Summary
Biz burada fizyolojik aktif thylakoids yüksek verimli izolasyon için protokoller ve protein taşıma deneyleri kloroplast ikiz arginin translocation (cpTat), salgı (cpSec1) ve sinyal tanıma parçacık (cpSRP) yolu için mevcut.
Abstract
Kloroplast vardır organelleri çok sayıda temel metabolik yollar, sorumlu yeşil bitkilerde fotosentez en önemlisi. Kloroplast içinde thylakoid membran sistemi ve fotosentetik pigment, reaksiyon merkezi kompleksleri ve elektron taşıyıcıları çoğu evler ışık bağımlı ATP sentezi için sorumludur. Kloroplast proteinlerin % 90'çekirdeğinde kodlanmış, sitozol tercüme ve daha sonra kloroplast ithal. Daha fazla protein taşıma içine veya thylakoid membran boyunca dört translocation yollar birini kullanır. Buraya, taşıma deneyleri üç enerji bağımlı cpTat, cpSec1 ve cpSRP-aracılı yolu ile birlikte bezelye (Pisum sativum), gelen taşıma-yetkili thylakoids yalıtım için yüksek verimli yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntemler thylakoid protein yerelleştirme, taşıma enerji ve protein translocation mekanizmaları biyolojik membranlar arasında ilgili deneyler etkinleştirin.
Introduction
Neredeyse tüm proteinaceous makine uygun kloroplast işlevi için sorumlu sitozol1ile translocated gerekir. Kloroplast zarflar protein yüzeylerde dış membran (TOC) translocon ve iç zar (TIC)2translocon alınır. Daha fazla thylakoid için hedefleme membran ve lümen oluşur ikiz arginin translocation (cpTat)3, salgı (cpSec1)4, sinyal tanıma parçacık (cpSRP)5ve spontan ekleme yolları6 ile . Yüksek verimli yalıtım fizyolojik aktif kloroplast ve thylakoid membran için bir yöntem enerji bilimi ve kinetik bir translocation olay, her yolu farklı taşıma mekanizmaları anlamak ve yerelleştirmek için ölçmek gerekli olan bir kloroplast altı ayrı bölmeleri hiçbirine ilgi belirli protein alt katman.
Kloroplast dan membran izolasyon taşıma enerji ölçümü etkileyen çevresel faktörler (örneğin, tuz ve substrat konsantrasyonu, ATP/GTP ve pH koşulların varlığı) üzerinde daha iyi deneysel kontrol sunar ve kinetik. Bu vitro ortamda aynı sebeplerden dolayı mekanik translocation ayrıntılarını keşif için oldukça rahat. Akıllı yazılım yerelleştirme kloroplast proteinlerin7,8geliştirdi, Ayrıca, vitro taşıma deneyleri onay için daha hızlı bir yöntem mikroskobu tabanlı floresan deneyleri üzerinde bunu sağlarken genetik olarak kodlanmış bir floresan etiketi, bitki dönüşümü ve/veya belirli antikor gerektirir. Burada, iletişim kuralları her enerji bağımlı thylakoid translocation yolları için optimize taşıma deneyleri yanı sıra, kloroplast ve thylakoid izolasyonların bezelye (Pisum sativum) üzerinden için mevcut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ilk malzemeleri
- 400 mL distile su içinde 3 saat yaklaşık 55 g bezelye ıslatın ve plastik bir tepsi içinde ekmek (35 cm x 20 cm x 6 cm) toprak vermikülit ince bir tabaka ile kaplı.
- Tepsiyi bezelye 12/12 h açık/koyu (50 µE/m2s) döngüsü için 9-15 gün altında 20 ° C'de büyümek.
- Protein substrat tercih edilen yöntemi göre hazırlayın.
