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Bioengineering

Gen Expressionsanalyse von Endothelzellen ausgesetzt um Stress mit mehreren Parallel-Platte Fluss Kammern Scheren

Published: October 21, 2018 doi: 10.3791/58478
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2,3, 1,2, 1,2, 1,2,3,4
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Keenan Research Centre in the Li Ka Shing Knowledge Institute, St. Michael's Hospital, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 4Department of Medicine, University of Toronto

Summary

Hier ist ein Workflow für die Kultur und Gen Expressionsanalyse von Endothelzellen unter Fluid Schubspannung präsentiert. Enthalten ist eine räumliche Anordnung für die gleichzeitig Gehäuse und Überwachung mehrerer Fluss Kammern in einer kontrollierten Umgebung und die Verwendung einer exogenen Referenz-RNA für die quantitative PCR.

Abstract

Wir beschreiben einen Workflow für die Analyse der Genexpression von Endothelzellen unterliegen einem stetigen Laminar-Flow mit mehreren Kammern überwachten Parallel-Platte Fluss. Endothelzellen bilden die innere zelluläre Auskleidung der Blutgefäße und die Reibungskraft des Blutflusses genannt Schubspannung chronisch ausgesetzt sind. Unter physiologischen Bedingungen, Endothelzellen Funktion in Anwesenheit von verschiedenen Schubspannung Bedingungen. So kann die Anwendung der Schubspannung in in-vitro- Modelle einen tieferen Einblick in Endothelzellen Antworten in Vivobieten. Die Parallel-Platte Strömungsraum zuvor von Lane Et Al. veröffentlicht 9 ist an Endothelzellen Genregulation in an- und Abwesenheit des stetigen (nicht pulsierender) Laminar-Flow zu studieren. Wichtige Anpassungen im Setup für laminare Strömung wie hier dargestellt sind eine große, engagierte Umgebung Haus gleichzeitige Fluss Schaltungen, die Überwachung der Fördermengen in Echtzeit, und die Aufnahme einer exogenen Referenz RNA für die Normalisierung der quantitative Echtzeit-PCR-Daten. Um mehrere Behandlungen/Bedingungen mit der Anwendung der Schubspannung zu beurteilen, werden mehrere Flow Schaltungen und Pumpen gleichzeitig innerhalb der gleichen beheizt und befeuchteten Inkubator verwendet. Die Durchflussmenge des jede Strömung Schaltung misst kontinuierlich in Echtzeit Schubspannung Bedingungen während der Experimente zu standardisieren. Da diese Experimente mehrere Bedingungen haben, verwenden wir auch eine exogene Referenz-RNA, die versetzt-in zur Zeit der RNA-Extraktion für die Normalisierung der RNA-Extraktion und erste Strang cDNA Synthese Effizienz ist. Diese Schritte minimieren die Variabilität zwischen den Proben. Diese Strategie ist in unserer Pipeline für die Gen-Expression-Analyse mit Schubspannung Experimente mit Parallel-Platte Strömungsraum eingesetzt, aber Teile dieser Strategie, wie die exogene RNA-Spike-in verweisen, können einfach und kostengünstig für verwendet werden andere Anwendungen.

Introduction

Vaskuläre endotheliale Zellen bilden das zelluläre Innenfutter der Blutgefäße im geschlossenen Kreislauf der höheren Arten. Sie bilden die Schnittstelle zwischen Blut und Gewebe und zeichnen sich durch luminalen und abluminalen Oberflächen. Das Endothel ist eine vielfältige, aktive und adaptive System, die Durchblutung, Nährstoff Menschenhandel, Immunität und das Wachstum neuer Blutgefäße Schiffe1reguliert. Im Körper gibt es endotheliale Zellen normalerweise in einem Umfeld, wo sie die Reibungskraft der Zirkulation, Schubspannung2ausgesetzt sind. Scherspannung ist ein wichtiger Regulator der Endothelzellen Gen Ausdruck3, und Endothelzellen versuchen weiterhin Schubspannung innerhalb eines gegebenen Bereichs2,4. Endothelzellen zeigen angiogenen Musterung in Ermangelung der Schubspannung5 , die Gewebedurchblutung verbessern können. Regionale Muster der gestörten Strömung und veränderten Schubspannung sind der Ausdruck der entzündlichen Gene6 und die Entwicklung von Atherosklerose7,8zugeordnet. So sind Modelle, die Scherspannung enthalten ein Hauptbestandteil der endothelialen Genregulation zu verstehen.

Wir beschreiben eine Methode zur Untersuchung der Genregulation im vaskulären endothelialen Zellen unter Scherbelastung. Dieses System nutzt nicht pulsierende Strömung und imitiert Fluid Schubspannung Ebenen und Sauerstoffkonzentration, Modell Bedingungen für arterielle Endothelzellen. Dieses Protokoll enthält detaillierte Informationen zu Methoden für die Verwendung von RNA-Interferenz (RNAi), die Einstellung für die Anwendung der Schubspannung mit dem Parallel-Platte Fluss Apparate und Methoden für das Spike-in einer exogenen Referenz RNA vor der Analyse von Gen-knockdown Reverse-Transkriptase quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR). Diese Pipeline dient zur Genregulation in Endothelzellen in an- und Abwesenheit von laminar Schubspannung zu studieren und beinhaltet eine Anpassung des Parallel-Platte Fluss Apparates von Lane Et Al. beschrieben 9. dieses bestimmten Set-up wurde entwickelt, um die gleichzeitige Bewertung von mehreren experimentellen Bedingungen zu ermöglichen, die Scherspannung Bedingungen im direkten Vergleich sowie die Normalisierung der RNA Analyse ermöglicht. Eine große beheizte Einheit mit kontrollierter Luftfeuchtigkeit wird genutzt, um mehrere separate Strömung Kammern und Pumpen mit Flussraten für jede Kammer fließmontage in Echtzeit überwacht gleichzeitig ausgeführt werden können. Die Anwendung dieses Set-up ist für gen-Knockdown mit RNAi in der Umgebung von Laminar-Flow/Scherbeanspruchung verwendet, sondern Aspekte dieses Protokolls auf die Beurteilung der RNA Ausdruck angewendet werden können.

Gemeinsame Konzepte für die Anwendung der Schubspannung für Endothelzellen gehören mikrofluidischen Systemen10, ein Kegel-Platte-Viskosimeter11und eine Parallel-Platte Fluss Kammer12. Mikrofluidischen Systemen verschiedener Hersteller wurden nützlich beim Studium von Mechanobiology und mechanotransduktion in mehrere Zell- und Gewebetypen und eine Vielzahl von biophysikalischen reizen. Für Endothelzellen wurden sie zur Endothelzellen in Isolierung sowie das Zusammenspiel von Endothelzellen und des Menschenhandels immun oder Tumor Zellen10zu studieren. Diese Systeme eignen sich jedoch weniger für die Wiederherstellung einer großen Zahl von Zellen9. Die Kegel-Platte-Viskosimeter und Parallel-Platte Fluss Kammern ermöglichen die Wiederherstellung einer großen Anzahl von Zellen in konfluierende Monolagen12. Diese Systeme können eine Reihe von scher Kräfte und Muster12erzeugen. Die Parallel-Platte Fluss Kammer Versammlung9 hat den Vorteil, dass Echtzeit-Bildgebung durch die Glasscheibe auszuwertende zellulären Morphologie zu jedem Zeitpunkt durchgeführt werden kann. Darüber hinaus kann die Perfusat unter sterilen Bedingungen gesammelt werden. Für das hier vorgestellte System kann die Strömung auch überwacht werden, in Echtzeit und in ein Mehrkammer-Setup, das erleichtert die Wartung der Scherung Bedingungen zwischen den Kammern.

