Summary
Här presenteras ett arbetsflöde för kultur och gen uttryck analys av endotelceller under vätska skjuvspänningen. Ingår en fysiska arrangemang för samtidigt bostäder och övervaka flera flöde chambers i en kontrollerad miljö och användning av en exogen referens RNA för kvantitativ PCR.
Abstract
Vi beskriva ett arbetsflöde för analys av genuttryck från endotelceller omfattas av en stadig laminärt flöde använder flera övervakade parallell-plattan flöde chambers. Endothelial celler bildar cellulära innerfoder av blodkärl och kroniskt är utsatta för friktion kraft blodflödet kallas skjuvspänning. Under fysiologiska betingelser, endotelceller funktion i närvaro av olika skjuvspänning. Tillämpningen av skjuvspänning i in vitro- modeller kan således ge större insikt i endotel Svaren i vivo. Parallell-plattan flöde kammaren tidigare utgiven av Lane et al. 9 är anpassad att studera endothelial genreglering i närvaro och frånvaro av stadig (icke-pulserande) laminärt flöde. Viktiga anpassningar i upplägget för laminär som presenteras här inkluderar en stor, dedikerad miljö att huset samtidiga flöde kretsar, övervakning av flöden i realtid, och införandet av en exogen referens RNA för normalisering av kvantitativ realtids PCR-data. För att bedöma flera behandlingar/villkor med tillämpning av skjuvspänning, används flera flöde kretsar och pumpar samtidigt inom samma uppvärmd och befuktade inkubatorn. Flödet av varje flöde krets mäts kontinuerligt i realtid för att standardisera skjuvspänning i hela experimenten. Eftersom dessa experiment har flera villkor, använder vi också en exogen referens-RNA som är spetsade-i vid tidpunkten för RNA-extraktion för normalisering av RNA-extraktion och första-strand cDNA syntes effektivitetsvinster. Dessa steg minimera variabiliteten mellan prover. Denna strategi är anställd i vår pipeline för gen uttryck analys med skjuvspänningen experiment med parallell-plattan flöde kammaren, men delar av denna strategi, såsom den exogena referera RNA spike-i, kan enkelt och kostnadseffektivt sätt användas för andra program.
Introduction
Vascular endothelial celler bildar cellulära innerfoder av blodkärlen i det slutna kardiovaskulära systemet av högre arter. De utgör gränssnittet mellan blod och vävnader och kännetecknas av luminala och abluminal ytor. Endotelet är en mångsidig, aktiva och adaptiva system som reglerar blodflödet, näringsämne människohandel, immunitet och tillväxten av nytt blod fartyg1. I kroppen finns endotelceller normalt i en miljö där de utsätts för cirkulation, skjuvspänningen2friktion kraft. Skjuvspänning är en viktig regulator av endotelceller gene expression3och endotelceller försöker upprätthålla skjuvspänningen inom ett givet intervall2,4. Endotelceller demonstrera angiogena mönstring i avsaknad av skjuvspänningen5 som kan förbättra vävnadsperfusion. Regionala mönster av störd flöde och förändrad skjuvspänning är associerade med uttrycket av inflammatoriska gener6 och utvecklingen av åderförkalkning7,8. Modeller som inkluderar skjuvspänning är således en viktig komponent för att förstå endothelial genreglering.
Vi beskriver en metod för att studera genreglering i vaskulära endotelceller under skjuvspänning. Detta system använder icke-pulserande flöde och härmar vätska skjuvspänningen nivåer och syrgaskoncentrationsmonitor det modell villkoren för arteriell endotelceller. Detta protokoll innehåller uppgifter om metoder för den gen knockdown använder RNA-interferens (RNAi), set-up för tillämpningen av shear stress med parallell-plattan flöde apparater och metoder för spike-av en exogen referens RNA före analys av omvänd-transkriptas kvantitativa polymeras-kedjereaktion (RT-qPCR). Denna rörledning används för att studera genreglering i endotelceller i närvaro och frånvaro av laminar skjuvspänning och omfattar en anpassning av parallell-plattan flow apparaten beskrivs av Lane et al. 9. detta särskilt upplägg var utformad för att underlätta samtidiga bedömningen av flera experimentella villkor som tillåter direkt jämförelse av skjuvspänning, samt normalisering av RNA analys. En stor uppvärmd enhet med kontrollerad luftfuktighet används för att tillåta flera separata flöde chambers och pumpar vara igång samtidigt med flöden som övervakas för varje flöde kammare sammansättning i realtid. Tillämpningen av detta upplägg används för genen knockdown med hjälp av RNAi i fastställandet av laminär/skjuvspänning, men aspekter av detta protokoll kan tillämpas på någon bedömning av RNA uttryck.
Gemensamt förhållningssätt till tillämpningen av shear stress för endotelceller inkluderar mikroflödessystem system10, en Kotte-och-tallrik viskometer11och en parallell-plattan flöde kammaren12. Mikroflödessystem system från olika tillverkare har varit användbar i att studera Mekanobiologi och mechanotransduction i flera cell- och vävnadstyper- och olika biofysiska stimuli. För endotelceller, har de använts för att studera endotelceller i isolering, samt samspelet mellan endotelceller och handel med immun eller tumör celler10. Dessa system är dock mindre lämpligt för återvinning av ett stort antal celler9. Både kon-och-tallrik viskometer och parallell-plattan flöde chambers tillåter återvinning av stort antal celler i konfluenta enskiktslager12. Dessa system kan generera en rad skeva styrkor och mönster12. Parallell-plattan flöde kammare montering9 har fördelen att realtid imaging kan utföras genom glasfönstret att utvärdera cellulära morfologi vid någon tidpunkt. Dessutom kan perfusatet samlas under sterila förhållanden. För systemet presenteras här, kan flödet också övervakas i realtid och en multi chamber set-up, vilket underlättar underhåll av skeva villkor mellan kamrarna.
För representativa experiment, mänskliga navel ven endotelceller (HUVEC), som företräder en makrovaskulära endotelceller typ, används och skjuvspänning vi använder (1 Pa) återspeglar arteriell villkor (0,1 - 0,7 Pa). Emellertid detta protokoll kan användas med andra typer av endothelial celler och skjuvspänning kan justeras enligt den experimentella frågan. Till exempel utvärdering av mänskliga endothelial celler i förhållanden som modell venösa cirkulationen skulle kräva lägre nivåer av skjuvspänning (1-6 Pa) och studier som modell mikrovaskulära omlopp har utnyttjat skjuvspänningen nivåer av 0,4 - 1,2 Pa13 , 14. Dessutom skjuvspänningen kan variera även mellan endotelceller inom samma blodkärl6. I den nuvarande strukturen, ett enda övervakningssystem används som kan samtidigt övervaka fyra separata flöde loopar. För labs som behöver mer flöde loopar, finns det utrymme i den dedikerade miljön för ett system för övervakning av ytterligare.
