Summary
Vi presenterer protokoller her for høy avkastning isolering av fysiologisk aktiv thylakoids og protein transport analyser for chloroplast twin arginine translokasjon (cpTat), sekretoriske (cpSec1) og signal anerkjennelse partikkel (cpSRP) stier.
Abstract
Chloroplasts er organelles i grønne planter ansvarlig for gjennomføring av mange viktige metabolske veier, spesielt fotosyntese. Chloroplasts, thylakoid membran systemet huser alle fotosynteseaktiviteten pigmentene, reaksjon center komplekser og de fleste av elektron bærere og er ansvarlig for lys-avhengige ATP syntese. Over 90% av chloroplast proteiner er kodet i kjernen, oversatt i stoffer, og deretter importeres til chloroplast. Ytterligere protein transport i eller over thylakoid membranen benytter en av fire translokasjon. Her beskriver vi en høy dekkevne metode for isolering av transport-kompetent thylakoids fra erter (Parlamentarisme sativum), samt transport analyser gjennom tre energi avhengig av cpTat, cpSec1 og cpSRP-mediert trasé. Disse metodene at eksperimenter vedrørende thylakoid protein lokalisering og transport energi mekanismer av protein translokasjon over biologiske membraner.
Introduction
Nesten alle proteinaceous maskiner ansvarlig for riktig chloroplast-funksjonen må være translocated fra stoffer1. På chloroplast konvoluttene importeres protein underlag gjennom translocon av den ytre membranen (Innholdsfortegnelsen) og translocon av indre membran (TIC)2. Videre målretting for thylakoid skjer membran og lumen gjennom twin arginine translokasjon (cpTat)3, sekretoriske (cpSec1)4, signalet anerkjennelse partikkel (cpSRP)5og spontan innsetting veier6 . En metode for høy avkastning isolering av fysiologisk aktive chloroplasts og thylakoid membraner er nødvendig for å måle energi og kinetics av en translokasjon hendelse, forstår de forskjellige transportmekanismene i hver veien og lokalisere en spesielle proteinet substrat av interesse for noen av de seks forskjellige avdelinger av chloroplast.
Isolasjon av membraner fra chloroplast gir bedre eksperimentelle kontroll over miljøfaktorer (for eksempel salt og underlaget konsentrasjoner, ATP/GTP, og pH forhold) som påvirker måling av transport energi og Kinetics. Dette i vitro miljø gir seg til utforskning av mekanistisk detaljer om translokasjon av samme grunn. I tillegg, mens prognosen programvare for lokalisering av chloroplast proteiner har forbedret7,8, gir i vitro transport analyser en raskere metode for bekreftelse over mikroskopi-baserte fluorescerende analyser som kreve en genetisk kodet fluorescerende kode, plante transformasjon og/eller spesifikke antistoffer. Her presenterer vi protokoller for chloroplast og thylakoid isolasjoner fra erter (Parlamentarisme sativum) og transport analyser optimalisert for hver av energi-avhengige thylakoid translokasjon veier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. første materialer
- Suge ca 55 g av erter i 3 timer i 400 mL destillert vann og deretter purke i en plast brett (35 cm x 20 cm x 6 cm) i jorda dekket med tynt lag av vermikulitt.
- Vokse skuffen av erter ved 20 ° C under 12/12 h lys/mørke (50 µE/m2s) syklus for 9 til 15 dager.
- Forberede protein substrat etter en foretrukket metode.
Merk: Vi har forberedt protein underlag bruker en rekke metoder, inkludert 1) i vitro transkripsjon fra renset plasmider etterfulgt av oversettelse hvetespirer ekstrakter eller kanin retikulocytt lysates i nærvær av [3H]-leucine eller [35S]-metionin, 2) i vitro oversettelse med en kombinert transkripsjon/oversettelse kit som TnT prosjektpakker fra Promega, med radiolabeling som ovenfor og 3) rensing av overexpressed protein i E. coli. Radioaktivt i vitro oversettelsen produkter er generelt slukket med 50 mM kaldt aminosyre før å bruke i transport reaksjoner. Hver av disse metodene krever vanligvis noen optimalisering for hver nye protein substrat. Et eksempel på et kombinert i vitro system, se Ling og Jarvis (2016)9.
