behandling. Begränsningar kan omfatta kvaliteten på fryst vävnad, som är potentiellt påverkade av bildandet av iskristaller och ändra subcellulär detaljer och generera artefakter kan upptäckas genom immunohistological färgning. Faktiskt, frysförvaring är tänkt att bättre bevara antigen och antigenicitet. I själva verket bevara frysta vävnader strukturen av antigener. Dessutom tillåter fryst vävnad behandling för immunohistokemi för att undvika användning av formalin, som är en förening som giftiga och cancerframkallande.
Aortaroten är en webbplats som är relativt enkelt att identifiera för histologisk bearbetning. Denna anatomiska webbplats är en guldmyntfot att studera aterosklerotiska lesion utveckling hos möss benägna till åderförkalkning. Data som erhållits genom analys av denna specifika region göra jämförelser bland möss som tillhör samma grupp eller till olika experimentella grupper. I själva verket vid snittning av aortaroten, är det lätt att känna igen en specifik region som kännetecknas av närvaron av alla tre ventiler. För att erhålla en så specifik region, rekommenderas det strängt att ägna särskild uppmärksamhet åt flera kritiska steg under inbäddning och snittning. Det är viktigt att fylla hålrummet i den övre delen av sektionerad hjärtat med OCT att undvika bildandet av luftbubblor i vävnaden som kan äventyra integriteten i avsnitten. För att säkerställa att skärvinkel exakt vinkelrätt mot aorta ascendens vid snittning, är det vidare nödvändigt att korrekt rikta övre sektionerad hjärtat vinkelrät mot undersidan av vävnad mögel. För att erhålla intakta skivor, bör kryostaten temperatur vara exakt vid-20 ° C. I själva verket en lägre temperatur kan äventyra kvaliteten på sektioner (dvs bladet kunde smula avsnitten vilket gör dem oanvändbara).
Notera, när tre ventilerna visas, rekommenderas det att skära vävnaden med olika tjocklekar, beroende på vilken typ av analys som ska utföras. I själva verket, vissa bilder kommer att användas för bestämning av plack progression, medan de återstående bilderna kan användas för olika färgningar (dvs., Picro Sirius, Mac3, etc.).
Aterosklerotiska lesioner hos möss som behandlats med aldosteron visas rik på lipider och makrofager kännetecknas av användningen av olja röd O (för lipid färgning), Mac3 (för makrofag färgning), Sirius röd (för färgningen av kollagen) eller andra specifika antikroppar för proteiner av intresse. Det är viktigt att framhålla att OCT inbäddning, till skillnad från paraffin inbäddning, undviker användningen av organiska lösningsmedel som ta bort fettinnehållet av lesioner. Därför lipid färgning med Oil Red O är genomförbart i OCT-embedded sektioner och fettinnehållet i aterosklerotiska plack kan kvantifieras just.
I det nuvarande manuskriptet visade vi att aldosteron infusion är en värdefull metod att främja åderförkalkning hos ApoE- / - möss. In fact, aldosteron infusion i ApoE- / - möss är att: 1) öka aktiveringen av endotelceller, vilket framgår av det ökat uttrycket av molekyler involverade i vidhäftning och migration av monocyter i ett tidigt skede av aterosklerotiska plack bildandet12,13. och 2) öka lipid- och pro-inflammatoriska makrofager innehåll aortaroten nivå10,13. Dessa effekter är inte på grund av hemodynamiska effekterna av aldosteron10. Sammanfattningsvis, representerar föreslagna protokollet en giltig metod för att generera och kännetecknar ateroskleros i möss; Detta skulle kunna övervaka tidiga stadier av sjukdomen och resultat av terapeutisk intervention och rehabilitering i åderförkalkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av bidrag från italienska hälsoministeriet (Ricerca Corrente, GR-2009-1594563 och PE-2011-02347070 till M.C.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjusted calories diet (42 % from fat) | Envigo | TD.88137 | atherogenic diet |
| Osmotic minipump with filling tube | Alzet | model 1004 | for continous realase |
| Aldosterone | SIGMA | A9477 | hormone |
| Ethanol | SIGMA | 34852-M | solvent |
| Alchol Preps saturated with 70 % Isopropyl Alcohol | Kendal Webcol | 6818 | Disinfectant |