RT-qPCR används för absoluta kvantitering av genuttryck i inställningen av shear stress. Relativa uttrycket av målgener används ofta att jämföra RNA uttryck över villkoren. Vissa RNA arter kan finns på mycket små mängder eller vara frånvarande, vilket komplicerar relativa mätningar. Exempelvis kan långa icke-kodande RNAs i endotelceller utöva potenta effekter vid relativt låga kopia nummer per cell5. Dessutom kan skillnader i primer effektivitet leda till en felaktig tolkning från utnyttja metoden delta-delta cycle tröskel (Ct) att analysera data. För att lösa detta problem, utför vi absolut kvantifiering genom att generera en standardkurva med en känd mängd av plasmid DNA. Dessutom kompletterande DNA (cDNA) syntes är en ineffektiv process, och skillnader i cDNA effektivitet kan redogöra för skillnader i RNA uttryck mellan villkor och prover15. Tillämpningen av shear stress eller transfection reagenser kan påverka cellproliferation, apoptos och livskraft eller lägga till komponenter som kan interferera med RNA isolering eller cDNA syntes. För att beakta möjligheten att bias från RNA isolering och cDNA syntes, använder vi en spike-i RNA kontroll syntetiseras i labbet, lagt till vid tidpunkten för RNA-extraktion och mätt med varje cDNA syntes via RT-qPCR. Detta tillåter inte bara justeringen för tekniska skillnader i RNA-extraktion och cDNA syntes men låter också beräkning av absolut kvantiteter per cell, när celltalet är känd.
Detta system använder ytterligare steg att behålla likheten eller hänsyn till tekniska skillnader mellan villkoren. Vi betonar särskilt dessa steg på grund av den komplicerade karaktären av dessa experiment, som inbegriper flera fysiska uppställningar och experimentella förhållanden som kan leda till experimentella variabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av exogena referens RNA
Obs: Välj ett exogent referens RNA som inte existerar i arter eller modell av intresse. För däggdjur system användas firefly luciferas RNA.
-
Linearisering av exogena referens RNA plasmid
- Förbereda exogena referens RNA i minst 48 timmar före den förväntade RNA-extraktionen. Skaffa eller tillverka en cDNA klon av valda exogena hänvisningen RNA, såsom en firefly luciferas cDNA klon i en plasmid vektor lämpliga för in vitro- transkription (se Tabell för material).
- Utföra restriktionsenzym (RE) rötning av 1 µg av fullängds plasmid (firefly luciferas plasmiden är pSP-luc + som har 4100 bp) använder single-skärare RE (XhoI) i 1,5 mL microfuge rör. Välja en RE som är en enda fräs (skär plasmid endast 1 x) på 3' ände exogena hänvisningen RNA-sekvens som lämnar en 5' överhäng eller trubbiga änden. För en typisk förberedelse, utföra sju plasmid linearisering reaktioner (steg 1.1.4 - 1.1.7) parallellt att generera tillräcklig RNA-koncentrationen och kvantitet att slutföra en uppsättning experiment eller ett projekt.
- Mätning av Plasmiden koncentrationen med hjälp av spektrofotometri eller spectrofluorometry.
- Förbered en RE blandning i varje rör: Tillsätt 4 µL av XhoI (20 000 enheter/mL), 8 µL RE buffert, x µL av Plasmiden (1 µg) och tillräcklig H2O för att nå en helhetslösning på 80 µL.
- Inkubera RE blandningen för 2 h vid 37 ° C. Använd RE enligt tillverkarens protokollet, eftersom eventuella ändringar kan resultera i ökad stjärna aktivitet eller icke-specifik klyvning av mål-DNA. Värme inaktivera reaktionsblandningen i 20 min vid 65 ° C.
- Avsluta den RE digest med etanol nederbörd i varje rör. Till RE mixen, direkt tillsätt 4 µL 0,5 M EDTA pH 8,0, 8 µL 3 M natrium acetat pH 5.2 och 184 µL av 100% etanol. Blanda väl och frysa blandningen vid-20 ° C under 30 minuter.
- Snurra ner blandningen vid 4 ° C i 20 min på en relativ centrifugalkraft (RCF) 16,100 x g.
- Ta bort supernatanten med en fin spets, utan att vidröra pelleten. Lufttorka pelleten i 5 min och resuspendera det i 6 µL H2O (värmas till 37 ° C) genom pipettering upp och ner 5 x - 10 x.
- Bekräfta Linearisering av luciferas plasmid genom att köra smält produkten på 2% agarosgel innehållande etidiumbromid (EtBr) tillsammans med en 1 kb + stege, en supercoiled stege, och klippa och uncut plasmid. Inspektera gelen och fortsätt till in vitro- transkriptionen om körfältet för skurna plasmiden visar ett enda band på ~ 4 kb (uncut plasmiden har tre band; (Se figur 1).
Varning: EtBr är cancerframkallande. Arbeta i dragskåp kemiska.
-
I vitro transkription av exogena referens RNA plasmid
- För varje tub av smält plasmid produkter, utföra in vitro transkription med transkription in vitro- metod (se Tabell för material). Följ tillverkarens anvisningar och Använd den lämpliga phage RNA-polymeras. Om den cDNA syntes kräver en poly(A) svans, eller andra program kräver en poly(A) svans, välja en metod för in vitro- transkription som inkluderar en poly(A) svans tillägg (se Tabell för material).
- Kombinera alla in vitro- transkriberas produkter till ett enda 1,5 mL polypropylen rör före rening.
-
Renat ing av RNA från in vitro- transkription reaktionen
- Renar i vitro transkriberas produkter med en in vitro- transkription sanering kit (se Tabell för material). Följ tillverkarens protokollet.
- Bedöma den RNA-koncentrationen genom att mäta absorbansen vid 260 nm med spektrofotometri.
Obs: RNA-koncentrationen beräknas med öl-Lambert lagen. Detta anges att absorbansen av nucleic syror (som absorberar ljus starkt vid 260 nm) är proportionell mot koncentrationen. En absorbans 1.0 är lika med 40 µg/mL enkelsträngat RNA.
