Summary
Aqui, um fluxo de trabalho para a análise de expressão de gene e cultura de células endoteliais sob tensão de cisalhamento fluido é apresentado. Incluído é um arranjo físico para habitação e monitoramento de múltiplas câmaras de fluxo em um ambiente controlado e o uso de um referência exógena do RNA por PCR quantitativo simultaneamente.
Abstract
Descrevemos um fluxo de trabalho para a análise da expressão gênica de células endoteliais, sujeito a um fluxo constante de laminar usando múltiplas câmaras monitoradas fluxo paralelo-placa. As células endoteliais formam o revestimento celular interno dos vasos sanguíneos e são cronicamente expostas para a força de fricção do fluxo de sangue chamado tensão de cisalhamento. Sob condições fisiológicas, a função de células endoteliais na presença de várias condições de tensão de cisalhamento. Assim, a aplicação das condições de tensão de cisalhamento em modelos em vitro pode fornecer maior conhecimento sobre respostas endotelial em vivo. A câmara de fluxo paralelo-placa anteriormente publicada por Lane et al 9 é adaptado para estudar a regulação gênica endotelial na presença e na ausência de fluxo laminar (não-pulsátil) constante. Principais adaptações na configuração para o fluxo laminar, tal como apresentada aqui incluem um ambiente grande, dedicado aos circuitos de casa fluxo simultâneo, o controlo das taxas de fluxo em tempo real e a inclusão de uma referência exógena do RNA para a normalização da dados PCR quantitativos em tempo real. Para avaliar tratamentos/condições múltiplas com a aplicação da tensão de cisalhamento, vários circuitos de fluxo e bombas são utilizadas simultaneamente dentro da mesma incubadora aquecida e umidificada. O caudal de cada circuito de fluxo é medido continuamente em tempo real para padronizar as condições de tensão de cisalhamento ao longo dos experimentos. Porque estas experiências têm várias condições, também utilizamos um RNA exógeno de referência que é cravado no momento da extração do RNA para a normalização da extração do RNA e eficiências de síntese do cDNA da primeiro-costa. Estas etapas minimizam a variabilidade entre as amostras. Esta estratégia é empregada em nosso pipeline para a análise de expressão de gene com tensão de cisalhamento experimentos utilizando a câmara de fluxo paralelo-placa, mas partes desta estratégia, tais como os exógenos referência pico-no RNA, podem facilmente e custos reduzidos a ser usadas para outras aplicações.
Introduction
Vascular em células endoteliais forma o revestimento celular interno dos vasos sanguíneos no sistema cardiovascular fechado de espécies superiores. Eles formam a interface entre o sangue e os tecidos e são caracterizados por luminal e superfícies abluminal. O endotélio é um sistema adaptável, ativo e diversificado que regula o fluxo de sangue, tráfico de nutrientes, imunidade e o crescimento de embarcações de sangue novo1. No corpo, as células endoteliais normalmente existem em um ambiente onde eles são expostos para a força de fricção de circulação, tensão de cisalhamento2. Tensão de cisalhamento é um importante regulador da célula endotelial gene expressão3, e células endoteliais tentam manter a tensão de cisalhamento dentro de um determinado intervalo de2,4. Células endoteliais demonstram angiogênico padronização na ausência de tensão de cisalhamento5 que podem melhorar a perfusão do tecido. Padrões regionais de fluxo perturbado e alterado tensão de cisalhamento estão associados com a expressão de genes inflamatórios6 e o desenvolvimento de aterosclerose7,8. Assim, modelos que incluem a tensão de cisalhamento são um componente importante da compreensão de regulação gênica endotelial.
Nós descrevemos um método para estudar a regulação gênica em células endoteliais vasculares sob tensão de cisalhamento. Este sistema usa fluxo não-pulsátil e imita os níveis de tensão de cisalhamento fluido e concentração de oxigénio que as condições de modelo para as células endoteliais arteriais. Este protocolo inclui detalhes de métodos para o knockdown de gene usando o RNA de interferência (RNAi), o set-up para a aplicação da tensão de cisalhamento com o dispositivo de fluxo paralelo-placa e métodos para o pico-de uma referência exógena do RNA antes da análise por transcriptase reversa quantitativa cadeia da polimerase (RT-qPCR). Esse pipeline é usado para estudar a regulação gênica em células endoteliais na presença e na ausência de tensão de cisalhamento laminar e inclui uma adaptação do aparato de fluxo paralelo-placa descrita por Lane et al 9. esta configuração particular foi projetada para facilitar a avaliação simultânea das várias condições experimentais que permite a comparação direta das condições de tensão de cisalhamento, bem como a normalização de análise de RNA. Uma grande unidade aquecida com umidade controlada é utilizada para permitir que várias câmaras de fluxo separado e bombas para ser executados simultaneamente, com taxas de fluxo monitorizadas para cada conjunto de câmara de fluxo em tempo real. A aplicação desta configuração é usada para knockdown gene usando RNAi na configuração da tensão de cisalhamento/fluxo laminar, mas aspectos do presente protocolo podem ser aplicados a qualquer avaliação da expressão do RNA.
Abordagens comuns para a aplicação da tensão de cisalhamento por células endoteliais incluem microfluidic sistemas10, um viscosímetro cone-placa e11e uma câmara de fluxo paralelo-placa12. Microfluidic sistemas de vários fabricantes tem sido útil no estudo de mechanobiology e mechanotransduction em células múltiplas e tipos de tecido e uma variedade de estímulos biofísicos. Por células endoteliais, eles tem sido usados para estudar células endoteliais em isolamento, bem como a interação de células endoteliais e o tráfico de imune ou tumor de células10. No entanto, estes sistemas são menos adequados para a recuperação de um grande número de células9. O viscosímetro cone-e-placa e câmaras de fluxo paralelo-placa permitam a recuperação de um grande número de células em monocamadas confluente12. Estes sistemas podem gerar uma gama de cisalhamento forças e padrões de12. A câmara de fluxo paralelo-placa montagem9 tem a vantagem essa imagem em tempo real pode ser realizada através da janela de vidro para avaliar a morfologia celular em qualquer ponto do tempo. Além disso, o perfusato pode ser coletado em condições estéreis. Para o sistema aqui apresentado, o fluxo também pode ser monitorado em tempo real e em um set-up multi-câmara, que facilita a manutenção das condições de cisalhamento entre as câmaras.