Für repräsentative Experimente dienen der menschlichen nabelader Endothelzellen (HUVECS), die eine vaskuläre Endothelzellen Art darstellen, und die Schubspannung Bedingungen, die wir verwenden (1 Pa) arterielle Bedingungen zu reflektieren (0,1 - 0,7 Pa). Jedoch dieses Protokolls kann andere Endothelzellen verwendet werden, und die Schubspannung Bedingungen eingestellt werden, nach experimentellen Frage. Beispielsweise die Bewertung der menschlichen Endothelzellen unter Bedingungen, die venösen Kreislauf Modell müssten geringere Scherbeanspruchung (1-6 Pa) und Studien, die mikrovaskuläre Zirkulation Modell verwendet haben Schubspannung Ebenen von 0,4 - 1,2 Pa13 , 14. Darüber hinaus Scherspannung kann sogar zwischen endothelial Zellen innerhalb der gleichen Blutgefäß6variieren. In der aktuellen Konstellation wird ein einzelnes monitoring-System verwendet, das kann vier separate Strömung Schleifen gleichzeitig überwachen. Für Labors, die mehr Strömung Schleifen benötigen, gibt es Raum in den dedizierten Umgebung für eine zusätzliche monitoring-System.

RT-qPCR dient die absolute Quantifizierung der Genexpression in der Einstellung der Schubspannung. Der relativen Ausdruck Zielgene dient oft RNA Ausdruck über Bedingungen zu vergleichen. Einige RNA-Spezies können bei sehr geringen Mengen vorhanden sind oder fehlen, so komplizieren relative Messungen. Zum Beispiel können lange Forensisches RNAs in Endothelzellen potente Effekte bei relativ geringen Kopienzahl pro Zelle5ausüben. Darüber hinaus können Unterschiede in der Effizienz der Grundierung zu eine ungenaue Interpretation führen von der Verwendung der Delta-Delta Zyklus Schwelle (Ct) Methode zum Analysieren der Daten. Um dieses Problem zu beheben, führen wir absolute Quantifizierung durch die Erzeugung einer Standardkurve mit einer bekannten Menge von Plasmid DNA. Darüber hinaus ergänzende DNA (cDNA)-Synthese ist ein ineffizienter Prozess, und Unterschiede in der Effizienz der cDNA können Unterschiede in RNA Ausdruck zwischen Bedingungen und Proben15entfallen. Die Anwendung der Schubspannung und/oder Transfektion Reagenzien kann beeinflussen, Zellproliferation, Apoptose und Lebensfähigkeit oder Hinzufügen von Komponenten, die RNA-Isolierung und/oder cDNA Synthese stören können. Um die Möglichkeit der Voreingenommenheit von RNA Isolation und cDNA Synthese berücksichtigen, verwenden wir ein Spike RNA Eingabesteuerelement im Labor synthetisiert, zum Zeitpunkt der RNA-Extraktion hinzugefügt und mit jeder cDNA Synthese über RT-qPCR gemessen. Dies ermöglicht nicht nur die Anpassung technische Unterschiede in RNA-Extraktion und cDNA Synthese, sondern ermöglicht auch die Berechnung der absoluten Mengen pro Zelle, wenn die Zellzahl bekannt ist.

Dieses System nutzt zusätzliche Schritte zur Aufrechterhaltung der Ähnlichkeit oder technische Unterschiede zwischen Bedingungen entfallen. Wir betonen vor allem diese Schritte aufgrund der Komplexität dieser Experimente, die beinhalten mehrere physische Set-ups und experimentellen Bedingungen, die experimentelle Variabilität führen kann.

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Protocol

1. Vorbereitung des exogenen Referenz RNA

Hinweis: Wählen Sie eine exogene Referenz RNA, die nicht vorhanden ist in der Art oder des Modells von Interesse. Bei Säugetieren-Systemen kann Firefly Luciferase RNA verwendet werden.

  1. Linearisierung von exogenen Referenz RNA plasmid
    1. Bereiten Sie exogene Referenz RNA mindestens 48 Stunden vor der erwarteten RNA-Extraktion. Zu erhalten oder herstellen einen cDNA Klon der gewählten exogene Referenz RNA, wie ein Glühwürmchen Luciferase cDNA Klon in einem Plasmid-Vektor für in-vitro- Transkription (siehe Tabelle der Materialien).
    2. Restriktionsenzym (RE) Verdauung von 1 µg der Full-Length Plasmid durchführen (Firefly Luciferase Plasmid ist pSP-Luc + hat 4100 bp) mit Einzel-Cutter RE (XhoI) in 1,5 mL Microfuge Röhren. Wählen Sie ein RE, die ein einzelnes Cutter (Plasmid schneidet nur 1 X) am 3' Ende der exogenen Referenz RNA-Sequenz, die eine 5' Überhang oder stumpfen Ende verlässt. Führen Sie für eine typische Zubereitung sieben Plasmid Linearisierung Reaktionen (Schritte 1.1.4 - 1.1.7) parallel zu erzeugen ausreichend RNA-Konzentration und Menge, eine Reihe von Experimenten oder ein Projekt abzuschließen.
      1. Messen Sie die Plasmid-Konzentration mittels Spektrophotometrie oder Spectrofluorometry.
      2. Bereiten Sie eine RE-Mischung in jedem Röhrchen: 4 µL XhoI hinzufügen (20.000 Einheiten/mL), 8 µL Puffer, X µL Plasmid (1 µg) und ausreichende H2O, eine Gesamtlösung von 80 µL zu erreichen.
      3. Inkubieren Sie die RE-Mischung für 2 h bei 37 ° c Verwenden Sie RE laut Protokoll des Herstellers, da Änderungen erhöhte Sternaktivität oder unspezifische Spaltung der Ziel DNA führen können. Wärme zu inaktivieren das Reaktionsgemisch für 20 min bei 65 ° C.
      4. Den RE-Digest mit Ethanol Niederschlag in jedem Röhrchen zu kündigen. Der RE-Mix fügen Sie direkt 4 µL 0,5 M EDTA pH 8.0, 8 µL 3 M Natrium Acetat pH 5,2 und 184 µL 100 % Ethanol hinzu. Gut mischen und die Mischung bei-20 ° C für 30 Minuten einfrieren.
      5. Spin-down das Gemisch bei 4 ° C für 20 min bei einer relativen Zentrifugalkraft (RCF) von 16.100 X g.
      6. Entfernen Sie den Überstand mit einer feinen Spitze, ohne Berührung der Pellet. Trocknen Sie das Pellet für 5 min an der Luft und Aufschwemmen Sie es durch pipettieren rauf und runter 5 x - 10 X in 6 µL H2O (auf 37 ° C erwärmt).
      7. Bestätigen Sie die Linearisierung der Luciferase Plasmid von der verdauten Produktausführung auf 2 % Agarosegel mit Interkalation Bromid (EtBr) zusammen mit eine 1 kb + Leiter, ein supercoiled Leiter und geschnitten und ungeschnitten Plasmid. Überprüfen Sie das Gel und fahren Sie mit der in-vitro- Transkription, wenn die Fahrspur für den geschnittenen Plasmid ein einzelnes Band bei ~ 4 kb zeigt (die ungeschnittene Plasmid haben drei Bands; ( Abbildung 1).
        Achtung: EtBr ist krebserregend. Arbeiten Sie in einem chemischen Abzug.
  2. In Vitro Transkription von exogenen Referenz RNA plasmid
    1. Für jedes Rohr verdaute Plasmid Produkte in Vitro Transkription mit einer in-vitro- Transkription Methode ausführen (siehe Tabelle der Materialien). Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers und verwenden Sie die entsprechende Phagen RNA-Polymerase. Wenn die Methode der cDNA Synthese ein Poly Endstück erfordert oder andere Anwendungen ein Poly Endstück erfordern, wählen Sie eine Methode der in-vitro- Transkription, die eine Poly-Tail-Ergänzung enthält (siehe Tabelle der Materialien).
    2. Kombinieren Sie alle in-vitro- Produkte in einem einzigen 1,5 mL Polypropylen Rohr vor der Reinigung transkribiert.
  3. Purif Ication RNA aus der in-vitro- Transkription Reaktion
    1. In-vitro- transkribiert reinigen Produkte mit einer in-vitro- Transkription Aufräumarbeiten kit (siehe Tabelle der Materialien). Folgen Sie bitte den Hersteller-Protokoll.
    2. Beurteilen Sie die RNA-Konzentration durch Messung der Absorption bei 260 nm mit Spektralphotometrie.
      Hinweis: RNA-Konzentration wird mit dem Bier-Lambert Gesetz berechnet. Dies besagt, dass die Absorption von Nukleinsäuren (die absorbieren Licht stark bei 260 nm) ist proportional zur Konzentration. Eine Extinktion von 1,0 entspricht 40 µg/mL einsträngige RNA.
  4. Aliquotierung Röhren die Aktie RNA in PCR für Versuchszwecke
    1. Sicherstellen Sie, dass die RNA-Konzentration 1 µg/µL.
      1. Wenn die RNA-Konzentration > 1 µg/µL ist, verdünnen Sie die Aktie um 1 µg / µL. aliquoten 1 µL in PCR-Röhren und bei-80 ° c aufbewahren
      2. Wenn die RNA-Konzentration < 1 µg/µL liegt, kann zusätzliche Niederschlag mit 5 M Ammoniumacetat (sofern im Kit) entsprechend des Herstellers Protokoll durchgeführt werden. Die RNA-Konzentration noch < 1 µg/µL, fahren Sie mit der Aliquotierung 1 µL in PCR-Röhrchen.