| Surgery wire (Vicryl 6.0) | Demas | 500004 | surgery |
| 10% Povidone/iodine ointment | Aplicare-Meriden | 52380-0026-1 | Antiseptic |
| Formalin 10% | SIGMA | HT5012 | to fix vascolature |
| Cryomold | Bio-Optica | 07-MP1515 | for embedding |
| O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | for embedding |
| Cryostat | Leica | CM1900 | instrument for sectioning |
| Dulbecco's Phosphat Buffered Saline | Aurogene | AU-L0615-500 | buffer solution |
| Adhesion Slides Polysine | VWR | 631-0107 | microscope glasses |
| Cover Glasses | Bio-Optica | 72015 | cover glasses |
| Formaldehyde 37% | SIGMA | 252549 | solvent |
| Oil Red O solution (0.5 % in isopropanol) | SIGMA | O1391 | staining solution |
| Mayer’s Hematoxylin | SIGMA | MHS32 | staining solution |
| Lithium Carbonate | SIGMA | 62470 | washing buffer |
| Acqueous Mounting Medium | Thermo Scientific | TA-125-AM | mounting solution |
| Acetone | SIGMA | 179124 | solvent |
| Phosphomolybdic acid solution | SIGMA | HT153 | for hystology |
| Direct Red 80 (Picrosirius Red) | SIGMA | 365548 | staining solution |
| Bio Clear (clearing agent of terpene origin) | Bio-Optica | 06-1782D | product for the preparation of histological samples |
| Eukitt Quick Hardening mounting medium (Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | SIGMA | 3989 | mounting solution |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fluka | 71725 | powder |
| Hydrogen Peroxide solution (30 %) | SIGMA | H1009 | solution |
| Vectorstain ABC KIT including: anti-rabbit IgG ABC, normal rabbit serum, Secondary-biotinylated Anti-Rat IgG , | Vector Laboratories | PK-6100 | staining solution |
| 3-amino-9-ethylcarbazole | Vector Laboratories | SK-4200 | staining solution |
| Mac3 antibody | BD Biosciences | 553322 | antibody |
| ImagePro Premier 9 | Media Cybernetics | 050910000-2534 | software to analyze images |
References
- Ross, R. Atherosclerosis--an inflammatory disease. New England Journal of Medicine. 340 (2), 115-126 (1999).
- Lafont, A. Basic aspects of plaque vulnerability. Heart. 89 (10), 1262-1267 (2003).
- Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal models of atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (5), 1104-1115 (2012).
- Bentzon, J. F., Falk, E. Atherosclerotic lesions in mouse and man: is it the same disease? Current Opinion in Lipidology. 21 (5), 434-440 (2010).
- Getz, G. S., Reardon, C. A. Do the Apoe-/- and Ldlr-/- Mice Yield the Same Insight on Atherogenesis? Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (9), 1734-1741 (2016).
- Emini Veseli, B., et al. Animal models of atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).
- Schwartz, S. M., Galis, Z. S., Rosenfeld, M. E., Falk, E. Plaque rupture in humans and mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (4), 705-713 (2007).
- de Rita, O., Hackam, D. G., Spence, J. D. Effects of aldosterone on human atherosclerosis: plasma aldosterone and progression of carotid plaque. Canadian Journal of Cardiology. 28 (6), 706-711 (2012).
- Ivanes, F., et al. Aldosterone, mortality, and acute ischaemic events in coronary artery disease patients outside the setting of acute myocardial infarction or heart failure. European Heart Journal. 33 (2), 191-202 (2012).
- McGraw, A. P., et al. Aldosterone increases early atherosclerosis and promotes plaque inflammation through a placental growth factor-dependent mechanism. Journal of the American Heart Association. 2 (1), e000018 (2013).
- Rittie, L. Method for Picrosirius Red-Polarization Detection of Collagen Fibers in Tissue Sections. Methods in Molecular Biology. 1627, 395-407 (2017).
- Caprio, M., et al. Functional mineralocorticoid receptors in human vascular endothelial cells regulate intercellular adhesion molecule-1 expression and promote leukocyte adhesion. Circulation Research. 102 (11), 1359-1367 (2008).
- Marzolla, V., et al. Essential role of ICAM-1 in aldosterone-induced atherosclerosis. International Journal of Cardiology. 232, 233-242 (2017).