2. chloroplast isolasjon og kvantifisering
Merk: Det første trinnet i utarbeidelse av thylakoids er isolering av intakt chloroplasts10. Alt materiale bør holdes kaldt under forberedelse. Rørets av chloroplasts bør håndteres forsiktig, som brudd på dette trinnet kan sterkt begrense etterfølgende thylakoid avkastning.
- Forberede etter løsninger på forhånd.
- 2 x Grinding Buffer (2xGB): 100 mM K-HEPES pH 7.3, 660 mM sorbitol, 2 mM MgCl2, 2 mM MnCl2, 4 mM EDTA, 0,2% BSA.
- 2 x Import Buffer (2xIB): 100 mM K-Tricine eller K-HEPES pH 8.0, 660 mM sorbitol, 8 mM MgCl2.
Merk: Konsentrasjoner av MgCl2 mellom 3 mM 10 mM har vært brukt uten observerbare forskjeller.
- Forbered en kontinuerlig tetthet gradert ved sentrifugering en blanding av 15 mL Percoll og 15 mL 2xGB 30,900 g i en fast vinkel rotor i 30 min på 4 ° C med bremsen av.
- Høste ca 25 g av 9-15 dager gamle erter og homogenize i 95 mL av 1xGB. En blender med skjerpet blader eller en Polytron har blitt brukt med hell. Filtrere denne blandingen gjennom minst 2 lag av Miracloth i en trakt.
Merk: Begrense mengden av stammen vev er ikke nødvendig, men kan gjøre homogenisering prosessen enklere, og dermed redusere chloroplast brudd som kan oppstå med langvarig blanding. - Pellets 3000 g i en svingende bøtte rotor i 5 min på 4 ° C, og forsiktig resuspend i 1 mL av 1xGB. En pensel kan være den mest skånsomme rørets teknikken.
- Nøye laget grønne suspensjon på toppen av Percoll gradering og sentrifuger 8000 g i en svingende bøtte rotor i 10 min på 4 ° C med bremsen av.
- Nøye innhøsting lavere grønne bandet som inneholder intakt chloroplasts i en fersk rør. Spinne de gjenopprettede intakt chloroplasts 1800 g i en svingende bøtte rotor i 5 min på 4 ° C, forkaste nedbryting og forsiktig resuspend pellet i 1xIB. Repeter dette vask igjen, resuspending i 30 mL av 1xIB hver gang, med den siste rørets i 1 mL av 1xIB.
- For å kvantifisere klorofyll (Chl) innhold, bland 10 µL av fullt resuspended chloroplasts med 5 mL av 80% aceton og filtrere gjennom Whatman 1 filter papir (nominell tykkelse 180 µm). Posten absorbans ved 720 nm, 663 nm og 645 nm i et spektrofotometer og beregne Chl konsentrasjonen bruker følgende formel11:
[Chl] mg/mL = [40.2* (en663 -en720) + 101.4* (en645 -en720)] * 0,1 - Justere chloroplasts til 1 mg/mL Chl ekvivalenter med 1xIB.
3. isolering av Thylakoids
Merk: Thylakoids er utarbeidet av hypotonisk lysis av intakt chloroplasts. Dette oppnås ved å utsette chloroplasts en hypotonisk buffer mangler sorbitol. Isolerte thylakoids kan brukes for assaying noen av translokasjon veier, men stromal ekstrakt (SE) må også være isolert i løpet av dette preparatet Hvis enten cpSec1 eller cpSRP veier å bli undersøkt.
- Forberede forhånd følgende løsninger.
- Hypotonisk lyseringsbuffer: 50 mM K-Tricine eller K-HEPES pH 8.0, 8 mM MgCl2.
- 2 x råolje Stroma Buffer (for konsentrasjon av SE): 100 mM K-HEPES pH 8.0, 660 mM sorbitol, 8 mM MgCl2.