Para experiências representativas, veia umbilical humana células endoteliais (HUVEC), que representam um tipo de célula endotelial macrovascular, são utilizadas, e as condições de tensão de cisalhamento, usamos (1 Pa) refletem condições arteriais (0,1 - 0,7 Pa). No entanto, este protocolo pode ser usado com outros tipos de células endoteliais, e as condições de tensão de cisalhamento podem ser ajustadas de acordo com a questão experimental. Por exemplo, a avaliação de células endoteliais humanas em condições que o modelo de circulação venosa exigiria mais baixos níveis de tensão de cisalhamento (Pa 1-6) e estudos que o modelo de circulação microvascular utilizaram-se os níveis de tensão de cisalhamento de 0.4 - 1.2 Pa13 , 14. Além disso, a tensão de cisalhamento pode variar mesmo entre células endoteliais dentro do vaso sanguíneo mesmo6. Na configuração atual, é usado um único sistema de monitoramento que pode monitorar simultaneamente quatro loops de fluxo separado. Para laboratórios que precisam de mais fluxo de loops, há espaço no ambiente dedicado para um sistema de monitoramento adicional.
RT-qPCR é usada para a quantificação absoluta de expressão gênica na configuração da tensão de cisalhamento. A expressão relativa dos genes-alvo é frequentemente usada para comparar a expressão do RNA através de condições. Algumas espécies de RNA podem existir em quantidades muito baixas ou estar ausente, complicando assim as medições relativas. Por exemplo, há muito tempo não codificante RNAs em células endoteliais podem exercer efeitos potentes em números relativamente baixos de cópia por célula5. Além disso, as diferenças na eficiência da primeira demão podem levar a uma interpretação imprecisa do utilizando o método de limiar (Ct) do ciclo de delta-delta para analisar os dados. Para resolver esta preocupação, realizamos quantificação absoluta, gerando uma curva de calibração usando uma quantidade conhecida de plasmídeo. Além disso, complementar síntese de DNA (cDNA) é um processo ineficiente, e as diferenças na eficiência do cDNA podem contabilizar diferenças na expressão do RNA entre condições e entre amostras15. A aplicação da tensão de cisalhamento e/ou reagentes de transfecção pode afetar a viabilidade, apoptose e proliferação celular, ou adicionar componentes que podem interferir com a síntese do RNA de isolamento e/ou de cDNA. Para considerar a possibilidade de viés de isolamento de RNA e a síntese do cDNA, usamos um pico-em controlo RNA sintetizados no laboratório, adicionado no momento da extração do RNA e medido com cada cDNA síntese através de RT-qPCR. Isto permite não só o ajustamento técnico diferenças na síntese do RNA de extração e cDNA mas também permite o cálculo das quantidades absolutas por célula, quando a contagem de células é conhecida.
Este sistema utiliza etapas adicionais para manter a similaridade ou esclarecem diferenças técnicas entre as condições. Enfatizamos especialmente estes passos devido à natureza complexa dessas experiências, que envolvem múltiplas instalações físicas e condições experimentais que podem levar à variabilidade experimental.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. preparação de referência exógena do RNA
Nota: Escolha uma referência exógena do RNA que não existe em espécie ou modelo de interesse. Para sistemas de mamíferos, luciferase de vaga-lume do RNA pode ser utilizado.
-
Linearização de plasmídeo de referência exógena do RNA
- Prepare a referência exógena do RNA pelo menos 48 h antes da extração de RNA antecipada. Obter ou produzir um clone de cDNA escolhido exógena da referência de RNA, como um clone de cDNA de luciferase de vaga-lume em um vetor do plasmídeo adequado para a transcrição em vitro (ver Tabela de materiais).
- Executar a enzima de restrição (RE) digestão de 1 µ g de longa-metragem do plasmídeo (o plasmídeo de luciferase de vaga-lume é pSP-luc + que tem 4100 bp) single-cortador RE (XhoI) em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Escolher um RE que é um único cortador (corta o plasmídeo apenas 1x) na extremidade 3' da sequência de RNA que deixa uma 5' saliência ou fim brusco referência exógena. Para uma preparação típica, realizar sete reações de linearização do plasmídeo (etapas 1.1.4 - 1.1.7) em paralelo para gerar suficiente concentração de RNA e quantidade para completar um conjunto de experiências ou um projeto.
- Medir a concentração de plasmídeo utilizando espectrofotometria ou spectrofluorometry.
- Prepare uma mistura RE em cada tubo: adicione 4 µ l de XhoI (20.000 unidades/mL), 8 µ l de tampão, x µL de plasmídeo (1 µ g) e suficiente H2O para chegar a uma solução total de 80 µ l.
- Incubar a mistura RE por 2 h a 37 ° C. Use o RE de acordo com o protocolo do fabricante, pois qualquer modificação pode resultar em aumento da atividade estelar ou clivagem não-específicas do ADN alvo. Calor inativar a mistura de reação por 20 min a 65 ° C.
- Termina o resumo RE com precipitação do álcool etílico em cada tubo. Para a mistura RE, adicione diretamente 4 µ l de pH de EDTA 0,5 M 8.0, 8 µ l de pH de acetato de sódio 3M 5.2 e 184 µ l de etanol 100%. Misture bem e congelar a mistura a-20 ° C por 30 min.
- Girar a mistura em 4 ° C por 20 min em uma força centrífuga relativa (RCF) 16.100 x g.
- Remova o sobrenadante com uma ponta fina, sem tocar a pelota. Secar ao ar livre a pelota por 5 min e Resuspenda-lo em 6 µ l de H2O (aquecido a 37 ° C) pipetando e descer 5x - 10x.
- Confirme a linearização do plasmídeo luciferase executando o produto digerido em gel de agarose 2% contendo brometo de etídio (EtBr) juntamente com uma 1 kb + escada, uma escada supercoiled e corte e plasmídeo sem cortes. Inspecionar o gel e prossiga para a transcrição em vitro , se a pista para o corte do plasmídeo mostra uma única banda no ~ 4 kb (o plasmídeo sem cortes terá três bandas; A Figura 1).
Cuidado: EtBr é cancerígeno. Trabalho em uma coifa de química.
-
Em transcrição de vitro do plasmídeo de referência exógena do RNA
- Para cada tubo de produtos plasmídeo digerido, executar a transcrição in vitro usando um método de transcrição em vitro (ver Tabela de materiais). Siga as instruções do fabricante e use o apropriado do fago RNA polimerase. Se o método de síntese do cDNA requer uma cauda poli (a), ou outras aplicações exigem uma cauda poli (a), escolha um método de transcrição em vitro que inclui uma adição da cauda poli (a) (ver Tabela de materiais).
- Combinar tudo em vitro transcrito produtos em um único tubo de polipropileno de 1,5 mL antes da purificação.
-
Purif icação do RNA a partir da reação de transcrição em vitro
- Purificar em vitro transcrito kit de produtos com um em vitro transcrição limpar (ver Tabela de materiais). Por favor, siga o protocolo do fabricante.
- Avaliar a concentração de RNA medindo absorvância a 260 nm, utilizando espectrofotometria.