-
Alikvotering beståndet RNA i PCR-rör för experimentell användning
- Säkerställa den RNA-koncentrationen 1 µg/µL.
- Om RNA-koncentrationen är > 1 µg/µL, späd beståndet att 1 µg / µL. alikvotens 1 µL till PCR-rör och lagra dem vid-80 ° C.
- Om RNA-koncentrationen är < 1 µg/µL, kan ytterligare nederbörd med 5 M ammoniumacetat (medföljer kit) utföras enligt tillverkarens protokoll. Om RNA-koncentrationen är fortfarande < 1 µg/µL, Fortsätt med alikvotering 1 µL till PCR-rören.
- Säkerställa den RNA-koncentrationen 1 µg/µL.
2. Skjut beläggning
Obs: Steg 2.1-2.10 bör vara utfört 24-48 timmar före den förväntade cellen sådd.
- Värm ugnen till 250 ° C.
- Använda sterila handskar, Linda varje glasskiva 2 x med aluminiumfolie. Undvik att vidröra ytan av bilden direkt.
- Baka bilder i ugnen i 1 h vid 250 ° C och låt bilderna ska svalna till rumstemperatur.
Obs: Detta steg är viktigt för att förstöra eventuella kontaminerande endotoxin. - Medan bilderna kylning, göra en Fibronektin stamlösning av 1 mg/mL med destillerat vatten och inkubera det under 30 minuter vid 37 ° C att upplösa. Gör 100-µL portioner. Upphäva alikvoter för omedelbar användning och frysa de återstående alikvoter för framtida bruk.
- Packa upp det yttre höljet av aluminiumfolie innan glasskiva i en biosäkerhet skåp. Utför steg 2,6-2,7 och 2,9 i biosäkerhet skåp.
- Placera glasskiva i en steril rektangulär 4-väl cell kultur maträtt.
- Späd Fibronektin stamlösning 1: 100 med destillerat vatten. Täck varje objektglas med 1 mL utspädd Fibronektin, droppe för droppe, med hjälp av en pipett. Se till att hela bilden är täckt.
- Inkubera bilder i en vävnadskultur inkubator vid 37 ° C för 24-48 h.
- Efter inkubering, aspirera Fibronektin genom att luta 4-väl cell kultur skålen. Undvik att vidröra bilden direkt med Sugenheten.
3. cell sådd på glas glider
- Räkna de mänskliga endothelial cellerna på tidig passage (passage 2-5) och utsäde ~1.0 x 106 celler till varje Fibronektin-belagda glas-bilden med 1 mL av media (1,0 x 106 celler/mL media). Kärna ur cellerna 24 h innan förväntade laminärt flöde om ingen annan behandling ska utföras.
Obs: Dessa nummer används som en guide för experiment med 24 h flöde.- Justera sådd densiteten för att uppnå en konfluenta enskiktslager av celler vid tidpunkten för cellen skörd och RNA-extraktion.
- Låt cellerna som följer bilden under 15 minuter vid 37 ° C.
- Lägg 3 mL av media i varje brunn av cell kultur skålen att täcka bilden och inkubera cellerna vid 37 ° C under 24 h med 5% CO2.
4. små stör RNA (siRNA) Transfection
-
Beredning av celler på glasskivor för siRNA transfection och flöde experiment
- Följa protokollet i steg 2 (objektglasöverdraget) och 3 (cell sådd på objektglas) för glas bild förberedelse och beläggning för flöde experiment.
- Utsäde celler 24 h före siRNA behandling (48 h före applicering av laminärt flöde).
- Utsäde mänskliga endothelial celler i antibiotika-fria medier på 750.000 till 1 x 106 celler per bild att uppnå 85-95% sammanflödet nästa dag.
Obs: HUVEC används i detta protokoll.
-
Beredning av siRNA-lipid-baserade transfection reagens komplex (per bild)
- Design anpassade siRNAs eller Beställ premade siRNAs för önskad gen av intresse.
Obs: Utför följande steg i en biosäkerhet skåp. - Tillsätt 6 µL siRNA (20 µM lager) i 414 µL av minskade serum medium (se Tabell av material) och blanda försiktigt genom pipettering.
- Späd 49,5 µL försiktigt blandad lipid-baserade transfection reagens (se Tabell för material) i 130,5 µL av minskade serum medium.
- Blanda försiktigt och odla i rumstemperatur i 5 min.
- Kombinera utspädda siRNAs och lipid-baserade transfection reagens, blanda försiktigt och inkubera i 15 min i rumstemperatur. Blanda försiktigt för att undvika störningar av lipid-baserade transfection reagens komplex.
Obs: Lösningen kan vara grumliga som komplex form. - Medan komplex bildar, ta bort odlingsmedium och tvätta cellerna 1 x med reducerad serum medium.
- Lägg till 2,4 mL minskade serum medium till varje bild.
- Lägga till 600 µL av försiktigt blandad siRNA-lipid-baserade transfection reagens komplex varje platta och rock plattan och tillbaka för att blanda. Säkerställa siRNA slutliga koncentration är 40 nM. Se till att bilden är helt täckt.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C i 4 h.
- Tillsätt 1 mL av antibiotika-fri endotelceller tillväxt medier som innehåller 3 x den normala koncentrationen av fetalt bovint serum (FBS) utan att ta bort transfection blandningen.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C tills de ska använda.
- Design anpassade siRNAs eller Beställ premade siRNAs för önskad gen av intresse.
5. beräkning av flödet klassar baserat på önskad skjuvspänningen9
- Beräkna flöde baserat på de önskade skjuvspänningar enligt följande ekvation:
Här
Q är flödet i mL/min;
Τ är önskad skjuvspänningen i kilopond cm2 (1 Pa = 10 dynes cm2);
w är bredden på parallell-plattan flöde kammaren i cm;
h är höjden av parallell-plattan flöde kammaren i cm;
µ är viskositeten av media i cP (g/cm·s).
Obs: Typiska laminar skjuvspänningen experiment (icke-pulserande) i det här arbetsflödet utförs på τ = 1 Pa (10 dynes cm2). µ kan mätas med en viskometer såsom en Kotte-och-tallrik viskometer och kan variera beroende på innehållet i media inklusive serum och ytterligare dextran9. - För att uppnå en specifik τ (shear stress), justera den flöde eller viskositet. Vid högre flöden, vidhäftande celler kan ta avstånd från bilden. Prov flöden med typisk flöde kammare visas i tabell 1.