- Laemmli prøven Buffer (for SDS-side, supplert med EDTA): 125 mM Tris pH 6.8, 10% SDS, 20% glyserol, 0,05 mg/mL bromophenol blå, 10% β-mercaptoethanol, 10 mM EDTA.
- Hvis SE utvinning ikke er nødvendig, sentrifuge intakt chloroplasts 1000 g i en svingende bøtte rotor for 6 min på 4 ° C.
- Forkast nedbryting og resuspend til 1 mg/mL i hypotonisk lyseringsbuffer. Ruge på isen i mørket 10 min, med sporadiske miksing.
- Gjenopprette thylakoids ved sentrifugering 3200 g i svingende bøtte rotoren i 8 min på 4 ° C. Vask thylakoids to ganger, resuspending med 1 til 2 mL lyseringsbuffer hver gang. Resuspend med 1 mL av 1xIB og requantify Chl som ovenfor i chloroplast isolasjon protokollen.
4. stromal ekstrakt utvinning og konsentrasjon
- Hvis SE utvinning er nødvendig, del intakt chloroplasts i 600 µL dele i 1,5 mL microcentrifuge rør og sentrifuge hver rør på 1000 g i svingende bøtte rotoren for 6 min på 4 ° C.
Merk: Dette er praktisk når du bruker 1,5 mL microcentrifuge rør, som bidrar til å forhindre forstyrrelse av den endelige pellet for gjenværende membraner.- Resuspend til 1 mg/mL Chl i hypotonisk lyseringsbuffer og ruge på isen i mørket 10 min, som i trinn 3.2.1.
- Sentrifuge hver rør 3200 x g i svingende bøtte rotoren i 8 min på 4 ° C og overføre den lys grønn eller gul supernatant følgende chloroplast lysis til en ny microcentrifuge rør med en lik mengde 2 x råolje Stroma Buffer.
- Vask thylakoids med 2 mengder lyseringsbuffer (tilnærmet 0,5 mg/mL) og samle ved sentrifugering 3200 g i svingende bøtte rotoren i 8 min på 4 ° C. Resuspend til 1 mg/mL Chl i 1xIB på is.
- Sentrifuge råolje stroma 42 000 g i en fast vinkel rotor i 30 min på 4 ° C til å fjerne gjenværende membraner. Immunoblotting for ytre og indre konvolutt proteiner kan brukes til å bekrefte renheten av nedbryting.
- Samle 95% av volumet fra hver rør uten å forstyrre det liten gul-grønne pellet. Merk volumet fra hver rør.
- For å forberede konsentrert stromal ekstrakt (SE), basseng de innsamlede supernatants og konsentrere femling bruker en 4 mL 30 kDa MWCO konsentrator.
Merk: SE forberedt på denne måten er tilsvarende stroma avledet fra chloroplasts på 2,5 mg/mL Chl. Om nødvendig kan SE konsentrert ti-fold til 5 mg/mL Chl ekvivalenter. SE blir gylden farge og tyktflytende. Lab legenden RT sentrifuge med svingende bøtte rotoren, krever dette om 10 min per mL konsentrert.
5. transport gjennom cpTat veien
Merk: I motsetning til de cpSec1 eller cpSRP, cpTat veien krever ikke løselig komponenter eller exogenously lagt energikilder; bare motiv lys-drevet proton er nødvendig3. Derfor bare isolert thylakoids og underlaget protein kreves for analysen. Typisk underlag er mellomliggende former for den 17 kDa (som sett i figur 1) og 23 kDa underenheter av oksygen utvikling komplekse, iOE17 og iOE23, henholdsvis, men forløperen skjemaer, prOE17 og prOE23, kan også vellykket transporteres. Forløperen skjemaer har hele bipartite N-terminal målretting sekvensen, mens middels skjemaer har bare thylakoid målretting sekvens.
- Forberede cpTat transport blanding med 0,33 mg/mL Chl thylakoids, 5 mM ATP fra et lager i 1xIB, og 8 mM dithiothreitol (DTT) fra et lager i 1xIB, på is. ATP er ikke strengt nødvendig for denne reaksjonen hvis utført under belysning.