Nota: A concentração de RNA é calculada usando a lei de Beer-Lambert. Este afirma que a absorvância de ácidos nucleicos (que absorvem a luz fortemente em 260 nm) é proporcional à concentração. Uma absorvância de 1.0 é igual a 40 µ g/mL de single-stranded do RNA.
-
Alíquotas do estoque do RNA em PCR tubos para uso experimental
- Certifique-se que a concentração de RNA é 1 µ g / µ l.
- Se a concentração de RNA é > 1 µ g / µ l, diluir o estoque de 1 µ g / µ l. alíquota 1 µ l em PCR tubos e armazená-los a-80 ° C.
- Se a concentração de RNA é < 1 µ g / µ l, precipitação adicional usando acetato de amónio de 5m (fornecido no kit) pode ser realizada conforme o protocolo do fabricante. Se a concentração de RNA ainda é < 1 µ g / µ l, prosseguir com alíquotas de 1 µ l em cadeia da polimerase.
- Certifique-se que a concentração de RNA é 1 µ g / µ l.
2. Deslize o revestimento
Nota: Os passos 2.1-2.10 devem ser realizada 24-48 h antes da semeadura a célula antecipada.
- Pré-aqueça o forno a 250 ° C.
- Usar luvas estéreis, enrole cada lâmina de vidro 2 x com folha de alumínio. Evite tocar a superfície da lâmina diretamente.
- Asse os slides no forno por 1 h a 250 ° C e permitir que os slides arrefecer à temperatura ambiente.
Nota: Este passo é importante para destruir qualquer contaminante endotoxinas. - Enquanto os slides são de arrefecimento, fazer uma solução stock de fibronectina de 1 mg/mL com água destilada e incube durante 30 min a 37 ° C para dissolver. Fazer alíquotas de 100 µ l. Reserve as alíquotas para uso imediato e congelar as alíquotas restantes para uso futuro.
- Desembrulhe o revestimento externo da folha de alumínio antes de colocar a lâmina de vidro em uma biossegurança do armário. Execute etapas 2,6-2,7 e 2.9 no armário a biossegurança.
- Coloque a lâmina de vidro em um prato de cultura de célula estéril de 4-bem retangular.
- Dilua a fibronectina solução 1: 100 com água destilada. Cubra cada slide com 1 mL de fibronectina diluída, gota a gota, com uma pipeta. Verifique se que o slide inteiro é coberto.
- Incube os slides em uma incubadora de cultura de tecidos, a 37 ° C por 24-48 h.
- Após a incubação, Aspire a fibronectina inclinando o prato de cultura de células 4-bem. Evite tocar o slide diretamente com o aspirador.
3. célula de propagação no vidro desliza
- Contar as células endoteliais humanas no início passagem (passagem 2-5) e sementes de ~1.0 x 106 células para cada slide fibronectina revestido de vidro com 1ml de mídia (1.0 x 106 células/mL meios de comunicação). As células 24h antes da aplicação antecipada de fluxo laminar as sementes se nenhum tratamento for executada.
Nota: Estes números são usados como um guia para experimentos com 24 h de fluxo.- Ajuste a densidade de semeadura para alcançar uma monocamada confluente das células no momento da colheita de célula e extração do RNA.
- Deixar que as células aderem ao slide por 15 min a 37 ° C.
- Adicionar 3 mL de mídia em cada poço do prato de cultura celular para cobrir o slide e incubar a 37 ° C por 24 h com 5% CO2células.
4. pequenos parasitas RNA (siRNA) Transfection
-
Preparação de células em lâminas de vidro para experimentos de transfecção e fluxo de siRNA
- Siga o protocolo nas etapas 2 (revestimento de slide) e 3 (célula semeadura em lâminas de vidro) para preparação de slide de vidro e revestimento para experiências de fluxo.
- Semente células 24 h antes do tratamento de siRNA (48 h antes da aplicação do fluxo laminar).
- Semente endoteliais células humanas na mídia sem antibióticos em 750.000 a 1 x 106 células por slide para atingir 85% - 95% confluência no dia seguinte.
Nota: HUVEC são utilizados no presente protocolo.
-
Preparação de complexos de reagente de transfeccao siRNA-lipídios-baseado (por slide)
- Design personalizado siRNAs ou ordem premade siRNAs para o gene desejado de interesse.
Nota: Execute as seguintes etapas em uma armário de biossegurança. - Adicione 6 µ l de siRNA (estoque de 20 µM) em 414 µ l de meio de soro reduzida (ver Tabela de materiais) e misture suavemente pipetando.
- Diluir a 49,5 µ l de reagente de transfeccao suavemente mistos baseados em lipídios (ver Tabela de materiais) em 130,5 µ l de meio de soro reduzida.
- Misture delicadamente e incubar a temperatura ambiente por 5 min.
- Combine siRNAs diluídos e reagente de transfeccao baseadas em lipídios, misture delicadamente e incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente. Misture delicadamente para evitar a interrupção dos complexos de reagente de transfeccao baseada em lipídios.
Nota: A solução pode parecer nublada como forma de complexos. - Enquanto estão se formando complexos, remover o meio de crescimento e lavar as células 1 x com médio reduzido de soro.
- Adicione 2,4 mL de meio de soro reduzida para cada slide.
- Adicionar 600 µ l de complexos de reagente suavemente misturados transfeccao siRNA-lipídios-baseado para cada prato e a placa de trás e a mistura de rock. Assegurar a concentração final de siRNA é 40 nM. Certifique-se de que o slide é completamente coberto.
- Incube as células a 37 ° C por 4 h.
- Adicione 1 mL de meio de crescimento de células endoteliais livre de antibióticos contendo 3 x a concentração normal de soro fetal bovino (FBS) sem remover a mistura de transfeccao.
- Incube as células a 37 ° C até que esteja pronto para usar.
- Design personalizado siRNAs ou ordem premade siRNAs para o gene desejado de interesse.
5. cálculo da taxa de fluxo baseado no desejada tensão de cisalhamento9
- Calcule a taxa de fluxo com base nas tensões de cisalhamento desejadas de acordo com a seguinte equação:
Aqui,
Q é a taxa de fluxo em mL/min;
Τ é a tensão de cisalhamento desejado em Dinas/cm2 (1 Pa = 10 Dinas/cm2);
w é a largura da câmara de fluxo paralelo-placa em cm;
h é a altura da câmara de fluxo paralelo-placa em cm;
µ é a viscosidade da mídia no cP (g/cm·s).
Nota: A tensão de cisalhamento laminar típico experimentos (não-pulsátil) este fluxo de trabalho são conduzidos no τ = 1 Pa (10 Dinas/cm2). µ pode ser medido usando um viscosímetro como um viscosímetro cone-e-placa e pode variar dependendo do conteúdo dos meios de comunicação incluindo o soro e o dextran adicional9. - Para alcançar um específico τ (tensão de cisalhamento), ajuste a taxa de fluxo e/ou viscosidade. Em taxas de fluxo superiores, células aderentes podem dissociar-se do slide. Taxas de fluxo de amostra com câmaras de fluxo típico são mostradas na tabela 1.