6. uppställning av en dedikerad miljö för övervakningssystem och flera parallella-plattan flöde Chambers (figur 2)
- Använd en stor uppvärmd enhet/inkubator med flera hyllor, interna El tillgång och glasdörrar — kallas stranden (inbyggd miljö med justerbar CO2 ) och värme — att hysa flera flöde kamrarna samtidigt för experiment som kräver både skjuvspänning och direkt jämförelse mellan två eller flera behandlingar eller utgångar (dvs, DNA, RNA och protein).
Obs: Stranden tillåter frekvent övervakning av flödet kretsen, inklusive flödet, utan täta avbrott av miljön. - Säkerställa adekvat CO2 är tillgänglig för experimentet och att CO2 bildskärmen är funktionella. Garantera vatten facket fylls på rätt sätt, så att det blir fuktad luft.
7. utformningen av parallell-plattan Flow apparaten
Obs: För tillverkning av parallella plattorna, vänligen se Lane et al. 9.
- Autoklav flödet kammare plattor, reservoar, dämpare, slangar och Luers för varje parallell-plattan flöde kammare set-up som anges i tabell 2.
-
Set-up flöde loop församling (figur 3).
- Placera sterila handdukar i biologisk säkerhet skåp. Montera ihop flödet loop systemet, först utan parallell-plattan flöde kammaren i skåpet biologisk säkerhet.
- Anslut slangar församlingen för behållaren:
- Infoga en #14 hårt tube i ett hål och två #14 mjuka rör i de andra två hålen i locket av reservoaren flöde. Se till att en av de mjuka rör vidrör botten av reservoaren som utflöde slangar.
- Placera en 1/16 ”hanluer i slutet av #14 hårt tube och bifoga ett sterilt filter som en ventilationslucka.
- Placera en 1/16 ”kvinnliga Luer i slutet av #14 mjuk inflöde tube, kommer från behållaren, och bifoga en 4-vägs Avstängningskranen.
Obs: För gen uttryck analys eller andra studier där perfusates behöver inte samlas, 2-vägs Avstängningskranar kan användas istället för 4-vägs Avstängningskranar i detta protokoll. - Placera en 1/16 ”hanluer i slutet av #14 mjuk utflöde röret, kommer från reservoaren.
- Anslut reservoar utflöde slangen till pumpen slangar: placera en 1/16 ”kvinnliga Luer i varje ände av en #13 hårt tube (pumpen slangar). Anslut röret #14 mjuk utflöde från reservoaren till #13 hårda röret genom att ansluta 1/16 ”manliga och kvinnliga Luers grupp.
- Ansluta pumpen slangen med 'dämpare bridge' slang: placera en 1/8 ”hanluer och en 1/8” kvinnliga Luer i varje ände av ett #16 mjuka rör. Anslut den 1/16 ”kvinnliga Luer av #13 hårda röret (slutet utflöde av pump slangen) med 1/8” hanluer av #16 mjuka röret.
- Montera slangen för den flow dämpare: placera en 3/16 ”hanluer i ena änden av den #25 mjuka slangen och upprepa detta för den andra sidan av den flow dämpare. Bifoga de fria ändarna av #25 mjuka rören till varje sida av de flow dämpare.
- Anslut 'dämpare bridge' slangen med slang för den flow dämpare: ansluta en #25 mjuk slang från den flow dämpare med #16 mjuk tub 'dämpare bron' med den 1/8 ”kvinnliga Luer från #16 'dämpare bridge' sida och den redan placerade 3/16” hanluer från #25 mjuka dämpare tube sida.
- Montera 'kammare bridge' slangar:
- Placera en 1/8 ”kvinnliga Luer och en 1/8” hanluer i varje ände av ett #16 mjuka rör ('kammare bridge' slangar).
- Anslut den 1/8 ”kvinnliga Luer 'kammare bron' med den 3/16” hanluer vid #25 mjuka röret från den fria änden av den flow dämpare.
- På den 1/8 ”hanluer (fria änden) på 'kammare bridge' slang, placera en 4-vägs Avstängningskranen.
- Anslut 4-vägs Avstängningskranen från den 'kammare bridge' fria änden till 4-vägs Avstängningskranen från reservoaren inflöde mjuka slangen (från steg 7.2.2.3). Stäng Avstängningskranar.
- Lägga till media till reservoaren och dämpare. För 48-h exponering för shear stress, tillsätt 35 mL media till reservoaren och 25 mL till dämpare. Justera volymen i media baserat på varaktigheten av flöde experimentet och antalet celler som seedade.
- Föra det monterade flöde kretsloppet till pumpen i stranden. Ställ #13 hårda röret (pumpen slangar) i pumphuvudet och säkra den. Öppna att Avstängningskranar.
- Slå på pumpen och långsamt öka pumpens varvtal. Låt media cirkulera genom loop systemet. Kontrollera eventuella läckage eller blockering (t.ex., tryckuppbyggnad). Se till att media flödar tillbaka till behållaren.
-
Set-up flöde kammare församling
- Placera en 1/8 ”kvinnliga Luer i ena änden av en #16 mjuka röret och fästa en 4-vägs Avstängningskranen. Fäst änden av röret till höger sida av övre plattan (inflöde sida).
- Placera en 1/8 ”hanluer i ena änden av en #16 mjuka röret och fästa en 4-vägs Avstängningskranen. Bifoga den fria änden av röret till vänster på den övre plattan (utflöde sida) .
- Placera en 1/8 ”hanluer och en 1/8” kvinnliga Luer i varje ände av en #16 mjuk slang (bubbla fälla slangar). Fäst slangen till bubbla fälla via den 1/8 ”hanluer. Bifoga en 4-vägs Avstängningskranen i andra änden av den slang via den 1/8 ”kvinnliga Luer.
- Använda steril pincett, överföra den cell-seedade glasskiva från 4-väl cell kultur skålen till urtaget på bottenplattan. Säkerställa den cell-seedade sidan av glas bilden är vänd uppåt.
- Med en 10 mL spruta, tillsätt 10 mL av varma media till bottenplattan inom raden röd packning runt plattan. Låt media att flöda genom bilden och täcka cellerna. Undvik att lägga till media direkt in i bilden.
- Placera försiktigt den övre plattan på bottenplattan, justera från ena sidan till den andra. Undvika införandet av luftbubblor. Skruva plattorna tätt ihop.