Not: 1 gibi yöntemleri kullanarak protein yüzeylerde hazırladık) vitro transkripsiyon arıtılmış plazmid gelen buğday tohumu özleri veya tavşan retikülosit lysates huzurunda [3H] kullanarak çeviri tarafından takip-lösin veya [35S]-metiyonin, 2) vitro çeviri birleştiğinde transkripsiyon/çeviri takımı TnT gibi kullanarak kitleri Promega yukarıda da belirtildiği gibi radiolabeling ile ve 3) E. colioverexpressed protein saflaştırma. Radyoaktif vitro çeviri ürünler genellikle 50 mM soğuk amino asit taşıma tepkileri kullanmak için önceden ile söndürülür. Bu yöntemlerin her biri, her yeni protein substrat için genellikle bazı optimizasyon gerektirir. Eşleşmiş vitro sistem örneği için bkz: Ling ve Jarvis (2016)9.
2. kloroplast yalıtım ve miktar
Not: Sağlam kloroplast10yalıtım thylakoids hazırlanmasında ilk adımdır. Tüm malzemeler hazırlık sırasında soğuk tutulmalıdır. Bu adımda kırılma ciddi sonraki thylakoid verim sınırlayabilirsiniz gibi kloroplast, Resuspension hafifçe, ele alınmalıdır.
- Çözümleri önceden hazırlayın.
- 2 x taşlama arabellek (2xGB): 100 mM K-HEPES pH 7.3, 660 mM sorbitol, 2 mM MgCl2, 2 mM MnCl2, 4 mM EDTA, % 0,2 BSA.
- 2 x alma arabellek (2xIB): 100 mM K-Tricine veya K-HEPES pH 8.0, 660 mM sorbitol, 8 mM MgCl2.
Not: 3 mM arasında değişen 10 mM den MgCl2 konsantrasyonları gözlemlenebilir farklılıkları kullanılmaktadır.
- Sürekli yoğunluk gradient Percoll 15 mL ve 2xGB 30,900 g sabit açılı Open End 4 ° C'de 30 dk de 15 mL karışımı ile fren kapalı centrifuging tarafından hazırlayın.
- Yaklaşık 25 bin 9-15 gün eski bezelye hasat ve 95 mL 1xGB homojenize. Bir blender ile bilenmiş bıçak ya da bir Polytron kullanıldığını başarıyla. Bu karışımı Miracloth en az 2 kat bir huni ile filtre.
Not: kök dokusu miktarını sınırlayarak gerekli değildir ancak homojenizasyon işlemi daha kolay, böylece uzun süreli karıştırma ile oluşabilir kloroplast kırılma azaltmak yapabilirsiniz. - Sallanan bir kova Open End 4 ° C'de 5 min için 3000 g de cips ve yavaşça 1 mL 1xGB resuspend. Bir fırça en nazik resuspension tekniği olabilir.
- Dikkatle Percoll degrade ve santrifüj 8000 g sallanan bir kova Open End 4 ° C'de 10 dakika için de en üstünde yeşil süspansiyon kapalı tut ile katman.
- Dikkatli bir şekilde taze bir tüpün içine sağlam kloroplast içeren alt yeşil bant hasat. Kurtarılan sağlam kloroplast 1800 g 4 ° C'de 5 min için sallanan bir kova Open End, spin, süpernatant atmak ve yavaşça Pelet 1xIB içinde resuspend. 1 ml 1xIB son resuspension ile her zaman 30 mL 1xIB resuspending bu yıkama bir kez daha tekrarlayın.
- Klorofil (Chl) içeriği ölçmek için 5 mL % 80 aseton ve filtre Whatman 1 filtre kağıdı (nominal kalınlık 180 µm) üzerinden de tam resuspended kloroplast 10 µL karıştırın. 720 absorbans kaydetmek nm, 663 nm ve 645 bir spektrofotometre nm ve aşağıdaki formül11kullanarak Chl konsantrasyonu hesaplayın:
[Chl] mg/mL = [40.2* (bir663 -720) + 101.4* (bir645 -720)] * 0,1 - Kloroplast 1 mg/ml 1xIB eşdeğerleriyle Chl ayarlayın.