2. Schieben Sie die Beschichtung

Hinweis: Schritte 2.1-2.10 sollte durchgeführte 24-48 h vor der Aussaat die erwartete Zelle.

  1. Heizen Sie den Backofen auf 250 ° C.
  2. Mit sterilen Handschuhen, wickeln jedes Glas-Folie 2 X mit Alu-Folie. Berühren Sie die Oberfläche der Folie direkt.
  3. Folien in den Ofen für 1 h bei 250 ° C backen und die Folien auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
    Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig für die Zerstörung jeder kontaminierenden Endotoxin.
  4. Während die Folien Kühlung sind, machen Sie eine Fibronektin-Stammlösung von 1 mg/mL mit destilliertem Wasser und inkubieren Sie es für 30 min bei 37 ° C auflösen. 100 µL Aliquots zu machen. Die Aliquote für den sofortigen Einsatz beiseite und frieren die restlichen Aliquote für die zukünftige Verwendung.
  5. Packen Sie die äußere Hülle des Alu-Folie vor der Inbetriebnahme der Objektträger eine biologische Kabinett. Führen Sie Schritte 2,6 bis 2,7 und 2,9 im Kabinett der Biosicherheit.
  6. Legen Sie die Glas-Folie in einer Kulturschale sterile rechteckige 4-Well-Zelle.
  7. Verdünnen Sie Fibronektin-Stammlösung 1: 100 mit destilliertem Wasser. Jede Folie mit 1 mL verdünnter FIBRONEKTIN, Tropfen für Tropfen, mit einer Pipette zu beschichten. Stellen Sie sicher, dass die ganze Folie bedeckt ist.
  8. Inkubieren Sie die Folien in einer Gewebekultur Inkubator bei 37 ° C für 24-48 h.
  9. Nach der Inkubation Aspirieren der Fibronektin durch Kippen der Kulturschale 4-Well-Zelle. Berühren Sie die Folie direkt mit der Absauganlage.

3. Zelle Aussaat auf Glas gleitet

  1. Zählen der menschlichen Endothelzellen an frühe Passage (Durchgang 2-5) und Samen ~1.0 x 106 Zellen auf jeder Fibronektin-beschichtete Objektträger mit 1 mL der Medien (1,0 x 106 Zellen/mL Medien). Samen der Zellen 24 h vor dem erwarteten Antrag der laminaren Strömung, wenn keine andere Behandlung durchgeführt werden soll.
    Hinweis: Diese Zahlen sind als Leitfaden für Experimente mit 24 h der Strömung verwendet.
    1. Passen Sie die Aussaatdichte um eine konfluierende Monolage von Zellen zum Zeitpunkt der Ernte Zelle und RNA-Extraktion zu erreichen.
  2. Lassen Sie die Zellen an der Folie für 15 min bei 37 ° c zu halten
  3. Fügen Sie 3 mL Medien in jede Vertiefung der Zelle Kulturschale die Folie abdecken und inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C für 24 h mit 5 % CO2.

4. kleine störende RNA (SiRNA) Transfection

  1. Vorbereitung der Zellen auf Objektträgern für SiRNA Transfection und Flow-Experimente
    1. Folgen Sie das Protokoll in den Schritten 2 (Folie Beschichtung) und 3 (Zelle Aussaat auf Glasplatten) Glas-Folie-Vorbereitung und Beschichtung für Flow-Experimente.
    2. Samen Zellen 24 h vor der SiRNA-Behandlung (48 h vor dem Auftragen der Laminar-Flow).
    3. Samen menschlichen Endothelzellen in antibiotikafreien Medien auf 750.000 bis 1 x 106 Zellen pro Folie, 85-95 % Zusammenfluss am nächsten Tag zu erreichen.
      Hinweis: HUVECS werden in diesem Protokoll verwendet.
  2. Vorbereitung der SiRNA-Lipid-basierte Transfection Reagens komplexe (pro Folie)
    1. Entwerfen Sie benutzerdefinierte SiRNAs oder Bestellung vorgefertigten SiRNAs für das gewünschte gen von Interesse.
      Hinweis: Führen Sie die folgenden Schritte in eine biologische Kabinett.
    2. 6 µL von SiRNA (20 µM bestand) in 414 µL reduzierte Serum Medium hinzufügen (siehe Tabelle der Materialien) und vorsichtig mischen durch pipettieren.
    3. Verdünnen Sie 49,5 µL sanft gemischte Lipid-basierte Transfection Reagens (siehe Tabelle der Materialien) in 130,5 µL reduzierte Serum-Medium.
    4. Vorsichtig mischen und in 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    5. Kombinieren Sie verdünnte SiRNAs und Lipid-basierte Transfection Reagens, mischen Sie vorsichtig und 15 min bei Raumtemperatur inkubieren. Mischung sanft, Unterbrechungen der Lipid-basierte Transfection Reagens komplexe zu vermeiden.
      Hinweis: Die Lösung trüb als komplexe Form erscheinen.
    6. Während komplexe bilden, entfernen Sie das Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellen 1 X mit reduzierten Serum Medium.
    7. Jede Folie 2,4 mL reduzierte Serum Medium hinzufügen.
    8. Jede Platte 600 µL sanft gemischte SiRNA-Lipid-basierte Transfection Reagens komplexe hinzu, und rocken Sie die Platte hin und her zu mischen. Sicherzustellen, dass die Endkonzentration von SiRNA 40 nM. Stellen Sie sicher, dass die Folie vollständig bedeckt ist.
    9. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C für 4 h.
    10. Hinzugeben Sie 1 mL Antibiotika-freie Endothelzellen Wachstumsmedien, enthält 3 x die normale Konzentration von fetalen bovine Serum (FBS) ohne die Transfektion Mischung.
    11. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C bis zum Gebrauch.