- Avlägsna luftbubblor från bubblan fällan genom att öppna Avstängningskranen på höger sida (inflöde) av plattan och spola försiktigt 20 mL varm media med en 30 mL sprutan. Kontrollera att Avstängningskranen på vänster sida (utflöde) av plattan är stängd och att media flödar genom bubbla fälla Avstängningskranen (öppna). Kassera spolas media.
- Stäng Avstängningskranen på bubbelfällan och öppna Avstängningskranen på vänster sida (utflöde) på avdelningen. Höja till vänster (utflöde) i kammaren till 45° vinkel och spola försiktigt 20 mL varm media med en 30 mL spruta från höger sida (inflöde) av kammaren ta bort luftbubblor från kammaren. Bubblor kan visualiseras genom fönstret. Kassera spolas media.
- Stäng Avstängningskranar på båda sidor av kammaren och cap. Inspektera cellerna av mikroskopi.
- Transport i kammaren till stranden med det tidigare monterade kretsloppet.
- Långsamt minska pumpens varvtal och pausa pumpen. Stäng Avstängningskranar på flöde loop systemet för att förhindra läckage.
- Anslut kammaren och loop systemet grupp via Avstängningskranar. Öppna alla Avstängningskranar.
- Långsamt öka pumpens varvtal och undersöka set-up för läckage eller blockering. Se till att medierna cirkulerar i en riktning och återgår till reservoaren.
- Placera flödessensorn på 'kammare bridge' slangen ligger på inflöde sida av kammaren. Kontrollera att sensorn är korrekt orienterade i flödesriktningen.
- Justera pumpen för att erhålla flödet som beräknades tidigare, baserat på önskad skjuvspänningen.
Obs: Flödet kan variera beroende på höjd och bredd på varje avdelning, liksom viskositeten av media. - Slå på CO2 tanken att uppnå 5% CO2 och placera en tråget inuti stranden.
8. upptagning av cellerna och extraktion av RNA från flödet kammaren
- När önskad tidsperiod av flöde är klar, långsamt Sänk den peristaltiska pumphastigheten till 0 och stänga av strömmen. Snabbt stänger alla öppna Avstängningskranar och avlägsna kammaren och Fäst slangen med en Avstängningskranen på varje ände.
- Ta en ren bänkmonterade kammaren och skruva försiktigt loss alla skruvar för att ta bort den övre plattan. Använda nål näsa pincett, bort glasskiva från bottenplattan och placera det i en 100 mm diameter vävnadsodling maträtt.
- Tvätta i bilden med 10 mL kall fosfatbuffrad saltlösning (PBS)- / - och kontrollera cellerna i Mikroskop för att bekräfta cell följsamhet och justeringen i flödesriktningen.
- Aspirera PBS från plattan och överföra bilden till en ren 100 mm diameter maträtt. Tillsätt 350 μl lyseringsbuffert från den RNA-extraktionen kit (se Tabell för material), som innehåller 1/100 av beta-merkaptoetanol, till bild.
FÖRSIKTIGHET: Lägga till beta-merkaptoetanol i kemiska dragskåp. - Skrapa cellerna bort från bilden med hjälp av en polyeten-bladig cell skrapa. Tilt vävnadsodling skålen, så att vätskan till poolen längst, och ta bort glasskiva med pincett. Pipettera cellen lysate i ett 1,5 mL rör och hålla det på is.
- Späd lager exogena referens RNA (luciferas RNA) till 0,0025 ng/µL genom seriell spädning innan att lägga till provet. Till exempel om lager koncentrationen 1 µg/µL, en spädning på 1/400 000 krävs att uppnå 0,0025 ng / µL. Tillsätt 10 µL utspädd luciferas RNA till varje prov av cell lysate för nedströms RNA isolering och analys.
- Fortsätta med protokollet RNA extraktion enligt tillverkarens instruktioner, eller frysa den lysate vid-80 ° C tills kunna gå vidare med utvinning.
9. beräkning av effektiviteten av de RNA-extraktion och cDNA syntes
Obs: Beräkna luciferas effektivitet efter RT-qPCR genom att jämföra den teoretiska avkastningen och experimentella avkastningen.
- Bestämma den teoretiska avkastningen för luciferas RNA.
- Bestämma den totala mängden luciferas kopior tillsatts per prov. (Lägga till 0,025 ng/prov = 2,73 x 107 kopior av luciferas RNA per prov före RNA-extraktion.)
- Beräkna det molekylära samlas av luciferas RNA med hjälp av en genomsnittlig molekylvikt per nukleotid av 330 g/mol och multiplikation med längden på den firefly luciferas RNA, 1652 nukleotider.
- Dela upp mängden luciferas RNA lagt till (0,025 ng) för varje prov före RNA-extraktion av det molekylära samlas till avkastning molar kvantiteten. Sedan multiplicera det med Avogadros tal ge kopiorna tillsatts per prov.
- Beräkna den teoretiska avkastningen för luciferas kopior för varje RT-qPCR-reaktion med hjälp av ekvation:
- Beräkna den experimentella avkastningen för luciferas kopior för varje RT-qPCR-reaktion med luciferas plasmiden för att generera en standardkurva för RT-qPCR.
- Beräkna luciferas effektivitet (%) med hjälp av ekvation:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Framgångsrika Linearisering av luciferas plasmid med restriktionsenzym bekräftades av rinnande smält produkter på en agarosgel (figur 1). Storleken på linearized produkten bekräftades med hjälp av DNA stegar och jämförelse med uncut plasmid.
Vi har anpassat parallell-plattan flöde kammare set-up från Lane et al. 9 för experiment som kräver flera villkor/behandlingar med skjuvspänningen eller flera skjuvspänning. Vi använder en dedikerad miljö, stranden, som rymmer flera, färdigmonterad flöde kretsar att alla har övervakade flöden (figur 2). Flödet övervakas bara uppströms parallell-plattan församling (figur 3). De flöde kretsar och priser kan övervakas direkt genom glasdörrarna utan orsakar fluktuationer i temperatur, fuktighet eller gasinnehåll inom stranden.
Tillverkningsprocesser kan leda till små variationer i kammaren höjd. Flöden måste därför beräknas för varje kammare att uppnå samma Skjuvspänningen (tabell 1). I teorin, kammare med identiska höjder kan använda identiska flöden för att uppnå samma skjuvspänningen och kan användas i serien. Typisk experiment med endotelceller använda skjuvspänningen 0 - 1,5 Pa. Laminar skjuvspänningen 1 Pa användes i detta arbetsflöde till modell arteriell endothelial skjuvspänning. Det kan också finnas variationer mellan pumpen huvud inställningar och inom pump huvuden över tid med användning. Med hjälp av flödesmätaren kan hänsyn till dessa skillnader.