- Starte transport ved å innføre 1:30 volum for volum substrat protein i transporten bland. Hvis underlaget protein ikke er utarbeidet i 1xIB, forberede en 1:1 fortynning med 2xIB først, deretter bruke 1:30 volum for volum av utvannet underlaget i transport mix.
Merk: Konsentrasjoner av underlaget vil variere avhengig av metoden forberedelse. Vanligvis vil i vitro forberedelser tillate nanomolar å micromolar beløp, mens overuttrykte vil tillate micromolar til millimolar beløp. Gjenkjenningsmetoder må også betraktes som autoradiography og fluorography er mer følsom enn immunoblotting. - Belyse suspensjonen i 80-100 µE/m2s Fotosyntetisk aktiv stråling (PAR) i 10 min ved romtemperatur. Hvis transport kinetikk, pre equilibrate både thylakoids og reaksjonen blandingen til romtemperatur og lyse i opptil 30 min.
- Stoppe transport reaksjon med en 8-fold fortynning av iskalde 1xIB og gjenopprette thylakoids ved sentrifugering 3200 g i microcentrifuge i 5 min på 4 ° C.
- Fjern gjenværende substrat som ikke har blitt transportert, resuspend thylakoid pellets i 120 µL av 1xIB og fordøye eksterne protein av tillegg av 6 µL av 2 mg/mL thermolysin og 10 mM CaCl2 i 1xIB.
- Inkuber protease reaksjonen på is 40 min, og deretter slukke protease ved å doble volumet med 25 mM EDTA i 1xIB.
- Gjenopprette thylakoids ved sentrifugering 3200 g i en microcentrifuge for 5 min på 4 ° C. Vask gjenopprettede thylakoids i 120 μL 5 mM EDTA i 1xIB og overføre til en ny tube.
- Sentrifuge 3200 g i en microcentrifuge for 5 min på 4 ° C. Resuspend i en passende mengde Laemmli eksempel Buffer med 10 mM EDTA. Et volum på 40 µL er vanligvis nok å oppdage substrat på en SDS side gel og sparer utvalg for gjenta gels når det er nødvendig.
- Sett prøvene i kokende vannbad for 10 min og analysere SDS-side. Autoradiography, fluorography eller vestlige blotting ikke eller epitope-merket proteiner har blitt brukt for påvisning av transportert proteiner.
6. transport gjennom cpSec1 veien
Merk: Transport gjennom cpSec1 translocon krever stromal protein cpSecA112,13, som kan være anskaffet via overuttrykte i E. coli14,15 eller gjenopprettes ved å konsentrere stroma under thylakoid isolasjon. En typisk underlaget er 33 kDa delenhet i oksygen utvikling komplekse (prOE33), som vist i figur 2.
- Klargjør cpSec1 transport blandingen med 0,33 mg/mL Chl thylakoids, 0,83 mg/mL Chl tilsvarende SE eller 1,5 μg rekombinant cpSecA1 og 5 mM ATP på is, og ruge i 10 min. En typisk transport reaksjonsblandingen her er 72 μL, opp fra 60 μL grunn SE tillegg.
- Hvis rekombinant cpSecA1 skal brukes i stedet for SE, justere renset cpSecA1 med et likt antall 2xIB og fortynne til en praktisk konsentrasjon legge til transport reaksjoner (f.eks 0,75 µg/µL).
Merk: For langtidslagring, cpSecA1 er lagret på isen i et kontrollert, nedkjølt rom etter rensing som fryser opphever aktivitet.
- Hvis rekombinant cpSecA1 skal brukes i stedet for SE, justere renset cpSecA1 med et likt antall 2xIB og fortynne til en praktisk konsentrasjon legge til transport reaksjoner (f.eks 0,75 µg/µL).
- Starte transport ved å innføre 1:10 volum for volum substrat protein til transporten bland. Hvis underlaget protein ikke er forberedt i 1xIB, forberede en 1:1 fortynning med 2xIB og legge til 1:10 volum for volum av utvannet protein til transport mix.
- Inkuber reaksjonen ved romtemperatur for 10 min under 80-100 µE/m2s PAR. Igjen, lengre tid kan være nødvendig for kinetics eller visse underlag.