6. configuração de um ambiente dedicado para monitorar o sistema e várias câmaras de fluxo paralelo-placa (Figura 2)
- Use uma grande unidade/incubadora aquecida com várias prateleiras, acesso interno da electricidade e portas de vidro — conhecido como da praia (ambiente interno com ajustável CO2 ) e calor — abrigar múltiplas câmaras de fluxo simultaneamente para experimentos que exigem tanto a tensão de cisalhamento e a comparação direta entre dois ou mais tratamentos ou saídas (ou seja, DNA, RNA e proteína).
Nota: A praia permite a monitorização frequente do circuito de fluxo, incluindo a taxa de fluxo, sem interrupções frequentes do ambiente. - Assegure a adequada CO2 está disponível para o experimento, e que o CO2 monitor é funcional. Certifique-se a bandeja de água é devidamente preenchida, tal que haverá ar umidificado.
7. instalação do aparato de fluxo paralelo-placa
Nota: Para a fabricação de placas paralelas, por favor consulte Lane et al 9.
- Autoclave o fluxo câmara Luers, reservatório, amortecedor, tubos e placas para cada configuração de câmara de fluxo paralelo-placa conforme indicado na tabela 2.
-
Instalação da Assembleia de circuito de fluxo (Figura 3).
- Coloque toalhas estéreis para a segurança biológica do armário. Monte o sistema de malha de fluxo, primeiro sem a câmara de fluxo paralelo-placa, no gabinete de segurança biológica.
- Conecte o conjunto de tubos para o reservatório:
- Inserir um tubo duro #14 para um buraco e dois #14 tubos macios nos outros dois furos na tampa do reservatório de fluxo. Certifique-se de que um dos tubos de suave toque o fundo do reservatório como tubo de saída .
- Coloque um 1/16" Luer macho no final do disco #14 tubo e anexar um filtro estéril como uma entrada de ar.
- Coloque um 1/16" Luer fêmea no final do #14 suave influxo do tubo, proveniente do reservatório e anexar uma torneira de 4 vias.
Nota: Para análise de expressão do gene ou outros estudos onde perfusates não precisam ser coletados, 2 vias torneiras podem ser usadas em vez de 4 vias torneiras neste protocolo. - Coloque um 1/16" Luer macho na extremidade do tubo de escoamento suave #14, proveniente do reservatório.
- Conecte a tubulação de saída do reservatório à tubulação da bomba: Coloque um 1/16" Luer fêmea em cada extremidade de um tubo rígido #13 (tubulação de bomba). Ligar o tubo de escoamento suave #14 do reservatório para o tubo duro #13 conectando-se 1/16" Luers masculino e feminino juntos.
- Conecte o tubo de bomba com tubo 'ponte de amortecedor': Coloque um 1/8" macho Luer e um 1/8" Luer fêmea em cada extremidade de um tubo macio de #16. Conectar-se a 1/16" Luer fêmea do tubo duro #13 (na extremidade de saída da tubulação da bomba) com o 1/8" macho Luer do tubo macio #16.
- Montar a tubulação para o amortecedor de fluxo: Coloque um 3/16" Luer macho em uma extremidade do tubo macio de #25 e repita isto para o outro lado do amortecedor do fluxo. Prenda as extremidades livres dos tubos macios #25 para cada lado do amortecedor do fluxo.
- Conecte o tubo de 'ponte de amortecedor' com a tubulação para o amortecedor de fluxo: Conecte um tubo macio #25 do amortecedor de fluxo com o tubo macio #16 da 'ponte amortecedor' usando a 1/8" fêmea Luer do lado #16 'ponte amortecedor' e o já colocado 3/16" Luer macho do lado de tubo macio amortecedor #25.
- Monte o tubo 'ponte de câmara':
- Coloque um 1/8" fêmea Luer e um 1/8" macho Luer em cada extremidade de um tubo macio de #16 (tubulação 'ponte de câmara').
- Conectar-se a 1/8" fêmea Luer da ponte câmara' com o 3/16" Luer macho no #25 tubo macio da extremidade livre do amortecedor do fluxo.
- À 1/8" Luer macho (extremidade livre) do tubo de 'ponte de câmara', coloque uma torneira de 4 vias.
- Conecte a torneira de 4 vias da extremidade livre 'ponte de câmara' a torneira de 4 vias do tubo macio influxo reservatório (da etapa 7.2.2.3). Feche as torneiras.
- Adicione mídia para o reservatório e o amortecedor. Para a exposição de 48h a tensão de cisalhamento, adicione 35 mL de mídia para o reservatório e 25 mL para o amortecedor. Ajuste o volume dos meios de comunicação em função da duração do experimento o fluxo e o número de células semeado.
- Trazer o sistema de malha de fluxo montado na bomba na praia. Coloque o tubo duro #13 (tubulação de bomba) na cabeça da bomba e fixá-lo. Abra as torneiras.
- Ligue a bomba e lentamente, aumentar a velocidade da bomba. Deixa a mídia circular através do sistema de laço. Verifique se há qualquer vazamento ou obstrução (por exemplo, acúmulo de pressão). Certifique-se de que a mídia está fluindo para o reservatório.
-
Instalação do conjunto de câmara do fluxo
- Coloque um 1/8" fêmea Luer em uma extremidade de um #16 suave do tubo e anexar uma torneira de 4 vias. Conecte a extremidade livre do tubo para o lado direito da placa superior (entrada lateral).
- Coloque um 1/8" Luer macho em uma extremidade de um #16 suave do tubo e anexar uma torneira de 4 vias. Conecte a extremidade livre do tubo ao lado esquerdo da placa superior (saída lateral).
- Coloque um 1/8" macho Luer e um 1/8" Luer fêmea em cada extremidade de um tubo macio de #16 (tubulação de armadilha de bolha). Fixar o tubo de bolha armadilha através a 1/8" macho Luer. Anexar uma torneira de 4 vias para a outra extremidade da tubulação através de 1/8" fêmea Luer.
- Usando uma pinça estéril, transferi a lâmina de vidro celular-semeado do prato de cultura de células 4-bem para o recesso na placa inferior. Certifique-se de lado célula-semeado da lâmina de vidro é virada para cima.
- Utilizando uma seringa de 10 mL, adicione 10 mL de mídia quente para a placa de fundo dentro da linha de gaxeta vermelha ao redor da placa. Permitir que a mídia de fluxo através do slide e cobrir as células. Evite adicionar mídia diretamente para o slide.