5. Berechnung des Volumenstroms anhand der gewünschten Schubspannung9

  1. Berechnen Sie die Fließgeschwindigkeit basierend auf der gewünschten Schubspannungen nach folgender Gleichung:
    Equation 1
    Hier,
    Q ist der Durchfluss in mL/min;
    Τ ist die gewünschte Scherspannung Dynes/cm2 (1 Pa = 10 Dynes/cm2);
    w ist die Breite des Parallel-Platte Strömungsraum in cm;
    h ist die Höhe des Parallel-Platte Strömungsraum in cm;
    µ ist die Viskosität des Mediums im cP (g/Cm·s).
    Hinweis: Typische laminar Scherspannung (nicht-pulsierender) in diesem Workflow sind Experimente bei τ = 1 Pa (10 Dynes/cm2). µ ist messbar mit einem Viskosimeter wie ein Kegel-Platte-Viskosimeter und kann je nach Inhalt der Medien einschließlich Serum und zusätzliche Dextran-9.
  2. Um eine spezifische τ (Schubspannung) zu erreichen, Einstellen der Durchflussmenge und/oder Viskosität. Bei höheren Strömungsgeschwindigkeiten können adhärente Zellen von der Folie zu distanzieren. Probe-Flussraten mit typischen Flow Kammern sind in Tabelle 1dargestellt.

6. Aufbau einer dedizierten Umgebung für Monitoring-System und mehreren Parallel-Platte Fluss Kammern (Abbildung 2)

  1. Verwenden Sie einen großen beheizten Einheit/Inkubator mit mehreren Regalen, Elektrizitätsbinnenmarkt Zugang und Glastüren — genannt Strand (integrierte Umgebung mit einstellbarer CO2 ) und Wärme — um mehrere Flow Kammern gleichzeitig für Haus Experimente, die Schubspannung und direkten Vergleich zwischen zwei oder mehr Behandlungen oder Ausgänge (d.h., DNA, RNA und Protein) erfordern.
    Hinweis: Am Strand ermöglicht häufige Überwachung der Strömung Schaltung, einschließlich der Durchfluss ohne häufige Unterbrechungen der Umwelt.
  2. Sorgen Sie für angemessene CO2 für das Experiment zur Verfügung steht und, dass die CO2 Monitor funktioniert. Sicherzustellen Sie, dass die Wasserschale entsprechend gefüllt ist, so dass befeuchtete Luft.

7. Aufbau des Apparates Parallel-Platte Fluss

Hinweis: Für die Herstellung von parallelen Platten findest du Lane Et al. 9.

  1. Autoklaven der Fluss Kammer Platten, Reservoir, Dämpfer, Schlauch und Luer für jede parallele Platte Fluss Kammer Aufbau wie in Tabelle 2angegeben.
  2. Aufbau einer Schleife fließmontage (Abbildung 3).
    1. Legen Sie sterile Handtücher in die biologische Sicherheit Kabinett. Montieren Sie die Fluss-Loop-System, zuerst ohne Parallel-Platte Strömungsraum in dem biologischen Sicherheitsschrank.
    2. Verbinden Sie die Schlauch Montage für das Reservoir:
      1. Legen Sie ein #14 harte Rohr in ein Loch und zwei #14 weichen Röhren in die anderen zwei Löcher in der Kappe des Flow-Stausees. Stellen Sie sicher, dass eines der weiche Rohre den Boden des Stausees als Abfluss Schlauch berührt.
      2. Legen Sie ein 1/16" männlichen Luer am Ende der hart #14 tube und legen ein Sterilfilter als eine Entlüftung.
      3. Legen Sie ein 1/16" weiblichen Luer am Ende des #14 weichen Zufluss Rohr, aus dem Reservoir, und fügen Sie ein 4-Wege-Hahn.
        Hinweis: Für die Genanalyse Ausdruck oder sonstiger Studien wo Perfusates brauchen nicht gesammelt werden, können 2-Wege-Hähne statt 4-Wege-Hähne in diesem Protokoll verwendet werden.
      4. Legen Sie ein 1/16" männlichen Luer-Anschluss am Ende des Rohres #14 weichen Abfluss aus dem Reservoir.
    3. Verbinden Sie das Reservoir Abfluss Rohr mit Pumpenschläuche: Platz 1/16" weiblichen Luer an jedem Ende einer #13 harte Röhre (Pumpenschläuche). Schließen Sie den Schlauch #14 weichen Abfluss aus dem Reservoir der #13 harte Rohr durch den Anschluss 1/16" männliche und weibliche Luers zusammen.
    4. Die Pumpenschläuche mit "Dämpfer Brücke" Schläuche verbinden: Platz 1/8" männlichen Luer-Anschluss und einen 1/8" weiblichen Luer an jedem Ende einer #16 weiche Röhre. Schließen Sie die 1/16" weiblichen Luer #13 harte Rohr (Ende Abfluss der Pumpenschläuche) mit 1/8" männlichen Luer die #16 weichen Schlauch.
    5. Schläuche für die Flow-Dämpfer montieren: Platz 3/16" männlichen Luer-Anschluss an einem Ende der #25 weichen Schlauch und wiederholen Sie diesen Vorgang für die andere Seite des Fluss-Dämpfer. Befestigen Sie die freien Enden der #25 weiche Rohre auf jeder Seite des Fluss-Dämpfer.
    6. Den "Dämpfer Brücke" Schlauch mit Schlauch "Connect" für die Fluss-Toleranz: Schließen Sie einen #25 weichen Schlauch von der Flow-Dämpfer mit der #16 weichen Schlauch mit 1/8""Dämpfer-Brücke"weiblichen Luer-Anschluss von der Seite #16"Dämpfer Brücke"und der bereits platzierten 3/16" männlichen Luer von der #25 weiche Dämpfer Tube Seite.
    7. Montieren Sie "Kammer-Brücke" Schlauch:
      1. Legen Sie eine 1/8" weiblichen Luer-Anschluss und einen 1/8" männlichen Luer an jedem Ende einer #16 weiche Röhre ("Kammer-Brücke" Schlauch).
      2. Schließen Sie die 1/8" weiblichen Luer der"Kammer-Brücke"mit 3/16" männlichen Luer auf der #25 weichen Schlauch aus dem freien Ende des Flow-Dämpfer.
      3. Am 1/8" männlichen Luer (freies Ende) der"Kammer-Brücke"Schläuche, legen Sie ein 4-Wege-Hahn.
    8. Verbinden Sie den 4-Wege-Hahn "Kammer-Brücke" freien Ende mit der 4-Wege-Hahn vom Reservoir Zufluss weichen Schlauch (aus Schritt 7.2.2.3). Schließen Sie die Hähne.
    9. Am Stausee und Dämpfer Medien hinzufügen. Fügen Sie 35 mL Medien für die 48-h-Belichtung, Stress zu scheren hinzu das Reservoir und 25 mL auf die Toleranz. Stellen Sie die Lautstärke der Medien aufgrund der Dauer des Experiments fließen und die Anzahl der Zellen ausgesät.
    10. Bringen Sie die montierte Flow Loop-System an der Pumpe am Strand. #13 harte Rohr (Pumpenschläuche) in den Pumpenkopf zu platzieren und befestigen. Öffnen Sie die Hähne.
    11. Schalten Sie die Pumpe und erhöhen Sie Pumpe langsam. Die Medien durch die Loop-System zirkulieren zu lassen. Suchen Sie nach einer Leckage oder Blockierung (z.B. Druckaufbau). Stellen Sie sicher, dass die Medien zurück zum Stausee fließt.
  3. Aufbau der Kammer fließmontage
    1. Legen Sie eine 1/8" weiblichen Luer-Anschluss an einem Ende eines # 16 weichen Schlauch und befestigen Sie eine 4-Wege-Hahn. Legen Sie das freie Ende des Rohres auf der rechten Seite der oberen Platte (Zufluss -Seite).
    2. Legen Sie eine 1/8" männlichen Luer-Anschluss an einem Ende eines # 16 weichen Schlauch und befestigen Sie eine 4-Wege-Hahn. Befestigen Sie das freie Ende des Rohres auf die linke Seite der oberen Platte (Abfluss Seite).
    3. Legen Sie eine 1/8" männlichen Luer-Anschluss und einen 1/8" weiblichen Luer an jedem Ende einer #16 weiche Röhre (bubble Trap Schläuche). Befestigen Sie den Schlauch an Blase Falle über die 1/8" männlichen Luer. Befestigen Sie ein 4-Wege-Hahn am anderen Ende der Schläuche über die 1/8" weiblichen Luer.
    4. Übertragen Sie sterile Pinzette, die Zelle ausgesät Objektträger aus der Zelle 4-Well Kulturschale Aussparung auf der Bodenplatte. Sicherstellen Sie, dass die Zelle ausgesät Seite der Folie Glas nach oben zeigt.
    5. Der Bodenplatte innerhalb der roten Dichtung-Linie um die Platte mit einer 10-mL-Spritze, 10 mL warmen Medien hinzufügen. Die Medien durch die Folie und decken die Zellen zu ermöglichen. Hinzufügen von Medien direkt auf der Folie zu vermeiden.
    6. Legen Sie vorsichtig die obere Platte an der Bodenplatte, Ausrichten von einer Seite zur anderen. Die Einführung von Luftblasen zu vermeiden. Verschrauben Sie die Platten fest.
    7. Entfernen Sie Luftblasen aus der Blase Falle durch den Absperrhahn auf der rechten Seite (Zufluss) der Platte öffnen und sanft spülen 20 mL warmen Medien mit einer 30-mL-Spritze. Stellen Sie sicher, den Absperrhahn auf der linken Seite (Abfluss) der Platte geschlossen ist und dass die Medien durch die Blase Falle Absperrhahn (offen) fließt. Entsorgen Sie die gespülten Medien.
    8. Schließen Sie den Absperrhahn auf die Blase-Falle und öffnen Sie den Absperrhahn auf der linken Seite (Abfluss) der Kammer. Erheben Sie die linke Seite (Abfluss) der Kammer zu einem Winkel von 45° zu und spülen Sie sanft 20 mL warmen Medien mit einer 30-mL-Spritze von der rechten Seite (Zufluss) der Kammer um Luftblasen aus der Kammer zu entfernen. Luftblasen können durch das Fenster visualisiert werden. Entsorgen Sie die gespülten Medien.
    9. Schließen Sie die Hähne auf beiden Seiten der Kammer und GAP. Überprüfen Sie die Zellen, indem Mikroskopie.
    10. Die Kammer an den Strand mit dem vorher montierten schleifensystem zu transportieren.
    11. Langsam sinken die Pumpendrehzahl und Anhalten der Pumpe. Schließen Sie die Hähne auf dem Fluss-Schleife-System auslaufen zu verhindern.
    12. Schließen Sie die Kammer und loop-System zusammen über Hähne. Öffnen Sie alle Hähne.
    13. Langsam erhöhen Sie die Pumpendrehzahl und untersuchen Sie das Set-up für Leckage oder Verstopfung. Stellen Sie sicher die Medien zirkuliert in eine Richtung und kehrt zurück zum Stausee.
    14. Ort des Flow Sensors auf der "Kammer-Brücke" Schlauch auf der Seite der Zufluss der Kammer befindet. Stellen Sie sicher, dass der Sensor richtig in Strömungsrichtung ausgerichtet ist.
    15. Passen Sie die Pumpendrehzahl die Durchflussmenge zu erhalten, die zuvor berechnet wurde, basierend auf der gewünschten Schubspannung.
      Hinweis: Die Durchflussmenge variieren je nach Höhe und Breite der einzelnen Kammern sowie die Viskosität des Mediums.
    16. Schalten Sie den CO2 Tank 5 % CO2 zu erreichen und eine Wasserschale in Strand legen.