- Etter lys behandling, fortynne 8-fold med iskald 1xIB og sentrifuger reaksjoner på 3200 g i microcentrifuge i 5 min på 4 ° C.
- Behandle med thermolysin og slukke med EDTA som ovenfor i trinn 5.5 gjennom 5.7.
- Sentrifuge 3200 g i microcentrifuge i 5 min på 4 ° C og resuspend pellet i en passende mengde Laemmli eksempel Buffer med 10 mM EDTA. Plasser i kokende vannbad for 10 min før lasting på SDS side gel.
7. innsetting gjennom cpSRP veien
Merk: CpSRP-mediert integrering av lys høsting komplekse proteiner (LHCP) i Figur 3 krever cpSRP54, cpSRP43 og cpFtsY16. Disse komponentene er gitt til transport reaksjonen gjennom konsentrert stromal ekstrakt, som cpSec1 transportprotokoll.
- Forberede cpSRP transport blanding med 0,33 mg/mL Chl thylakoids og 0,83 mg/mL Chl tilsvarende SE 5 mM ATP på is og ruge i 10 min.
- Starte transport ved å innføre 1:10 volum for volum substrat protein til transporten bland. Hvis underlaget protein ikke er forberedt i 1xIB, forberede en 1:1 fortynning med 2xIB og legge til 1:10 volum for volum av utvannet protein til transport mix.
- Inkuber reaksjon ved romtemperatur for 10 min i 80-100 µE/m2s PAR.
- Etter lys behandling, fortynne 8-fold med iskald 1xIB og sentrifuger reaksjoner på 3200 g i microcentrifuge i 5 min på 4 ° C. Forkast nedbryting og resuspend pellet i 120 µL av 1xIB.
- Behandle med thermolysin som ovenfor i delene 5.5 gjennom 5.7. Thermolysin fordøyelsen er nødvendig her å vurdere vellykket membran integrering. Vask gjenopprettede thylakoids i 120 μL 5 mM EDTA i 1xIB og overføre til en ny tube.
- Sentrifuge 3200 g i microcentrifuge i 5 min på 4 ° C og resuspend pellet igjen i en passende mengde 2 x Laemmli buffer med 10 mM EDTA. Plasser i kokende vannbad for 10 min før analyse av SDS-side.
Merk: Integrering av eldre LHCP (mLHCP) er vurdert av utseendet på et protease-beskyttet fornedrelse produkt (mLHCP-D) ca 1,5-2 kDa mindre enn de uncleaved mLHCP17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å måle mengden av underlaget ble transportert, er det nyttig å inkludere én eller flere "prosent input" baner. 10% av den endelige transport reaksjonen uten thylakoids ble brukt for dataene nedenfor. Denne "prosent input" bidrar også til å visualisere størrelsen på forløper underlaget. Prosentandelen representerer en kjent, definert mengde substrat som å sammenligne transportert substrat mot og kan skaleres opp eller ned som nødvendig bruker først forberedt protein. I tillegg er det tilrådelig å laste mindre enn 4 µg av Chl ekvivalenter i samme kjørefelt på 0,75 mm polyakrylamid gels å unngå fordreining og smøre. Alle underlag nedenfor ble utarbeidet og radiolabeled bruker i vitro oversettelse kits.
Transport av iOE17 gjennom cpTat veien
Figur 1 . Transport av iOE17through cpTat veien. Fluorograph [3H]-iOE17 transport analysen og thermolysin behandling av ikke-transportert substrat. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Vellykket cpTat transport av de fleste Tat underlag kan registreres i en størrelse skifte på spalting av N-terminal signal peptid3. I underlag der ingen cleavable signal peptid finnes18,19, er protease behandling nødvendig å avsløre underlaget som krysset membranen, og dermed blir utilgjengelig for fordøyelsen av protease. I figur 1, transport av iOE17 gir et størrelse skifte til ca 2-3 kDa mellom introdusert underlaget og de eldre behandlet skjemaet. Non-transportert underlaget er degradert gjennom protease behandling (lane 4).