- Coloque delicadamente a placa superior sobre a placa inferior, alinhando-se de um lado para o outro. Evite a introdução de bolhas de ar. Aparafuse as placas firmemente.
- Remova as bolhas de ar da bolha armadilha abrindo a torneira de passagem no lado direito (influxo) da placa e suavemente irrigando 20ml de mídia quente, usando uma seringa de 30 mL. Verifique se a torneira do lado esquerdo (saída) da placa está fechada e que a mídia está fluindo através da torneira de armadilha de bolha (aberto). Descarte a mídia corada.
- Feche a torneira de passagem sobre o borbulhador e abra a torneira do lado esquerdo (vazão) da câmara. Elevar o lado esquerdo (vazão) da câmara para um ângulo de 45° e lave delicadamente 20ml de mídia quente usando uma seringa de 30 mL do lado direito (influxo) da câmara para remover as bolhas de ar da câmara. As bolhas podem ser visualizadas através da janela. Descarte a mídia corada.
- Feche as torneiras de ambos os lados da câmara e cap. Inspecione as células por microscopia.
- Transporte a câmara para a praia com o sistema de malha previamente montado.
- Lentamente, diminuir a velocidade da bomba e pausar a bomba. Feche as torneiras sobre o sistema de malha de fluxo para evitar fugas.
- Ligue a câmara e loop sistema juntos através de torneiras. Abra todas as torneiras.
- Lentamente, aumentar a velocidade da bomba e examinar o set-up para qualquer vazamento ou obstrução. Assegure os meios de comunicação circula em uma direção e retorna para o reservatório.
- Coloque o sensor de fluxo do tubo 'ponte de câmara' localizado no lado de entrada da câmara. Certifique-se que o sensor é orientado corretamente na direção do fluxo.
- Ajuste a velocidade da bomba para obter a taxa de fluxo que foi calculada anteriormente, baseia a desejada tensão de cisalhamento.
Nota: A taxa de fluxo pode variar dependendo da altura e largura de cada câmara, bem como a viscosidade dos meios de comunicação. - Ligue o CO2 tanque para atingir 5% de CO2 e coloque uma bandeja de água dentro da praia.
8. a colheita de células e extração do RNA da câmara de fluxo
- Concluído o período de tempo desejado de fluxo, lentamente, abaixe a velocidade da bomba peristáltica para 0 e desligá-lo. Rapidamente, feche todas as torneiras abertas e remova a câmara e o tubo anexado com uma torneira de passagem em cada extremidade.
- Levar a câmara para uma bancada limpa e suavemente, desparafuse todos os parafusos para remover a placa superior. Usando uma pinça de ponta, remova a lâmina de vidro da placa inferior e coloque-o em um prato de cultura de tecidos de diâmetro de 100 mm.
- Lave o slide com 10 mL de frio fosfato salino (PBS)- / - e verificar as células sob um microscópio para confirmar a aderência de célula e alinhamento na direção do fluxo.
- Aspirar a PBS da placa e transferir o slide para um prato de diâmetro 100mm limpo. Adicione 350 µ l de tampão de lise da extração de RNA kit (veja a Tabela de materiais), que contém 1/100 de beta-Mercaptoetanol, para o slide.
Atenção: Adicione beta-Mercaptoetanol em uma coifa de química. - Raspe as células fora do slide com uma espátula de lâmina de polietileno de célula. Incline o prato de cultura de tecidos, permitindo que o líquido a piscina na parte inferior e remover a lâmina de vidro com a pinça. Pipetar o lisado em um tubo de 1,5 mL de celular e mantê-lo no gelo.
- Dilua o estoque referência exógena do RNA (RNA de luciferase) a 0,0025 ng / µ l através de diluição serial antes de adicioná-lo à amostra. Por exemplo, se a concentração das ações é de 1 µ g / µ l, uma diluição de 1/400.000 é necessário para alcançar 0,0025 ng / µ l. adicionar 10 µ l de diluído luciferase RNA para cada amostra de lisado para isolamento de RNA a jusante e análise celular.
- Prossiga com o protocolo de extração de RNA conforme as instruções do fabricante, ou congelar o lisado a-80 ° C até capaz de prosseguir com a extração.
9. cálculo da eficiência da extração do RNA e síntese de cDNA
Nota: Calcule a eficiência do luciferase após RT-qPCR, comparando o rendimento teórico e o rendimento experimental.
- Determine o rendimento teórico de luciferase RNA.
- Determine a quantidade total de cópias do luciferase adicionado por amostra. (Adição de 0,025 ng/amostra = 2,73 x 107 cópias de luciferase RNA por amostra antes da extração do RNA.)
- Calcule a massa molecular da luciferase RNA usando uma massa molecular média por nucleotídeos de 330 g/mol e multiplicando-o pelo comprimento do luciferase de vaga-lume RNA, nucleotídeos de 1652.
- Divida a quantidade de luciferase RNA adicionado (0,025 ng) para cada amostra antes da extração do RNA pela massa molecular para produzir a quantidade molar. Então, multiplique por do número de Avogadro para produzir as cópias adicionadas por amostra.
- Calcule o rendimento teórico para as cópias de luciferase para cada reação de RT-qPCR usando a equação:
- Calcule o rendimento experimental para as cópias de luciferase para cada reação de RT-qPCR usando o plasmídeo luciferase para gerar uma curva padrão para RT-qPCR.
- Calcule a eficiência do luciferase (%) usando a equação:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bem sucedida linearização do plasmídeo de luciferase usando enzimas de restrição foi confirmada pela execução produtos digeridos em um gel de agarose (Figura 1). O tamanho do produto linear foi confirmado usando escadas de DNA e em comparação com o plasmídeo sem cortes.
Nós adaptamos a afinação de câmara de fluxo paralelo-placa de Lane et al 9 para experimentos que requerem múltiplas condições/tratamentos com tensão de cisalhamento ou várias condições de tensão de cisalhamento. Nós usamos um ambiente dedicado, a praia, que pode abrigar múltiplas, circuitos de fluxo montado inteiramente que todos têm monitorado taxas de fluxo (Figura 2). A taxa de fluxo é monitorizada apenas a montante da Assembleia paralelo-placa (Figura 3). Os circuitos de fluxo e as taxas podem ser monitoradas diretamente através de portas de vidro, sem causar flutuações de temperatura, umidade ou conteúdo de gás dentro da praia.
Processos de fabricação podem levar a pequenas variações de altura de câmara. Assim, as taxas de fluxo devem ser calculadas para cada câmara alcançar a mesma tensão de cisalhamento (tabela 1). Em teoria, câmaras com idênticas alturas podem usar vazões idênticas para alcançar a mesma tensão de cisalhamento em podem ser usadas na série. Típicos experimentos com células endoteliais usam tensão de cisalhamento de 0 - 1,5 PA. Laminar tensão de cisalhamento de 1 Pa foi usado no fluxo de trabalho para a tensão de cisalhamento endotelial arterial de modelo. Também pode haver variações entre configurações de cabeça da bomba e dentro de cabeçotes de bomba ao longo do tempo com o uso. Usar o medidor de fluxo pode dar conta dessas diferenças.