Experiment med tillämpningen av shear stress ofta involverar flera skjuvspänning, behandling villkor och tidpunkter. Om möjligt, använder vi en endogen referens RNA till konto för någon variabilitet i experimental set-up. För några experiment, hitta en endogen referens RNA med kvantitativa stabilitet är inte genomförbart16. Dessutom kan kvantitativa stabilitet eller instabilitet av endogena referens gener mellan prover hänföras till antingen impulsberoende effekter på cellulära uttrycksnivåerna eller variationer i effektivitet av RNA extraktioner eller omvänd Transkription. För att redovisa för denna ineffektivitet, och i den miljö där en endogen Referensgenen inte är kvantitativt stabil, använder vi en spike-i exogena Referensgenen. För experiment införliva laminar skjuvspänning i däggdjur endotelceller, använder vi en firefly luciferas RNA som exogena RNA spike-in (figur 4A).
Figur 4 visar analyserade RTqPCR experimentella data från skjuvspänningen experiment att bedöma Krüppel-liknande faktor 2 (KLF2) förlust-av-funktion använder siRNA. KLF2 är en transkription faktorn uppreglerad laminärt flöde i endotelceller och stora transkriptionell medlare av endothelial genuttryck i inställningen av laminärt flöde2.
Figur 4A visar luciferas effektivitetsvinster för tre separata experiment, vardera med två flöde kammare. Luciferas effektivitetsvinster kan liknande mellan prover av ett experiment (Experiment 1) eller visar vissa variabilitet (experiment 2 och 3) (figur 4A). Dessa resultat är särskilt värdefulla i experimentella system där endast små absoluta förändringar ses. Användning av en exogen Referensgenen kan vara särskilt viktigt i experiment där experimentella behandlingar kan störa effektiviteten av omvänd Transkription eller PCR-17. Resultaten skildras i figur 4A är typiska. Ett luciferas effektivitet på 5% anger att 5% av luciferas RNA (dvsförsta utgångsbeloppet för RNA) tillsätts provet före RNA-extraktion detekteras av RT-qPCR. Mellan prover eller villkor inom ett enda experiment är luciferas effektivitetsvinsterna vanligtvis ± 50%. Resultaten bör tolkas med försiktighet om variabiliteten luciferas effektivitetsvinster är > 50% och bör omfatta en genomgång av de experimentella rutiner och villkor.
Figur 4B visar typiska experimentella resultat av RT-qPCR från upprepade skjuvspänningen experiment, varje med flera parallella-plattan flöde chambers. Inom varje experiment är KLF2 mRNA uttryck normaliseras på tre sätt. Den första normaliseringen använder en endogen referens RNA, cyklofilinhämmarna A (CycA). Andra normalisering använder en exogen referens RNA, firefly luciferas (Luc). Den tredje normaliseringen använder både endogena och exogena hänvisningen RNA. Inom varje experiment visas i figur 4B, alla tre normalisering metoder (normalisering till endogena Referensgenen, exogena Referensgenen och både endogena och exogena referens gener grupp) ger liknande resultat. Om metoden normalisering ändras signifikant resultat (t.ex., leder till > 50% skillnad), bör resultaten tolkas med försiktighet. När det finns betydande variationer mellan metoderna för normalisering, bör endogena referens gene(s) ses över, eftersom det kan vara en beroende variabel i experimentella system. Likaså bör de experimentella rutiner och villkor ses över. I figur 4Bavkastningar KLF2 knockdown med siRNA liknande knockdown effektivitet mellan tre separata experiment (Experiment 1, 2 och 3). Vi använde tre distinkta biologiska prover för dessa experiment, med två samtidigt rinnande flöde kammare med skjuvspänningen 1 Pa för varje experiment.
Figur 1: agaros gel bilden av Linearisering av exogena luciferas plasmid. Supercoiled och 1 kb + DNA stegar används som markörer för att avgöra både oklippt och skär luciferas plasmid storlekar i kilobases (kb). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk översikt av flera flöde krets sammansättningar inom en dedikerad miljö (stranden). Flödesvärden i både flöde kretsar övervakas enkelt i realtid, utan att störa miljön, och båda kretsar kan köras samtidigt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Schematisk översikt över ett enda flöde krets montering. Slangar storlekar och Luers används anges i denna siffra. Kontrollera att flödesmätaren är orienterade i riktning mot flödet och placeras uppströms flöde kammaren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa resultat från KLF2 förlust-av-funktion experiment i mänskliga endothelial celler utsätts för shear stress (1 Pa) för 24 h. (A) denna panel visar kvantifiering av exogena luciferas RNA i tre separata flöde experiment. Luciferas effektivitetsvinster kan vara liknande mellan prover av ett experiment (Experiment 1) eller visar vissa variabilitet (experiment 2 och 3). Luciferas (absolut kopior) är kopia antalet luciferas RNA upptäcks av transkriptas kvantitativ PCR (RT-qPCR) av absolut kvantifiering med en standardkurva. Luciferas effektivitet är experimentell luciferas kopiorna dividerat med teoretiska luciferas kopior för varje prov multipliceras med 100 (se steg 8 i protokollet). Relativa luciferas effektivitet är luciferas effektiviteten av varje prov dividerat med referens villkoret (flöde + Ctlsi) inom varje experiment. (B) dessa paneler visar normalisering av genuttryck i en uppsättning prov skjuvspänningen experiment med både endogena och exogena referens gener. Resultaten är från transkriptas kvantitativ PCR (RT-qPCR). Knockdown KLF2 mRNA uttryck visas i närvaro av laminärt flöde med skjuvspänningen 1 Pa för 24 h. FC = faldig förändring; CycA = cyklofilinhämmarna A, används som en endogen referens RNA; Luc = luciferas, används som en exogen referens RNA. Data anpassade från mannen et al. 5. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Kammaren höjd (mikrometer; µm) |
Bredd (centimeter, cm) |
Flow Rate (mL/min) för 1 Pa skjuvspänning | Viskositet (centipoise, cP) |
| 303.80 | 1,90 | 19,48 | 0,90 |
| 326.10 | 1,90 | 22.45 | 0,90 |
| 344.84 | 1,90 | 25.10 | 0,90 |
| 319.06 | 1,90 | 21,49 | 0,90 |
Tabell 1: Kammare höjder och exempel på flöden för olika flöde chambers att uppnå skjuvspänningen 1 Pa.