Transport av prOE33 gjennom cpSec1 veien
Figur 2 . Transport av prOE33 gjennom cpSec1 sti. Autoradiograph [35S]-prOE33 transport analysen bruker SE, renset cpSecA1 eller begge samtidig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Transport gjennom cpSec1 sti (figur 2) kan vurderes gjennom et størrelse skifte i eldre underlaget hvis underlaget inneholder en cleavable thylakoid målretting signal, samt protease beskyttelse transportert substrat20.
Integrering av prLHCP gjennom cpSRP veien
Figur 3 . Integrering av prLHCP gjennom cpSRP sti. Autoradiograph [35S]-prLHCP og fordøyelse til produktet mLHCP-D etter innsetting thylakoid membranen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Innsetting av prLHCP i thylakoid membranen via cpSRP veien kan evalueres gjennom thermolysin fordøyelsen. En størrelse skifte av ca 1,5-2 kDa er et tegn på vellykket membran innsetting som membranen beskytter uncleaved eldre protein komplett proteolyse15. I Figur 3er protease-beskyttet produkt mLHCP-D klart synlig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Chloroplast og Thylakoid isolasjon
Overdreven brudd kan resultere i dårlig chloroplast isolasjon og dårlig thylakoid kapasitet etter separasjonen i forløpningen. Det er best å homogenize høstet vevet forsiktig ved å sikre at alt materiale er neddykket før blanding og pulserende i 15 s sykluser til fullt homogenisert. Om nødvendig kan du bruke flere kortere runder blanding med mindre vev i hver runde.
Kjøle alle materialer som kommer i kontakt med høstet vev hjelper isolert chloroplasts beholde aktivitet opp til 2 timer. Det er viktig å holde chloroplasts på isen i mørket etter isolasjon også.
Det er viktig å inkludere magnesium i buffere kontakter isolert thylakoids. Ikke gjør dette resulterer i granal destacking og påvirker kritisk generering av proton motiv kraft på belysning21. Thylakoids har blitt brukt i transport reaksjoner til 2 timer etter isolasjon når holdt på isen og i mørket.
Optimalisere Transport reaksjoner
Isolerte thylakoids betale raskt og kan føre til ulike Chl ekvivalenter mellom reaksjoner. Som sådan, er det viktig å blande thylakoids grundig før du bruker, særlig når du setter opp et stort antall eksempler.
Tat veien
Transport effektivitet gjennom Tat veien kan reduseres ved overdreven vask av thylakoids siden Tha4 (TatA) delvis kan hentes fra membranen22. I slike tilfeller er det nyttig for å redusere thylakoid vask trinnene før transport reaksjonen. Lengre belysning ganger kan i tillegg forbedre gjenkjenning der underlag dårlig transporteres under vanlige forhold.
CpSec1 veien
Når assaying cpSec1 veien, bør hvor mye cpSecA1 i konsentrert SE støtte transport, men at transport kan være svak. Effektiv transport i isolerte thylakoids kan nytte i tillegg renset cpSecA1 for visse proteiner, men stromal chaperones se kan også øke effektiviteten av transport15. Videre bør forberedelser cpSecA1 protein ikke være frosset før bruk i transport, som dette reduserer transport aktivitet. Tilsvarende er frosne SE mindre effektiv enn nylagde ekstrakt. Som Tat transport, kan lengre inkubasjon perioder transport blandingen hjelpe med vanskelige underlag.
CpSRP veien
Mens rekonstituering cpSRP transport bruker enkeltkomponenter har vært utført23, er det praktisk å levere cpSRP43, cpSRP54, og cpFtsY med SE. Thermolysin motstand er de strengeste vilkårene for LHCP integrasjon16, 17, men alkaliske utvinning kan utføres som vel17. Mens forløpere kan ofte frosset og lagret på-80 ° C for mange transport reaksjoner, bør prLHCP utarbeidet av i vitro syntese brukes til transport umiddelbart etter syntese uten frysing.