3. Thylakoids yalıtım
Not: Thylakoids sağlam kloroplast hipotonik lizis tarafından hazırlanır. Bu kloroplast sorbitol eksik hipotonik arabellek için teşhir ederek elde edilir. İzole thylakoids herhangi bir translocation yolları raporlaması için kullanılabilir, ama ya cpSec1 ya da cpSRP yollarının araştırılması için ise stromal özü (SE) Ayrıca bu hazırlık sırasında izole edilmelidir.
- Vaktinden önce aşağıdaki çözümleri hazırlayın.
- Hipotonik lizis arabellek: 50 mM K-Tricine veya K-HEPES pH 8.0, 8 mM MgCl2.
- 2 x ham Stroma arabellek (için konsantrasyon se): 100 mM K-HEPES pH 8.0, 660 mM sorbitol, 8 mM MgCl2.
- Laemmli örnek arabellek (SDS-EDTA ile desteklenen sayfa için): 125 mM Tris pH 6.8, % 10 SDS, % 20 gliserol, 0,05 mg/mL bromophenol mavi, % 10 β-mercaptoethanol, 10 mM EDTA.
- SE kurtarma gerekmiyorsa, sallanan bir kova Open End 4 ° C'de 6 dk 1000 g de sağlam kloroplast santrifüj kapasitesi
- Süpernatant atın ve 1 mg/ml hipotonik lizis tampon resuspend. Ara sıra karıştırma ile 10 dakika, karanlıkta buz üzerinde kuluçkaya.
- Thylakoids 3200 g 8 dk için kova rotor 4 ° C'de sallanan içinde de centrifuging tarafından yeniden elde etmek İki kez, her zaman 1-2 mL ile lizis arabellek resuspending thylakoids yıkayın. 1 mL 1xIB ile resuspend ve yukarıda olarak Chl kloroplast yalıtım protokolünde requantify.
4. stromal özü kurtarma ve konsantrasyon
- SE kurtarma gerekli ise, 600 µL aliquots 1.5 mL microcentrifuge tüpler sağlam kloroplast bölün ve her tüpün içinde 6 dk için kova rotor 4 ° C'de sallanan 1000 g de santrifüj kapasitesi
Not: Bu 1.5 mL microcentrifuge tüpler, kullanırken kalan membranlar için nihai Pelet karışıklık önlemek için yardımcı olur uygun birimdir.- 1 mg/ml Chl hipotonik lizis arabelleği resuspend ve karanlıkta adım 3.2.1 olduğu gibi 10 dk buz üzerinde kuluçkaya.
- Her tüpün içinde 8 dk için kova rotor 4 ° C'de sallanan 3200 x g , santrifüj kapasitesi ve 2 x ham Stroma arabellek eşit bir birimdeki yeni bir microcentrifuge tüp ışık yeşil veya sarı süpernatant aşağıdaki kloroplast lizis aktarmak.
- Thylakoids lizis arabelleği (yaklaşıldığıdır 0,5 mg/mL) 2 cilt ile yıkayın ve 8 dk için kova rotor 4 ° C'de sallanan içinde 3200 g de Santrifüjü tarafından toplamak 1 mg/mL Chl buzda 1xIB için resuspend.
- 42.000 g 4 ° C'de kalan membranlar kaldırmak için 30 dk için sabit açılı rotor de ham stroma santrifüj kapasitesi. Immunoblotting iç ve dış zarf proteinler için süpernatant saflığı doğrulamak için kullanılabilir.
- Birimin % 95'i küçük sarı-yeşil Pelet bozmadan her tüp sizden toplamak. Birimin her tüp sizden alınan not.
- Konsantre stromal özü (SE) hazırlamak için toplanan supernatants havuz ve 4 mL 30 kDa MWCO yoğunlaştırıcı filolarının kullanarak konsantre ol.
Not: Bu şekilde hazırlanan SE kloroplast, 2.5 mg/mL Chl. türetilen stroma eşdeğerdir Gerekirse, SE on 5 mg/mL Chl eşdeğerleri konsantre olabilir. SE altın renkli ve yapışkan olacaktır. Kova rotor sallanan ile laboratuar efsane RT santrifüje, bunun hakkında 10 min başına mL konsantre gerekir.