Experimentos utilizando a aplicação da tensão de cisalhamento, muitas vezes envolvem múltiplas condições de tensão de cisalhamento, condições de tratamento e pontos de tempo. Sempre que possível, usamos uma referência endógena RNA a conta para qualquer variabilidades na montagem experimental. Para algumas experiências, encontrar um referência endógena de RNA com estabilidade quantitativa não é viável16. Além disso, quantitativa estabilidade ou instabilidade de genes endógenos referência entre amostras pode ser atribuída a qualquer dependente do estímulo efeitos sobre os níveis de expressão celular ou variações na eficiência de extração de RNA ou transcrição reversa. Para levar em conta para essas ineficiências e o cenário onde um gene endógeno de referência não é quantitativamente estável, usamos um gene de pico-em referência exógenos. Para experiências, incorporando a tensão de cisalhamento laminar em células endoteliais de mamíferos, usamos um luciferase de vaga-lume RNA como um pico-in exógeno do RNA (Figura 4A).
A Figura 4 mostra analisados RT-qPCR dados experimentais de tensão de cisalhamento experimentos avaliando fatores Krüppel-2 (KLF2)-perda de função usando siRNA. KLF2 é um upregulated do fator de transcrição pelo fluxo laminar em células endoteliais e um importante mediador transcriptional endotelial da expressão de gene no cenário de fluxo laminar2.
Figura 4A mostra as eficiências do luciferase para três experiências distintas, cada uma usando duas câmaras de fluxo. Luciferase eficiências podem ser similares entre as amostras de um experimento (experimento 1) ou mostrar alguma variabilidade (experimentos 2 e 3) (Figura 4A). Estes resultados são especialmente valiosos em sistemas experimentais onde apenas pequenas alterações absolutas são vistas. A utilização de um gene exógeno de referência pode ser particularmente importante em experimentos onde tratamentos experimentais podem interferir com a eficácia da transcrição reversa ou PCR17. Os resultados descritos na Figura 4A são típicos. Uma eficiência de luciferase de 5% indica que 5% do luciferase RNA (ou seja, a quantidade de partida inicial de RNA) adicionado à amostra antes da extração do RNA é detectado pelo RT-qPCR. Entre amostras ou condições dentro de uma única experiência, eficiências de luciferase são geralmente ± 50%. Resultados devem ser interpretados com cautela se a variabilidade das eficiências do luciferase é > 50% e deve incluir uma revisão das condições e procedimentos experimentais.
Figura 4B mostra resultados experimentais típicos de RT-qPCR de experiências repetidas de tensão de cisalhamento, cada um usando múltiplas câmaras de fluxo paralelo-placa. Dentro de cada experimento, a expressão de RNAm de KLF2 é normalizado de três maneiras. A primeira normalização usa um referência endógena do RNA, A ciclofilina (CycA). A normalização segunda usa um RNA exógeno referência, luciferase de vaga-lume (Luc). A normalização de terceira usa ambos a endógena e exógena referência RNA. Dentro de cada experimento mostrado na Figura 4B, todos os três métodos de normalização (normalização para o gene endógeno de referência, o gene exógeno referência e ambos os genes endógenos e exógenos referência juntos) produz resultados semelhantes. Se o método de normalização altera significativamente os resultados (por exemplo, leva a > 50% de diferença), os resultados devem ser interpretados com cautela. Quando há considerável variabilidade entre os métodos de normalização, os genes endógenos de referência devem ser revistas, como pode ser uma variável dependente no sistema experimental. Da mesma forma, os procedimentos experimentais e condições devem ser revistas. Na Figura 4B, KLF2 knockdown usando siRNA rende semelhante "knockdown" eficiência entre três experimentos separados (experimento 1, 2 e 3). Usamos três amostras biológicas distintas para estas experiências, usando duas câmaras de fluxo de execução simultaneamente com a tensão de cisalhamento em 1 Pa para cada experimento.
Figura 1: imagem de gel de Agarose da linearização do plasmídeo exógena do luciferase. Escadas de DNA supercoiled e 1 kb + são usadas como marcadores para determinar os dois sem cortes e cortar luciferase plasmídeo tamanhos em kilobases (kb). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: visão geral esquemática de vários assemblies de circuito de fluxo dentro de um ambiente dedicado (praia). As taxas de fluxo em ambos os circuitos de fluxo são facilmente monitoradas em tempo real, sem perturbar o ambiente e os dois circuitos podem executar simultaneamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: visão geral esquemática de uma montagem de circuito de fluxo único. Os tamanhos da tubulação e Luers usado são indicadas nesta figura. Certifique-se que o medidor de fluxo é orientado na direção do fluxo e colocado a montante da câmara de fluxo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: representante resulta de experiências de perda-de-função KLF2 em células endoteliais humanas expostas a estresse de cisalhamento (1 Pa) por 24 h. (A), este painel mostra a quantificação de luciferase exógena do RNA em três experimentos de fluxo separado. Luciferase eficiências podem ser similares entre as amostras de um experimento (experimento 1) ou mostrar alguma variabilidade (experimentos 2 e 3). Luciferase (cópias absolutas) é o número de cópia de luciferase RNA detectado por PCR quantitativo de transcriptase reversa (RT-qPCR) por quantificação absoluta usando uma curva padrão. Luciferase eficiência é as cópias de luciferase experimental divididas por cópias de luciferase teórico para cada amostra multiplicado por 100 (consulte a etapa 8 do protocolo). Luciferase relativa eficiência é a eficiência do luciferase de cada amostra dividida pela condição de referência (fluxo + Ctlsi) dentro de cada experimento. (B), estes painéis mostram a normalização da expressão do gene em um conjunto de amostra de tensão de cisalhamento experimentos usando ambos os genes de referência endógenos e exógenos. Os resultados são de PCR quantitativo de transcriptase reversa (RT-qPCR). Nocaute de expressão de RNAm de KLF2 é mostrado na presença de fluxo laminar com tensão de cisalhamento de 1 Pa para 24 h. FC = mudança de dobra; CycA = A ciclofilina, usada como uma referência endógena do RNA; Luc = luciferase, usado como uma referência exógena do RNA. Os dados adaptados do homem et al 5. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Altura da câmara (mícrons; µm) |
Largura da câmara (centímetros; cm) |
Vazão (mL/min) para 1 tensão de cisalhamento de Pa | Viscosidade (centipoise; cP) |
| 303.80 | 1,90 | 19.48 | 0.90 |
| 326.10 | 1,90 | 22.45 | 0.90 |
| 344.84 | 1,90 | 25.10 | 0.90 |
| 319.06 | 1,90 | 21.49 | 0.90 |
Tabela 1: Câmara alturas e exemplos de taxas de fluxo para várias câmaras de fluxo atingir a tensão de cisalhamento de 1 PA.