8. Ernte der Zellen und Extraktion von RNA aus den Strömungsraum

  1. Sobald die gewünschte Zeitspanne Fluss abgeschlossen ist, langsam herunterdrehen der peristaltischen Pumpengeschwindigkeit auf 0 und schalten Sie das Gerät. Schnell schließen Sie alle offenen Hähne und entfernen Sie die Kammer und den angeschlossenen Schlauch mit einem Absperrhahn an jedem Ende.
  2. Nehmen Sie die Kammer zu einem sauberen Benchtop und Schrauben Sie sanft alle entfernen die obere Platte. Nadelnase Pinzette, entfernen Sie den Objektträger aus der Bodenplatte und setzen Sie es in ein 100 mm Durchmesser Gewebekultur Gericht.
  3. Waschen Sie die Folie mit 10 mL kalte Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)- / - und überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, zelladhärenz und Ausrichtung in Strömungsrichtung zu bestätigen.
  4. Aspirieren Sie die PBS von der Platte und übertragen Sie die Folie auf einen sauberen 100 mm Durchmesser Teller zu. Hinzufügen von 350 µL Lyse Puffer von der RNA-Extraktion kit (siehe Tabelle der Materialien), mit 1/100 des Beta-Mercaptoethanol, auf die Folie.
    Achtung: Beta-Mercaptoethanol in einer chemischen Dampfhaube hinzufügen.
  5. Kratzen Sie die Zellen aus der Folie mit einem Polyethylen-Blatt Zelle Schaber. Kippen der Gewebekultur Schale, so dass die Flüssigkeit zum Pool an der Unterseite, und die Objektträger mit einer Pinzette zu entfernen. Die Zelle lysate zu einem Schlauch 1,5 mL Pipette und halten sie auf dem Eis.
  6. Verdünnen Sie Lager exogene Verweis RNA (Luciferase RNA) auf 0.0025 ng/µL durch serielle Verdünnung vor der Probe hinzufügen. Zum Beispiel, wenn die Lager Konzentration 1 µg/µL, eine Verdünnung von 1/400.000 ist erforderlich, um 0,0025 erreichen ng / µL. Fügen Sie 10 µL verdünnt Luciferase RNA zu jeder Probe der Zelle lysate für nachgeschaltete RNA Isolierung und Analyse.
  7. Fahren Sie mit dem RNA-Extraktion-Protokoll gemäß den Anweisungen des Herstellers, oder frieren Sie der lysate bei-80 ° C bis die Extraktion fortsetzen ein.

9. Berechnung der Effizienz der RNA-Extraktion und cDNA Synthese

Hinweis: Berechnen Sie die Luciferase-Effizienz nach RT-qPCR durch den Vergleich der theoretischen Ausbeute und die experimentelle Ausbeute.

  1. Bestimmen Sie die theoretische Ausbeute für Luciferase RNA.
    1. Bestimmen Sie den Gesamtbetrag der Luciferase Kopien pro Probe hinzugefügt. (Hinzufügen von 0,025 ng/Probe = 2,73 x 107 Exemplare der Luciferase RNA pro Probe vor der RNA Extraktion.)
    2. Berechnen Sie die Molekülmasse der Luciferase RNA mit einer durchschnittlichen molekularen Masse pro Nukleotid von 330 g/Mol und Multiplikation mit der Länge des Firefly Luciferase RNA, 1652 Nukleotide.
    3. Teilen Sie die Menge der Luciferase RNA hinzugefügt (0,025 ng) für jede Probe vor der RNA-Extraktion durch die molekulare Masse die molare Menge liefern. Dann multiplizieren Sie diese mit Avogadro die Zahl der Exemplare pro Probe hinzugefügt zu erbringen.
    4. Berechnen Sie die theoretische Ausbeute für die Luciferase-Kopien für jede RT-qPCR-Reaktion unter Verwendung der Gleichung:
      Equation 2
  2. Berechnen Sie die experimentelle Ausbeute für die Luciferase-Kopien für jede RT-qPCR Reaktion mithilfe der Luciferase Plasmid eine Standardkurve für RT-qPCR zu generieren.
  3. Berechnen Sie die Luciferase Wirkungsgrad (%) unter Verwendung der Gleichung:
    Equation 3

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Representative Results

Erfolgreiche Linearisierung der Luciferase Plasmid mit Restriktionsenzymen verdaut Produkte auf einem Agarosegel (Abbildung 1) bestätigt. Die Größe des linearisierten Produktes bestätigte mit DNA-Leitern und durch Vergleich mit unbeschnittenen Plasmid.