5. cpTat yolu ile ulaşım
Not: CpSec1 veya cpSRP, aksine cpTat yolu çözünür bileşenler gerektirmez veya exogenously enerji kaynakları eklendi; Sadece ışık tahrik proton nedeni gerekli3güçtür. Bu nedenle, sadece izole protein thylakoids ve substrat, tahlil için gereklidir. Tipik yüzeylerde ( Şekil 1' de görüldüğü gibi) 17 kDa ara formları ve 23 kDa alt birimleri oksijen karmaşık gelişen, iOE17 ve iOE23, sırasıyla vardır, ama habercisi formlar, prOE17 ve prOE23, de başarılı bir şekilde taşınan. Öncü formları tüm önerebilirim N-terminal hedefleme sıra, ara formlar yalnızca sıra hedefleme thylakoid vardır.
- CpTat ulaşım karışımı 0,33 mg/mL ile Chl thylakoids, 5 mM ATP 1xIB ve 8 mM dithiothreitol (DTT) 1xIB, buz üzerinde hazırlanan bir stoktan hazırlanan bir stoktan hazırlayın. ATP aydınlatma altında yürütülen, kesinlikle bu reaksiyon için gerekli değildir.
- 1:30 tanıtımı tarafından başlatmak taşıma birim birim taşıma substrat protein karışımı. Substrat protein 1xIB içinde hazır olmadığı bir 1:1 2xIB ile seyreltme ilk, o zaman kullanmak 1:30 birim birim seyreltilmiş substrat / ulaşım karışımı hazırlamanız.
Not: Substrat konsantrasyonu hazırlama yöntemi göre değişir. Overexpression için millimolar tutarları micromolar sağlayacak süre genellikle vitro hazırlıklar micromolar tutarlarına, nanomolar için izin verir. Autoradiography ve fluorography daha immunoblotting daha duyarlı olduğu gibi algılama yöntemleri de düşünülmelidir. - 80-100 µE/m2s omnivor aktif radyasyon (PAR) Oda sıcaklığında 10 dakika için süspansiyon aydınlatmak. Taşıma kinetik gerekiyorsa, oda sıcaklığında thylakoids ve tepki karışıma önceden equilibrate ve 30 dakikaya kadar aydınlatmak.
- Buz gibi 1xIB 8-fold bir seyreltme ile taşıma reaksiyonu durdurmak ve 3200 g microcentrifuge 4 ° C'de 5 min için de Santrifüjü tarafından thylakoids kurtarmak
- Değil taşınan kalan substrat kaldırmak, thylakoid Pelet 1xIB 120 µL içinde resuspend ve 2 mg/mL thermolysin ve 10 mM CaCl 1xIB içinde2 6 µL eklenmesi tarafından dış protein sindirimi.
- Proteaz tepki 40 min için buz üzerinde kuluçkaya ve sonra proteaz 25 mM EDTA 1xIB içinde hazırlanan birimle ikiye katlayarak gidermek.
- Thylakoids 3200 g 4 ° C'de 5 min için bir microcentrifuge de centrifuging tarafından yeniden elde etmek Kurtarılan thylakoids 5 mm EDTA 1xIB ve yeni bir tüp transferi 120 μL yıkayın.
- Bir microcentrifuge 4 ° C'de 5 min için 3200 g de santrifüj kapasitesi Laemmli örnek 10 mM EDTA ile desteklenmiş arabellek uygun bir hacmine resuspend. Genellikle yeterince 40 µL hacmi olduğunu substrat SDS-sayfa jel üzerinde tespit etmek ve gerektiğinde tekrar jelleri için örnek tasarruf sağlar.
- Örnekleri 10 dakika kaynar su banyosu yerleştirin ve SDS-PAGE tarafından analiz. Autoradiography, fluorography veya yerel olmayan veya epitope öğesini proteinlerin Western blot taşınan proteinler tespiti için başarılı bir şekilde kullanılmıştır.