| Panos de J |
| Pinça |
| Tampa e garrafa de reservatório |
| Amortecedor e Cap |
| Loop de fluxo |
| 1/16" Luer macho x 3 |
| 1/16" Luer fêmea x 3 |
| 1/8" macho Luer x 2 |
| 1/8" Luer fêmea x 4 |
| 3/16" adaptador macho x 2 |
| 14 L/S tubo rígido (2 polegadas) x 1 |
| 14 L/S tubo macio (5 polegadas) x 2 |
| 16 L/S tubo macio (3 polegadas) x 2 |
| 25 L/S tubo macio (3 polegadas) x 2 |
| 13 tubo duro L/S (10 polegadas) x 1 |
| Câmara de fluxo |
| 1/8" macho Luer x 2 |
| 1/8" Luer fêmea x 2 |
| 16 L/S tubo macio (3 polegadas) x 3 |
| Superior e inferior de placas |
| Parafusos |
Tabela 2: Peças para ser esterilizada na etapa 6.2 do protocolo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tensão de cisalhamento é uma condição fisiológica que modula a função endotelial, em parte, por afetar o estado estacionário gene expressão2,5. Modelos de regulação gênica em diferentes condições de tensão de cisalhamento irão contribuir para uma melhor compreensão da função endotelial. Este fluxo de trabalho pragmático inclui um circuito de fluxo utilizando uma câmara de fluxo paralelo-prato adaptada de Lane et al 9 e representa fluxo laminar, não-pulsátil. O set-up global foi projetado para facilitar a experimentos que requerem múltiplas câmaras de fluxo e minimizar a variabilidade experimental neste cenário.
A montagem de circuitos de fluxo é um componente importante do fluxo de trabalho e é adaptada de Lane et al 9. várias adaptações desta assembleia e protocolo foram feitas para refletir as diferenças nos sistemas experimentais. Uma grande unidade aquecida, a praia, é uma adaptação que facilita a operação simultânea e acompanhamento dos diversos circuitos de fluxo dentro do mesmo ambiente. Este sistema tem sido usado com sucesso para a aplicação da tensão de cisalhamento de células endoteliais por vários períodos de tempo, de 1 h para 7 dias e em vários níveis de tensão de cisalhamento (por exemplo, 1.0, 1.5 e 2.0 Pa). Este sistema foi usado também para estudos "knockdown" gene para avaliar a função de um gene endotelial fluxo-responsivo na configuração da tensão de cisalhamento (Figura 4)5. Há considerável variabilidade entre as bombas e cabeças de bomba, que também podem mudar ao longo do tempo devido ao desgaste normal. Para considerar essas diferenças, nós usamos um sensor de fluxo situado proximal para a câmara de fluxo para monitorar continuamente as taxas de fluxo. Vários tamanhos de tubulação e Luers são usados para garantir um ajuste apertado para cada componente e para evitar qualquer vazamento durante as experiências. Nós contados células e semeado aproximadamente 1.000.000 células por lâmina de vidro, gota a gota e então permitir que as células incubar a 37 ° C por 15 min aumentar a eficiência de aderência. Em comparação com células progenitoras endoteliais, que podem ser propagadas por um curto período de tempo antes da aplicação da tensão de cisalhamento9, nós semeamos células endoteliais humanas pelo menos 24 h antes da aplicação da tensão de cisalhamento. Durações mais curtas podem originar a desalojar das células durante o fluxo, ou uma camada descontínua de células endoteliais, mesmo com a densidade de semeadura adequada. Enfatizamos a inspeção dos slides para uma monocamada confluente das células endoteliais, ambos antes e depois da aplicação da tensão de cisalhamento. Encontramos que lâminas revestidas com fibronectina, um componente natural da matriz extracelular18, mantenham a monocamada endotelial mais consistentemente em comparação com os lados revestidos com gelatina (desnaturado fibrillar colágeno tipo I). Finalmente, os amortecedores de fluxo no presente protocolo são otimizados para usar 30 mL de mídia, em comparação com 190 mL de mídia para outros fabricantes.
Vários passos na Assembleia de circuito de fluxo requerem cuidados adicionais. Uma mesmo monocamada de células endoteliais deve ser estabelecida antes da aplicação da tensão de cisalhamento. É importante para as células de semente para o slide de vidro gota a gota para aumentar o número de células que aderem ao slide e, assim, a cobertura total do slide. O tempo de espera entre a célula a propagação e a adição de mídia adicionais para o slide geralmente melhora a eficiência de semeadura pois proporciona tempo suficiente para as células aderir ao slide, ao invés de ser lavados na bandeja multi slide. Inspecione as células visualmente antes, durante e depois da aplicação da tensão de cisalhamento. Um microscópio pode ser colocado na praia para essa finalidade. O sensor de fluxo deve ser anexado na orientação correta e a taxa de fluxo do alvo deve ser verificada para cada câmara de fluxo individual. O sistema de malha de fluxo deve ser perfundido sem câmara para garantir que nenhum escapamento de mídia ou outros problemas, como o acúmulo de pressão, para evitar perturbar as células durante as experiências reais. Verifique se há e eliminar bolhas no sistema. Ao testar o sistema de malha de fluxo, certifique-se das que torneiras são todas abertas antes de ligar a bomba peristáltica para permitir o fluxo ininterrupto, unidirecional. Certifique-se de que todas as torneiras estão fechadas antes de ligar a câmara de fluxo para o loop e totalmente abertas antes de reiniciar a bomba.
Nós achamos que a adição de um gene exógeno referência é útil em uma variedade de cenários. Célula endotelial mídia muitas vezes contém heparina, que é um inibidor de PCR17. Enquanto alguns protocolos de extração de RNA incorporam etapas para remover a heparina, vestígios podem causar diferenças na eficiência da PCR entre amostras. Tratamentos potentes também podem impedir a identificação de um gene endógeno de referência que é quantitativamente estável. Nosso laboratório criou um protocolo eficiente para sintetizar RNA 5'-tampado e de cauda poli-A luciferase para uso como um RNA exógeno de referência. Esta estratégia provou para ser uma abordagem custo-benefício em comparação à compra de um RNA comercialmente disponível. Durante a preparação da referência exógena do RNA, é importante a alíquota RNA em alíquotas de uso único para evitar vários ciclos de congelamento e descongelamento. Mistura completa e exata de pipetagem são fundamentais para manter a consistência entre alíquota. Experiências típicas mostram uma eficiência de luciferase no intervalo de ± 5% e 2,5%, mas podem variar de 1% - 10%. É prudente corrigir resultados de RT-qPCR para a eficiência de referência exógena do RNA e um gene de referência endógena (limpeza).