| J dukar |
| Pincett |
| Reservoaren flaska och Cap |
| Dämpare och Cap |
| Flöde Loop |
| 1/16 ”hanluer x 3 |
| 1/16 ”kvinnliga Luer x 3 |
| 1/8 ”hanluer x 2 |
| 1/8 ”kvinnliga Luer x 4 |
| 3/16 ”hane adapter x 2 |
| 14 L/S hårt Tube (2 tum) x 1 |
| 14 L/S Soft Tube (5 tum) x 2 |
| 16 L/S mjuk rör (3 tum) x 2 |
| 25 L/S mjuk rör (3 tum) x 2 |
| 13 L/S hårt Tube (10 tum) x 1 |
| Flöde kammare |
| 1/8 ”hanluer x 2 |
| 1/8 ”kvinnliga Luer x 2 |
| 16 L/S mjuk rör (3 tum) x 3 |
| Toppen och botten pläterar |
| Skruvar |
Tabell 2: Delar som ska autoklaveras i steg 6,2 i protokollet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Skjuvspänning är ett fysiologiskt tillstånd som modulerar endotelfunktion, delvis genom att påverka steady state gen uttryck2,5. Modeller av genreglering i olika skjuvspänning kommer att bidra till en större förståelse för endotelfunktion. Denna pragmatiska arbetsflödet innehåller en flöde krets använder en parallell-plattan flöde kammare anpassad från Lane et al. 9 och representerar laminär, icke-pulserande flöde. Den övergripande strukturen var avsedd att underlätta experiment som kräver flera flöde chambers och minimera experimentell variationer i inställningen.
Flöde krets montering är en viktig del av detta arbetsflöde och anpassas från Lane et al. 9. flera anpassningar av denna församling och protokoll har gjorts med hänsyn till skillnader i de experimentella system. En stor uppvärmd enhet, stranden, är en anpassning som underlättar samtidig manövrering och övervakning av flera flöde kretsar i samma miljö. Detta system har använts framgångsrikt för tillämpningen av shear stress till endotelceller för olika tidsperioder, från 1 h till 7 dagar, och på flera nivåer av skjuvspänning (t.ex, 1.0, 1.5 och 2.0 Pa). Detta system användes också för genen knockdown studier för att bedöma funktionen av en flow-lyhörd endothelial gen i inställningen av skjuvspänning (figur 4)5. Det finns betydande variationer mellan pumpar och pump huvuden, som också kan förändras över tiden på grund av normalt slitage. För att beakta dessa skillnader, vi använder en flödessensor belägen proximalt flöde kammaren att kontinuerligt övervaka flöden. Olika storlekar av slangar och Luers används för att säkerställa en tight passform för varje komponent och att förhindra läckage under experiment. Vi räknade celler och seedade cirka 1 000 000 celler per glasskiva, droppvis, och sedan låta cellerna Inkubera vid 37 ° C i 15 min att öka följsamhet effektivitet. Jämfört med endothelial stamceller, som kan vara seedad för en kort tid före applicering av skjuvspänningen9, utsäde vi mänskliga endothelial celler under minst 24 h innan applicering av skjuvspänning. Kortare löptider kan leda till att den lossnar av celler under flöde, eller ett diskontinuerligt lager av endotelceller, även med den lämpliga djurtäthet som sådd. Vi betonar inspektion av bilder för en konfluenta enskiktslager av endotelceller både före och efter tillämpningen av skjuvspänning. Finner vi att bilder belagd med Fibronektin, en naturlig extracellulärmatrix komponent18, upprätthålla den endothelial enskiktslager mer konsekvent jämfört sidor belagd med gelatin (denaturerat fibrillar typ I-kollagen). Slutligen är de flow dämpare i detta protokoll optimerad för att använda 30 mL av media, jämfört med 190 mL media för andra tillverkare.
Flera steg i flödet krets montering kräver extra vård. En jämn enskiktslager av endothelial celler bör fastställas innan applicering av skjuvspänning. Det är viktigt att utsäde celler in i glas bilden droppvis för att öka antalet celler som följer bilden och därmed den totala befolkningsandelen i bilden. Väntetiden mellan cell sådd och lägga till ytterligare media till bild allmänhet förbättrar sådd effektivitet eftersom det ger tillräckligt med tid för celler att följa till bild i stället för att tvättas bort i flera Skjut facket. Inspektera celler före, under och efter tillämpningen av skjuvspänning. Ett Mikroskop kan placeras i stranden för detta ändamål. Flödessensorn måste fästas i rätt riktning och mål flödeshastighet bör kontrolleras för varje enskilt flöde kammare. Flöde loop systemet bör vara perfusion utan kammaren att säkerställa inget media läckage eller andra problem, såsom tryckuppbyggnad, att undvika störande cellerna under de faktiska experiment. Kontrollera och eliminera bubblor i systemet. Medan testa flödet loop systemet, säkerställa Avstängningskranar är öppna innan du slår på den peristaltiska pumpen att tillåta oavbruten, enkelriktade flödet. Säkerställa att alla Avstängningskranar är stängd före fästa flöde kammaren till slingan och helt öppen innan omstart pumpen.
Vi tycker att tillägget av en exogen Referensgenen är användbart i en mängd olika scenarier. Endotelcell media innehåller ofta heparin, som är en hämmare av PCR-17. Medan vissa RNA extraktion protokoll införliva åtgärder för att avlägsna heparin, kan spårmängder orsaka skillnader i PCR effektivitetsvinster mellan prover. Potenta behandlingar kan också hindra identifiering av en endogen Referensgenen som är kvantitativt stabil. Vårt labb har skapat en effektiv protokoll för att syntetisera 5'-capped och poly-A-tailed luciferas RNA för användning som en exogen referens RNA. Denna strategi har visat sig vara en kostnadseffektiv strategi jämfört med att köpa ett kommersiellt tillgängliga RNA. Under beredningen av exogena referens RNA är det viktigt att alikvotens RNA till engångsbruk alikvoter att undvika flera frysning-tining cykler. Omsorgsfull blandning och korrekt pipettering är kritiska för upprätthållande mellan alikvotens konsistens. Typisk experiment visar ett luciferas effektivitet i spänna av 5 ± 2,5% men kan variera från 1-10%. Det är klokt att korrigera RTqPCR resultat för både exogena referens RNA effektivitet och en endogen Referensgenen (städning).