Wir haben den Parallel-Platte Fluss Kammer Aufbau von Lane Et Al. angepasst. 9 für Experimente, die mehrere Bedingungen/Behandlungen mit Scherbeanspruchung oder mehrere Schubspannung Bedingungen erfordern. Wir verwenden eine dedizierte Umgebung, der Strand, das Multiple beherbergen kann, komplett montiert Fluss Schaltungen, dass alle Durchflussmengen (Abbildung 2) überwacht haben. Die Durchflussmenge wird überwacht nur oberhalb des Parallel-Platte-Montage (Abbildung 3). Die Fluss-Schaltungen und Preise können direkt durch Glastüren ohne Schwankungen in Temperatur, Luftfeuchtigkeit oder Gasgehalt innerhalb der Strand überwacht werden.

Herstellungsverfahren führt zu kleinen Variationen in der Kammer Höhe. So müssen Flussraten für jede Kammer, die gleichen Scherspannung (Tabelle 1) zu erreichen berechnet werden. In der Theorie Kammern mit identischen Höhen können identische Flussraten um der gleichen Schubspannung zu erreichen und können in Serie verwendet werden. Typische Experimente mit Endothelzellen verwenden Schubspannung von 0 - 1,5 PA Laminar Schubspannung von 1 Pa diente in diesem Workflow, Modell arterielle Endothelzellen Schubspannung. Im Laufe der Zeit mit Einsatz kann auch Variationen zwischen Kopf pumpeneinstellungen und in den Pumpenköpfen sein. Mit dem Flow-Meter kann diese Unterschiede ausmachen.

Experimente mit der Anwendung der Schubspannung oft beinhalten mehrere Schubspannung Bedingungen Behandlungsbedingungen und Zeitpunkten. Wenn möglich, verwenden wir eine endogene Referenz RNA-Konto für jede Variabilitäten in der Versuchsanordnung. Für einige Versuche eine endogenen Referenz-RNA mit quantitativen Stabilität zu finden ist nicht machbar16. Darüber hinaus kann quantitative Stabilität oder Instabilität von endogenen Referenz Genen zwischen den Proben entweder Stimulus-abhängige Effekte auf zelluläre Ausdruck Ebenen oder Variationen Wirkungsgrade von RNA-Extraktion oder reversen Transkription zugeschrieben werden. Um für diese Ineffizienz, und in der Umgebung wo eine endogene Referenz-gen nicht quantitativ stabil ist zu berücksichtigen, verwenden wir ein Spike-in exogene Referenz-gen. Für Experimente mit laminar Schubspannung in Säugetieren Endothelzellen verwenden wir ein Glühwürmchen Luciferase RNA als exogene RNA Spike-in (Abb. 4A).

Abbildung 4 zeigt analysierten RT-qPCR Versuchsdaten aus Schubspannung Experimente Krüppel-ähnlichen Faktor 2 (KLF2) Beurteilung der Verlustfunktion mit SiRNA. KLF2 ist eine Transkription Faktor hochreguliert durch laminare Strömung in Endothelzellen und großen transkriptionelle Vermittler der endotheliale Genexpression in der Umgebung von Laminar-Flow2.

Abbildung 4A zeigt Luciferase Wirkungsgrade für drei separate Experimente, jeweils mit zwei Kammern fließen. Luciferase Wirkungsgrade zwischen Proben von einem Experiment (Experiment 1) ähnlich sein können oder zeigen gewisse Variabilität (Experimente 2 und 3) (Abb. 4A). Diese Ergebnisse sind besonders wertvoll in experimentellen Systemen wo sind nur kleine absolute Veränderung gesehen. Die Verwendung von einem exogenen Referenz-gen möglicherweise besonders wichtig bei versuchen, wo experimentelle Behandlungen stören können die Effizienz der reversen Transkription oder PCR17. Typisch sind die Ergebnisse in Abbildung 4A dargestellt. Ein Luciferase-Wirkungsgrad von 5 % bedeutet, dass 5 % der Luciferase RNA (d. h.der erste Ausgangsbetrag der RNA) hinzugefügt, um die Probe vor der RNA-Extraktion von RT-qPCR erkannt wird. Zwischen den Proben oder Bedingungen in einem einzigen Experiment sind Luciferase Wirkungsgrade in der Regel ± 50 %. Ergebnisse sollten mit Vorsicht interpretiert werden, wenn die Variabilität der Luciferase Effizienz > 50 % und sollte eine Überprüfung der experimentellen Verfahren und Bedingungen enthalten.

Abbildung 4 b zeigt typische experimentelle Ergebnissen der RT-qPCR aus wiederholten Schubspannung Experimenten, jeweils mit mehreren Parallel-Platte Fluss Kammern. Innerhalb jedes Experiment KLF2 mRNA Expression in dreierlei Hinsicht normalisiert. Die ersten Normalisierung verwendet eine endogene Referenz RNA, Cyclophilin A (CycA). Die zweite Normalisierung verwendet eine exogene Referenz RNA, Firefly Luciferase (Luc). Die dritte Normalisierung verwendet die endogenen und exogenen Verweis RNA. Innerhalb jedes Experiment, dargestellt in Abbildung 4 balle drei Methoden Normalisierung (Normierung auf das endogene Referenz-gen, das exogene Referenz-gen und beide endogene und exogene Referenz Gene zusammen) liefert ähnliche Ergebnisse. Ändert sich die Normalisierung Methode deutlich die Ergebnisse (z.B.führt zu > 50 % Unterschied), sollten die Ergebnisse mit Vorsicht interpretiert werden. Als es beträchtlichen Variabilität zwischen den Methoden der Normalisierung gibt, sollten die endogenen Referenz-Gens überprüft werden, wie es eine abhängige Variable in der experimentellen System sein kann. Ebenso sollten die experimentellen Verfahren und Bedingungen überprüft werden. In Abbildung 4 bliefert KLF2 Zuschlag mit SiRNA ähnliche Knockdown Effizienz zwischen drei separate Experimente (Experiment 1, 2 und 3). Wir verwendet drei unterschiedliche biologische Proben für diese Experimente mit zwei gleichzeitig laufende Fluss Kammern mit Schubspannung bei 1 Pa für jedes Experiment.

Figure 1
Abbildung 1: Agarose-Gelbild der Linearisierung von exogenen Luciferase Plasmid. Supercoiled und 1 kb + DNA-Leitern dienen als Marker bestimmen beide ungeschnitten und Schnittgrößen Luciferase Plasmid in Kilobases (kb). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: schematischer Überblick über mehrere Flow Schaltung Baugruppen innerhalb einer dedizierten Umgebung (Strand). Die Durchflussmengen in beiden Flow-Schaltungen sind problemlos in Echtzeit überwacht, ohne zu stören die Umwelt, und beide Kreisläufe können gleichzeitig laufen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Schematische Übersicht über einen einzigen Schaltung fließmontage. Die Schlauchgrößen und Luers verwendet sind in dieser Zahl angegeben. Sicherstellen Sie, dass der Durchflussmesser ist in Richtung der Strömung orientiert und den Strömungsraum vorgeschaltet platziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Vertreter ergibt sich aus KLF2 Verlustfunktion-Experimente in menschlichen Endothelzellen shear Stress ausgesetzt (1 Pa) für 24 h (A) dieses Panel zeigt die Quantifizierung der exogenen Luciferase RNA in drei separate Strömung versuchen. Luciferase Effizienz können zwischen Proben von einem Experiment (Experiment 1) ähnlich sein oder zeigen gewisse Variabilität (Experimente 2 und 3). Luciferase (absolute Exemplare) ist die Kopienzahl des Luciferase RNA durch Reverse-Transkriptase quantitative PCR (RT-qPCR) durch absolute Quantifizierung mit Hilfe einer Standardkurve ermittelt. Luciferase Effizienz ist die experimentelle Luciferase-Kopien, geteilt durch die theoretische Luciferase-Kopien für jede Probe multipliziert mit 100 (siehe Schritt 8 des Protokolls). Relative Luciferase Effizienz ist die Luciferase Effizienz jeder einzelnen Probe dividiert durch Referenzzustand (Fluss + Ctlsi) innerhalb jedes Experiment. (B) Diese Tafeln zeigen die Normalisierung der Gen-Expression in einer Reihe von Probe Schubspannung Experimente mit beide Gene endogene und exogene Referenz. Die Ergebnisse stammen aus Reverse-Transkriptase quantitative PCR (RT-qPCR). Knockdown von KLF2 mRNA Ausdruck zeigt sich im Beisein von Laminar-Flow mit Schubspannung von 1 Pa für 24 h FC = Falte ändern; CycA = Cyclophilin A, als eine endogene Referenz RNA; Luc = Luciferase, als eine exogene Referenz RNA verwendet. Die Daten, adaptiert von Mann Et al. 5. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Kammer-Höhe
(Mikrometer, µm)		 Breite Kammer
(Zentimeter, cm) 		Durchfluss (mL/min) für 1 Pa Schubspannung Viskosität (Centipoise, cP)
303.80 1.90 19.48 0.90
326.10 1.90 22.45 Uhr 0.90
344.84 1.90 25.10 0.90
319.06 1.90 21.49 0.90