6. cpSec1 yolu ile ulaşım
Not: CpSec1 translocon yoluyla ulaşım overexpression E. coli14,15 üzerinden tedarik veya stroma yoğunlaşarak kurtarılan stromal protein cpSecA112,13, gerektirir. thylakoid yalıtım sırasında. Tipik bir substrat karmaşık gelişen oksijen (prOE33), 33 kDa alt birim Şekil 2' de görüldüğü gibi var.
- CpSec1 ulaşım karışımı 0,33 mg/mL ile Chl thylakoids, 0,83 mg/mL Chl eşdeğer SE veya rekombinant cpSecA1 ve 5 mM ATP buz üzerinde 1,5 μg hazırlamak ve kuluçkaya 10 dakikadır. Bir tipik taşıma tepki burada 72 μL, en fazla 60 μL SE eklenmesi nedeniyle gelen karışımdır.
- Rekombinant cpSecA1 SE yerine kullanılacaksa, saf cpSecA1 2xIB eşit bir birimdeki ayarlayın, daha sonra taşıma reaksiyonlar (Örneğin, 0,75 µg/µL) eklemek için uygun bir konsantrasyon oranında seyreltin.
Not: uzun süreli depolama için cpSecA1 bir kontrollü, buzdolabında odada buz sonra arıtma depolanır donma onuntemsilcilerini etkinlik.
- Rekombinant cpSecA1 SE yerine kullanılacaksa, saf cpSecA1 2xIB eşit bir birimdeki ayarlayın, daha sonra taşıma reaksiyonlar (Örneğin, 0,75 µg/µL) eklemek için uygun bir konsantrasyon oranında seyreltin.
- 1:10 tanıtımı tarafından başlatmak taşıma birim birim taşıma substrat protein karışımı. Substrat protein 1xIB içinde hazır değil, 2xIB ile 1:1 seyreltme hazırlamak ve 1:10 birim birim seyreltilmiş protein taşıma karışıma ekleyin.
- Tepki altında 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya 80-100 µE/m2s PAR. Yine, daha uzun zaman kinetik veya belirli yüzeyler için gerekli olabilir.
- Işık tedavisi sonra 8-fold seyreltik 3200 g microcentrifuge 4 ° C'de 5 min için de buz gibi 1xIB ve santrifüj tepkiler ile
- Thermolysin ile tedavi ve adımları 5.5 EDTA ile 5,7 gidermek.
- 3200 g microcentrifuge 4 ° C'de 5 min için de santrifüj kapasitesi ve uygun bir birimdeki Laemmli örnek arabelleği 10 mM EDTA ile desteklenmiş Pelet resuspend. Su banyosu SDS-sayfa jel yükleme önce 10 dakika kaynar suda koyun.
7. cpSRP yolu aracılığıyla ekleme
Not: CpSRP54, cpSRP43 ve cpFtsY16cpSRP-aracılı entegrasyonu karmaşık proteinleri (LHCP) Şekil 3 ' te görülen hasat ışık gerektirir. Bu bileşenler için konsantre stromal özü, yoluyla taşıma tepki cpSec1 aktarma protokolü için açıklandığı gibi sağlanır.
- CpSRP hazırlamak taşıma 0,33 mg/mL Chl thylakoids, 0,83 mg/mL Chl eşdeğer SE ve 5 mM ATP buz ile karıştırın ve 10 dakikadır kuluçkaya.
- 1:10 tanıtımı tarafından başlatmak taşıma birim birim taşıma substrat protein karışımı. Substrat protein 1xIB içinde hazır değil, 2xIB ile 1:1 seyreltme hazırlamak ve 1:10 birim birim seyreltilmiş protein taşıma karışıma ekleyin.
- Reaksiyon, oda sıcaklığında 10 dk 80-100 µE/m2s PAR için kuluçkaya.
- Işık tedavisi sonra 8-fold seyreltik 3200 g microcentrifuge 4 ° C'de 5 min için de buz gibi 1xIB ve santrifüj tepkiler ile Süpernatant atın ve Pelet 1xIB 120 µL içinde resuspend.