För experiment vi bedriver, används firefly luciferas sekvenser som icke däggdjur spike-i referens RNA i däggdjur modeller. I experiment där firefly luciferas uttrycks i celler, skulle detta inte vara en lämplig referens-gen. Andra artspecifika referens gener kan användas, inklusive Caenorhabditis elegans miRNA cel-miR-3919 och ribulose bisphosphate ribulosbisfosfatkarboxylas växt RNA20.
Detta flöde krets modeller en 2-D enskiktslager av endothelial celler odlas på vävnadsodling plast eller glas, som är ganska hård. Matrix stelhet kan påverka endotel svaret till vätska skjuvspänningen21. Denna modell används en relativt hög syrekoncentration som är mer liknande till arteriell än venös syrehalter. Denna modell nära liknar raka segment av större fartyg i en sluten kardiovaskulära systemet och ger en relativt homogen miljö för endotelceller i bilden. Andra specifika villkor i 3D-strukturer, såsom bifurkationer eller krökningar av fartyg, föreställs inte med denna modell. Andra system kan modell andra flödesmönster, inklusive de i böjda regioner i kärlsystemet, men ger färre celler än det system som beskrivs i detta protokoll. Likaså kan andra sammansättningar vara lämpligare om > 1 x 106 celler krävs, eller om en enskild cell analys krävs. Vår nuvarande ansökan modeller icke-pulserande laminärt flöde. Ändå, denna modell kan användas för att generera andra vågformer, inklusive pulserande eller oscillerande vågformer, med konsekvens, som fortlöpande övervakas flödesvärden.
Sammantaget ger detta pragmatiska arbetsflödet ett system för samtidig tillämpning av shear stress till flera flöde kammare med övervakade flöden. Material och metoder i hela detta arbetsflöde är utformade för att minimera experimentella variabilitet mellan prover och villkor. Detta arbetsflöde har använts framgångsrikt för RNAi experiment i fastställandet av laminärt flöde och kan också användas för några experiment som kräver flera villkor med laminär skjuvspänning, eller flera laminar skjuvspänningen magnituder och/eller tidpunkter, inklusive alternativa vågformer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av CIHR MOP 142307 till pam. H.S.J.M. är mottagare av en kanadensisk institut av forskning utbildning hälsoprogram i regenerativ medicin gemenskap. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. och M.K.D. är mottagare av drottning Elizabeth II Graduate stipendierna i vetenskap och teknik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | gibco | 25300-062 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 10 mm2 Culture Dish | Sarstedt | 83.3902 | |
| 30 mL Syringe | BD | 302832 | |
| 4-Way Stopcocks | Discofix | D500 | |
| Aluminum foil | |||
| BEACH | Darwin Chambers Company | MN: HO85, SN: 4947549 | |
| Cell Scrapers | |||
| CO2 Meter | BioSphenix, Ltd. | MN: P120, SN: 0342 | |
| CO2 Sensor | BioSphenix, Ltd. | MN: C700, SN: 52852 | |
| Distilled water | gibco | 15230-170 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) -/- | gibco | 14190-144 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | Promo Cell | C-22011 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix | Promo Cell | C-39216 | |
| Fibronectin (pure) | Sigma-Aldrich | 11051407001 | |
| Filter (0.20 um) | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Flow Dampener and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Meter: 400 Series Console | Transonic Scisense Inc. | T402 | |
| Flow Meter: 400 Series Tubing | Transonic Scisense Inc. | TS410 | |
| Flow Reservoir and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Sensor | Transonic Scisense Inc. | ME4PXL | |
| Isotemp 737F Oven | Fisher Scientific | FI-737F | |
| J cloth | J cloth | ||
| Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm) | Fisherfinest | 12-544-4 | |
| Paper sterilization pouch | Cardinal Health | 92713 | |
| Pump (Masterflex L/S Economy Drive) | Cole-Parmer | 7554-90 | |
| Pump Head (Masterflex L/S Easy Load) | Cole-Parmer | 7518-00 | |
| Rectangular 4 Well Dish | Thermo Scientific | 267061 | |
| Tweezers | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tubing | |||
| Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-25 | |
| Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-14 | |
| Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-16 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-13 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-14 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luer | |||
| 3/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-08 | For #25 tubing |
| 1/8" Male Luer | Cole-Parmer | 30800-24 | For #16 tubing |
| 1/8" Female Luer | Cole-Parmer | 30800-08 | For #16 tubing |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-00 | For #14 tubing |
| 1/16" Female Luer | Cole-Parmer | 45508-00 | For #14 tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockdown reagents | |||
| Oligofectamine Reagent | Invitrogen | 12252-011 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | gibco | 31985-070 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In vitro transcription | |||
| Generuler 1kb+ DNA ladder | Thermo Scientific | SM1331 | |
| MEGAclear Kit | Ambion | AM1908 | |
| mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| pSP-luc+ | Promega | E4471 | |
| Supercoiled DNA Ladder | New England BioLabs Inc. | N0472S | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| UltraPure Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585011 | |
| XhoI Restriction Enzyme | New England BioLabs Inc. | R0146S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA extraction | |||
| Beta-mercaptoethanol | Sigma | M3148-100mL | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
References
- Aird, W. C.
- Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).
- Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4478-4485 (2001).
- Cybulsky, M. I., Marsden, P. A. Effect of disturbed blood flow on endothelial cell gene expression: a role for changes in RNA processing. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (9), 1806-1808 (2014).
- Man, H. S. J., et al. Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).
- Won, D., et al. Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow. The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).
- Baeyens, N., et al. Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point. eLIFE. 4, 04645 (2015).
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. The atherosusceptible endothelium: endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo. Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), 3349 (2012).
- Gray, K. M., Stroka, K. M. Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models. Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).
- Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress. Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).
- Resnick, N., Gimbrone, M. A. Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression. The FASEB Journal. 9 (10), 874-882 (1995).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. The Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- DeStefano, J. G., Xu, Z. S., Williams, A. J., Yimam, N., Searson, P. C. Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs). Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20 (2017).
- Thormar, H. G., et al. Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis. Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).
- Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription. Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).
- Vaughan-Shaw, P. G., et al. A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification. Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).
- Collins, C., et al. Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells. Nature Communications. 5, 3984 (2014).
- Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).
- Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR. Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).
- Kohn, J. C., et al. Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior. Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).