Karakterisering av en roman underlaget er målretting Pathway
I tilfeller der translokasjon veien tatt av en roman underlaget er ukjent, er det tilrådelig å først undersøke mulig signal peptider i sili bruker aminosyresekvens forløper eller mellomform. CpTat veien krever vanligvis en bestemt twin arginine konsensus motiv i signal peptid og ingen ATP vellykket transport under PAR3. I motsetning til Tat veien krever den cpSec1 sti ATP og cpSecA1 protein. Mislykkede transport forhold mangler disse komponentene antyder det cpSec1 sti20. CpSRP veien krever signal anerkjennelse partikkel funnet i SE. transportere renset cpSecA1 og ATP, men mangel på twin arginine konsensus motivet signal peptid, antyder cpSRP sti23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette manuskriptet var forberedt med finansiering av Division of kjemiske Sciences, Geofag og biovitenskap, 408 kontoret til energi basalfag av oss Department of Energy gjennom Grant DE-SC0017035
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pisum sativum seeds | Seedway LLC, Hall, NY | 8686 - Little Marvel | |
| Miracloth | Calbiochem, Gibbstown, NJ | 475855-1 | |
| 80% Acetone | Sigma, Saint Louis, MO | 67-64-1 | |
| Blender with sharpened blades | Waring Commercial | BB155S | |
| Polytron 10-35 | Fischer Sci | 13-874-617 | |
| Percoll | Sigma, Saint Louis, MO | GE17-0891-01 | |
| Beckman J2-MC with JA 20 rotor | Beckman-Coulter | 8043-30-1180 | |
| Sorvall RC-5B with HB-4 rotor | Sorvall | 8327-30-1016 | |
| 100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 12/3/83 | Can be frozen in aliquots for future use |
| 200 mM MgATP in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 74804-12-9 | Can be frozen in aliquots for future use |
| Thermolysin in 1xIB (2mg/mL) | Sigma, Saint Louis, MO | 9073-78-3 | Can be frozen in aliquots for future use |
| HEPES | Sigma, Saint Louis, MO | H3375 | |
| K-Tricine | Sigma, Saint Louis, MO | T0377 | |
| Sorbitol | Sigma, Saint Louis, MO | 50-70-4 | |
| Magnesium Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 7791-18-6 | |
| Manganese Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 13446-34-9 | |
| EDTA | Sigma, Saint Louis, MO | 60-00-4 | |
| BSA | Sigma, Saint Louis, MO | 9048-46-8 | |
| Tris | Sigma, Saint Louis, MO | 77-86-1 | |
| SDS | Sigma, Saint Louis, MO | 151-21-3 | |
| Glycerol | Sigma, Saint Louis, MO | 56-81-5 | |
| Bromophenol Blue | Sigma, Saint Louis, MO | 115-39-9 | |
| B-Mercaptoethanol | Sigma, Saint Louis, MO | 60-24-2 |
References
- Ellis, R. Chloroplast protein synthesis: principles and problems. Sub-cellular biochemistry. 9, 237 (1983).
- Li, H. -m, Chiu, C. -C.
- Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP. Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).
- Skalitzky, C. A., et al. Plastids contain a second sec translocase system with essential functions. Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).
- Dabney-Smith, C., Storm, A. Plastid Biology. , Springer. 271-289 (2014).
- Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. Distinct "assisted" and "spontaneous" mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).
- Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. hloroP. ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites. Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).
- Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nature protocols. 2 (4), 953 (2007).
- Ling, Q., Jarvis, R. Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants. Journal of Visualized Experiments. (117), e54717 (2016).
- Lo, S. M., Theg, S. M. Photosynthesis Research Protocols. , Springer. 139-157 (2011).
- Vernon, L. P. Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts. Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).
- Knott, T. G., Robinson, C. The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).
- Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting. Science. 266 (5186), 796-798 (1994).
- Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts. FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).
- Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).
- Luirink, J., Sinning, I. SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).
- Yuan, J., Henry, R., Cline, K. Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein. Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).
- Tjalsma, H., van Dijl, J. M. Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane. Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).
- Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life. Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).
- Yuan, J., Cline, K. Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity. Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).
- Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., Büchel, C. Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach. Biochemistry. 43 (45), 14508-14516 (2004).
- Frielingsdorf, S., Jakob, M., Klösgen, R. B. A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).
- Tu, C. -J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes. Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).