Para os experimentos que realizamos, sequências de luciferase de vaga-lume são usadas como uma não-mamíferos spike-em referência RNA em modelos de mamíferos. Em experimentos em luciferase de vaga-lume é expressa em células, isso não seria um gene de referência adequado. Outros genes da espécie-específicos de referência podem ser usados, incluindo Caenorhabditis elegans miRNA cel-miR-3919 e ribulose bisfosfato carboxilase planta RNA20.
Este circuito de fluxo modela uma 2-D monocamada de células endoteliais, cultivadas em cultura de tecido plástico ou vidro, que é bastante duro. Rigidez de matriz pode influenciar a resposta endotelial à tensão de cisalhamento fluido21. Este modelo sistema usa uma concentração relativamente alta de oxigênio arterial mais semelhante do que as concentrações de oxigênio venoso. Este modelo estreitamente assemelha-se segmentos retos dos maiores navios em um sistema cardiovascular fechado e fornece um ambiente relativamente homogêneo para células endoteliais no slide. Outras condições específicas em estruturas 3-d, como bifurcações ou curvaturas dos navios, não são representadas com este modelo. Outros sistemas podem modelo outros padrões de fluxo, incluindo aqueles em regiões curvas da vasculatura, mas rendem menos células do que o sistema descrito neste protocolo. Da mesma forma, outros módulos (assemblies) pode ser mais apropriado se > 1 x 106 células são necessários, ou se é necessária uma análise de célula única. Nosso aplicativo atual modelos não-pulsátil fluxo laminar. No entanto, este modelo pode ser usado para gerar outras formas de onda, incluindo formas de onda pulsátil ou oscilatórias, com consistência, como as taxas de fluxo são monitoradas continuamente.
Em geral, este fluxo de trabalho pragmático fornece um sistema para a aplicação simultânea de múltiplas câmaras de fluxo com taxas de fluxo monitorado de tensão de cisalhamento. Materiais e procedimentos em todo este fluxo de trabalho são projetados para minimizar a variabilidade experimental entre amostras e condições. Este fluxo de trabalho tem sido usado com sucesso para experimentos de RNAi no cenário do fluxo laminar e também pode ser usado para quaisquer experimentos que requerem várias condições com tensão de cisalhamento laminar, ou várias magnitudes de tensão de cisalhamento laminar e/ou pontos de tempo, incluindo formas de onda alternativas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela CIHR MOP 142307 ao P.A.M. H.S.J.M. é um destinatário de um canadense institutos de saúde pesquisa programa de treinamento em comunhão de medicina regenerativa. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. e M.K.D. são os destinatários da Rainha Elizabeth II bolsas pós-graduação em ciência e tecnologia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | gibco | 25300-062 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 10 mm2 Culture Dish | Sarstedt | 83.3902 | |
| 30 mL Syringe | BD | 302832 | |
| 4-Way Stopcocks | Discofix | D500 | |
| Aluminum foil | |||
| BEACH | Darwin Chambers Company | MN: HO85, SN: 4947549 | |
| Cell Scrapers | |||
| CO2 Meter | BioSphenix, Ltd. | MN: P120, SN: 0342 | |
| CO2 Sensor | BioSphenix, Ltd. | MN: C700, SN: 52852 | |
| Distilled water | gibco | 15230-170 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) -/- | gibco | 14190-144 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | Promo Cell | C-22011 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix | Promo Cell | C-39216 | |
| Fibronectin (pure) | Sigma-Aldrich | 11051407001 | |
| Filter (0.20 um) | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Flow Dampener and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Meter: 400 Series Console | Transonic Scisense Inc. | T402 | |
| Flow Meter: 400 Series Tubing | Transonic Scisense Inc. | TS410 | |
| Flow Reservoir and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Sensor | Transonic Scisense Inc. | ME4PXL | |
| Isotemp 737F Oven | Fisher Scientific | FI-737F | |
| J cloth | J cloth | ||
| Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm) | Fisherfinest | 12-544-4 | |
| Paper sterilization pouch | Cardinal Health | 92713 | |
| Pump (Masterflex L/S Economy Drive) | Cole-Parmer | 7554-90 | |
| Pump Head (Masterflex L/S Easy Load) | Cole-Parmer | 7518-00 | |
| Rectangular 4 Well Dish | Thermo Scientific | 267061 | |
| Tweezers | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tubing | |||
| Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-25 | |
| Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-14 | |
| Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-16 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-13 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-14 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luer | |||
| 3/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-08 | For #25 tubing |
| 1/8" Male Luer | Cole-Parmer | 30800-24 | For #16 tubing |
| 1/8" Female Luer | Cole-Parmer | 30800-08 | For #16 tubing |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-00 | For #14 tubing |
| 1/16" Female Luer | Cole-Parmer | 45508-00 | For #14 tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockdown reagents | |||
| Oligofectamine Reagent | Invitrogen | 12252-011 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | gibco | 31985-070 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In vitro transcription | |||
| Generuler 1kb+ DNA ladder | Thermo Scientific | SM1331 | |
| MEGAclear Kit | Ambion | AM1908 | |
| mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| pSP-luc+ | Promega | E4471 | |
| Supercoiled DNA Ladder | New England BioLabs Inc. | N0472S | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| UltraPure Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585011 | |
| XhoI Restriction Enzyme | New England BioLabs Inc. | R0146S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA extraction | |||
| Beta-mercaptoethanol | Sigma | M3148-100mL | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
References
- Aird, W. C.
- Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).
- Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4478-4485 (2001).
- Cybulsky, M. I., Marsden, P. A. Effect of disturbed blood flow on endothelial cell gene expression: a role for changes in RNA processing. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (9), 1806-1808 (2014).
- Man, H. S. J., et al. Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).
- Won, D., et al. Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow. The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).
- Baeyens, N., et al. Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point. eLIFE. 4, 04645 (2015).
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. The atherosusceptible endothelium: endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo. Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), 3349 (2012).
- Gray, K. M., Stroka, K. M. Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models. Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).
- Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress. Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).
- Resnick, N., Gimbrone, M. A. Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression. The FASEB Journal. 9 (10), 874-882 (1995).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. The Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- DeStefano, J. G., Xu, Z. S., Williams, A. J., Yimam, N., Searson, P. C. Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs). Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20 (2017).
- Thormar, H. G., et al. Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis. Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).
- Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription. Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).
- Vaughan-Shaw, P. G., et al. A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification. Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).
- Collins, C., et al. Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells. Nature Communications. 5, 3984 (2014).
- Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).
- Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR. Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).
- Kohn, J. C., et al. Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior. Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).