- Bölümlerde 5.7 ile 5.5 thermolysin ile tedavi. Thermolysin sindirim burada başarılı membran tümleştirme değerlendirmek için gereklidir. Kurtarılan thylakoids 5 mm EDTA 1xIB ve yeni bir tüp transferi 120 μL yıkayın.
- 3200 g microcentrifuge 4 ° C'de 5 min için de santrifüj kapasitesi ve Pelet tekrar 10 mM EDTA ile desteklenmiş 2 x Laemmli arabellek uygun bir hacmine resuspend. Su banyosu SDS-sayfa göre analiz önce 10 dakika kaynar suda koyun.
Not: Olgun LHCP (mLHCP) entegrasyonunu proteaz korumalı bozulması ürün (mLHCP-D) görünümünü tarafından değerlendirilir yaklaşık 1,5-2 kDa uncleaved mLHCP17daha küçük.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Başarılı bir şekilde taşınan substrat miktarını ölçmek için bir veya daha fazla "yüzde giriş" Şerit eklemek kullanışlı olabilir. Aşağıda gösterilen veri için son aktarım tepki thylakoids olmadan yüzde 10'u kullanıldı. Bu "yüzde giriş" da habercisi substrat boyutunu görselleştirmek için yardımcı olur. Yüzde hangi substrat taşınan Karşılaştır substrat karşı için bilinen, tanımlı miktarını temsil eder ve gerekli başlangıçta kullanarak protein hazırlanırken yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir. Ayrıca, 0,75 mm polyacrylamide çözgü ve bulaşması grup önlemek için jeller üzerinde tek bir şeritte Chl eşdeğerleri 4 µg yüklemek için tavsiye edilir. Tüm yüzeylerde aşağıdaki hazırlanmıştır ve vitro çeviri kitleri kullanarak radiolabeled.
İOE17 cpTat yolu ile ulaşım
Resim 1 . İOE17through cpTat yolu ulaşım. Fluorograph [3H]-iOE17 taşıma tahlil ve thermolysin tedavisi olmayan taşınan substrat. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Çoğu Tat yüzeylerde taşımacılığının başarılı cpTat boyutu shift N-terminal sinyal peptid3bölünme üzerine tarafından tespit edilebilir. Hiçbir yarilabilir sinyal peptid18,19bulunduğu yüzeylerde proteaz tedavi böylece tarafından proteaz sindirim için ulaşılmaz hale membran, çarpı işareti belgili tanımlık substrate ortaya çıkarmak için gereklidir. Şekil 1' de, yaklaşık 2-3 kDa tanıtılan substrat ve olgun arasında bir boyutu vardiyada iOE17 sonuçlarının taşıma formu işleme. Sigara taşınan substrat proteaz tedavi (lane 4) ile düşer.
PrOE33 cpSec1 yolu ile ulaşım
Resim 2 . PrOE33 cpSec1 yolu ile taşıma. Autoradiograph [35S]-prOE33 taşıma tahlil SE, saf cpSecA1 veya her ikisini aynı anda kullanarak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Belgili tanımlık substrate sinyal yanı sıra proteaz koruma taşınan substrat20hedefleme bir yarilabilir thylakoid varsa cpSec1 yolu (Şekil 2) yoluyla ulaşım olgun substrat bir boyut değişikliği yoluyla değerlendirilebilir.