Tabelle 1: Kammer Höhen und Beispiele für Durchflussmengen für Kammern fließen Scherbeanspruchung von 1 zu erreichen PA

J-Tücher
Pinzette
Vorratsflasche und Kappe
Dämpfer und Kappe
Fluss-Schleife
1/16" männlichen Luer x 3
1/16" weiblichen Luer x 3
1/8" männlichen Luer 2
1/8" weiblichen Luer x 4
3/16" männliche Adapter 2
14 L/S harten Rohr (2 Zoll) X 1
14 L/S Soft Tube (5 Zoll) 2
16 L/S Soft Tube (3 Zoll) 2
25 L/S Soft Tube (3 Zoll) 2
13 L/S harten Rohr (10 Zoll) X 1
Strömungsraum
1/8" männlichen Luer 2
1/8" weiblichen Luer 2
16 L/S Soft Tube (3 Zoll) X 3
Ober- und Unterplatten
Schrauben

Tabelle 2: Teile in Schritt 6.2 des Protokolls autoklaviert werden.

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Discussion

Scherspannung ist eine physiologische Bedingung, die endotheliale Funktion teilweise moduliert durch Einwirkung auf stationären Gen Ausdruck2,5. Modelle der Genregulation in verschiedenen Schubspannung Bedingungen tragen zu einem besseren Verständnis der Endothelfunktion. Diese pragmatische Workflow umfasst eine Fluss-Schaltung mit einem Parallel-Platte Strömungsraum adaptiert von Lane Et al. 9 und stellt laminar, nicht pulsierender Verlauf. Die gesamte Einrichtung wurde entwickelt, um Experimente zu erleichtern, die erfordern mehrere Flow Kammern und experimentelle Variabilität in dieser Umgebung zu minimieren.

Der fließmontage Schaltung ist ein wichtiger Bestandteil dieses Workflows und angepasst von Lane Et al. 9. mehrere Anpassungen dieser Versammlung und Protokoll wurden vorgenommen, um Unterschiede in der experimentellen Systemen widerspiegeln. Eine große beheizte Einheit, der Strand ist eine Anpassung, die den gleichzeitigen Betrieb und Überwachung von mehreren Fluss Schaltungen innerhalb der gleichen Umgebung erleichtert. Dieses System wurde für die Anwendung der Schubspannung an Endothelzellen für verschiedene Zeiträume von 1 h bis zu 7 Tagen und auf mehreren Ebenen der Schubspannung erfolgreich eingesetzt (z.B.1.0, 1.5 und 2.0 Pa). Dieses System war auch für gen-Knockdown Studien verwendet, um die Funktion eines Flow-responsive endotheliale Gens in der Umgebung der Schubspannung (Abbildung 4)5bewerten. Es gibt beträchtliche Variabilität zwischen Pumpen und Pumpenköpfe, die sich auch im Laufe der Zeit aufgrund des normalen Verschleißes ändern können. Um diesen Unterschieden Rechnung zu tragen, verwenden wir einen Durchflusssensor liegt proximal zu Strömungsraum Flussraten kontinuierlich überwachen. Verschiedene Größen von Schläuchen und Luers dienen dazu, einen festen Sitz für jede Komponente zu gewährleisten und um Undichtigkeiten während der Experimente zu verhindern. Wir zählten Zellen und ca. 1.000.000 Zellen pro Objektträger, tropfenweise, ausgesät und lassen Sie dann die Zellen Inkubation bei 37 ° C für 15 min zur Einhaltung der Effizienzsteigerung. Im Vergleich zu endothelialen Vorläuferzellen, die für eine kurze Zeit vor dem Auftragen der Schubspannung9ausgesät werden können, säen wir menschlichen Endothelzellen für mindestens 24 h vor dem Auftragen der Schubspannung. Kürzere Laufzeiten können zu das verdrängen der Zellen während Flow oder eine diskontinuierliche Schicht aus Endothelzellen, auch mit den entsprechenden Aussaatdichte führen. Wir legen Wert auf die Überprüfung der Folien für eine konfluierende Monolage von Endothelzellen vor und nach der Anwendung der Schubspannung. Wir finden, dass Folien beschichtet mit FIBRONEKTIN, eine natürliche extrazelluläre Matrix Komponente18, die endotheliale monomolekularen Film mehr konsequent im Vergleich zu Seiten mit Gelatine beschichtet pflegen (denaturiert Fibrillären Typ I Kollagen). Schließlich sind die Flow-Dämpfer in diesem Protokoll optimiert, um 30 mL von Medien, im Vergleich zu 190 mL Medien für andere Hersteller verwenden.

Mehrere Schritte in der Schaltung fließmontage erfordern zusätzliche Pflege. Eine sogar Monolage von Endothelzellen sollten vor dem Auftragen der Schubspannung festgelegt werden. Es ist wichtig, Samenzellen auf dem Objektträger tropfenweise zur Erhöhung der Zahl der Zellen, die an der Folie und damit die gesamte Folie Abdeckung halten. Die Wartezeit zwischen Zelle seeding und Hinzufügen von zusätzlichen Medien auf die Folie in der Regel verbessert die Aussaat Effizienz bietet genügend Zeit für die Zellen an der Folie haften, anstatt in das Multi-Dia-Fach weggespült werden. Inspizieren Sie Zellen visuell vor, während und nach der Anwendung der Schubspannung. Zu diesem Zweck kann ein Mikroskop am Strand platziert werden. Durchflusssensor muss in der richtigen Ausrichtung zugeordnet werden und die Ziel-Durchflussmenge für jeden einzelnen Strömungsraum überprüft werden. Die Fluss-Loop-System sollte ohne die Kammer darauf kein Medien durchsickern oder andere Probleme, wie Druckaufbau zu vermeiden, sind die Zellen während der eigentlichen Experimente durchblutet werden. Kontrollieren und Luftblasen im System beseitigen. Während des Tests der Fluss-Loop-Systems sicherstellen Sie, dass die Hähne alle geöffnet sind, vor dem Einschalten der peristaltischen Pumpe ununterbrochen, unidirektional fließen kann. Stellen Sie sicher, dass alle Hähne geschlossen vor dem Anbringen der Strömungsraum an der Schlaufe und vor dem Neustart der Pumpe vollständig geöffnet.