PrLHCP cpSRP yolu ile bütünleştirilmesi
Şekil 3 . PrLHCP cpSRP yolu ile entegrasyon. [35S] autoradiograph-prLHCP ve thylakoid membran içine ekleme sonra ürün mLHCP-d sindirim. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
PrLHCP cpSRP yolu ile thylakoid membran içine ekleme thermolysin sindirim değerlendirilebilir. Yaklaşık 1.5-2 kDa bir boyutu kayması, başarılı membran ekleme, membran uncleaved olgun protein tam proteolizis15korur gibi göstergesidir. Şekil 3' te, proteaz korumalı ürün mLHCP-D açıkça görülüyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kloroplast ve Thylakoid yalıtım
Aşırı kırılması neden olur zavallı kloroplast ayrılık degradedeki sonra yalıtım ve böylece zavallı thylakoid verim. Hasat doku yavaşça tüm malzeme karıştırma ve tamamen homojenize oluncaya kadar 15 s döngülerle darbe önce batık sağlayarak homojenize en iyisidir. Gerekirse, birden çok daha kısa tur her turda daha az doku ile harmanlama kullanın.
Hasat doku ile temas gelen tüm malzemeler soğutma izole kloroplast etkinlik 2 saat korumak için yardımcı olur. Kloroplast buz üzerinde de yalıtım sonra karanlıkta tutmak önemlidir.
Magnezyum izole thylakoids irtibata arabellekleri dahil etmek çok önemlidir. Bunu yaparken granal destacking neden olur ve eleştirel proton sebep kuvvet üzerine aydınlatma21nesil etkiler. Thylakoids taşıma reaksiyonlar için 2 saat sonra buz üzerinde ve karanlıkta tutulur yalıtım kullanılmıştır.
Taşıma reaksiyonlar en iyi duruma getirme
İzole thylakoids hızla yerleşmek ve eşit olmayan Chl eşdeğerleri tepkiler arasındaki yol açabilir. Bu nedenle, özellikle çok sayıda örnekleri ayarlarken kullanılacak iyice önceki thylakoids karıştırmak önemlidir.
Tat yolu
Tat yolu ile ulaşım verimliliği üzerine thylakoids aşırı çamaşır Tha4 beri azaltılmış (TatA) kısmen düşük membran22çıkarılan. Bu gibi durumlarda, thylakoid yıkama adımları taşıma reaksiyon önce azaltmak yararlıdır. Buna ek olarak, daha uzun aydınlatma süreleri nerede yüzeylerde kötü tipik koşullar altında taşınmaktadır algılama artırabilirsiniz.
CpSec1 yolu
Taşıma zayıf olabilir ama o zaman cpSec1 yolu raporlaması, konsantre se cpSecA1 miktarda taşıma, desteklemelidir. Stromal chaperones se de taşıma15verimliliğini artırmak yardımcı olabilir rağmen etkili taşıma izole thylakoids bazı proteinler için saf cpSecA1 ilavesi yararlanabilirler. Bu taşıma faaliyet indirgeyerek Ayrıca, hazırlıklar cpSecA1 protein kullanımı taşıma, önce donmuş değil. Benzer şekilde, donmuş SE taze hazırlanmış özü daha az etkili. Tat taşıma olduğu gibi ulaşım karışımı uzun kuluçka dönemleri ile zor yüzeylerde yardımcı olabilir.
CpSRP yolu
Sulandırma cpSRP taşıma bireysel bileşenleri kullanılarak gerçekleştirilen23olmuştur süre, cpSRP43, cpSRP54, tedarik uygundur ve cpFtsY SE. Thermolysin dirençle LHCP entegrasyon16için en sıkı kriterleri, 17, ama alkalin ayıklama iyi17olarak gerçekleştirilen. Hareketlenme öncesi ilk belirtiler genellikle donmuş ve taşıma tepki için-80 ° C'de depolanan iken, vitro sentezi tarafından hazırlanan prLHCP hemen sonra sentez donma olmadan taşıma için kullanılmalıdır.
Roman bir substrat karakterizasyonu yol hedef
Roman bir substrat tarafından alınan translocation yolu bilinmeyen nerede durumlarda, ilk öncül veya ara form amino asit dizisini kullanarak olası sinyal peptidler silico araştırmak için tavsiye edilir. CpTat yolu bir belirli kişilik arginin fikir birliği motif sinyal peptid ve hiçbir ATP PAR3altında başarılı ulaşım için genellikle gerektirir. Tat yolu farklı olarak, ATP ve cpSecA1 protein cpSec1 yolu gerektirir. Başarısız taşıma koşullarında bu bileşenler eksik cpSec1 yolu20öneriyor. CpSRP yolu arıtılmış cpSecA1 ve ATP kullanarak taşıma ancak ikiz arginin fikir birliği motifi sinyal peptid eksikliği gösteriyor cpSRP yolu23SE. başarısız sinyal tanıma parçacık bulundu gerektirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu el yazması kimyasal Bilimler Bölümü, yerbilim ve Biosciences, temel enerji Bilimler bize Enerji Bakanlığı aracılığıyla Grant DE-SC0017035, 408 Office tarafından fon ile hazırlanmıştır
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pisum sativum seeds | Seedway LLC, Hall, NY | 8686 - Little Marvel | |
| Miracloth | Calbiochem, Gibbstown, NJ | 475855-1 | |
| 80% Acetone | Sigma, Saint Louis, MO | 67-64-1 | |
| Blender with sharpened blades | Waring Commercial | BB155S | |
| Polytron 10-35 | Fischer Sci | 13-874-617 | |
| Percoll | Sigma, Saint Louis, MO | GE17-0891-01 | |
| Beckman J2-MC with JA 20 rotor | Beckman-Coulter | 8043-30-1180 | |
| Sorvall RC-5B with HB-4 rotor | Sorvall | 8327-30-1016 | |
| 100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 12/3/83 | Can be frozen in aliquots for future use |
| 200 mM MgATP in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 74804-12-9 | Can be frozen in aliquots for future use |
| Thermolysin in 1xIB (2mg/mL) | Sigma, Saint Louis, MO | 9073-78-3 | Can be frozen in aliquots for future use |
| HEPES | Sigma, Saint Louis, MO | H3375 | |
| K-Tricine | Sigma, Saint Louis, MO | T0377 | |
| Sorbitol | Sigma, Saint Louis, MO | 50-70-4 | |
| Magnesium Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 7791-18-6 | |
| Manganese Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 13446-34-9 | |
| EDTA | Sigma, Saint Louis, MO | 60-00-4 | |
| BSA | Sigma, Saint Louis, MO | 9048-46-8 | |
| Tris | Sigma, Saint Louis, MO | 77-86-1 | |
| SDS | Sigma, Saint Louis, MO | 151-21-3 | |
| Glycerol | Sigma, Saint Louis, MO | 56-81-5 | |
| Bromophenol Blue | Sigma, Saint Louis, MO | 115-39-9 | |
| B-Mercaptoethanol | Sigma, Saint Louis, MO | 60-24-2 |
References
- Ellis, R. Chloroplast protein synthesis: principles and problems. Sub-cellular biochemistry. 9, 237 (1983).
- Li, H. -m, Chiu, C. -C.
- Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP. Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).
- Skalitzky, C. A., et al. Plastids contain a second sec translocase system with essential functions. Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).
- Dabney-Smith, C., Storm, A. Plastid Biology. , Springer. 271-289 (2014).
- Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. Distinct "assisted" and "spontaneous" mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).
- Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. hloroP. ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites. Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).
- Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nature protocols. 2 (4), 953 (2007).
- Ling, Q., Jarvis, R. Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants. Journal of Visualized Experiments. (117), e54717 (2016).
- Lo, S. M., Theg, S. M. Photosynthesis Research Protocols. , Springer. 139-157 (2011).
- Vernon, L. P. Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts. Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).
- Knott, T. G., Robinson, C. The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).
- Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting. Science. 266 (5186), 796-798 (1994).
- Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts. FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).
- Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).
- Luirink, J., Sinning, I. SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).
- Yuan, J., Henry, R., Cline, K. Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein. Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).
- Tjalsma, H., van Dijl, J. M. Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane. Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).
- Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life. Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).
- Yuan, J., Cline, K. Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity. Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).
- Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., Büchel, C. Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach. Biochemistry. 43 (45), 14508-14516 (2004).
- Frielingsdorf, S., Jakob, M., Klösgen, R. B. A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).
- Tu, C. -J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes. Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).