Wir finden, dass der Zusatz eines exogenen Referenz-Gens in einer Vielzahl von Szenarien hilfreich ist. Endothelzellen Medien enthält in der Regel Heparin, ein Inhibitor der PCR17ist. Während einige RNA-Extraktion-Protokolle Schritte zum Entfernen von Heparin enthalten, können Spuren unterschieden in PCR-Effizienz zwischen Proben führen. Potente Behandlungen können auch die Identifizierung eines endogenen Referenz-Gens ausschließen, die quantitativ stabil ist. Unser Labor hat ein effizientes Protokoll um 5' gekappt und Poly-A-tailed Luciferase RNS für den Einsatz als eine exogene Referenz RNA synthetisieren geschaffen. Diese Strategie erwies sich eine kostengünstige Lösung im Vergleich zum Kauf einer handelsüblichen RNS. Während der Vorbereitung der exogenen Referenz RNA ist es wichtig, aliquoten RNA in Einweg-Aliquote mehrere Gefrier-tau-Zyklen zu vermeiden. Gründliches mischen und genaues pipettieren sind entscheidend für die Aufrechterhaltung der Inter aliquoten Konsistenz. Typische Experimente zeigen eine Luciferase-Effizienz im Bereich von 5 % ± 2,5 % aber reichen von 1 bis 10 %. Es ist ratsam, RT-qPCR Ergebnisse für die exogene Referenz RNA-Effizienz und eine endogene Referenz (Zimmermädchen) Gen zu korrigieren.

Für die Experimente, die wir durchführen, sind Glühwürmchen Luciferase Sequenzen als nicht-Säugetier Spike-in Referenz RNA in Säugetieren Modelle verwendet. In Experimenten wo Firefly Luciferase in Zellen exprimiert wird, wäre dies keine entsprechende Referenz-gen. Andere Spezies-spezifische Referenz-Gene können verwendet werden, einschließlich der Caenorhabditis Elegans MiRNA Cel-MiR-3919 und Ribulose Bisphosphate Carboxylase Pflanze RNA20.

Diese Strömung Schaltung modelliert eine 2-D-Monolayer Endothelzellen auf Gewebekultur Kunststoff oder Glas, welches ganz steif geworden. Matrix-Steifigkeit kann die endotheliale Reaktion auf flüssige Schubspannung21beeinflussen. Dieses Modellsystem verwendet eine relativ hohe Sauerstoffkonzentration arteriellen ähnlicher als venöse Sauerstoffkonzentrationen. Dieses Modell ähnelt gerade Segmente größerer Schiffe in einem geschlossenen Herz-Kreislauf-System und bietet eine relativ homogene Umgebung für Endothelzellen auf der Folie. Andere spezifische Bedingungen in 3-d-Strukturen, wie z. B. Bifurkationen oder Krümmungen von Schiffen, sind nicht mit diesem Modell vertreten. Andere Systeme können Modell andere Strömungsmuster, einschließlich derjenigen in gekrümmten Regionen des Gefäßsystems, aber weniger Zellen als die in diesem Protokoll beschriebenen System ergeben. Ebenso können andere Baugruppen besser geeignet sein, > 1 x 106 Zellen benötigt werden, ob eine einzellige Analyse erforderlich ist. Unsere aktuelle Anwendung modelliert nicht pulsierender Laminar-Flow. Jedoch kann dieses Modell verwendet werden, erzeugen andere Wellenformen, einschließlich pulsierende oder oszillierende Wellenformen mit Konsequenz, da die Durchflussmengen kontinuierlich überwacht werden.

Insgesamt bietet dieser pragmatischen Workflow ein System für die gleichzeitige Anwendung der Schubspannung zu mehreren Fluss Kammern mit überwachten Durchflussmengen. Materialien und Verfahren im gesamten Workflow sollen experimentelle Variabilität zwischen Proben und Bedingungen zu minimieren. Dieser Workflow für RNAi-Experimente in der Umgebung von Laminar-Flow erfolgreich eingesetzt und eignet sich auch für keine Experimente erfordern mehrere Bedingungen mit laminarer Scherbeanspruchung oder mehrere laminar Schubspannung Größen und/oder Zeitpunkten, einschließlich Alternative Wellenformen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch CIHR MOP 142307, P.A.M. H.S.J.M. ist ein Empfänger einer kanadischen Institute der Gesundheit Forschung Ausbildung in der regenerativen Medizin Gemeinschaft. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. und M.K.D. sind Empfänger von Königin Elizabeth II Graduate Stipendien in der Wissenschaft und Technik.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA gibco 25300-062
10 mL Syringe BD 302995
10 mm2 Culture Dish Sarstedt 83.3902
30 mL Syringe BD 302832
4-Way Stopcocks Discofix D500
Aluminum foil
BEACH Darwin Chambers Company MN: HO85, SN: 4947549
Cell Scrapers
CO2 Meter BioSphenix, Ltd. MN: P120, SN: 0342
CO2 Sensor BioSphenix, Ltd. MN: C700, SN: 52852
Distilled water gibco 15230-170
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) -/- gibco 14190-144
Endothelial Cell Growth Medium 2 Promo Cell C-22011
Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix Promo Cell C-39216
Fibronectin (pure) Sigma-Aldrich 11051407001
Filter (0.20 um) Sarstedt 83.1826.001
Flow Dampener and Cap U of T glass blowing shop
Flow Meter: 400 Series Console Transonic Scisense Inc. T402
Flow Meter: 400 Series Tubing Transonic Scisense Inc. TS410
Flow Reservoir and Cap U of T glass blowing shop
Flow Sensor Transonic Scisense Inc. ME4PXL
Isotemp 737F Oven Fisher Scientific FI-737F
J cloth J cloth
Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm) Fisherfinest 12-544-4
Paper sterilization pouch Cardinal Health 92713
Pump (Masterflex L/S Economy Drive) Cole-Parmer 7554-90
Pump Head (Masterflex L/S Easy Load) Cole-Parmer 7518-00
Rectangular 4 Well Dish Thermo Scientific 267061
Tweezers
Name Company Catalog Number Comments
Tubing
Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing Cole-Parmer 06424-25
Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing Cole-Parmer 06424-14
Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing Cole-Parmer 06424-16
Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing Cole-Parmer 06508-13
Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing Cole-Parmer 06508-14
Name Company Catalog Number Comments
Luer
3/16" Male Luer Cole-Parmer 45518-08 For #25 tubing
1/8" Male Luer Cole-Parmer 30800-24 For #16 tubing
1/8" Female Luer Cole-Parmer 30800-08 For #16 tubing
1/16" Male Luer Cole-Parmer 45518-00 For #14 tubing
1/16" Female Luer Cole-Parmer 45508-00 For #14 tubing
Name Company Catalog Number Comments
Knockdown reagents
Oligofectamine Reagent Invitrogen 12252-011
Opti-MEM I Reduced Serum Medium gibco 31985-070
Name Company Catalog Number Comments
In vitro transcription
Generuler 1kb+ DNA ladder Thermo Scientific SM1331
MEGAclear Kit Ambion AM1908
mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Ambion AM1340
pSP-luc+ Promega E4471
Supercoiled DNA Ladder New England BioLabs Inc. N0472S
UltraPure Agarose Invitrogen 16500-500
UltraPure Ethidium Bromide Invitrogen 15585011
XhoI Restriction Enzyme New England BioLabs Inc. R0146S
Name Company Catalog Number Comments
RNA extraction
Beta-mercaptoethanol Sigma M3148-100mL
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104

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References

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Biotechnik Ausgabe 140 Strömungsraum Schubspannung laminare Strömung Parallel-Platte Überwachung Endothel Genexpression Genregulation quantitative PCR Normalisierung Luciferase verweisen RNA
Gen Expressionsanalyse von Endothelzellen ausgesetzt um Stress mit mehreren Parallel-Platte Fluss Kammern Scheren
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Man, H. S. J., Sukumar, A. N., Ku,… More

Man, H. S. J., Sukumar, A. N., Ku, K. H., Dubinsky, M. K., Subramaniam, N., Marsden, P. A. Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers. J. Vis. Exp. (140), e58478, doi:10.3791/58478 (2018).

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